專利名稱：一種蟲草油浸膏、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化制劑領(lǐng)域，具體來說涉及一種以古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)Liang 5-19菌株發(fā)酵菌絲為原料生產(chǎn)的蟲草油浸膏，同時(shí)還涉及蟲草油浸膏的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從蟲草屬真菌中提取的蟲草油，含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如各種氨基酸、維生素、煙酸、核苷及多糖等，具有營(yíng)養(yǎng)保健、美容護(hù)膚和醫(yī)療等作用。由于蟲草油的上述特點(diǎn)，且安全性好因而已被用作食品、醫(yī)藥和化妝品的原料或添加劑。
目前通常采用從蛹蟲草中用超臨界二氧化碳和乙醚兩種方法提取得到蟲草油，超臨界二氧化碳法雖然具有提取效果好等多種優(yōu)點(diǎn)，但所需設(shè)備非常昂貴，操作復(fù)雜。制成的蟲草油軟膠囊，主要作為食品、化妝品和藥品的原料。古尼擬青霉菌絲體中所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很豐富，尤其是維生素A，E，C等的含量很高，而這些維生素是目前國(guó)際上研究之熱點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品和化妝品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景?，F(xiàn)用于生物培養(yǎng)基的制備及微生物發(fā)酵工程方面的浸膏類都屬于水溶性類混合物如酵母浸膏、牛肉浸膏等，但脂溶性浸膏還未用于這些方面。從古尼蟲草(Cordyceps gunnii)無性型—古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)菌絲中提取蟲草油，以及把蟲草油作為生化制劑并研究其應(yīng)用價(jià)值這些方面尚未見報(bào)道。因此研究從古尼擬青霉Liang5-19菌株中提取蟲草油的工藝條件及探明該蟲草油的應(yīng)用價(jià)值意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提取工藝簡(jiǎn)單，安全性好，應(yīng)用前景廣闊的以古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)Liang5-19菌株發(fā)酵菌絲為原料生產(chǎn)的蟲草油浸膏。
本發(fā)明的另一目的還在于提供該蟲草油浸膏的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于蟲草油浸膏在微生物發(fā)酵工程方面的應(yīng)用。
本發(fā)明采用的真菌是古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)Liang5-19菌株，是梁宗琦教授從古尼蟲草(Cordyceps gunnii)中分離篩選出的一個(gè)單子囊孢子菌株。已于2005年01月21日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No.1305。
本發(fā)明蟲草油浸膏，密度(ρ)≥0.75g/cm3，所含維生素A(VA)量≥115mg/100ml，所含維生素E(VE)量≥200mg/100ml。
本發(fā)明的蟲草油浸膏的生產(chǎn)方法采用的層析柱浸提法(正交法)是發(fā)明人選用濾紙浸提法、直接浸提法和層析柱浸提法從古尼擬青霉Liang 5-19菌株發(fā)酵菌絲體中用乙醚在不同時(shí)間進(jìn)行浸提，濃縮并回收乙醚，比較其蟲草油浸膏得率，經(jīng)多次反復(fù)試驗(yàn)得到的。
