專利名稱：：一個簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法一個簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因及其表達(dá)載體和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKI及其表達(dá)載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：小麥?zhǔn)鞘澜缟戏植甲顝V、種植面積最大的糧食作物，對人類糧食安全具有舉足輕重的作用。小麥生產(chǎn)過程中，受到諸多逆境的脅迫(如病蟲害、干旱、鹽潰等)，制約其產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。由專性寄生真菌Blumeriagraminisf.sp.tritici侵染引起的小麥白粉病是我國小麥的第二大病害，近年來出現(xiàn)由南向北逐漸加重之勢，給小麥生產(chǎn)帶來了越來越嚴(yán)重的危害。防治白粉病最經(jīng)濟(jì)有效的方法是使用抗病品種，但由于病原菌小種變化快，我國現(xiàn)有的大部分品種已逐漸失去了對白粉病的抗性。分離和鑒定新的抗白粉病基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良和創(chuàng)造小麥抗白粉病新種質(zhì)，為小麥抗白粉新品種的選育提供了新的路徑。簇毛麥(Haynaldiavillosa,2n=14,VV),是小麥的一個野生近緣種，它高抗小麥白粉病、銹病、梭條花葉病、全蝕病等病害，并具有抗旱、耐鹽、耐寒等特性，是小麥抗逆遺傳改良的寶貴基因資源庫。其中來自簇毛麥6VS的Pm21基因是目前抗白粉病主效基因之一，具有抗性強(qiáng)、抗譜廣等特點(diǎn)，是目前為止最有效的抗白粉病基因(參考文獻(xiàn)=ChenPD,QiLL,ZhouB,etal.DevelopmentandmoIecμIarcytogeneticanalysisofwheat-Haynaldiavillosa6VS/6ALtranslocationlinesspecifyingresistancetopowderymildew.TheorApplGenet,1995，91:1125-1128.)。因此，研究Pm21基因發(fā)揮抗病作用過程中所涉及的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因和重要的防衛(wèi)反應(yīng)基因，對于了解廣譜抗性的分子機(jī)理，運(yùn)用基因工程手段提高小麥對白粉病的抗性具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKI。本發(fā)明的另一目的是提供該基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的又一目的是提供該基因和表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKI，來自簇毛麥，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。該簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)HvCIPKI，其氨基酸序列為SEQIDN0.2。含有所述的類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表達(dá)載體。含有所述的類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表達(dá)載體優(yōu)選以pAHC25為出發(fā)載體，將所述的HvCIPKI基因插入pAHC25的SmaI和SacI酶切位點(diǎn)間所得。所述的類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKI在培育抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。所述的類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKI的表達(dá)載體在培育白粉病小麥品種中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明從簇毛麥中克隆得到了一個類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKI及其所編碼的蛋白質(zhì)HvCIPKl。HvCIPKI可用于基因工程育種，將其插入表達(dá)載體pAHC25，得到該基因的過量表達(dá)載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小麥品種對白粉病的抗性。圖1利用中國春、簇毛麥和小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL及小麥-簇毛麥的一套添加系材料對HvCIPKI基因進(jìn)行染色體區(qū)段定位，將HvCIPKl定位到6V染色體短臂。1，簇毛麥；2，小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系92R137;3，中國春(ChineseSpring);4，小麥-簇毛麥DAlV;5，小麥-簇毛麥DA2V;6，小麥-簇毛麥DA3V;7，小麥-簇毛麥DA4V;8,小麥-簇毛麥DA5V;9,小麥-簇毛麥DA6V;10，小麥簇毛麥DA7V;12，MarkerDL2000(Takala).圖2HvCIPKl在簇毛麥葉片經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)后的RT-PCR分析0h、2h、6h、12h、24h、48h分別表示白粉病菌誘導(dǎo)了0h、2h、6h、12h、24h、48h的葉片cDNA樣品。圖3HvCIPKl過量表達(dá)載體構(gòu)建圖4HvCIPKl基因轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的Ttl代陽性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分子鑒定結(jié)果泳道I為未轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158對照，泳道2為MarkerDL2000,泳道3為包含目的基因的質(zhì)粒，泳道4-23依次為T。