專利名稱：高效氮循環(huán)細菌人工篩選及在水生態(tài)修復(fù)和水處理中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物人工篩選技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物人工篩選及其在環(huán)境治理中的應(yīng)用，更具體的說，是高效氮循環(huán)細菌人工篩選及在水生態(tài)修復(fù)和水處理中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
湖泊，河流等水體的污染和富營養(yǎng)化是中國乃至世界上許多地區(qū)危及人類健康，制約社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的嚴峻生態(tài)環(huán)境問題。環(huán)境監(jiān)測部門的調(diào)查表明，我國七大水系、湖泊、水庫、部分地區(qū)地下水和近岸海域受到不同程度的污染，其中富營養(yǎng)化問題尤為突出，滇池、太湖等天然水體先后暴發(fā)了大面積的水華。治理富營養(yǎng)化問題已是當(dāng)今我國水環(huán)境面臨的重大問題，是國家亟待解決的重大科學(xué)和技術(shù)難題，也是當(dāng)代資源環(huán)境科學(xué)的熱點。迄今已有的研究表明，引起水體富營養(yǎng)化的各類營養(yǎng)物質(zhì)中，氮、磷是主要的限制性因子。因此解決水體富營養(yǎng)化問題的關(guān)鍵之一就在于控制水體的氮的含量一方面制定嚴格的排放標(biāo)準(zhǔn)，在排入水體前對生活污水和工業(yè)廢水進行治理，控制排放源；一方面需對已經(jīng)污染的水體進行修復(fù)。
對于生活污水和工業(yè)廢水的治理目前國內(nèi)外的研究和應(yīng)用的最多的是生物脫氮法，其中又以固定化生物脫氮技術(shù)綜合治理效果最佳，但是現(xiàn)今的研究技術(shù)主要存在以下缺點硝化-反硝化過程難以在時間和空間上統(tǒng)一，脫氮效果差，造成生物脫氮這一多步驟生物催化反應(yīng)受基質(zhì)傳遞速率、底物和產(chǎn)物抑制等限制。目前，國內(nèi)外已有通過聚乙烯醇(PVA)、海藻酸鈉、光致交聯(lián)樹脂等多聚體化合物將硝化菌和反硝化菌混合包埋的研究(曹國民，趙慶詳，龔劍麗，張彤，固定化微生物在好氧條件下同時硝化和反硝化，環(huán)境工程，2000，18(5)17-19)，能在一定程度上實現(xiàn)同步硝化反硝化。但關(guān)于將四種氮循環(huán)細菌(氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌)同時進行吸附增殖固定化的研究，目前僅李正魁等有過研究(李正魁，濮培民，固定化增殖氮循環(huán)細菌群SBR法凈化富營養(yǎng)化湖水，核技術(shù)，2001，24(8)674～679)，取得了較好的脫氮效果。但是對四種高效氮循環(huán)細菌的篩選和富集方面仍需改進。
對于氮污染型富營養(yǎng)化水體的治理，國際、國內(nèi)湖泊界和環(huán)境科學(xué)界科學(xué)工作者已經(jīng)采用了許多治理措施，目前已有的技術(shù)有物理方法底泥疏浚、引水沖淤，機械除藻等，治標(biāo)不治本，處理效果易出現(xiàn)反復(fù)；化學(xué)方法營養(yǎng)鹽控制、投加化學(xué)藥劑控制藻類生長等，易引發(fā)二次污染，同時可能惡化水體水質(zhì)，破壞水體生態(tài)系統(tǒng)的自凈能力和自我調(diào)控能力；生物方法生物調(diào)控、水生態(tài)修復(fù)、生態(tài)工程等，這種方法能夠從根本上修復(fù)水體的自凈能力，實現(xiàn)生態(tài)平衡，并且基本上不產(chǎn)生二次污染，其中又以水生態(tài)修復(fù)和生態(tài)工程為最佳。
但是，水生態(tài)修復(fù)的應(yīng)用面臨的主要難題是較低水溫的影響?，F(xiàn)有生態(tài)修復(fù)技術(shù)采用的水生高等植物常為一年生或秋冬枯萎的多年生植物，在秋冬季節(jié)基本喪失水體凈化能力，而低溫對微生物活動的抑制作用更為強烈，15℃時硝化細菌硝化速率顯著下降，僅為30℃時的50％左右，10℃時反硝化細菌的反硝化速率極大下降。
水體的高度均一化。在富營養(yǎng)化水體中，原有水生態(tài)系統(tǒng)已受到破壞，水體的空間異質(zhì)性差，缺乏相互分異的氧化-還原微環(huán)境，僅僅在水-沉積物界面存在明顯的相互分異的氧化-還原微環(huán)境。水體的硝化-反硝化所致的氮素釋放活動十分微弱。這種近似荒漠化的水體環(huán)境，給引種水生植物帶來了極大的生存壓力，直接阻礙了健康水生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)與穩(wěn)定。
