專利名稱：導(dǎo)入核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及導(dǎo)入核酸的方法，更具體來說，涉及通過電穿孔將核酸導(dǎo)入細胞的方法。
背景技術(shù)：
將基因?qū)爰毎姆椒ū挥脕黻U明基因的功能和基因編碼的蛋白的性質(zhì)，以及用于大量地生產(chǎn)重組蛋白。此外，將基因?qū)爰毎姆椒ㄒ灿糜趯⒛康拿富蚣毎蜃拥幕驅(qū)胧茉囌叩募毎ㄟ^基因在體內(nèi)產(chǎn)生目的物質(zhì)，從而提供對疾病的治療。
人類基因組DNA的測序已經(jīng)接近完成，可以預(yù)料到存在具有各種未知功能的基因。今后，對新的人類基因的功能分析是研究中的極大挑戰(zhàn)，但是為了對多達幾萬種基因進行功能分析，需要能夠過量表達和徹底地敲除基因、并且是高通量的方法。
將基因?qū)爰毎募夹g(shù)可以粗略地分成生物學(xué)方法、也就是利用來自腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒的病毒載體的導(dǎo)入方法、利用物理學(xué)方法例如脂轉(zhuǎn)染方法(脂質(zhì)體方法)的導(dǎo)入方法、電穿孔方法(電穿孔方法)、微注射方法和微粒槍方法。
在這些方法中，利用病毒載體的方法具有高的基因?qū)胄剩且簿哂腥秉c，病毒載體的制備復(fù)雜，在安全性方面發(fā)現(xiàn)有問題。盡管脂轉(zhuǎn)染方法安全性高，它們的缺點是基因?qū)胄实?、細胞毒性強等?br> 直接的導(dǎo)入方法例如微注射方法和微粒槍方法的缺點在于細胞損傷嚴(yán)重、有效導(dǎo)入基因的條件的最適化煩瑣，為了用于技術(shù)操作需要特別的技術(shù)和儀器。
此外，常規(guī)的電穿孔方法采用的方法是在電極例如平行板之間安排了培養(yǎng)基，其中懸浮有基因和細胞，然后在兩個電極之間施加電脈沖，以便在細胞膜中產(chǎn)生小孔，并在它們恢復(fù)之前將外源基因?qū)爰毎?非專利文獻1EMBO Journal，1982，Vol.1，第841-845頁；非專利文獻2Bioelectrochem.&Bioenerg.，1999，Vol.48，第3-16頁)。盡管該方法導(dǎo)入基因的效率高，其缺點是細胞損傷嚴(yán)重，導(dǎo)入基因的時機和位點難以自由選擇等。
此外，最近已經(jīng)開發(fā)了轉(zhuǎn)染陣列，其中將細胞培養(yǎng)在已經(jīng)印刷(print)了表達質(zhì)粒的玻璃基材上，通過脂轉(zhuǎn)染方法將基因?qū)爰毎愿咄康胤治龌虻墓δ?非專利文獻3Nature 2001，Vol.411，第107-110頁)。因為該方法使用了脂轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染，上面提到的由脂轉(zhuǎn)染方法引起的缺點仍然存在。
另一方面，報道了另一種吸附方法，該方法將生物分子例如核酸和蛋白以保持活性的狀態(tài)固定在基材的表面上(非專利文獻4Biosensors & Bioelectronics，1994，Vol.9，第677-684頁)。該方法通過將具有不同靜電荷的聚合物交替地吸附到基材上，繼而通過靜電相互作用層壓聚合物薄膜(形成聚合高分子電解質(zhì)復(fù)合物)，但是應(yīng)用這種方法導(dǎo)入基因的例子還沒有報道。
發(fā)明公內(nèi)容本發(fā)明解決的問題本發(fā)明的一個目的是提供一種導(dǎo)入基因的方法以解決常規(guī)的電穿孔方法的問題，更具體來說，提供了一種方法，其中不僅可以將基因有效地導(dǎo)入細胞，而且基因的導(dǎo)入可以在所需的時間和所需的位點進行，并且不損傷細胞。此外，本發(fā)明的另一個目的是提供能夠執(zhí)行上述基因?qū)氲姆椒?，該方法使用了能夠在細胞的顯微觀察中提供良好觀察環(huán)境的電極基材。
解決問題的方法本發(fā)明人試圖改進通過常規(guī)的電穿孔導(dǎo)入基因的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過將核酸放置在電極表面，使細胞附著到獲得的裝載核酸的電極表面，然后對附著的細胞施加電脈沖，不僅能夠有效地將基因?qū)爰毎?，而且可以在所需的時間和所需的位點導(dǎo)入基因，并且不損傷細胞。此外，本發(fā)明人研究了更多的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用透明的半導(dǎo)體電極作為電極時，細胞的顯微鏡觀察可以被執(zhí)行得很好?；谏鲜龅陌l(fā)現(xiàn)本發(fā)明人完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明是(1)一種通過電穿孔將核酸導(dǎo)入細胞的方法，包括步驟(A)將核酸裝在電極的表面上；步驟(B)將細胞附著在獲得的裝載核酸的電極的表面上；以及步驟(C)對附著的細胞施加電脈沖，(2)一種通過電穿孔將核酸導(dǎo)入細胞的方法，包括步驟(a)提供具有陽離子表面的電極；步驟(b)將核酸吸附并裝在電極的陽離子表面上；步驟(c)將細胞附著在步驟(b)中獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(d)對細胞施加電脈沖，(3)上面(2)的方法，其中具有陽離子表面的電極是這樣的陽離子表面電極，其中有在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的單層，陽離子聚合物吸附在單層的表面上，(4)上面(2)的方法，其中具有陽離子表面的電極是這樣的電極，其中有在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或硅烷化劑形成的單層，陰離子聚合物吸附在單層的表面上，陽離子聚合物進一步吸附在它的表面上，
(5)上面(2)的方法，其中具有陽離子表面的電極是透明的電極，其上吸附了陽離子聚合物，(6)上面(2)的方法，其中步驟(b)的執(zhí)行是通過一次直接將核酸吸附在電極的陽離子表面上，或者將核酸和陽離子聚合物通過交替吸附方法按照核酸、陽離子聚合物和核酸的次序交替吸附在表面上，(7)上面(3)或(4)的方法，其中的電極是使用從鉑、金和鋁中選擇的金屬制成的，(8)上面(3)或(4)的方法，其中的電極是金電極基材，(9)上面(8)的方法，其中的金電極是其上沉積有金的玻璃基材或透明塑料基材，(10)上面(5)的方法，其中的透明電極是其上沉積有氧化銦錫、氧化銦、摻有鋁的氧化鋅或摻有銻的氧化錫的玻璃基材或透明塑料基材，(11)上面(5)的方法，其中的透明電極是其上沉積有氧化銦錫的玻璃物基材或透明塑料基材，(12)上面(3)的方法，其中的在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物是通式(1)所示的硫醇化合物R1(CH2)n-SH(1)(其中R1代表陰離子官能團，n代表1-40之間的整數(shù))，(13)上面(12)的方法，其中的R1是從羧酸、磷酸、磺酸基團和膦酸中選擇的基團，(14)上面(12)的方法，其中的由通式(1)代表的硫醇化合物是從11-巰基-十一烷酸、8-巰基-辛酸和15-巰基棕櫚酸中選擇的巰基烷酸，(15)上面(3)、(4)或(5)的方法，其中的陽離子聚合物是從聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙縮醛化的聚乙烯醇、在側(cè)鏈末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、酸處理的明膠、魚精蛋白、聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚精氨酸、殼聚糖、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和聚酰胺型胺類枝狀聚合物中選擇的聚合物。