代再生植株(其中泳道4、5、7、13、14、15、17、18、21、22、23為陽性轉(zhuǎn)化植株)，泳道24為水空白對照。圖5普通小麥染色體示6簇毛麥染色體示7小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL的示8小麥-簇毛麥添加系DA6V的示圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例1簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的克隆本實(shí)驗(yàn)室前期利用簇毛麥?zhǔn)馨追劬T導(dǎo)后的cDNA樣品與大麥表達(dá)譜芯片BarleyIGeneChip(http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/barley,affx)進(jìn)行雜交，篩選克隆了一個在簇毛麥中受白粉誘導(dǎo)表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因(Hv-S/TPK)，物理定位于Pm21所在區(qū)段，轉(zhuǎn)入感病小麥揚(yáng)麥158超量表達(dá)后表現(xiàn)高抗白粉病(CaoAZ,XingLP,etal.Serine/threoninekinasegeneStpk-V,akeymemberofpowderymildewresistancegenePm21,conferspowderymildewresistanceinwheat,PNAS,2011,108(19):7727-7732)。為進(jìn)一步克隆位于簇毛麥Pm21所在區(qū)段的抗白粉病相關(guān)基因，本發(fā)明以Hv-S/TPK為出發(fā)點(diǎn)，篩選其周圍的抗病基因類似物。大量研究表明，水稻和小麥染色體之間存在一定的共線性，其中小麥第六部分同源群染色體與水稻第2條染色體之間存在共線性，Hv-S/TPK在水稻中的同源基因位于克隆AP004093.3和AP004863.3上，這兩個緊鄰的克隆位于第2條染色體上且部分重疊。通過搜索Genbank，獲得了水稻第2條染色體上位于Hv-S/TPK基因上下游的BAC同源序列，進(jìn)一步利用水稻基因組的序列信息，圍繞Hv-S/TPK的同源BAC繼續(xù)篩選第六部分同源群中間區(qū)域的抗病基因類似物。圍繞Hv-S/TPK的同源BAC，在小麥第六部分同源群中共查找到具有抗病基因結(jié)構(gòu)的EST23個，設(shè)計了68條引物(組成49對)。49對引物在簇毛麥中均能擴(kuò)增出條帶，為了篩選出定位于6VS上的抗病基因類似物，本發(fā)明以6VS/6AL易位系，小麥-簇毛麥異附加系(DAlV-DA7V)(1、ChenPD,QiLL,ZhouB,etal.Developmentandmolecularcytogeneticanalysisofwheat-Haynaldiavillosa6VS/6ALtranslocationlinesspecifyingresistancetopowderymildew.TheorApplGenet,1995，91:1125-1128.2、L.L.Qi,S.L.Wang,P.D.Chen,D.J.Liu,B.S.Gill1998IdentificationandphysicalmappingofthreeHaynaldiaviIIosachromosome_6VdeletionlinesTAG97:1042-1046)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終得到6個定位于6VS上的基因。其中I個為BarIey1-14940(引物對Pltgctctccttggatacattt(SEQIDNO.3)和P2(acaaggttcagaaaggtgaaCSEQIDNO.4)),染色體定位如圖1,其預(yù)測的結(jié)果顯示，它包含一個完全不同于Hv-S/TPK的絲氨酸蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，為了研究它和Hv-S/TPK的功能差別，以及它在抗白粉病中是否和Hv-S/TPK有聯(lián)系，進(jìn)一步利用篩選簇毛麥葉片cDNA文庫的方法克隆獲得了該基因的全長序列。本發(fā)明所用的白粉菌誘導(dǎo)12h的簇毛麥葉片cDNA文庫(陳雅萍，2005)，能夠滿足對簇毛麥葉片中Pm21基因和其它抗性基因、防衛(wèi)基因和其它優(yōu)良基因的克隆研究。cDNA片段兩端經(jīng)NotI和SalI酶切位點(diǎn)定向克隆于載體。pSPORTl能被lmmol/LIPTG(isopropylthio-β-galactoside)誘導(dǎo),通過半乳糖苷啟動子表達(dá)被克隆的基因。多克隆位點(diǎn)的設(shè)計便于用HenikofT法進(jìn)行套式缺失的構(gòu)建和測序，其它特征和PUC系列載體類似。為長期保存文庫和減小篩庫工作量，先從5個384孔板每4-5個小混合池中各吸IμI菌液,將其混合到一起，37°C擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。每塊384孔板提取80個質(zhì)粒，共有400個質(zhì)粒。首先用Barleyl-14940引物以上述的400個混合池質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選到一個陽性的混合質(zhì)粒；然后取1.5μI初級混合池質(zhì)粒做電擊轉(zhuǎn)化，涂10個LBA平板，37°C培養(yǎng)待其生長16h后，每平板分30個小區(qū)刮取菌落，接入含500μILBA的1.5ml離心管中培養(yǎng)5個小時后，進(jìn)行PCR篩選。用Barleyl-14940引物以這300個小區(qū)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，70%以上的次級克隆池可以擴(kuò)出陽性條帶。其中83號次級克隆池中陽性條帶最濃，取5μI83號菌液稀釋200倍，每ImlLBA培養(yǎng)基中接種10μI。共100管菌液，用Barleyl-14940弓I物進(jìn)行PCR篩選。