水生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)，要求較為穩(wěn)定的水體環(huán)境。較大的水流流速，波動的水溫、外界擾動較大的水體生態(tài)環(huán)境等等，都是阻礙水生態(tài)修復(fù)順利進行的因素。
污染治理不徹底，污染物只是被在形態(tài)上被轉(zhuǎn)變與簡單遷移并未徹底從水體中去除。如張清敏等研制了一種修復(fù)水環(huán)境的微生態(tài)菌制劑(張清敏，王蘭，胡國臣等，修復(fù)養(yǎng)殖水環(huán)境的微生態(tài)菌制劑及其制備方法，專利申請?zhí)?00410019818.4)，具有該制劑適應(yīng)性強，活菌數(shù)高，對養(yǎng)殖水生環(huán)境修復(fù)效果好，但是其主要效果在于穩(wěn)定氨態(tài)氮(NH4+-N)，并保持在一定水平上，并沒有將過剩的氮素徹底地從污染水體中去除。
目前對于湖泊、水庫等天然水體水生態(tài)修復(fù)和生態(tài)工程技術(shù)主要以水生植物的修復(fù)和水生生物恢復(fù)為主，包括水生魚類(生物調(diào)控技術(shù))、底棲動物等，基本沒有考慮到水生態(tài)系統(tǒng)中除了水生植物、水生動物之外的另一個重要環(huán)節(jié)的微生物的作用。如張治等發(fā)明了一種富營養(yǎng)化小水體的生態(tài)修復(fù)方法，主要由菹草、黑藻、馬來眼子菜、輪藻、狐尾藻等組成(張治，周忠良，林晨，呂亞佳等，富營養(yǎng)化淺水小水體的生態(tài)修復(fù)方法，專利申請?zhí)?3115845.5)對各種水生植物凈化富營養(yǎng)化水體的作用進行了專利申請保護，但卻沒有對水生微生物對凈化水質(zhì)的作用進行闡述。

發(fā)明內(nèi)容
1、要解決的技術(shù)問題現(xiàn)有技術(shù)提供的高效氮循環(huán)細菌的篩選和富集仍不能滿足水生態(tài)修復(fù)和水處理的要求，本發(fā)明提供一種高效氮循環(huán)細菌的人工篩選，篩選出能較好的用于水生態(tài)修復(fù)和水處理的高效氮循環(huán)細菌。該高效氮循環(huán)細菌的人工篩選用于水生態(tài)修復(fù)和水處理時，可以提高菌種的篩選速度，加快氮素污染物的轉(zhuǎn)化，較好的對氮污染型富營養(yǎng)化水體進行生態(tài)修復(fù)。
2、技術(shù)方案高效氮循環(huán)細菌人工篩選，其主要包括以下步驟(a)在天然水體中水生植物生長根區(qū)采集含有土著氮循環(huán)細菌的水樣；(b)分別配制氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養(yǎng)基，接入水樣置于搖床上培養(yǎng)，進行擴培；(c)再分別配置固體培養(yǎng)基，將四種擴培后的菌種轉(zhuǎn)至平板培養(yǎng)；根據(jù)平板上長出的單個微生物，選擇其中長勢較好的分別進行富集培養(yǎng)，中間進行鏡檢觀測；(d)用初步分離的方法再次分離純化，將分離純化后的菌種投放待測水樣中進行轉(zhuǎn)化試驗，分別測N的轉(zhuǎn)化率，以轉(zhuǎn)化率高的菌為優(yōu)選菌。
步驟(b)中可以根據(jù)需要配制氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養(yǎng)基的一種或幾種。步驟(b)和步驟(c)中的四種細菌培養(yǎng)基的確定以使四種細菌分別擴培為目的。
高效氮循環(huán)細菌人工篩選在水生態(tài)修復(fù)和水處理中的應(yīng)用，其步驟包括(e)將所述的高效氮循環(huán)細菌人工篩選得到的高效氮循環(huán)細菌進行富集；
(f)將富集后的氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌優(yōu)選菌混合后，投入制備好的載體進行固定化；(g)將制備好的固定化氮循環(huán)細菌置入廢水處理裝置中進行廢水處理或?qū)⒐潭ɑh(huán)細菌用特制裝置置入自然水體中，對自然水體進行生態(tài)修復(fù)。
步驟(e)中采用連續(xù)進水方式對優(yōu)選菌進行富集培養(yǎng)，分別按照氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌分類配制液體培養(yǎng)基，通過恒流泵控制進量，通過溶解氧探頭監(jiān)測各種氮循環(huán)細菌富集過程中的DO值，溫度保持在28±1℃，定期收集，在0～4℃溫度條件下，7000r～12000r/min離心分別得到氨化、硝化、亞硝化和反硝化細菌。