(16)上面(4)的方法，其中的在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物是通式(2)所示的硫醇化合物R2(CH2)n-SH(2)
(其中R2代表陽離子官能團，n代表1-40之間的整數(shù))，(17)上面(16)的方法，其中的R2是氨基基團(18)上面(1)或(2)的方法，其中的核酸是DNA、RNA、反義核酸、siRNA或它們的表達載體，(19)上面(1)或(2)的方法，其中的核酸是編碼蛋白的DNA或其一部分，(20)上面(1)的方法，其中步驟(B)是通過在含有核酸的電極表面上溫育細胞來進行的，(21)上面(2)的方法，其中的步驟(c)是通過在含有核酸的電極的表面上溫育細胞來進行的，(22)上面(1)的方法，其中步驟(C)是通過在附著了細胞的含有核酸的電極的對面提供對電極、然后在兩個電極之間產(chǎn)生電脈沖來進行的，(23)上面(2)的方法，其中步驟(d)是通過在附著了細胞的含有核酸的電極的對面提供對電極、然后在兩個電極之間產(chǎn)生電脈沖來進行的，以及(24)上面(2)的方法，其中具有陽離子表面的電極是具有微型圖案(micropatterned)表面的電極。
此外，本發(fā)明是(25)具有陽離子表面的電極，其中有在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的單層，陽離子聚合物吸附在單層的表面上，以及(26)具有陽離子表面的電極，其中由通式(1)所代表的硫醇化合物的單層形成在通過在玻璃基材上沉積金而制成的金電極的表面上，陽離子聚合物然后被吸附在單層的表面上R1(CH2)n-SH(1)(其中R1代表陰離子官能團，n代表1-40之間的整數(shù))。
本發(fā)明的效果本發(fā)明提供了通過電穿孔將核酸導(dǎo)入細胞的方法，通過該方法不僅能夠?qū)⒑怂嵊行У貙?dǎo)入到細胞中，而且核酸的導(dǎo)入可以在所需的時間和所需的位點進行，并且不損傷細胞。
附圖簡述

圖1顯示了用于對在裝載有核酸的金電極上的附著細胞進行電穿孔的裝備以及電脈沖系統(tǒng)。
圖2顯示了HEK293細胞在施加電脈沖(電場強度75V/cm，脈沖時間10毫秒，脈沖數(shù)1)48小時后的相差顯微照片(A)和熒光顯微照片(B)。比例尺200μm。
圖3是一個條形圖，顯示了電場強度對轉(zhuǎn)染效率的影響。
圖4顯示了細胞存活率與電場強度之間的關(guān)系。
圖5顯示了聚乙烯亞胺和聚烯丙胺的分子量對轉(zhuǎn)染效率的影響。
圖6顯示了裝載于具有各種不同陽離子聚合物的電極上的DNA的量。
圖7顯示了在電脈沖后從具有各種不同陽離子聚合物的電極上釋放的DNA的量。
圖8顯示了轉(zhuǎn)染效率與釋放的DNA的量之間的相關(guān)性。
圖9顯示了HEK293細胞在電脈沖48小時后的熒光照片。電脈沖的施加是在細胞接種于裝載有DNA的電極后(A)24、(B)48和(C)72小時。
圖10顯示了在施加電脈沖前細胞溫育時間改變時的轉(zhuǎn)染效率。
圖11顯示了原代海馬神經(jīng)元在裝載有pEGFP和pDsRed混合物的表面上電脈沖48小時后的相差顯微照片(左)和熒光顯微照片(中，右)。上部和下部的照片顯示了不同視野的圖象，電穿孔在同樣的條件下進行。
圖12顯示了HEK293細胞在裝載有pEGFP或pDsRed的表面上在限定位點進行電穿孔48小時后的相差顯微照片(左)和熒光顯微照片(右)。
圖13顯示了在不同的交替吸附循環(huán)數(shù)后獲得的ITO表面的ATR紅外吸收光譜。
圖14顯示了交替吸附循環(huán)數(shù)和磷酸基團的兩個吸收帶的峰面積之間的關(guān)系。
圖15顯示了交替吸附循環(huán)數(shù)與ITO表面的水接觸角度之間的關(guān)系。
圖16顯示了HEK293細胞在裝載有DNA的ITO表面上進行電脈沖(電場強度250V/cm，脈沖時間10毫秒，脈沖數(shù)1)48小時后的相差顯微照片(A)和熒光顯微照片(B)。
圖17顯示了電場強度對裝載有DNA的ITO表面上的轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的影響。
圖18顯示了交替吸附循環(huán)數(shù)對裝載有DNA的ITO表面上的轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的影響。
圖19顯示了在不同的交替吸附循環(huán)數(shù)后裝載到ITO表面上的DNA的量。
圖20是顯示了轉(zhuǎn)染效率和釋放的DNA的量之間的關(guān)系的相關(guān)性圖。
圖21顯示了海馬神經(jīng)元在裝載有pEGFP和pDsRed混合物的ITO表面上電脈沖48小時后的相差顯微照片(左)和熒光顯微照片(中，右)。上部和下部的照片顯示了不同視野的圖象，電穿孔在同樣的條件下進行。
圖22是HEK293細胞在ITO表面上電脈沖48小時后的熒光顯微照片，在ITO表面上以陣列的形式吸附有不同的質(zhì)粒(pEGFP或pDsRed或二者的混合物)。
代碼描述圖1中的符號的意義如下A電穿孔儀B電穿孔緩沖液C細胞D核酸-陽離子聚合物復(fù)合層 E金薄膜電極(陰極)F金電極(陽極)G硅酮間隔物實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明的一個方面是通過電穿孔將核酸導(dǎo)入到細胞的方法，包括步驟(A)將核酸裝在電極的表面上；步驟(B)將細胞附著在獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(C)對附著的細胞施加電脈沖，上面提到的相應(yīng)步驟繼續(xù)說明如下。
步驟(A)為了在電極上裝載核酸，可以采取例如(A1)提供具有陽離子表面的電極，然后將核酸吸附到電極的陽離子表面上的方法，(A2)提供具有陽離子表面的電極，然后將核酸和陽離子聚合物交替地吸附到電極的陽離子表面上，并形成例如陽離子聚合物-核酸-陽離子聚合物-核酸等的多層的方法。
(陽離子表面電極基材的描述)具有陽離子表面的電極可以從電極的表面具有正電荷的電極中選擇，這樣的電極的例子包括(a1)電極，其上有在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的單層，陽離子聚合物被吸附在單層的表面上，(a2)電極，其上有在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或硅烷化劑形成的單層，陰離子聚合物被吸附在單層的表面上，陽離子聚合物進一步吸附在其表面上，(a3)電極，其上有陽離子聚合物吸附在表面上，等。
上述的具有陽離子表面的電極(a1)可以通過例如下面的方法來產(chǎn)生1)在電極基材表面上形成在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物的單層，以及2)在單層表面上吸附陽離子聚合物。
此外，上述的具有陽離子表面的電極(a2)可以通過例如下面的方法來產(chǎn)生1)在電極基材的表面上形成在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物、二硫化物、硫化物或硅烷化劑的單層，2)在單層表面上吸附陰離子聚合物，以及然后3)在陰離子聚合物表面上吸附陽離子聚合物。
此外，上述的具有陽離子表面的電極(a3)可以通過例如在電極的表面上吸附陽離子聚合物來產(chǎn)生。
電極由基材(substrate)來支持，例如平板、芯片(包括微芯片)、陣列等。構(gòu)成成它們的基本材料沒有具體的限制，只要它們是能夠支持電極的絕緣材料就行，例如可以使用無機絕緣材料例如玻璃、云母、石英、礬土、藍寶石、鎂橄欖石、碳化硅、二氧化硅和氮化硅；有機絕緣材料例如聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚對苯二甲酸乙二酯、不飽和的聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸樹脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛樹脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹酯、三聚氰胺樹脂、苯乙烯-丙烯腈共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚砜。
