專利名稱：用固定化α－葡萄糖苷酶模型篩選活性天然藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用固定化α-葡萄糖苷酶模型篩選活性天然藥物的方法，屬新藥篩選化學(xué)工藝技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
α-葡萄糖苷酶能催化α-1.4-糖苷鍵水解，使小腸內(nèi)麥芽糖、蔗糖等寡糖水解。抑制α-葡萄糖苷酶的活性，可使葡萄糖的生成及吸收減緩，降低餐后血糖峰值，調(diào)整血糖水平，在調(diào)節(jié)糖代謝的同時也調(diào)節(jié)了脂肪的生成。α-葡萄糖苷酶抑制藥物成為近年來藥物化學(xué)的研究熱點。傳統(tǒng)篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑方法是用游離的α-葡萄糖苷酶同時和它的底物(4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG))以及和被篩選的抑制劑作用。
據(jù)報道，體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶在跨越雙分子層被多肽鏈錨定在腸膜上時，N端在內(nèi)，C端在外，而傳統(tǒng)的體外酶活性試驗所使用的α-葡萄糖苷酶是游離的，其N端與C端的朝向自由，抑制劑與N端及C端都可以作用。傳統(tǒng)的體外酶抑制劑活性試驗，不能排除作用于N端抑制劑的假陽性現(xiàn)象，使得酶抑制劑的體內(nèi)外藥理學(xué)效果存在差異。若把α-葡萄糖苷酶的N端固定在載體上，模擬它在小腸壁上的狀況，以此在體外研究α-葡萄糖苷酶抑制劑活性，剔除一些作用于N端的抑制劑，正確地評價抑制劑的作用效果。利用此原理設(shè)計出篩選模型進行天然藥物的篩選，可突破傳統(tǒng)方法不能模擬α-葡萄糖苷酶在體內(nèi)情況的不足之處。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種篩選具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的天然藥物的新技術(shù)。
該方法的要點是把α-葡萄糖苷酶固定化，模擬它在體內(nèi)小腸壁上的情況，形成一個固定化酶篩選模型。
本發(fā)明方法的特征在于具有以下的過程和步驟a α-葡萄糖苷酶固定化用三羥甲基磷為交聯(lián)劑，以殼聚糖作載體固定化α-葡萄糖苷酶；b 制作抑制劑篩選模型將上述固定化α-葡萄糖苷酶裝入直徑為0.5～1.0cm、長度為5～10cm的層析柱中，柱中加入pH6.8的磷酸鉀緩沖液，于4℃保存，構(gòu)成篩選模型；
c模型有效性驗證用具有代表性的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖進行該篩選模型有效性驗證，將上述柱子下端緊密插入帶有活塞的小管，上端插入一注射器，將柱中的緩沖溶液壓到離柱頂下約0.3～1.0cm后，分別加入4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷和一定量的阿卡波糖溶液，輕輕震蕩使柱頂?shù)娜芤夯靹?，然后繼續(xù)壓溶液至液面和柱頂相平，關(guān)上底端的活塞，再把該柱放入水浴槽，在37℃下溫育數(shù)分鐘，待反應(yīng)完畢，用磷酸鉀緩沖液沖洗柱內(nèi)，收集洗脫液，并稀釋至5～20ml，用紫外分光光度計在400nm處測定吸光度值；并把上述的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖溶液和緩沖液稀釋至相同體積作空白，按照所得反應(yīng)液的吸光度計算抑制劑阿卡波糖的抑制率；d抑制率I(％)的計算I(％)＝(ΔAE-ΔA)/ΔAE×100％；ΔAE＝未加抑制劑前固定化α-葡萄糖苷酶與4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷反應(yīng)后的吸光度值(扣除相應(yīng)空白)；ΔA＝加入抑制劑后固定化α-