氮循環(huán)細菌優(yōu)勢菌富集培養(yǎng)裝置包括培養(yǎng)基貯罐、恒流泵、恒溫培養(yǎng)箱。
進行水生態(tài)修復(fù)時，步驟(g)中可以在自然水體中布設(shè)浮島，浮島懸掛固定化氮循環(huán)細菌釋放裝置，該裝置將固定化氮循環(huán)細菌載體放置于具有網(wǎng)眼的容器中，使得固定化細菌能夠接觸水體，從而通過這種方式將固定化氮循環(huán)細菌釋放到自然水體中，對自然水體進行生態(tài)修復(fù)。
大多數(shù)富營養(yǎng)化湖泊水體的空間異質(zhì)性差，缺乏相互分異的氧化-還原微環(huán)境，僅僅在水與沉積物界面存在明顯的相互分異的氧化-還原微環(huán)境。從宏觀上看，應(yīng)用固定化氮循環(huán)細菌技術(shù)，由于采用具有特殊微孔結(jié)構(gòu)的固定化載體，構(gòu)成了載體內(nèi)外相互分異的硝化-反硝化微環(huán)境，這樣便提供了一種存在于厘米尺度上的人工制造的氧化-還原界面。這種人工微環(huán)境在自然水體中的存在類似于自然水體中水-沉積物界面具有的硝化-反硝化功能，人為營造了一種具有良好水氣通道和硝化-反硝化微孔立體結(jié)構(gòu)界面的微環(huán)境，將僅存在于自然水體中水-沉積物界面的氧化-還原微環(huán)境從平面擴展到了立體空間。載體的這種人工微環(huán)境在自然水體中的存在，彌補了目前富營養(yǎng)化湖泊水體中因大量水生高等植物衰亡導(dǎo)致的水體均一性增加、非均一性(異質(zhì)性)減少而使氧化-還原環(huán)境惡變及水體自凈能力下降的不足。由于固定化載體在水體中的布設(shè)起到了一種在類似于荒漠化的均一性自然水體中引入一種人工制造的非均一性的劇烈的氧化-還原環(huán)境，大大增加了水體的硝化-反硝化能力，增加了水體氮素的轉(zhuǎn)化效果。另一方面，從微觀上來說，隨著氮循環(huán)細菌從載體中向水體釋放和擴散，水體中的氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌、反硝化細菌數(shù)量大大增加，水體中的有機氮經(jīng)氮循環(huán)細菌氨化作用轉(zhuǎn)化為氨氮和氣態(tài)的NH3，氨氮在載體表面富氧區(qū)被氧化成硝態(tài)氮，硝態(tài)氮在固定化載體內(nèi)部缺氧區(qū)被反硝化細菌還原為氣態(tài)氮并進入大氣，水體中不同形態(tài)的氮營養(yǎng)鹽正是在生態(tài)工程實驗區(qū)水體中氮循環(huán)細菌釋放區(qū)域數(shù)量分布上的差異，在水域內(nèi)交替進行硝化-反硝化的過程中逐漸被去除。
應(yīng)用實施時對生態(tài)工程實際布設(shè)區(qū)的周邊自然環(huán)境與污染源進行調(diào)查，確定鄰近水體的流態(tài)與進水水質(zhì)，確定工程區(qū)的具體分布，并開始進行工程區(qū)水體水質(zhì)監(jiān)測。當(dāng)工程區(qū)水體水質(zhì)和水溫確定已經(jīng)能夠保證水生高等植物生長時，向人工浮島引種水生高等植物。水生高等植物的引種，使水體中增加了許多根際微生態(tài)系統(tǒng)，而固定化氮循環(huán)細菌的釋放，又使水生高等植物根際細菌明顯增加，從而強化了氮循環(huán)細菌-水生植物互利共生凈化實驗區(qū)水質(zhì)效果。
3、有益效果本發(fā)明通過改進菌種的篩選和富集方法，得到除氮效果更好的高效氮循環(huán)細菌。這些高效氮循環(huán)細菌應(yīng)用于生活污水、工業(yè)廢水的治理以及對富營養(yǎng)化水體的生態(tài)修復(fù)時，增強了生態(tài)工程-固定化技術(shù)對惡劣環(huán)境的耐受能力，克服以往技術(shù)在秋冬季節(jié)基本失效或被迫停止的缺點，實現(xiàn)了生態(tài)工程在較低溫度下的連續(xù)運行。增加了固定化氮循環(huán)細菌-水生植物互利共生凈化實驗區(qū)水質(zhì)效果。通過氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌的作用，使自然水體、生活污水、工業(yè)廢水中各種形態(tài)的氮按照氮循環(huán)反應(yīng)逐步被去除，反應(yīng)終產(chǎn)物主要為氮氣，避免了對氮污染的治理僅僅成為氮素離子形態(tài)的轉(zhuǎn)變和簡單遷移。對氮素去除具有明顯的效果。
四

圖1為高效氮循環(huán)細菌人工篩選流程示意圖；圖2為氮循環(huán)細菌優(yōu)勢菌的富集培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為各種氮循環(huán)細菌培養(yǎng)基的成分組成；圖4-氮循環(huán)細菌1號革蘭氏陽性菌株(氨化細菌)形態(tài)圖；圖5-氮循環(huán)細菌2號革蘭氏陰性菌株(硝化細菌)形態(tài)圖；圖6-氮循環(huán)細菌3號革蘭氏陰性菌株(亞硝化細菌)形態(tài)圖；