本發(fā)明的蟲草油浸膏的生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)菌株的活化將古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)Liang5-19菌株轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，25-26℃培養(yǎng)7天，備用；(2)菌絲粉的制備將活化的古尼擬青霉Liang 5-19菌株接種于沙氏(Sabauround)液體培養(yǎng)液中，26℃搖瓶培養(yǎng)5-7天，按10ml/100ml的接種量接種于50升沙氏(Sabauround)培養(yǎng)基發(fā)酵罐中，26.5℃通氣培養(yǎng)48-60h，放罐、板框過濾、清洗并在50℃下烘干，將烘干的菌絲體粉碎，過40目篩，得到菌絲粉，備用；(3)蟲草油浸膏的提取稱取一定量的干燥菌絲粉，放于層析柱中，用每克菌絲粉2-3ml量的乙醚浸泡2小時(shí)，然后用每克菌絲粉1-2ml量的乙醚洗滌5次，收集乙醚提取液，濃縮并回收乙醚后，所得到的棕色油狀液體即蟲草油浸膏。
通過以下試驗(yàn)數(shù)據(jù)來說明蟲草油浸膏微生物發(fā)酵工程方面的用途及效果。
1、試驗(yàn)方法1.1試驗(yàn)用培養(yǎng)基的制備配制查氏固體培養(yǎng)基，并在其中各加入0.1ml/100g、0.5ml/100g的VE標(biāo)品及0.1ml/100g、0.5ml/100g、1ml/100g的蟲草油浸膏。配置的菌懸液約為3.2×107個(gè)/ml，接種量為0.1ml，設(shè)對(duì)照3個(gè)。
1.2孢子懸液的制備將試驗(yàn)所需菌種接于沙氏或PDA平皿上活化約4-5天左右，用加有0.05ml/100ml吐溫80的無菌水洗，將洗下的孢子懸液倒入裝有無菌玻璃珠的三角瓶中，搖勻，稀釋100倍，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定其孢子量，備用。
1.3產(chǎn)孢量的測(cè)定定量接入待測(cè)菌株于1.1制備的各種培養(yǎng)基中，待平皿上的試驗(yàn)菌成熟后，收集分生孢子，用含有0.05ml/100ml吐溫80的無菌水洗下每皿孢子，用血球記數(shù)板計(jì)算每皿孢子數(shù)(三次重復(fù))。
1.4蟲草油浸膏對(duì)玫煙色擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)03菌株產(chǎn)孢量的影響平板混勻法吸取已配置好的孢子懸液0.1ml(3.2×107/L)于平皿中，倒入加有0.1ml/100g和0.5ml/100g VE標(biāo)品和0.1ml/100g，0.5ml/100g和1ml/100g蟲草油浸膏的查氏培養(yǎng)基，混勻，待凝固后，于25℃下恒溫培養(yǎng)12天，測(cè)定產(chǎn)孢量(每濃度三個(gè)重復(fù))。
1.5蟲草油浸膏對(duì)玫煙色擬青霉(P.fumosoroseus)03菌株液體發(fā)酵菌絲生物量的影響將新培養(yǎng)的玫煙色擬青霉移入裝有玻璃珠的無菌水三角瓶中，震蕩5分鐘，制成1.25×106的孢子懸液。取孢子懸液1ml接于裝有50ml加有不同濃度的本發(fā)明的蟲草油浸膏(0.05，0.1，0.15，0.5，1，1.5)(ml/100g)的查氏培養(yǎng)液的300ml三角瓶中(每濃度設(shè)3重復(fù))，25℃，培養(yǎng)7天，測(cè)定其菌絲生物量。
1.6蟲草油浸膏對(duì)繭草無性型，粉被瑪利亞霉(Mariannaea pruinosa)0311菌株形成子實(shí)體的影響將同樣大小新鮮培養(yǎng)的繭草無性型菌塊，接于加有不同濃度的本發(fā)明的蟲草油浸膏(CK，0.05，0.1，0.15％，0.2，0.5，1，1.5，2)(ml/100g)的查氏培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)。逐日觀察培養(yǎng)過程中色素及子實(shí)體形成情況。
1.7蟲草油浸膏對(duì)大黑平菇(Pleurotus sp.)出菇的影響將大黑平菇斜面菌種接種于小麥培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，至菌絲長(zhǎng)滿后，取同樣大一勺麥粒鐘分別接種于不同濃度的本發(fā)明的蟲草油浸膏(CK，0.2，0.4，0.6，0.8，1)(ml/100g)的蘑菇袋料改良培養(yǎng)基中，25℃下培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿袋后，開蓋。出菇后，同時(shí)采樣，烘干，稱重。