50%的菌液可以擴(kuò)增出陽性條帶，其中60號菌液擴(kuò)出的條帶最濃。取60號菌液稀釋10000倍，取10μI稀釋液涂平板。用槍頭挑取15-20個單克隆于500μILBA中培養(yǎng)，用Barleyl-14940引物進(jìn)行PCR篩選。篩選出含有目標(biāo)片段的混合菌液，再次稀釋鋪板挑單克隆，LBA中培養(yǎng)后進(jìn)行PCR篩選，獲得I個陽性克隆。測序結(jié)果表明，該cDNA克隆全長2491個堿基，序列如SEQIDNO.1所示，其中5’UTR區(qū)有404堿基，3’-UTR有692個堿基，開放閱讀框(ORF)長1395bp(圖5-8)，編碼465個氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。通過對該氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)它含有一個絲氨酸蘇氨酸激酶活性區(qū)和一個NAF結(jié)構(gòu)域。NAF結(jié)構(gòu)域又名FISL結(jié)構(gòu)域，由21個氨基酸殘基組成，其中A、F和L殘基在已克隆的CIPK(CBL-1nteractingserine-threonineproteinkinases)基因中高度保守。CIPK是一類植物特有的響應(yīng)I丐信號、CBL(B_likecalciumsensorproteins)特定祀向的絲氨酸-蘇氨酸激酶。經(jīng)BLAST分析，該基因編碼的蛋白序列與高粱中的CIPK31基因同源性最高為82%，與擬南芥CIPK2、水稻CIPKl所編碼的氨基酸序列同源性分別為58%、44%。因本實(shí)驗(yàn)克隆的基因含有保守的NAF結(jié)構(gòu)域而且與其它種屬的CIPK基因有較高的同源性，故將該基因命名為HvCIPKl。實(shí)施例2白粉菌誘導(dǎo)后HvCIPKl的表達(dá)特征分析把簇毛麥的非誘導(dǎo)和誘導(dǎo)不同時間的樣品的cDNA為模板、以引物對P3(TTCGAGGATTGGCCTAATTG(SEQID勵.5))和卩4(GCACTGATGAGCTGATGGAA(SEQIDNO.6))進(jìn)行實(shí)時熒光定量qPCR分析，以管家基因Tubulin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)在實(shí)時熒光定量PCR儀(MylQ，Bio-Rad，USA)上擴(kuò)增并檢測熒光。20μIPCR反應(yīng)體系中含2XSYBRGreenPCRMasterMix10μ1,0.4nmol/yI引物P3和P4，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μI。擴(kuò)增參數(shù)為95°CIOmin,然后95°C15s、58°C30s，72°Clmin，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線的測定。檢測基因表達(dá)水平定量用MyiQ系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。qPCR結(jié)果表明HV_S/TPK基因在簇毛麥中受白粉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，12小時期間達(dá)到最高值，隨后下降并維持在較低水平(圖2)。實(shí)施例3HvCIPKl基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化普通小麥揚(yáng)麥158把用P5(TCCCCCGGGATGGAGGAAAGGAGGACA(SEQIDNO.7))和P6(ACGCGAGCTCTTACTCCTGTGGCTGCTGT(SEQIDNO.8))從簇毛麥cDNA中擴(kuò)增出來的HvCIPKl基因片段構(gòu)建入轉(zhuǎn)化載體pAHC-25(公知公用，參考文獻(xiàn)ChristensenAH，QuailPH,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996，5:213-218.)，用SmaI和SacI分別雙酶切載體pAHC-25和目標(biāo)片段HvCIPKl基因，以HvCIPKl替換pAHC25載體上的⑶S基因編碼序列，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組子，由此將目標(biāo)基因克隆到強(qiáng)啟動子Ubi的下游，獲得表達(dá)載體pAHC-HvCIPKl。除草劑抗性基因(Bar基因)作為植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因(附圖3)。將構(gòu)建好的過量表達(dá)載體通過基因槍法轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158，挑選1200個幼胚愈傷進(jìn)行基因槍轟擊，轟擊前在高滲培養(yǎng)基(MS++2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+0.4mol/L甘露醇，pH5.8)上預(yù)處理4小時，轟擊后在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)16小時。之后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基(1/2MS(只有大量元素減半的MS)+水解酪蛋白500mg/L+2，4_D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上暗培養(yǎng)2周，再將其轉(zhuǎn)移至含有除草劑的篩選培養(yǎng)基上(1/2MS+ZTImg/L+1AA0.5mg/L+水解釀蛋白500mg/L+2,4-Dlmg/L+鹿糖30g/L+3mg/LBialaphos,pH5.8),分化篩選培養(yǎng)2周。然后將具有抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中(1/2MS+水解酪蛋白200mg/L+ZTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0.8%,pH5.8)進(jìn)行分化，待分化芽長至2-4cm時將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(l/2MS+IAAlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0.8%，pH5.8)中。