圖7-氮循環(huán)細菌4號革蘭氏陰性菌株(反硝化細菌)形態(tài)圖。
五具體實施例方式
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明實施例11.采集細菌水樣在湖泊等水體中的各種水生高等植物生長區(qū)，用已滅菌的無菌試管(15×1.5cm)伸入水面以下20～30cm水層取樣，取樣后立即封口，在實驗室待接種。
2.第一次擴培分別配制硝化細菌、反硝化細菌、亞硝化細菌、氨化細菌培養(yǎng)基各200ml，(其中硝化細菌的培養(yǎng)基成分為NaNO31g，Na2CO31g，NaCl 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，F(xiàn)eSO40.4g，H2O 1000ml，pH值8.2；亞硝化細菌培養(yǎng)基成分為(NH4)2SO40.2g，K2HPO40.1g，MgSO40.05g，NaCl 0.2g，F(xiàn)eSO40.04g，CaCO30.5g，H2O 100ml，pH值7.2；氨化細菌的培養(yǎng)基成分為牛肉膏4.5g，蛋白胨9.0g，NaCl 4.5g，H2O 1000ml，pH值7.2～7.4；反硝化細菌培養(yǎng)基成分為KNO32g，檸檬酸鈉5g，K2HPO41g，KH2PO41g，MgSO40.2g，H2O 1000ml，pH值7.2～7.6。每種培養(yǎng)基分別裝入兩個250ml錐形瓶中，每瓶100ml，121℃濕熱滅菌20min，無菌條件下向每個錐形瓶中接入5ml水樣，置于搖床上28℃培養(yǎng)48h，并觀察菌種生長狀態(tài)。
3.初步分離分別配置各種菌的固體培養(yǎng)基，將擴培后的菌種進行平板劃線分離，每瓶液體培養(yǎng)基劃4個平板。28℃培養(yǎng)48h，注意觀察菌種生長狀況。
4.富集根據(jù)平板上長出的單個微生物，選擇其中長勢較好的分別進行富集培養(yǎng)。這些單個微生物有可能是同種微生物，也有可能是不同種微生物。28℃培養(yǎng)48h，中間進行鏡檢觀測。
5.分離純化方法同初步分離
6.檢測轉(zhuǎn)化效果將分離純化后的菌種投放待測水樣中進行轉(zhuǎn)化試驗，分別測N的轉(zhuǎn)化率，以轉(zhuǎn)化率高的菌為優(yōu)選菌，標(biāo)記待混合。
7.第二次富集采用附圖2氮循環(huán)細菌富集裝置分別對分離純化后的氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌進行第二次富集，以備固定化氮循環(huán)細菌之用。實驗裝置包括液體培養(yǎng)基貯存罐(1)、恒流泵(2)、溶解氧探頭和溶解氧控制器(4)、恒溫培養(yǎng)箱(3)和氮循環(huán)細菌搜集罐(5)。溫度保持在28±1℃，pH值控制在7.2～8.5之間。基本富集流程如下分別按照氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌分類配制液體培養(yǎng)基，通過恒流泵控制進量，其中富集氨化細菌時pH控制在7.2～7.4之間，富集硝化細菌時pH控制在8.3～8.6之間，富集亞硝化細菌時pH控制在7.1～7.3之間，富集反硝化細菌時pH控制在7.2～7.6之間；通過溶解氧探頭監(jiān)測各種氮循環(huán)細菌富集過程中的DO值；氨化、硝化、亞硝化細菌富集時控制溶解氧5.0～8.0之間，反硝化細菌富集時控制溶解氧在1.0以下；各種氮循環(huán)細菌富集時溫度保持在28±1℃，定期收集，在0～4℃溫度條件下，7000r～12000r/min離心分別得到氮化、硝化、亞硝化和反硝化細菌備用。
8.固定化優(yōu)選菌將富集后的氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌優(yōu)選菌混合后，投入制備好的載體進行固定化。
實施例2高效固定化氮循環(huán)細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)應(yīng)用于湖泊、水庫等水體的富營養(yǎng)化生態(tài)工程和生態(tài)修復(fù)(以貴陽紅楓湖為例)應(yīng)用實施方法A.制備固定化氮循環(huán)細菌(包括固定化氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌)B.對生態(tài)工程實際布設(shè)區(qū)的周邊自然環(huán)境與污染源進行調(diào)查，確定鄰近水體的流態(tài)與進水水質(zhì)，確定工程區(qū)的具體分布，并開始進行工程區(qū)水體水質(zhì)監(jiān)測。