葡萄糖苷酶與4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷反應(yīng)后的吸光度值(扣除相應(yīng)空白)；C為抑制劑濃度，以C為橫坐標(biāo)，抑制率I％為縱坐標(biāo)，作抑制劑濃度C與相應(yīng)抑制率I％的回歸曲線，并于50％抑制率處得到半抑制率濃度IC50；e篩選模型的應(yīng)用參照上述驗證固定化α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型的方法篩選天然藥物虎仗和血竭，以IC50值作為判斷抑制活性指標(biāo)。
本發(fā)明方法的特點是摒棄了用傳統(tǒng)游離的α-葡萄糖苷酶進行活性藥物篩選的方法，采用固定化的α-葡萄糖苷酶篩選模型進行篩選，由于該模型是模擬α-葡萄糖苷酶在體內(nèi)被錨定在小腸膜上的情況，所以用該方法進行篩選要比傳統(tǒng)篩選方法更準(zhǔn)確和更有效。本發(fā)明方法簡便且易于操作，適合大規(guī)模篩選有抑制α-葡萄糖苷酶活性的天然藥物。
具體實施方法現(xiàn)將本發(fā)明的具體實施例敘述于后。
實施例1本實施例的具體過程和步驟如下1.α-葡萄糖苷酶固定化用三羥甲基磷為交聯(lián)劑，以殼聚糖作載體固定化α-葡萄糖苷酶；2.制作抑制劑篩選模型將上述固定化α-葡萄糖苷酶裝入直徑為0.8cm、長度為8cm的層析柱中，柱中加入pH6.8的磷酸鉀緩沖液，于4℃保存，構(gòu)成篩選模型；3.模型有效性驗證用具有代表性的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖進行該篩選模型有效性驗證，將上述柱子下端緊密插入帶有活塞的小管，上端插入一注射器，將柱中的緩沖溶液壓到離柱頂下約0.4cm后，分別加入50μl的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(0.116mol/L)和一定量的阿卡波糖溶液(250mg/L)，輕輕震蕩使柱頂?shù)娜芤夯靹?，然后繼續(xù)壓溶液至液面和柱頂相平，關(guān)上底端活塞，再把該柱放入水溶槽，在37℃下溫育10分鐘，待反應(yīng)完畢，用5ml pH6.8磷酸鉀緩沖液沖洗柱內(nèi)，收集洗液，把洗脫液稀釋至10ml體積，用紫外分光光度計在400nm處測定吸光度值；并把上述50μl的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖溶液和5ml緩沖溶液稀釋至10ml作空白，按照所得反應(yīng)液的吸光度數(shù)據(jù)計算抑制劑阿卡波糖的抑制率；4.抑制率I(％)的計算I(％)＝(ΔAE-ΔA)/ΔAE×100％，ΔAE＝未加抑制劑前固定α-葡萄糖苷酶與4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷反應(yīng)后的吸光度值(扣除相應(yīng)空白)；ΔA＝加入抑制劑后固定化α-葡萄糖苷酶與4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷反應(yīng)后的吸光度值(扣除相應(yīng)空白)；C為抑制劑濃度，C為橫坐標(biāo)，抑制率I％為縱坐標(biāo)，作抑制劑濃度C與相應(yīng)抑制率I％的回歸曲線，并于50％抑制率處得到半抑制率濃度IC50。
5用固定化α-葡萄糖苷酶篩選模型進行中藥虎仗水溶性部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性篩選，篩選虎仗水溶性部位的數(shù)據(jù)列于表1。
表1 固定化酶篩選模型篩選虎仗水溶性部位數(shù)據(jù)(n＝5)

以上這些數(shù)據(jù)表明，虎仗有顯著抑制α-葡萄糖苷酶的作用，與文獻(xiàn)報道是一致的。
實施例2本實施例的具體過程和步驟與上述實施例1基本相同，不同的是在第5步，其固定化酶篩選模型篩選的對象是中藥廣西血竭。其反應(yīng)體系為甲醇和pH3.6緩沖液以1∶2比例配制的混合液。固定化酶篩選模型篩選廣西血竭的數(shù)據(jù)列于表2。