在這些物質(zhì)當(dāng)中，具有上述(a1)和(a2)的陽離子表面的電極的基材的基本材料優(yōu)選為無機絕緣材料，例如玻璃、云母、石英、礬土、藍寶石、鎂橄欖石、碳化硅、二氧化硅和氮化硅，或者是透明的塑料。具有上述(a3)的陽離子表面的電極的基材的基本材料優(yōu)選為玻璃或透明塑料，而玻璃是特別優(yōu)選的。對上述的透明塑料沒有具體的限制，只要它是沒有自身熒光的透明聚合物材料就行，可以是已知的材料。作為透明塑料，例如上述的有機材料等是示例性的，但是在其中，聚對苯二甲酸乙二酯是優(yōu)選的。
另一方面，對電極沒有特別的限制，只要它是可以在電穿孔方法中使用的電極就行，但是由金屬材料例如鉑、金和鋁制成的電極是優(yōu)選的。此外，透明電極被優(yōu)選提及，以便利細胞的顯微鏡觀察。透明電極包括氧化銦錫(ITOIn2O3-SnO3)、摻有鋁的氧化鋅(ZnO)、摻有銻的氧化錫(SnO3)等，氧化銦錫是特別優(yōu)選的。
包含上述的“基材”和“電極”的優(yōu)選的電極基材包括了那些電極，其中在玻璃基材、塑料基材或云母基材的一側(cè)提供了金屬電極例如鉑、金或鋁電極或透明電極基材基材基材。前者的優(yōu)選例子包括在玻璃基材、云母基材或透明塑料基材的一側(cè)提供了金電極基材基材基材的電極，后者的優(yōu)選例子包括在透明基材例如玻璃基材和透明塑料基從的一側(cè)提供了氧化銦錫透明電極基材基材基材的電極。
可以按照現(xiàn)有的方法執(zhí)行以在基材的一側(cè)提供電極，例如提到了使用現(xiàn)有程序的一種方法，其中上述的金屬被加熱或/和壓在將被結(jié)合的無機絕緣基材上。此外，除了上述的方法之外，真空鍍膜方法、噴鍍方法、離子注射方法、電鍍法等也被提及。
對于被用來在電極表面形成單層的在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物來說，提及了例如由下面的通式(1)代表的硫醇化合物R1(CH2)n-SH(1)(其中的符號具有前面定義的同樣的意義)?；衔?1)的優(yōu)選的例子包括了那些化合物，其中代表陰離子官能團的R1是羧酸、磷酸、磺酸或膦酸，n是1到40，優(yōu)選為7到18。
此外，為了代替硫醇化合物(1)，也可以使用由下面的通式(1A)或(1B)代表的二硫化物或硫化物R1(CH2)n-S-S-(CH2)m-R1(1A)R1(CH2)n-S-(CH2)m-R1(1B)(其中R1和n具有上面定義的同樣意義，m代表1到40的整數(shù))。盡管二硫化物或硫化物可以是對稱型或非對稱型的，優(yōu)選的為對稱型的，因為可以形成均勻的單層。
優(yōu)選化合物(1)或其二硫化物或硫化物的具體的例子包括例如11-巰基-十一烷酸、8-巰基-辛酸和15-巰基棕櫚酸、10-羧基癸基二硫化物等。
此外，對于被用來在電極表面形成單層的在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物來說，示例了例如由下面的通式(2)代表的硫醇化合物R2(CH2)n-SH(2)(其中R2代表了陽離子官能團，n具有上面定義的同樣意義)。對于R2代表的陽離子官能團而言，示例的為例如氨基基團；n是1到40的整數(shù)，優(yōu)選為7到18。
此外，為了代替硫醇化合物(2)，也可以使用由下面的通式(2A)或(2B)代表的二硫化物或硫化物R2(CH2)n-S-S-(CH2)m-R2(2A)R2(CH2)n-S-(CH2)m-R2(2B)(其中R2和n具有上面定義的同樣意義，m代表1到40的整數(shù))。盡管二硫化物或硫化物可以是對稱型或非對稱型的，優(yōu)選使用對稱型的，因為它可以形成均勻的單層。
優(yōu)選化合物(2)或其二硫化物或硫化物的具體的例子優(yōu)選包括例如11-氨基-1-十一烷硫醇等。
對于被用來在電極表面形成單層的在末端具有陽離子官能團的硅烷化劑來說，示例了例如由下面的通式(3)代表的硅烷化合物R2(CH2)p-Si(OR)3(3)(其中R2具有上面定義的同樣的意義，p代表1到40的整數(shù)，OR代表烷氧基團)。對于R2代表的陽離子官能團而言，提及了例如氨基基團。p被提及是1到40的整數(shù)，優(yōu)選為7到18，OR被提及是具有碳原子數(shù)為1到6、優(yōu)選為1到3的低級烷氧基團。
可以執(zhí)行常規(guī)的方法以在電極表面形成單層。例如，將電極基材浸泡在硫醇化合物(通式1或2)、它的二硫化物(通式1A或2A)、硫化物(通式1B或2B)或硅烷化劑(3)的溶液中，從而在電極上形成具有高密度和高方向性的單層。
當(dāng)在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物(1)或其二硫化物或硫化物(1A或1B)被用作硫醇化合物時，具有上面提到的陽離子表面的電極(a1)是通過在這些化合物的單層表面上吸附陽離子聚合物而獲得的。
本文使用的“陽離子聚合物”可以是通過與在電極表面上形成的單層之間的靜電相互作用(例如離子鍵)而吸附到單層的表面上的陽離子聚合物。這樣的陽離子聚合物的例子包括聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙縮醛化的聚乙烯醇、在側(cè)鏈末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物(例如聚(N，N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸)等)、酸處理的明膠、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸、多聚精氨酸、魚精蛋白、殼聚糖、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和聚酰胺基氨類枝狀聚合物(陽離子性枝狀聚合物)等。其中聚乙烯亞胺和聚烯丙胺是特別優(yōu)選的。
陽離子聚合物的平均分子量是500到5000000，優(yōu)選為600到100000。例如，在聚乙烯亞胺的情況下，其平均分子量優(yōu)選為200到25000，特別優(yōu)選的是500到10000。此外，在聚烯丙胺的情況下，其平均分子量優(yōu)選為500到150000，特別優(yōu)選的是1000到70000。
陽離子聚合物吸附到單層的表面可以通過將陽離子聚合物溶液帶到單層表面上來執(zhí)行。例如，它可以優(yōu)選通過將陽離子聚合物溶解在適當(dāng)緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)中形成的溶液加入到單層的表面上并將其保留在室溫下來執(zhí)行。對陽離子聚合物的濃度沒有特別的限制，但是優(yōu)選為0.1％到10％。因此，單層和陽離子聚合物通過離子相互作用吸附，并提供了具有上述的陽離子表面的電極(a1)。
當(dāng)在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物(2)或其二硫化物或硫化物被用作硫醇化合物時，或當(dāng)在末端具有陽離子官能團的硅烷化劑(3)被用作硅烷化劑時，陰離子聚合物首先被吸附到這些化合物的單層表面上。
本文使用的“陰離子聚合物”可以是通過與在電極表面上形成的單層之間的靜電相互作用(例如離子鍵)而吸附到單層的表面上的陰離子聚合物。這樣的陰離子聚合物的例子包括合成的聚合物例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸，以及天然的聚合物例如褐藻酸(arginic acid)、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素和堿處理的明膠。