在紅楓湖上流5600m2水域內(nèi)，建設(shè)全年高效凈化水質(zhì)的生態(tài)工程區(qū)域，在生態(tài)工程區(qū)內(nèi)布設(shè)4個25m2剛性浮島和2個100m2軟體浮島，每一個生態(tài)浮島懸掛一個固定化氮循環(huán)細菌釋放裝置，該裝置將固定化氮循環(huán)細菌載體放置于特制的具有網(wǎng)眼的容器中，使得固定化細菌能夠接觸水體，并置于水面之下20～30cm處。采用固定化氮循環(huán)細菌作為貴陽紅楓湖生態(tài)工程區(qū)的先鋒種群，運用固定化高效氮循環(huán)細菌轉(zhuǎn)化實驗區(qū)水體氮素，另外通過載體的微孔結(jié)構(gòu)形成的硝化-反硝化環(huán)境轉(zhuǎn)化實驗區(qū)水體氮素污染物；同時，載體中氮循環(huán)細菌的釋放增加生態(tài)工程實驗區(qū)單位體積水體中的氮循環(huán)細菌數(shù)量，并初步增加了水體中的硝化-反硝化界面，增強了實驗區(qū)水體的氮素釋放活動，為下一步引種水生高等植物創(chuàng)造了條件。
C.監(jiān)測工程區(qū)水體水質(zhì)和水溫，當(dāng)確定已經(jīng)能夠保證水生高等植物生長時，向人工浮島引種水生高等植物。水生高等植物的引種，使水體中增加了許多根際微生態(tài)系統(tǒng)，而固定化氮循環(huán)細菌的釋放，又使水生高等植物根際細菌明顯增加，從而強化了氮循環(huán)細菌-水生植物互利共生凈化實驗區(qū)水質(zhì)效果。
高效氮循環(huán)細菌人工篩選應(yīng)用于湖泊、水庫等天然水體的富營養(yǎng)化生態(tài)工程和生態(tài)修復(fù)與其它技術(shù)相比有以下明顯優(yōu)點A)采用固定化細菌技術(shù)，增強生態(tài)工程-固定化技術(shù)對惡劣環(huán)境的耐受能力，克服以往技術(shù)在秋冬季節(jié)基本失效或被迫停止的缺點，實現(xiàn)了生態(tài)工程在較低溫度下的連續(xù)運行。
B)固定化氮循環(huán)細菌運行一定時間后在載體微孔中形成溶解氧梯度分布、表面好氧、內(nèi)部厭氧的環(huán)境，使氮循環(huán)細菌在載體呈上梯度分布，為連續(xù)硝化-反硝化反應(yīng)提供了條件；同時，在均一化水體中，載體的存在引入了大量硝化-反硝化界面，極大地增強了水體的不均一性，提供了湖泊、水庫等水體硝化與反硝化條件，增強了硝化-反硝化效果。
C)因固定化氮循環(huán)細菌生長與繁殖較快，并向周圍水體擴散，使引種的水生高等植物根際微生物數(shù)量比無固定化氮循環(huán)細菌人工浮島處水生高等植物根際微生物高1～2個數(shù)量級，增加了固定化氮循環(huán)細菌-水生植物互利共生凈化實驗區(qū)水質(zhì)效果。
D)固定化氮循環(huán)細菌作為先鋒物種改善了荒漠化水體的水質(zhì)，為水生高等植物等的引種提供了條件。
E)本方法以固定化氮循環(huán)菌的釋放為基礎(chǔ)，而釋放出的氮循環(huán)菌將隨水流進入下游水體，促進下游水體的氮素釋放，并抑制大腸桿菌等有害菌群的生長，增強全流域的自凈能力與生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
F)采用高效固定化氮循環(huán)細菌治理水體中氮污染，反應(yīng)終產(chǎn)物主要為氮氣，而不是停留在有害的中間產(chǎn)物狀態(tài)，避免了對氮污染的治理僅僅成為氮素離子形態(tài)的轉(zhuǎn)變和簡單遷移。
經(jīng)過固定化氮循環(huán)細菌治理后，實驗區(qū)總氮、非離子氨和亞硝酸鹽氮分別比工程前明顯降低，工程后排入紅楓湖的非離子氨＜0.02mg/L，NO2--N≤0.1mg/L，工程后Chla平均值僅為3.5ug/L，達到了生態(tài)工程修復(fù)水體的效果。
實施例3高效固定化氮循環(huán)細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)應(yīng)用于河流等流動水體(以貴陽后午灣為例)具體實施方案A.在天然水體水生植物生長根區(qū)取水樣待接種B.按實施例1進行擴培、初步分離、富集、純化、二次富集后，得到高效的硝化細菌、亞硝化細菌、氨化細菌、反硝化細菌。其中硝化細菌的培養(yǎng)基成分為NaNO31.1g，Na2CO31.2g，NaCl 0.7g，K2HPO40.6g，MgSO40.6g，F(xiàn)eSO40.5g，H2O 1000ml，pH值8.5；亞硝化細菌培養(yǎng)基成分為(NH4)2SO40.3g，K2HPO40.2g，MgSO40.06g，NaCl 0.3g，F(xiàn)eSO40.05g，CaCO30.6g，H2O 100ml，pH值7.5；氨化細菌的培養(yǎng)基成分為牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，H2O 1000ml，pH值7.6；反硝化細菌培養(yǎng)基成分為KNO32.1g，檸檬酸鈉5.2g，K2HPO41.1g，KH2PO41.1g，MgSO40.3g，H2O 1000ml，pH值7.8。