2、試驗(yàn)結(jié)果2.1蟲草油浸膏對(duì)玫煙色擬青霉(P.fumosoroseus)03菌株產(chǎn)孢量的影響與對(duì)照及加入0.1ml/100g和0.5ml/100gVE標(biāo)品相比較，蟲草油浸膏在0.5ml/100g-1ml/100g的濃度范圍內(nèi)可明顯提高玫煙色擬青霉(P.fumosoroseus)03菌株孢子量。尤其在0.5ml/100g蟲草油浸膏的濃度下，其產(chǎn)孢量是對(duì)照的7倍多，也是VE標(biāo)品的6倍和2倍多。而在1ml/100g蟲草油浸膏濃度時(shí)，產(chǎn)孢量下降，說明并不是濃度越高，孢子量越大。從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還可知，除VE可刺激產(chǎn)孢外，蟲草油浸膏組分中還有其它一種或一些物質(zhì)也可刺激產(chǎn)孢。
2.2蟲草油浸膏對(duì)玫煙色擬青霉(P.cicadae)03菌株液體發(fā)酵菌絲生物量的影響表3“蟲草油浸膏”對(duì)玫煙色擬青霉液體發(fā)酵菌絲生物量的影響


注試驗(yàn)均為三次重復(fù)的結(jié)果在所試的濃度范圍內(nèi)，加入蟲草油浸膏均可提高玫煙色擬青霉液體發(fā)酵菌絲的生物量，在低濃度0-0.1ml/100g時(shí)，菌絲生物量呈上升趨勢(shì)，到0.1ml/100g時(shí)，達(dá)到最大生物量。說明促進(jìn)玫煙色擬青霉液體發(fā)酵生物量的蟲草油浸膏的最佳濃度為0.1ml/100g。
2.3蟲草油浸膏對(duì)繭草無性型(M.pruinosa)0311菌株形成子實(shí)體的影響天然繭草子實(shí)體呈鮮明的黃色，在實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)條件下也呈黃色。加入蟲草油浸膏時(shí)，隨著濃度的增大，基質(zhì)菌絲的色素產(chǎn)則逐漸減少蟲草油浸膏對(duì)繭草無性型色素的形成有很大影響。
在查氏培養(yǎng)基中，加入不同濃度的蟲草油浸膏后，繭草無性型形成子實(shí)體在速度和數(shù)量上也都比對(duì)照好，尤其在0.05ml/100g-0.15ml/100g和0.5ml/100g-1.5ml/100g的濃度范圍內(nèi)，產(chǎn)生子實(shí)體的速度和數(shù)量更具有明顯優(yōu)勢(shì)。在低濃度時(shí)，繭草無性型形成的子實(shí)體盡管數(shù)量多，但很纖細(xì)；而在較高濃度時(shí)形成的子實(shí)體不僅數(shù)量多，且比較粗壯。
2.4蟲草油浸膏對(duì)大黑平菇出菇的影響經(jīng)分別兩次袋料栽培皆顯示，蟲草油浸膏對(duì)提前大黑平出菇時(shí)間、菌柄長(zhǎng)度、菌蓋寬度和增加產(chǎn)量等方面均有影響。在所試0-0.4ml/100g低濃度的范圍內(nèi)，幾項(xiàng)指標(biāo)均呈上升趨勢(shì)。尤其在濃度為0.4ml/100g時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)都達(dá)到最大，分別為菌柄長(zhǎng)3.2cm，菌蓋寬1.3cm，干重20.9g。從表4可得出蟲草油浸膏能促進(jìn)大黑平菇提前出菇時(shí)間和菇的生物量，其最佳濃度為0.4ml/100g。
表4不同濃度“蟲草油浸膏”(ml/100g)對(duì)大黑平出菇的影響*

*于10℃左右的條件下培養(yǎng)，開袋70天后，從每個(gè)濃度的三個(gè)重復(fù)中混合選出20個(gè)最大的菇體進(jìn)行測(cè)量(菌柄長(zhǎng)，菌蓋寬，鮮重，干重)。
綜上所述，蟲草油浸膏在一定濃度范圍對(duì)產(chǎn)孢、子實(shí)體的形成、大黑平菇出菇時(shí)間和生物量等都有顯著影響，并且都具有這樣一個(gè)趨勢(shì)低濃度呈現(xiàn)促進(jìn)現(xiàn)象，有效濃度達(dá)到最大值后呈下降趨勢(shì)。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了對(duì)蟲草資源的綜合利用，符合當(dāng)前循環(huán)經(jīng)濟(jì)的政策，且提取工藝簡(jiǎn)單，安全性好，因此應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