陰離子聚合物吸附到單層的表面可以通過將陰離子聚合物溶液帶到并與單層表面相接觸來執(zhí)行。例如，它可以優(yōu)選通過將陰離子聚合物溶解在適當(dāng)緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液)中形成的溶液加入到單層的表面上并將其保留在室溫下來執(zhí)行。
然后，具有上面提到的陽離子表面的電極(a2)通過將陽離子聚合物吸附到被吸附的陰離子聚合物的表面上而獲得。對于本文使用的陽離子聚合物來說，可以使用與上述的那些相同的陽離子聚合物，吸附也可以以與上述相同的方式來進行。
此外，例如當(dāng)上述的透明電極如氧化銦錫和氧化銦被用作電極時，在電極表面吸附了陽離子聚合物的上述具有陽離子表面的電極(a3)可以通過用陽離子聚合物處理電極基材的表面而獲得。對于這里所用的陽離子聚合物而言，可以使用與上述相同的陽離子聚合物，用陽離子聚合物的處理可以優(yōu)選通過將陽離子聚合物溶液加入到電極基材的表面上并將其保留在室溫下來執(zhí)行。
(將核酸裝載于具有陽離子表面的電極上)裝載有核酸的電極是通過將核酸裝載于如上述提供的電極的陽離子表面上而獲得的。
本發(fā)明中使用的“核酸”可以是多核苷酸或寡核苷酸，可以是DNA或RNA。DNA可以是質(zhì)粒DNA、cDNA、基因組DNA或合成的DNA?！昂怂帷卑―NA衍生物和RNA衍生物。衍生物是指具有硫代磷酸酯鍵的核酸或在核苷酸間的磷酸部分、糖基部分和堿基部分進行了化學(xué)修飾以防止酶降解的核酸。
“核酸”包括了編碼具有生物學(xué)活性能夠有效治療或改善疾病癥狀的蛋白的質(zhì)粒DNA、編碼能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)有效阻止、治療或改善疾病癥狀的蛋白的質(zhì)粒DNA、以及這些DNA的一部分。
核酸也包括反義核酸。“反義核酸”是與特定的mRNA分子的至少一部分互補、通過被導(dǎo)入細胞而與相應(yīng)的mRNA雜交、從而形成雙鏈分子的DNA分子或RNA分子。因為細胞不翻譯雙鏈mRNA，反義核酸干擾了RNA的翻譯?！昂怂帷边€包括siRNA(刺激RNA干擾的小干擾RNA)。此外，“核酸”包括了用于反義核酸和siRNA的表達載體。
當(dāng)核酸是編碼蛋白的質(zhì)粒DNA時，優(yōu)選的質(zhì)粒被構(gòu)建成能夠在核酸導(dǎo)入細胞后在細胞中表達遺傳密碼，它含有表達目的基因所需的片段例如啟動子。此外，當(dāng)需要證實目的基因是否被導(dǎo)入到細胞中時，除了目的基因之外可能還需要在DNA中包含報告基因。
對“核酸”的大小沒有特別的限制，但是一般來說它是10bp到200kbp，優(yōu)選為15bp到100kbp。
將核酸裝載于電極的陽離子表面可以通過將核酸溶液與電極的陽離子表面接觸來進行，例如，可以優(yōu)選通過將核酸溶解在適當(dāng)?shù)木彌_液(例如磷酸鹽緩沖液)中形成的溶液加入到電極的陽離子表面上并在室溫放置來進行。未吸附的核酸可以通過用適當(dāng)?shù)木彌_液(例如磷酸鹽緩沖液)淋洗電極表面來除去。因此獲得了裝載有核酸的電極基材。
此外，裝載有核酸的電極可以通過將核酸和陽離子聚合物按照核酸、陽離子聚合物和核酸的次序交替吸附在電極的陽離子表面上來獲得。這里，所執(zhí)行的核酸和陽離子聚合物的交替吸附可以以與上述相同的方式來進行。
步驟B本步驟是一個將細胞附著于前面獲得的裝載有核酸的電極的表面上的步驟。
本發(fā)明中使用的“細胞”可以是來自生物體的任何細胞，只要它具有粘附性就行，例如，可以是任意種類(例如細菌、酵母)或多細胞生物(例如動物如脊椎動物、無脊椎動物)、植物(例如單子葉植物、雙子葉植物)等。例如，可以使用來自脊椎動物(例如盲鰻、七鰓鰻、軟骨魚(chondrichtian)、硬骨魚綱、兩棲動物、爬行動物、鳥綱、哺乳動物等)的細胞。更具體來說，可以使用來自哺乳動物(例如單孔類動物、有袋動物、貧齒目動物、皮翼目動物、翼手目動物、食肉目動物、食蟲目動物、長鼻類動物、奇蹄目動物、偶蹄目動物、管齒目動物、鱗甲目、海牛目動物、鯨目動物、靈長目動物等)的細胞。在一個實施方案中，使用了來自靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴和人類)的細胞，特別是來自人類的細胞。人類來源細胞的具體例子包括例如人類來源的已建立的細胞株例如人類宮頸癌細胞(HeLa)；人類來源的原代培養(yǎng)細胞例如人類胎腎細胞、人類臍帶靜脈血管壁內(nèi)皮細胞、人類血管壁內(nèi)皮細胞、人類動脈平滑肌細胞、人類肝細胞、人類成纖維細胞、人類角膜上皮細胞和人類角膜內(nèi)皮細胞；來自人的干細胞例如間質(zhì)干細胞、胚胎干細胞和神經(jīng)干細胞。
將細胞附著于裝載有核酸的電極表面的方法沒有特別的限制，例如可以通過在電極上加入細胞懸浮液來進行，或?qū)⒓毎麘腋∮谶m當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，將獲得的細胞懸浮液滴加電極上，在對細胞適合的條件下溫育。但是，從細胞種群的轉(zhuǎn)染效率和對轉(zhuǎn)染位點的限制的視角來看優(yōu)選的是在裝載有核酸的電極上進行細胞的培養(yǎng)。通過培養(yǎng)細胞，它們附著在電極表面并繁殖。在優(yōu)選情況下未附著的細胞在施加電脈沖前應(yīng)該除去。未附著細胞的除去可以通過例如用適當(dāng)?shù)木彌_液更換培養(yǎng)基來進行。
步驟C對細胞施加電脈沖可以通過放置其上附著了細胞的裝載有核酸的電極(稱為第一電極)、面對第一電極上的細胞提供對電極(稱為第二電極)、然后使用電穿孔儀在第一和第二電極之間產(chǎn)生電脈沖來進行。這時，盡管可以使用交流電或直流電來產(chǎn)生電脈沖，一般來說優(yōu)選通過直流電產(chǎn)生電脈沖。
當(dāng)用直流電產(chǎn)生電脈沖時裝載有核酸的第一電極被用作陰極(-)，第二電極被設(shè)為陽極(+)，或與此相反。優(yōu)選情況下第一電極被設(shè)為陰極(-)，第二電極被設(shè)為陽極(+)。對第二電極的材料沒有特別的限制，只要它是導(dǎo)電的就行，但是包括金屬例如金、鉑、銅、鋁、不銹鋼、鎢、鈦、鈷-鉻合金、鈷-鉻-鉬合金(活合金(vitallium))、或透明的電極材料例如ITO(氧化銦錫)和氧化銦。
至于電脈沖的條件，電場強度、電脈沖的時間長短、施加的脈沖的數(shù)量等可以依賴電極材料、細胞、導(dǎo)入的核酸、基材上的陽離子聚合物等的種類來進行適當(dāng)?shù)倪x擇。通常來說，電場強度是10到500V/cm，優(yōu)選為25到300V/cm，電脈沖的時間長度是1到99毫秒，優(yōu)選為1到50毫秒，施加的脈沖的數(shù)量是1到99，優(yōu)選為1到5，但是它們不受限于此。
對施加電脈沖的時間沒有特別的限制，可以被適當(dāng)?shù)剡x擇。也就是說，在細胞被接種于裝載有核酸的電極、溫育并附著于基材后，通常不應(yīng)該馬上施加電脈沖，但是可以在任何時間施加，只要這個時間在細胞接種后大約4到5天之內(nèi)就行。通過施加電脈沖，核酸被有效地導(dǎo)入到細胞中。
圖1顯示了一套帶有裝載有核酸的電極的電脈沖裝置，用于執(zhí)行上面提到的本發(fā)明的方法。本發(fā)明的詳細情況使用附圖來說明。例如，金薄膜電極(E)形成在玻璃基材的表面上。核酸-陽離子聚合物復(fù)合層(D)形成在電極上，細胞(C)附著于層的表面上。此外，細胞被例如硅酮間隔物(G)分隔開，孔中充滿電穿孔緩沖液(B)。作為對電極的金電極(F)被放置在硅酮間隔物(G)上，與帶有細胞的底部電極(E)平行。第一電極(E)和第二電極(F)被連接到電穿孔儀(A)上，它能產(chǎn)生電脈沖(A)。在本實施例中，第一電極(E)和第二電極(F)之間的距離被設(shè)置為2mm，孔的面積被設(shè)定為13×13mm2。至于電脈沖的極性，第一電極(E)被設(shè)置為陰極(-)，第二電極(F)被設(shè)置為陽極(+)。通過用電穿孔儀(A)產(chǎn)生電脈沖將核酸(DNA)導(dǎo)入細胞(C)。