C.將四種氮循環(huán)細菌混合投入載體中，制成高效的固定化氮循環(huán)細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)D.對后午灣的周邊自然環(huán)境與污染源進行調(diào)查，確定鄰近水體的流態(tài)與進水水質(zhì)，確定工程區(qū)的具體分布，并開始進行工程區(qū)水體水質(zhì)監(jiān)測。
E.在后午灣建立生態(tài)工程實驗區(qū)，實驗區(qū)分為對照區(qū)、固定化氮循環(huán)細菌實驗區(qū)，水生植物+固定化氮循環(huán)細菌實驗區(qū)，將20kg固定化氮循環(huán)細菌分為5kg，5kg，5kg，5kg四部分，分別用生態(tài)浮島布置于固定化氮循環(huán)細菌實驗區(qū)與水生植物+固定化氮循環(huán)細菌實驗區(qū)的兩端，每一個生態(tài)浮島懸掛一個固定化氮循環(huán)細菌釋放裝置，該裝置將固定化氮循環(huán)細菌載體放置于特制的具有網(wǎng)眼的容器中，并置于水面之下20～30cm處，使得固定化細菌能夠接觸水體。
F.載體中氮循環(huán)細菌的釋放增加單位體積水體中的氮循環(huán)細菌數(shù)量，并初步增加了水體中的硝化-反硝化界面，增強了生態(tài)工程試驗區(qū)水體的氮素釋放活動，為下一步引種水生高等植物創(chuàng)造了條件。
G.監(jiān)測工程區(qū)水體水質(zhì)，當(dāng)確定已經(jīng)能夠保證水生高等植物生長時，向人工浮島引種水生高等植物。水生高等植物的引種，使水體中增加了許多根際微生態(tài)系統(tǒng)，強化了氮循環(huán)細菌的處理效果。而固定化氮循環(huán)細菌的釋放，又使水生高等植物根際細菌明顯增加；且隨著水流的運動，氮循環(huán)細菌進一步向下游擴散，促進下游水體的氮素擴散，增強全流域的自凈能力。
應(yīng)用效果應(yīng)用本方法釋放氮循環(huán)細菌對后午灣試驗區(qū)內(nèi)水生植物根區(qū)細菌數(shù)量有明顯的影響，生態(tài)浮島內(nèi)水生植物根區(qū)的反硝化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和氨化細菌數(shù)量均在4至6個數(shù)量級之間，明顯高于無生態(tài)浮島內(nèi)的水生植物根區(qū)細菌數(shù)，平均高1～2個數(shù)量級，其中反硝化細菌、亞硝化細菌和氨化細菌MPN值達極顯著水平(P＜0.01)；F檢驗結(jié)果表明，出水處反硝化細菌MPN值均極顯著高于進水處MPN值(P＜0.01)；方差分析表明，上敞水區(qū)、下敞水區(qū)、距固定化氮循環(huán)細菌10cm、30cm處，以及出水處的亞硝化細菌MPN值均極顯著高于進水處亞硝化細菌MPN值(P＜0.005)；試驗區(qū)內(nèi)各處的氨化細菌MPN值均極顯著高于進水處的氨化細菌MPN值(P＜0.005)；釋放的硝化細菌數(shù)在試驗區(qū)內(nèi)各處均明顯高于進水處，其中距固定化氮循環(huán)菌人工浮島10cm處的硝化細菌數(shù)最高，其MPN值極顯著高于進水處(P＜0.001)。試驗期間，下游水域中氮循環(huán)細菌數(shù)也明顯高于進水處。
經(jīng)過固定化氮循環(huán)細菌治理后，實驗區(qū)總氮、亞硝酸鹽氮、非離子氨分別比工程前明顯降低，TN、NO3-、NH3從工程前的最高值4.613mg/L、0.075mg/L、0.15mg/L工程后分別下降為0.21mg/L，0.008mg/L，和0.05mg/L，表明采用高效固定化氮循環(huán)細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化細菌)技術(shù)對應(yīng)用于河流等流動水體的氮素去除具有明顯的效果。
實施例4高效固定化氮循環(huán)細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)應(yīng)用于處理溫度變化范圍廣的廢水(能適應(yīng)80℃的高溫，并在7℃的冬季水體中仍能保持活性)a在天然水體水生植物生長根區(qū)取水樣待接種b按實例1進行擴培、初步分離、富集、純化、二次富集后，得到高效的硝化細菌、亞硝化細菌、氨化細菌、反硝化細菌。其中硝化細菌的培養(yǎng)基成分為NaNO30.8g，Na2CO30.9g，NaCl 0.4g，K2HPO40.4g，MgSO40.4g，F(xiàn)eSO40.3g，H2O 1000ml，pH值8.0；亞硝化細菌培養(yǎng)基成分為(NH4)2SO40.1g，K2HPO40.1g，MgSO40.04g，NaCl 0.1g，F(xiàn)eSO40.03g，CaCO30.4g，H2O 100ml，pH值7.0；氨化細菌的培養(yǎng)基成分為牛肉膏4.0g，蛋白胨8.0g，NaCl 4.0g，H2O 1000mlpH值7.0；反硝化細菌培養(yǎng)基成分為KNO31.8g，檸檬酸鈉4.8g，K2HPO40.8g，KH2PO40.8g，MgSO40.1g，H2O 1000ml，pH值7.0。