至再生苗長約5-8cm、根系較健壯時，即可開管煉苗1-2天，最后洗去根系攜帶的培養(yǎng)基殘?jiān)憧梢圃匀肱枥?，獲得再生植株共125株。提取所有再生植株基因組DNA，對轉(zhuǎn)化植株利用載體上啟動子引物P7(CCCTGTTGTTTGGTGTTACCSEQIDNO.9))和基因HvCIPKl內(nèi)部引物P8(CTTCAATACGTTGGGATGT(SEQIDNO.10))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以鑒定陽性植株。PCR程序10_50ng/μI基因組模板，ΙΟμΜ的5’引物Ρ7和3’引物Ρ8各O.5μI;2·5μIIOXbuffer；2.5μI2.5mM的dNTP；1.5μ125mM的Mg2+;0·25μI(5U/μI)Taqpolymerase(TaKaRa),加水至25μI。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min；94°C45s,58°C45s,72°Clmin，35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0PCR產(chǎn)物經(jīng)8%的聚丙烯凝膠電泳檢測。其中11株可以擴(kuò)增約556bp的目的條帶，初步鑒定為陽性植株，株系編號依次為TQ-4、TQ-5、TQ-7、Ttl-13、Ttl-14、Ttl-15、Ttl-17、Ttl-18、TQ-21、TQ-22、T0-23(附圖4)。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定對Ttl代轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)基因受體品種揚(yáng)麥158進(jìn)行了田間抗病性鑒定，對T2代轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)基因受體品種揚(yáng)麥158進(jìn)行了苗期離體和成株期白粉病抗病性鑒定?？剐澡b定標(biāo)準(zhǔn)采用“0-9級”白粉病抗性反應(yīng)型的分級標(biāo)準(zhǔn)0-2級為高抗、3-4級為中抗、5-6級為中感、7-9為高感。Ttl代成株期抗性鑒定的結(jié)果表明揚(yáng)麥158表現(xiàn)為高感，陽性轉(zhuǎn)基因植株中，除IV18和TciH表現(xiàn)為中感，其余陽性轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為中抗。T2代苗期離體抗性鑒定的兩次重復(fù)結(jié)果表明揚(yáng)麥158表現(xiàn)為高感；陽性轉(zhuǎn)基因植株中，1-144-174-22和TQ-23均表現(xiàn)為高抗，Tc1-LTc1-S和TpI均表現(xiàn)為中抗。T2代成株期白粉病鑒定結(jié)果表明揚(yáng)麥158表現(xiàn)為高感，陽性轉(zhuǎn)基因植株中，Tq-14表現(xiàn)為高抗，Tq-17、Tq-21、T0-22和TQ-23均表現(xiàn)為中抗，T0-4,T0-5和Tc1-1S均表現(xiàn)為中感。(表2)。表2轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定權(quán)利要求1.一個簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKl，其特征在于其核苷酸序列為SEQIDNO.1。2.權(quán)利要求1所述簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因的蛋白質(zhì)HvCIPKl，其特征在于其氨基酸序列為SEQIDNO.2。3.含有權(quán)利要求1所述的簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表達(dá)載體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表達(dá)載體是以PAHC25為出發(fā)載體，將權(quán)利要求1所述的HvCIPKl基因插入PAHC25的SmaI和SacI酶切位點(diǎn)間所得。5.權(quán)利要求1所述的簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKl培育抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求3或4所述的含簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPKl的表達(dá)載體在培育抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一個簇毛麥類鈣調(diào)素互作蛋白激酶基因HvCIPK1及其表達(dá)載體和應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。HvCIPK1的cDNA序列為SEQIDNO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.2。該基因?yàn)榇孛溨惺状螆蟮?，受小麥白粉病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在小麥感白粉病品種揚(yáng)麥158中過量表達(dá)該基因可以提高揚(yáng)麥158對白粉病菌的抗性。HvCIPK1是簇毛麥抗病信號傳導(dǎo)途徑中的一個重要元件，可作為目的基因?qū)敫邪追鄄⌒←溒贩N，提高白粉病抗性；同時探明其作用的分子機(jī)制，有助于了解白粉病的廣譜抗性機(jī)制。文檔編號C12N15/63GK102994528SQ20121051258公開日2013年3月27日申請日期2012年12月4日優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日發(fā)明者邢莉萍,曹愛忠,胡佳夢,錢晨,李穎波,王秀娥,陳佩度申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)