作為本發(fā)明的另一方面，上述的核酸導(dǎo)入方法可以使用具有微型圖案表面的基材來進行。微型圖案的制作可以通過已知的方法來進行。具有微型圖案的含有核酸的電極可以通過用適當(dāng)?shù)姆椒ǚ指綦姌O的陽離子表面、將多種核酸分別裝載到各部分來制備。此外，電極基材的表面用有機硅烷化合物(例如十八烷基三乙氧基甲硅烷)或烷基硫醇來處理以形成它們自我裝配的單層，覆蓋上光學(xué)屏蔽物，用紫外光照射以分解自我裝配的單層，從而獲得具有微型圖案的電極基材；從而可以使用基材來排列核酸。因此，當(dāng)使用上述的具有微型圖案的裝載有核酸的電極執(zhí)行本發(fā)明時，核酸導(dǎo)入的位點可以被限定。
在下面通過實施例將對本發(fā)明進行進一步解釋，但是應(yīng)該解釋的是本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實施例的限制。
實施例1制備具有陽離子表面的電極用于靜電吸附DNA。首先在一個玻璃板上形成在末端具有羧基基團的硫醇化合物(11-巰基十一烷酸，由Sigma-Aldrich Co.生產(chǎn))單層，玻璃板在一側(cè)沉積有金薄膜。在單層上加入含有聚乙烯亞胺的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)，聚乙烯亞胺的平均分子量為800(在以后稱為PEI800，Aldrich Co.，Ltd.生產(chǎn))，濃度為1％，在室溫放置30分鐘。獲得的基材表面用水充分清洗，在氮氣下干燥，以獲得具有陽離子表面的金電極。
然后，將用乙醇消毒的硅酮間隔物(內(nèi)部面積1.3×1.3cm2，高度2mm)固定到前面獲得的金電極的陽離子表面上。然后，含有0.05mg/ml編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA(pEGFP-C1由Clontech Laboratories Inc.生產(chǎn))的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)加入到硅酮間隔物中金電極的陽離子表面，在室溫放置2小時以便將DNA靜電吸附到表面上。用磷酸鹽緩沖液充分清洗表面以除去沒有吸附的DNA，從而獲得裝載有DNA的金電極基材。
來自人類胚胎腎臟的細胞(HEK293從人類科學(xué)基金會獲得)被懸浮在含有血清的培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基成分最低基本培養(yǎng)基(MEM)(GibcoLife Technology)、10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素)，將懸浮液鋪在裝載有DNA的金電極的表面上。細胞在37℃和5％CO2環(huán)境下溫育以附著到電極表面。24小時后，用4℃的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)代替培養(yǎng)基以除去沒有附著的細胞，再在表面上加入新鮮的磷酸鹽緩沖液。然后，將一側(cè)沉積有金薄膜的玻璃基材固定在硅酮間隔物上作為第二電極。它們的排列顯示在圖1中。
然后，裝載有DNA的金電極被設(shè)置為陰極(-)，第二電極被設(shè)置為陽極(+)。它們被連接到高壓脈沖產(chǎn)生裝置(Electrosquarereportor T820，由Genetronics Inc.的BTX分部制造)上并施加電脈沖，條件為電場強度75V/cm，脈沖時間10毫秒，執(zhí)行電穿孔施加的脈沖數(shù)為1。在施加脈沖后，將細胞在室溫保溫5分鐘，然后用事先在37℃保溫的含血清培養(yǎng)基替換磷酸鹽緩沖液，在37℃和5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)細胞。
在電穿孔48小時后分析導(dǎo)入的基因的瞬時表達。在熒光顯微鏡下計數(shù)由于表達了綠色熒光蛋白(EGFP)而發(fā)射綠色熒光的細胞，轉(zhuǎn)染效率被定為總細胞數(shù)中EGFP陽性細胞的數(shù)量。
圖2顯示了HEK293細胞在電穿孔48小時后的相差顯微照片(A)和熒光顯微照片(B)。從照片中可以看出，電極表面的細胞表達了EGFP，沒有可察覺的損傷。EGFP陽性細胞的百分?jǐn)?shù)、即轉(zhuǎn)染效率是80％。這個結(jié)果清楚地表明本發(fā)明的方法是允許有效地導(dǎo)入基因的方法。
實施例2采用與實施例1相似的方式，將HEK293細胞接種在裝載了DNA的金電極上以便附著。然后對細胞施加電脈沖以進行電穿孔。這時，電脈沖的電壓被改變并研究了電場強度對轉(zhuǎn)染效率的影響。此外，除了電壓之外的施加脈沖的條件與實施例1相同(脈沖時間10毫秒，脈沖次數(shù)1次)。轉(zhuǎn)染效率被評估為施加電脈沖48小時后的EGFP陽性細胞百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示在圖3中。此外，電場強度對細胞存活率的影響被同時研究。細胞存活率通過錐蟲藍染料排斥方法來評估，其中細胞在施加電脈沖后3小時用錐蟲藍處理并回收細胞。也就是說沒有被錐蟲藍染色的細胞數(shù)量(活細胞數(shù))被確定，然后按照下面的公式計算存活率。結(jié)果顯示在圖4中。
(公式1) 如圖3所示，當(dāng)沒有施加電脈沖時，EGFP完全不表達。相反，在電脈沖過的細胞中觀察到了轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染效率通過下面的公式計算，使用了從亮視野顯微鏡圖象確定的附著的細胞數(shù)和從熒光顯微鏡圖象確定的表達熒光蛋白的細胞數(shù)。
(公式2) 在電場強度為75V/cm時轉(zhuǎn)染效率最高。當(dāng)施加200V/cm或以上的電脈沖時，轉(zhuǎn)染效率顯著降低。此外，如圖4所示，對于通過錐蟲藍染料排斥方法來估計的施加電脈沖后的細胞存活率來說，當(dāng)電場強度是100V/cm或以下時細胞存活率高。在150V/cm或以上時，施加電脈沖后許多細胞脫離并死亡。還觀察到保留在電極上的細胞受到明顯損傷。沒有脈沖時觀察不到轉(zhuǎn)染這個結(jié)果說明電脈沖使DNA從電極表面釋放，釋放的DNA通過由電脈沖導(dǎo)致的不穩(wěn)定的細胞膜或由脈沖在細胞膜上形成的微孔被導(dǎo)入到細胞中。
實施例3采用與實施例1相似的方式，將HEK293細胞接種并附著在裝載了DNA的金電極上。然后施加電脈沖(電場強度75V/cm，脈沖時間10毫秒，脈沖數(shù)為1)以進行電穿孔。在裝載有核酸的的電極的制備中，具有不同分子量的陽離子聚合物被裝載，以研究陽離子聚合物的分子量對轉(zhuǎn)染效率的影響。作為陽離子聚合物，使用了分子量為800、25000和750000的聚乙烯亞胺(被稱為PEI800、PEI25000和PEI750000，它們都是由Aldrich Co.生產(chǎn)的)和分子量為15000和70000的聚烯丙胺鹽酸(稱為PAA15000和PAA70000，它們都是由Aldrich Co.生產(chǎn)的)。
圖5顯示了轉(zhuǎn)染效率與聚乙烯亞胺和聚烯丙胺的分子量之間的關(guān)系。從圖中可以看出，隨著聚乙烯亞胺分子量的增加轉(zhuǎn)染效率降低了。圖6顯示了裝載于這些表面上的DNA的量。此外，在施加電脈沖(電場強度75V/cm，脈沖時間10毫秒，脈沖數(shù)為1)后，從表面上釋放的DNA的量通過用PicoGreen測量上清液中含有的DNA的量來估計。結(jié)果顯示在圖7中。從這些圖中可以明顯看出，當(dāng)陽離子聚合物的分子量變高時裝載的DNA的量增加，但是在施加電脈沖后從表面釋放的DNA的量，當(dāng)陽離子聚合物具有較高分子量時比具有較低分子量時少。盡管在用低分子量聚乙烯亞胺(PEI 800)制備的表面上裝載的DNA的量少，在施加電脈沖后有大約30％裝載的DNA被釋放。
圖8顯示了用不同陽離子聚合物制備的表面上的轉(zhuǎn)染效率與施加脈沖后釋放的DNA量之間的關(guān)系。從圖中可以明顯看出，觀察到在轉(zhuǎn)染效率和釋放的DNA的量之間的正相關(guān)。結(jié)果表明在本發(fā)明中轉(zhuǎn)染效率強烈地依賴于從電極表面釋放的DNA的量。