c將四種氮循環(huán)細菌混合投入載體中，制成高效的固定化氮循環(huán)細菌(氨化-硝化-亞硝化-反硝化)d將固定化氮循環(huán)細菌投入廢水處理裝置中，當(dāng)實驗湖水溫度下降至7℃時，出水的TN、NH4+-N的去除率分別比進水下降55.6％和58.9％，雖然呈現(xiàn)出一定的溫度效應(yīng)，但此結(jié)果表明固定化氮循環(huán)細菌在冬季低溫條件下仍保持了較高的除氮能力；當(dāng)實驗湖水升到50℃時，載體內(nèi)所含氮循環(huán)細菌MPN值比游離細菌高4個數(shù)量級；當(dāng)實驗水溫上升到80℃高溫時，載體內(nèi)氮循環(huán)細菌仍保持了一定數(shù)量的存活數(shù)。
實施例5高效固定化氨化-硝化細菌應(yīng)用于處理高濃度氮污染廢水a(chǎn)取污水處理廠中好氧段水樣和硝化污泥，用待處理廢水進行馴化，得到高效氨化細菌和硝化細菌。
b將氨化細菌和硝化細菌按實例1分別進行二次富集后，混合投入載體中，制成高效的固定化氨化-硝化細菌。
c將固定化氨化-硝化細菌投入污水處理裝置中，進水總氮(TN)為112mg/l，銨氮(NH4+-N)為60.5mg/L。工藝運行條件為缺氧攪拌3h，曝氣7h，沉淀排水3h，滯留時間為13h。實驗溫度為(28±1)℃。結(jié)果表明，經(jīng)過30d連續(xù)凈化試驗，合成廢水經(jīng)過高效固定化氨化-硝化細菌處理后，TN、NH4+-N濃度均有不同程度下降，凈化效果逐步明顯，試驗第10天，每批次出水的TN和NH4+-N的去除率穩(wěn)定在75％和92％左右。
實施例6高效固定化硝化-反硝化細菌應(yīng)用于處理生活污水a(chǎn)取污水處理廠好氧段硝化污泥，用人工廢水馴化后得到高效硝化細菌b取污水處理廠厭氧段反硝化污泥，用人工廢水馴化后得到高效反硝化細菌c將得到的硝化細菌和反硝化細菌混合后固定化，制成高效固定化硝化-反硝化細菌。投入污水處理裝置中，進水CODCr為240mg/L，BOD5為98mg/L，銨氮(NH4+-N)為23mg/L，pH值為6～9，控制滯流時間為8h，缺氧攪拌2h，曝氣6h。經(jīng)處理后污水CODCr去除率達78％，NH4+-N的去除率高達95％。
實施例7高效固定化硝化細菌應(yīng)用于處理廢水中的NH4+-N。
a.取污水處理廠好氧段硝化污泥，用人工廢水馴化后得到供試硝化細菌。
b.將固定化硝化細菌投入污水處理裝置中，進水NH4+-N為60.5mg/L，曝氣時間為9h，沉淀、排水、閑置、進水時間共3h。結(jié)果表明，在30d的連續(xù)運行過程中，開始時NH4+-N的去除率逐日升高，10d后穩(wěn)定達到每周期去除銨態(tài)氮95％。同時在進水時CODCr為340.7mg/L條件下，經(jīng)過15d的連續(xù)運行，CODCr的去除率穩(wěn)步增加到90％左右。
實施例8高效固定化反硝化細菌應(yīng)用于處理廢水中的硝酸鹽a取污水處理廠生物脫氮缺氧段污泥，用合成廢水(含甲醇、硝酸鈉、硝酸鉀及適量KH2PO4、NaMoO4等，控制pH值為8)馴化65d，得到反硝化菌。
b將固定化反硝化細菌投入污水處理裝置中，在30d的連續(xù)運行過程中，NO3-態(tài)N的去除率穩(wěn)定增加，20d后達到良好的去除效果，硝酸鹽的去除率達78.5％并進入穩(wěn)定的運行狀態(tài)即在第20～30d的運行過程中硝酸鹽的去除率穩(wěn)定在78.5％左右。
實施例9高效氨化-硝化-亞硝化固定化細菌應(yīng)用于處理高負荷有機質(zhì)廢水a(chǎn)取污水處理廠好氧段硝化污泥，按實例1進行分離純化，用人工廢水馴化后分別得到高效氨化細菌、硝化細菌和亞硝化細菌。
b將得到的氨化細菌、硝化細菌和亞硝化細菌混合后固定化，制成高效固定化氨化-硝化-亞硝化細菌。投入污水處理裝置中，進水CODCr為473.8mg/L，經(jīng)高效固定化氨化-硝化-亞硝化細菌處理后，出水CODCr大幅度降低，去除率達到76％。
權(quán)利要求