(1)將古尼擬青霉Liang5-19菌株轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，25-26℃培養(yǎng)7天，備用；(2)將活化的古尼擬青霉Liang5-19菌株接種于沙氏液體培養(yǎng)液中，26℃左右搖瓶培養(yǎng)5-7天，按10ml/100ml的接種量接種于50升發(fā)酵罐中(沙氏培養(yǎng)基)，26℃左右通氣培養(yǎng)48-60h，放罐、板框過濾、清洗并在50℃下烘干，將烘干的菌絲體粉碎，過40目篩，得到菌絲粉，備用；(3)稱取5克干燥的菌絲粉，放于直徑為2.5cm的20ml的層析柱中，用10ml乙醚浸泡時(shí)間2小時(shí)，用10ml乙醚洗滌5次，濃縮并回收乙醚后，即得到密度(ρ)為0.75g/cm3，所含維生素A(VA)量為115mg/100ml，所含維生素E(VE)量為200mg/100ml的蟲草油浸膏0.4-1克。
實(shí)施例2(1)將古尼擬青霉Liang5-19菌株轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，25-26℃培養(yǎng)7天，備用；(2)將活化的古尼擬青霉Liang5-19菌株接種于沙氏液體培養(yǎng)液中，26℃左右搖瓶培養(yǎng)5-7天，按10ml/100ml的接種量接種于50升發(fā)酵罐中(沙氏培養(yǎng)基)，26℃左右通氣培養(yǎng)48-60h，放罐、板框過濾、清洗并在50℃下烘干，將烘干的菌絲體粉碎，過40目篩，得到菌絲粉，備用；(3)稱取5克干燥的菌絲粉，放于直徑為2.5cm的20ml的層析柱中，用15ml乙醚浸泡時(shí)間2小時(shí)，用10ml乙醚洗滌4次，濃縮并回收乙醚后，即得到15.66g油脂/100g菌絲粉，密度(ρ)為0.81g/cm3，測(cè)得維生素A(VA)量＝124mg/100ml，所含維生素E(VE)量＝205mg/100ml。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種蟲草油浸膏，其特征在于密度≥0.75g/cm3，所含維生素A量≥115mg/100ml，所含維生素E量≥200mg/100ml。
2.一種蟲草油浸膏的生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)菌株的活化將古尼擬青霉(Paecilomyces gunnii)Liang5-19CGMCC No.1305菌株轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上，25-26℃培養(yǎng)7天，備用；(2)菌絲粉的制備將活化的古尼擬青霉Liang 5-19菌株接種于沙氏液體培養(yǎng)液中，26℃搖瓶培養(yǎng)5-7天，按10ml/100ml的接種量接種于50升沙氏培養(yǎng)基發(fā)酵罐中，26.5℃通氣培養(yǎng)48-60h，放罐、板框過濾、清洗并在50℃下烘干，將烘干的菌絲體粉碎，過40目篩，得到菌絲粉，備用；(3)蟲草油浸膏的提取稱取一定量的干燥菌絲粉，放于層析柱中，用每克菌絲粉2-3ml量的乙醚浸泡2小時(shí)，然后用每克菌絲粉1-2ml量的乙醚洗滌5次，收集乙醚提取液，濃縮并回收乙醚后，所得到的棕色油狀液體即蟲草油浸膏。
3.蟲草油浸膏在微生物發(fā)酵工程方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蟲草油浸膏，密度(ρ)≥0.75g/cm3，所含維生素A(VA)量≥115mg/100ml，所含維生素E(VE)量≥200mg/100ml；其制備方法包括菌株的活化、菌絲粉的制備及蟲草油浸膏層析柱浸提；還公開了其在微生物發(fā)酵工程方面的應(yīng)用。本發(fā)明的蟲草油浸膏含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提取工藝簡(jiǎn)單，安全性好，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1683513SQ20051000302
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月9日
發(fā)明者梁宗琦, 韓燕峰, 李祝, 雷邦星, 吳重光, 陶遵海 申請(qǐng)人:貴州大學(xué), 貴州赤天化股份有限公司