實施例4采用與實施例1相似的方式，將HEK293細胞接種并附著在裝載了DNA的金電極基材上，然后對細胞施加電脈沖以進行電穿孔。在本實驗中，施加電脈沖前的培養(yǎng)時間被改變以研究培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)染效率的影響。
圖9顯示了在細胞接種后24、48和72小時時施加電脈沖48小時后細胞的相差顯微照片。從圖中可以看出，在電脈沖之前培養(yǎng)了24、48和72小時的細胞中基因被有效地表達。此外，圖10顯示了電脈沖前的培養(yǎng)時間與轉(zhuǎn)染效率(％)之間的關(guān)系。結(jié)果表明，細胞在電脈沖前培養(yǎng)了12、24、48和72小時任何一種情況下都能夠達到有效的轉(zhuǎn)染，因此可以在所需的時間將基因?qū)氲礁街募毎小?br> 實施例5(原代細胞的實驗驗證)從大鼠胚胎腦中收集海馬以獲得神經(jīng)細胞。采用與實施例1相似的方式將編碼EGFP或紅色熒光蛋白(DsRed)的質(zhì)粒DNA導(dǎo)入原代神經(jīng)細胞。
也就是說，采用與實施例1相同的方式，編碼綠色熒光蛋白(EGFP)和紅色熒光蛋白(DsRed)的質(zhì)粒DNA(pEGFP和pDsRed由ClontechLaboratories Inc.生產(chǎn))被裝載到金電極的陽離子表面上(陽離子聚合物PEI 800)，原代神經(jīng)細胞在表面上培養(yǎng)3天，施加電脈沖(125V/cm，10毫秒，單次脈沖)。被導(dǎo)入的基因的瞬時表達分析在施加電脈沖后48小時時進行。
(結(jié)果)圖11顯示了海馬神經(jīng)元在電脈沖48小時后的相差顯微照片(左相差)和熒光顯微照片(中EGFP，右DsRed)。從相差照片中可以看出在電穿孔后細胞沒有可以注意到的損傷。此外，從中間(EGFP)和右邊(DsRed)的顯微照片可以看出pEGFP和pDsRed都被導(dǎo)入到細胞中，被這些質(zhì)粒編碼的熒光蛋白EGFP和DsRed得到了表達。這些結(jié)果顯示多個基因可以通過本方法有效地導(dǎo)入到原代培養(yǎng)細胞中。
當(dāng)采用與HEK293細胞的情況相似的方式測定時，對海馬神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染效率是20％。當(dāng)通過常規(guī)的脂轉(zhuǎn)染方法(參考下面描述的對比實施例1)和電穿孔方法(參考下面描述的參比實施例2)將pEGFP和pDsRed導(dǎo)入原代神經(jīng)細胞作為對比時，轉(zhuǎn)染效率是10％到20％，在這些方法和本發(fā)明之間沒有觀察到明顯的區(qū)別。但是在常規(guī)的方法中觀察到極大程度的細胞損傷，許多細胞死亡了。死亡細胞百分率達到20％到30％。另一方面，使用本發(fā)明的基因?qū)敕椒ㄍ耆珱]有觀察到細胞損傷。
(對比實施例1)收集的海馬神經(jīng)元被接種到用聚L-賴氨酸包被的24孔板中至70％到80％滿底，使用Lipofectamine 2000(由Invitrogene Inc.生產(chǎn))進行基因?qū)?。使?μg質(zhì)粒DNA和2μl Lipofectamine 2000。Lipofection2000和DNA分別用50μl Opti-MEM(無血清培養(yǎng)基)稀釋。這些溶液被混合，在室溫保溫20分鐘，然后將溶液加入到細胞中以進行脂轉(zhuǎn)染。在脂轉(zhuǎn)染48小時后使用熒光顯微鏡分析EGFP的表達。如上所述，轉(zhuǎn)染效率是10％到20％。
(對比實施例2)海馬神經(jīng)元用PBS清洗，懸浮在PBS中使?jié)舛葹?×106細胞/ml。在懸浮液(200μl)中加入15μg質(zhì)粒DNA(pEGFP)，然后混合。將懸浮液注射到電穿孔杯中，在冰上放置10分鐘。然后進行電穿孔，條件為電場強度625V/cm(電極間的距離4mm)、脈沖時間10毫秒、脈沖數(shù)1。在脈沖后，將懸浮液保留在杯中，在室溫放置10分鐘，然后接種于60mm的PLL包被的細胞培養(yǎng)皿。電穿孔48小時后，使用熒光顯微鏡分析EGFP的表達。如上所述，轉(zhuǎn)染效率是10％到20％。
實施例6在以與實施例1中相似的方式制備的電極的陽離子表面上，將兩種質(zhì)粒(pEGFP或pDsRed)分別裝載在小的區(qū)域(直徑5mm)內(nèi)。采用與實施例1相似的方式，將HEK293細胞附著并生長在裝載了DNA的金電極上，在細胞接種后24小時移除未附著的細胞，然后施加電脈沖(75V/cm，10毫秒，脈沖數(shù)1)。
圖12顯示了電脈沖48小時后HEK293細胞的相差顯微照片(左)和熒光顯微照片(右)。照片在低放大倍數(shù)下獲得以便觀察電極上的較大區(qū)域(大約1.5×1.5cm2)?？梢钥吹郊毎鶆虻馗街诫姌O表面上。此外，獲得了裝載pEGFP和pDsRed的區(qū)域的熒光照片。這些照片被合并并顯示在右圖中。可以看出，在裝載了相應(yīng)基因的區(qū)域觀察到了來自EGFP和DsRed的熒光。這些結(jié)果表明本發(fā)明的方法允許在限定的位點進行導(dǎo)入。
實施例7使用等離子體發(fā)生器(型號PA300AT，Okuma Engineering Co.生產(chǎn))用氧等離子體(輸出功率30W，壓力5Pa)在室溫處理一側(cè)沉積有氧化銦錫(在以后稱為ITO)的玻璃基材5分鐘，以便從表面除去雜質(zhì)。
然后在ITO表面上加入含有聚乙烯亞胺的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)，聚乙烯亞胺的平均分子量為800(在以后稱為PEI800，AldrichCo.，Ltd.生產(chǎn))，濃度為1％，在室溫放置30分鐘。ITO表面用水充分清洗，在氮氣下干燥，以獲得具有陽離子表面的ITO。然后，將用乙醇消毒的硅酮框架(內(nèi)部面積1.3×1.3cm2，高度1mm)固定到前面獲得的ITO電極的陽離子表面上。然后，含有0.05mg/ml編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA(pEGFP-Cl由Clontech Laboratories Inc.生產(chǎn))的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)加入到硅酮框架中ITO電極的陽離子表面，在室溫放置30分鐘以便將DNA靜電吸附到ITO表面上。然后用磷酸鹽緩沖液充分清洗表面以除去沒有吸附的DNA。然后，將PEI 800和DNA以相似的方式交替吸附，然后用磷酸鹽緩沖液充分清洗表面，從而獲得含有DNA的透明電極基材。
接下來，未處理的ITO電極的交替吸附循環(huán)數(shù)被引用為零，每個吸附PEI和DNA的步驟被計算為1個循環(huán)。也就是說，具有PEI800-DNA-PEI800的表面的交替吸附循環(huán)被表示為3。其上交替吸附了PEI800和DNA的ITO表面的原子組成通過X-射線光電子能譜(XPS)來確定。結(jié)果顯示在表1中。

所得有機發(fā)光器件在10mA/cm2正向電流密度下顯示3.57V驅(qū)動電壓。另外，基于1931 CIE彩色坐標(biāo)觀察到x＝3.94，y＝0.56處的特定Alq3綠光譜。器件在上述驅(qū)動電壓下的該發(fā)光行為表明，置于發(fā)光層與陰極之間的層內(nèi)所含的通式1-1化合物可起電子注入/傳輸材料作用。
對比例1除采用真空沉積法將用于電子注入和傳輸?shù)某Ｒ?guī)化合物Alq3替換通式1-1化合物以200厚度涂覆于發(fā)光層上用以形成電子注入/傳輸層之外，重復(fù)實施例1從而制得有機發(fā)光器件。
所得有機發(fā)光器件在10mA/cm2正向電流密度下顯示4.12V驅(qū)動電壓。另外，基于1931 CIE彩色坐標(biāo)觀察到x＝0.34，y＝0.56處的特定Alq3綠光譜。