表2 固定化酶篩選模型篩選廣西血竭數(shù)據(jù)(n＝5)

以上這些數(shù)據(jù)表明，廣西血竭有顯著強性抑制α-葡萄糖苷酶的作用，與文獻(xiàn)報道是一致的。
另外，作為參考，用具有代表性的α-葡萄糖苷酶抑制劑的阿卡波糖進行固定化酶篩選模型的篩選所得的試驗數(shù)據(jù)列于表3。
表3 固定化酶篩選模型篩選阿卡波糖的數(shù)據(jù)(n＝5)

表3的數(shù)據(jù)表明，固定化α-葡萄糖苷酶能很好地被阿卡波糖抑制。
權(quán)利要求
1.一種用固定化α-葡萄糖苷酶篩選模型篩選天然藥物的方法，其特征在于具有以下的過程和步驟a.α-葡萄糖苷酶固定化用三羥甲基磷為交聯(lián)劑，以殼聚糖作載體固定化α-葡萄糖苷酶。b.制作α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型將上述固定化α-葡萄糖苷酶裝入直徑為0.5～1.0cm。長度為5～10cm的層析柱中，柱中加入pH6.8的磷酸鉀緩沖液，于4℃保存，構(gòu)成篩選模型；c.模型有效性驗證用具有代表性的α-葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖進行該篩選模型有效性驗證，將上述柱子下端緊密插入帶有活塞的小管，上端插入-注射器，將柱中的緩沖溶液壓到離柱頂下約0.3～1.0cm后，分別加入4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷和一定量的阿卡波糖溶液，輕輕震蕩使柱頂?shù)娜苋芑靹?，然后繼續(xù)壓溶液至液面和柱頂相平，關(guān)上底端的活塞，再把該柱放入水浴槽，在37℃下溫育數(shù)分鐘，待反應(yīng)完畢，用磷酸鉀緩沖液沖洗柱內(nèi)，收集洗液，把洗脫液稀釋至5～20ml體積，用紫外分光光度計在400nm處測定吸光度值；并把上述的4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖溶液和緩沖液稀釋至相同體積作空白，按照所得反應(yīng)液的吸光度數(shù)據(jù)計算抑制劑阿卡波糖的抑制率；d.抑制率I(％)的計算I(％)＝(ΔAE-ΔA)/ΔAE×100％；ΔAE＝未加抑制劑前固定化α-葡萄糖苷酶與4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷反應(yīng)后的吸光度值(扣除相應(yīng)空白)；ΔA＝加入抑制劑后固定化α-葡萄糖苷酶與4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷反應(yīng)后的吸光度值(扣除相應(yīng)空白)；C為抑制劑濃度，以C為橫坐標(biāo)，抑制率I％為縱坐標(biāo)，作抑制劑濃度C與相應(yīng)抑制率I％的回歸曲線，并于50％抑制率處得到半抑制率濃度IC50；e.篩選模型的應(yīng)用參照上述驗證固定化α-葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型的方法篩選天然藥物中藥虎仗和血竭，以IC50值作為判斷抑制活性指標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用固定化α－葡萄糖苷酶模型篩選活性天然藥物的方法，屬新藥篩選化學(xué)工藝技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明方法的特征在于具有以下過程和步驟首先將α－葡萄糖苷酶固定化，制作α－葡萄糖苷酶抑制劑篩選模型，用具有代表性的α－葡萄糖苷酶抑制劑阿卡波糖進行該篩選模型有效性驗證；用固定化α－葡萄糖苷酶篩選模型篩選天然藥物中藥虎仗和血竭，其方法是將α－葡萄糖苷酶固定化，裝入層析柱中，柱中加入p
文檔編號C12Q1/18GK1687448SQ200510025259
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月21日
發(fā)明者雍克嵐, 呂敬慈, 盧大勝, 陳旭, 顧慧娟 申請人:上海大學(xué)