1.一種高效氮循環(huán)細菌人工篩選，其主要包括以下步驟(a)在天然水體中水生植物生長根區(qū)采集含有土著氮循環(huán)細菌的水樣；(b)分別配制氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養(yǎng)基，接入水樣置于搖床上培養(yǎng)，進行擴培；(c)再分別配置固體培養(yǎng)基，將四種擴培后的菌種轉(zhuǎn)至平板培養(yǎng)；根據(jù)平板上長出的單個微生物，選擇其中長勢較好的分別進行富集培養(yǎng)，中間進行鏡檢觀測；(d)用初步分離的方法再次分離純化，將分離純化后的菌種投放待測水樣中進行轉(zhuǎn)化試驗，分別測N的轉(zhuǎn)化率，以轉(zhuǎn)化率高的菌為優(yōu)選菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效氮循環(huán)細菌人工篩選，其特征在于步驟(b)中可以根據(jù)需要配制氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養(yǎng)基的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效氮循環(huán)細菌人工篩選，其特征在于所述的步驟(b)和步驟(c)中的四種細菌培養(yǎng)基的確定以使四種細菌分別擴培為目的。
4.一種高效氮循環(huán)細菌人工篩選在水生態(tài)修復(fù)和水處理中的應(yīng)用，其步驟包括(e)將權(quán)利要求1所述的高效氮循環(huán)細菌人工篩選得到的高效氮循環(huán)細菌進行富集；(f)將富集后的氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌優(yōu)選菌混合后，投入制備好的載體進行固定化；(g)將制備好的固定化氮循環(huán)細菌投入廢水處理裝置中進行廢水處理或?qū)⒐潭ɑh(huán)細菌投入到自然水體中對自然水體進行生態(tài)修復(fù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效氮循環(huán)細菌人工篩選在水生態(tài)修復(fù)和水處理中的應(yīng)用，其特征在于步驟(e)中采用連續(xù)進水方式對優(yōu)選菌進行富集培養(yǎng)，分別按照氨化細菌、硝化細菌、亞硝化細菌和反硝化細菌分類配制液體培養(yǎng)基，通過恒流泵控制進量，通過溶解氧探頭監(jiān)測各種氮循環(huán)細菌富集過程中的D0值，溫度保持在28±1℃，定期收集，在0～4℃溫度條件下，7000r～12000r/min離心分別得到氨化、硝化、亞硝化和反硝化細菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效氮循環(huán)細菌人工篩選在水生態(tài)修復(fù)和水處理中的應(yīng)用，其特征在于氮循環(huán)細菌優(yōu)勢菌富集培養(yǎng)裝置包括培養(yǎng)基貯罐(1)、恒流泵(2)、恒溫培養(yǎng)箱(3)。
7.根據(jù)權(quán)利要求4～6所述的高效氮循環(huán)細菌人工篩選在水生態(tài)修復(fù)和水處理中的應(yīng)用，其特征在于步驟(g)中可以在自然水體中布設(shè)浮島，浮島懸掛固定化氮循環(huán)細菌釋放裝置，該裝置將固定化氮循環(huán)細菌載體放置于具有網(wǎng)眼的容器中，使得固定化細菌能夠接觸水體，從而通過這種方式將固定化氮循環(huán)細菌釋放到自然水體中，對自然水體進行生態(tài)修復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物人工篩選技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物人工篩選及其在環(huán)境治理中的應(yīng)用。高效氮循環(huán)細菌人工篩選，其步驟為(a)采集含有土著氮循環(huán)細菌的水樣；(b)分別配制氨化細菌、亞硝化細菌、硝化細菌及反硝化細菌培養(yǎng)基，進行擴培；(c)將四種擴培后的菌種轉(zhuǎn)至平板培養(yǎng)；然后進行富集培養(yǎng)，中間進行鏡檢觀測；(d)分離純化，以轉(zhuǎn)化率高的菌為優(yōu)選菌。本發(fā)明增強了生態(tài)工程－固定化技術(shù)對惡劣環(huán)境的耐受能力，克服以往技術(shù)在秋冬季節(jié)基本失效或被迫停止的缺點，實現(xiàn)了生態(tài)工程在較低溫度下的連續(xù)運行。通過四種細菌的作用，使自然水體、生活污水、工業(yè)廢水中各種形態(tài)的氮按照氮循環(huán)反應(yīng)逐步被去除，對氮素去除具有明顯的效果。
文檔編號C12N1/20GK1693449SQ20051003883
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月12日
發(fā)明者李正魁, 濮培民, 寧安, 洪宇寧 申請人:南京大學(xué)