如下表1顯示了對于實施例1和對比例1所得有機發(fā)光器件，其依賴于電流的驅(qū)動電壓變化結(jié)果。
表1

從表1可看出，采用通式1-1化合物形成用于有機發(fā)光器件的電子注入/傳輸層時，與采用起電子注入/傳輸層作用的常規(guī)材料Alq3的有機面的接觸角度比后面的吸附PEI800的表面的接觸角度小?？赡艿谝粚覲EI800沒有完全地覆蓋ITO表面，基本材料的基底ITO表面被部分暴露。
實施例8在按照實施例7制備的裝載有DNA的ITO電極上進行細胞的電穿孔。首先，人類胚胎腎細胞(HEK293從人類科學(xué)基金會獲得)被懸浮在含有血清的培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基成分最低基本培養(yǎng)基(MEM)(GibcoLife Technology)、10％胎牛血清、100單位/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素)，將懸浮液加入到含有DNA的透明電極(層數(shù)＝5，基底材料為聚對苯二甲酸乙二酯(PET))的表面上。細胞在37℃和5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)以吸附到電極表面。24小時后，用4℃的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)代替培養(yǎng)基以除去沒有附著的細胞。用磷酸鹽緩沖液充滿硅酮框架的孔，然后將一側(cè)沉積有金薄膜的玻璃板放置在硅酮框架上作為第二電極。它們的排列顯示在圖1中(在本實施例中假設(shè)符號E是ITO電極)。
然后，裝載有DNA的ITO電極被設(shè)置為陰極(-)，上部的金電極被設(shè)置為陽極(+)。它們被連接到高壓脈沖產(chǎn)生裝置上(Electrosquarereportor T820，由Genetronics Inc.的BTX分部制造)并施加電脈沖，條件為電場強度250V/cm，脈沖時間10毫秒，脈沖數(shù)為1，從而進行電穿孔。在施加脈沖后，將細胞在室溫保溫5分鐘。然后用事先在37℃保溫的含血清培養(yǎng)基替換孔中的磷酸鹽緩沖液，在37℃和5％CO2環(huán)境下培養(yǎng)細胞。
在電穿孔48小時后分析導(dǎo)入的基因的瞬時表達。在熒光顯微鏡下計數(shù)由于表達了綠色熒光蛋白(EGFP)而發(fā)射綠色熒光的細胞，轉(zhuǎn)染效率被定為總細胞數(shù)中EGFP陽性細胞的數(shù)量。
圖16顯示了HEK293細胞在電穿孔48小時后的相差顯微照片(A)和熒光顯微照片(B)。從圖中可以看出，全部細胞中有大約70％表達了EGFP。這個結(jié)果清楚地顯示本發(fā)明的方法允許有效地導(dǎo)入基因。此外，在使用熒光和相差顯微鏡觀察細胞時獲得了具有高分辨率的明亮的圖像(當(dāng)玻璃被用作基底材料時)。這強調(diào)了通過使用透明電極可以更好地進行細胞的觀察。
實施例9按照實施例8相似的方式，將HEK293細胞接種在裝載有DNA的透明電極上并附著，然后施加電脈沖以進行電穿孔。改變電脈沖的電壓以研究電場強度對轉(zhuǎn)染效率的影響。除了電壓之外施加脈沖的條件與實施例8中相同(脈沖時間10毫秒，脈沖次數(shù)1次)。轉(zhuǎn)染效率被評估為施加電脈沖48小時后EGFP陽性細胞的百分?jǐn)?shù)。此外，同時研究了電場強度對細胞存活率的影響。細胞存活率通過錐蟲藍染料排斥方法來評估，其中細胞在施加電脈沖48小時后用錐蟲藍處理并收獲。也就是說沒有被錐蟲藍染色的活細胞數(shù)被確定，并計算它在沒有施加電脈沖時獲得的活細胞數(shù)(對照)中占的比例。使用下面的公式計算細胞存活率。
(公式3) 結(jié)果顯示在圖17中。如圖17所示，當(dāng)沒有施加脈沖時沒有EGFP表達。另一方面，經(jīng)過電脈沖的細胞中表達了EGFP。轉(zhuǎn)染效率按照下面的公式計算，使用了用錐蟲藍染料排斥方法確定的電極上的總活細胞數(shù)和通過熒光圖像確定的表達熒光蛋白的細胞數(shù)。
(公式4) 隨著電場強度的增加轉(zhuǎn)染效率線性增加。當(dāng)施加300V/cm或以上的電脈沖時，轉(zhuǎn)染效率達到平臺水平(大約80％)。另一方面，在電場強度為250V/cm或以下時在施加電脈沖后細胞存活率保持較高。在300V/cm或以上時，施加電脈沖后許多細胞脫離并死亡。不施加脈沖時觀察不到轉(zhuǎn)染，這個結(jié)果表明施加電脈沖后DNA從電極上釋放，以及對細胞膜去穩(wěn)定化以產(chǎn)生微孔，這兩種機制同時發(fā)生增進了DNA向細胞內(nèi)的導(dǎo)入。
實施例10按照實施例8相似的方式，將HEK293細胞接種在裝載有DNA的ITO電極(吸附循環(huán)數(shù)＝5，基底材料為PET)上并附著，然后施加電脈沖(電場強度250V/cm，脈沖時間10毫秒，脈沖次數(shù)1次)以進行電穿孔。在本實施例中，改變了PEI 800和DNA的吸附循環(huán)數(shù)以研究循環(huán)數(shù)對轉(zhuǎn)染效率的影響。
圖18顯示了轉(zhuǎn)染效率與循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系。從圖中可以看出，較大的吸附循環(huán)數(shù)能夠?qū)е赂行У霓D(zhuǎn)染，同時保持了細胞存活率。圖19顯示了經(jīng)過不同的吸附循環(huán)數(shù)后表面上裝載的DNA的量?？梢钥闯鲅b載的DNA的量隨著吸附循環(huán)數(shù)的增加而增加。
在施加電脈沖(電場強度200-300V/cm，脈沖時間10毫秒，脈沖數(shù)為1)后，從表面上釋放的DNA的量通過用PicoGreen(由Molecular ProbeInc.生產(chǎn))測量上清液中含有的DNA的量來估計。圖20顯示了對不同樣品測定的脈沖后的轉(zhuǎn)染效率與從這些表面釋放的DNA的量之間的關(guān)系?？梢钥闯?，釋放的DNA的量隨著吸附循環(huán)數(shù)的增加而增加。在施加電脈沖后有大約10％-30％裝載的DNA被釋放。從圖中可以明顯看出，轉(zhuǎn)染效率與釋放的DNA的量有正相關(guān)性。因此，這表明本發(fā)明中的轉(zhuǎn)染效率主要由從表面釋放的DNA的量來控制。
實施例11(原代細胞的實驗驗證)
從大鼠胚胎腦中制備海馬神經(jīng)元。采用與實施例8相似的方法用編碼EGFP或紅色熒光蛋白(DsRed)的質(zhì)粒DNA對原代神經(jīng)元進行細胞的電穿孔。
也就是說，采用與實施例8相似的方式，編碼綠色熒光蛋白(EGFP)和紅色熒光蛋白(DsRed)的質(zhì)粒DNA(pEGFP和pDsRed由ClontechLaboratories Inc.生產(chǎn))被裝載到透明ITO電極(吸附循環(huán)數(shù)＝5，電極ITO，基底材料為玻璃)的表面上，原代神經(jīng)元在表面上培養(yǎng)3天，然后施加電脈沖(200V/cm，10毫秒，單次脈沖)。EGFP和DsRed的瞬時表達分析在施加電脈沖48小時后進行。
(結(jié)果)圖21顯示了在電脈沖后48小時時的相差顯微照片(左相差)和熒光顯微照片(中EGFP，右DsRed)。從左邊的顯微照片中可以看出在電穿孔后沒有觀察到細胞的損傷。熒光顯微照片(圖21中中間和右邊的照片)顯示pEGFP和pDsRed都被導(dǎo)入到細胞中，熒光蛋白EGFP和DsRed在細胞中得到了表達。此外，這些圖表明不同的基因可以通過本方法有效地導(dǎo)入。該結(jié)果還表明在脈沖前細胞即使被溫育3天，電穿孔也可以被成功地執(zhí)行，表明本方法可以用于在細胞接種后有利的時間進行轉(zhuǎn)染。
實施例12(在ITO電極的表面安排核酸陣列，以及在陣列上電穿孔)ITO電極(基底材料為玻璃)的表面用氧等離子體處理來清潔。然后，將ITO電極浸泡在十八烷基三乙氧基硅烷(LS-6970，Shin-EtsuChemical Co.，Ltd.)的1％甲苯溶液中，在室溫放置2小時。在用甲苯和乙醇充分清洗后，將電極在80℃加熱12小時。然后，在電極表面放置其中鉻圖案沉積在玻璃基底上的光學(xué)屏蔽物，用紫外光在室溫照射圖案1小時。除去光學(xué)屏蔽物后，將基材用乙醇清洗以除去由紫外線照射而分解的有機硅烷層。結(jié)果獲得了有圖案的表面，其中含有疏水有機硅烷單層區(qū)域以及親水的ITO表面被暴露的孤立區(qū)域。PEI 800和質(zhì)粒DNA(pEGFP，pDsRed或二者的混合物)通過將這些溶液手工滴加到有圖案的ITO電極上的不同ITO斑點上(ITO被暴露的環(huán)形斑點，直徑1mm，10×10個斑點)而被交替吸附(吸附循環(huán)數(shù)＝5)。按照與實施例8相同的方式將HEK293細胞附著到裝載有DNA的陣列上，在細胞接種24小時后、移除未附著的細胞之后施加電脈沖(200V/cm，10毫秒，1次脈沖)。
圖22顯示了電脈沖48小時后的熒光顯微照片。照片在低放大倍數(shù)下獲得以便觀察陣列上的全部區(qū)域(大約1.7×7cm2)。對EGFP和DsRed分別進行記錄的熒光照片被合并并顯示在圖22中。在裝載了相應(yīng)質(zhì)粒的位點觀察到了熒光。此外，兩個基因被混合的位點上的細胞共表達了兩種蛋白。這些結(jié)果表明本發(fā)明可以提供限定轉(zhuǎn)染區(qū)域的方法。
工業(yè)實用性本發(fā)明的方法可用于有效地將基因?qū)爰毎灰鸺毎麚p傷。本方法還能夠使我們在限定的時間和位點轉(zhuǎn)染細胞。結(jié)果，本發(fā)明的導(dǎo)入核酸的方法可用于在細胞水平對基因和基因產(chǎn)物進行功能分析、促進細胞生物學(xué)、后基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)研究以及醫(yī)學(xué)護理的發(fā)展。
權(quán)利要求
1.一種通過電穿孔將核酸導(dǎo)入細胞的方法，包括步驟(A)將核酸裝載至電極的表面上；步驟(B)將細胞附著在獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(C)對附著的細胞施加電脈沖。
2.一種通過電穿孔將核酸導(dǎo)入細胞的方法，包括步驟(a)提供具有陽離子表面的電極；步驟(b)將核酸吸附并裝載至電極的陽離子表面上；步驟(c)將細胞附著在步驟(b)中獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(d)對細胞施加電脈沖。
3.權(quán)利要求2的方法，其中具有陽離子表面的電極是這樣的電極，其上有在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成的單層，以及陽離子聚合物吸附在單層的表面上。
4.權(quán)利要求2的方法，其中具有陽離子表面的電極是這樣的電極，其上有在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物或硅烷化劑形成的單層，陰離子聚合物吸附在單層的表面上，而陽離子聚合物進一步吸附在它的表面上。
5.權(quán)利要求2的方法，其中具有陽離子表面的電極是透明的電極，其上吸附了陽離子聚合物。
6.權(quán)利要求2的方法，其中步驟(b)是通過僅一次直接將核酸吸附在電極的陽離子表面上，或者將核酸和陽離子聚合物采用交替吸附方法按照核酸、陽離子聚合物和核酸的次序交替吸附在表面上來進行的。
7.權(quán)利要求3或4的方法，其中的電極是使用從鉑、金和鋁中選擇的金屬制成的。
8.權(quán)利要求3或4的方法，其中的電極基材是金電極基材。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的金電極是其上沉積有金的玻璃基材或透明塑料基材。
10.權(quán)利要求5的方法，其中的透明電極是其上沉積有氧化銦錫、氧化銦、摻有鋁的氧化鋅或摻有銻的氧化錫的玻璃基材或透明塑料基材。
11.權(quán)利要求5的方法，其中的透明電極是其上沉積有氧化銦錫的玻璃基材或透明塑料基材。
12.權(quán)利要求3的方法，其中在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物是通式(1)所示的硫醇化合物R1(CH2)n-SH(1)(其中R1代表陰離子官能團，n代表1-40之間的整數(shù))。
13.權(quán)利要求12的方法，其中的R1是從羧酸基團、磷酸基團、磺酸基團和膦酸基團中選擇的基團。
14.權(quán)利要求12的方法，其中由通式(1)代表的硫醇化合物是從11-巰基-十一烷酸、8-巰基-辛酸和15-巰基棕櫚酸中選擇的巰基烷酸。
15.權(quán)利要求3、4或5的方法，其中的陽離子聚合物是從聚乙烯亞胺、聚烯丙胺、聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、氨基乙縮醛化的聚乙烯醇、在側(cè)鏈末端具有伯胺到季胺的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物、酸處理的明膠、魚精蛋白、聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚精氨酸、殼聚糖、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖和聚酰胺型胺類枝狀聚合物中選擇的聚合物。
16.權(quán)利要求4的方法，其中在末端具有陽離子官能團的硫醇化合物是通式(2)所示的硫醇化合物R2(CH2)n-SH(2)(其中R2代表陽離子官能團，n代表1-40之間的整數(shù))。
17.權(quán)利要求16的方法，其中的R2是氨基基團。
18.權(quán)利要求1或2的方法，其中的核酸是DNA、RNA、反義核酸、siRNA或它們的表達載體。
19.權(quán)利要求1或2的方法，其中的核酸是編碼蛋白的DNA或其一部分。
20.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(B)是通過在裝載有核酸的電極上溫育細胞來進行的。
21.權(quán)利要求2的方法，其中的步驟(c)是通過在裝載有核酸的電極表面上溫育細胞來進行的。
22.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(C)是通過在其上附著了細胞的裝載有核酸的電極的對面提供對電極，然后在兩個電極之間產(chǎn)生電脈沖來進行的。
23.權(quán)利要求2的方法，其中步驟(d)是通過在附著了細胞的裝載有核酸的電極的對面提供對電極、然后在兩個電極之間產(chǎn)生電脈沖來進行的。
24.權(quán)利要求2的方法，其中具有陽離子表面的電極是具有微型圖案表面的電極。
25.具有陽離子表面的電極，其中在末端具有陰離子官能團的硫醇化合物、二硫化物或硫化物形成單層，以及陽離子聚合物吸附在單層的表面上。
26.具有陽離子表面的電極，其中由通式(1)所代表的硫醇化合物的單層形成在通過在玻璃基材上沉積金而制成的金電極基材的表面上，以及陽離子聚合物被吸附在單層的表面上R1(CH2)n-SH(1)(其中R1代表陰離子官能團，n代表1-40之間的整數(shù))。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過電穿孔將核酸導(dǎo)入細胞的方法，包括步驟(A)核酸裝載至電極的表面上；步驟(B)細胞附著在獲得的裝載有核酸的電極的表面上；以及步驟(C)對附著的細胞施加電脈沖。按照本方法，不僅可以將基因有效地導(dǎo)入細胞，而且基因的導(dǎo)入可以在所需的時間和所需的位點進行，并且不損傷附著的細胞。
文檔編號C12N15/87GK1863910SQ20048002959
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月8日
發(fā)明者巖田博夫, 加藤功一, 山內(nèi)文生 申請人:國立大學(xué)法人京都大學(xué)