專利名稱:抗人ox40l單克隆抗體的制備及其應(yīng)用的制作方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽,更具體地說,本發(fā)明涉及抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7,其制備方法以及這些單克隆抗體在抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、刺激T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化成熟、刺激T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化及抗體分泌中的應(yīng)用。
發(fā)明的背景已知有許多受體-配體相互作用都參與誘導(dǎo)、建立和調(diào)節(jié)抗原特異性免疫反應(yīng)。為了有效地激活T細(xì)胞反應(yīng),通常至少需要兩個(gè)信號(hào)。其中除T細(xì)胞抗原受體(TCR)識(shí)別抗原提呈細(xì)胞(APC)上的MHC-抗原復(fù)合物以提供第一信號(hào)即抗原特異性信號(hào)外,還必須獲得T細(xì)胞與APC表達(dá)的共刺激分子相互作用后產(chǎn)生的非抗原特異性、非MHC限制性的第二信號(hào)。第二信號(hào)即為共刺激信號(hào)或協(xié)同刺激信號(hào)。如果僅有抗原特異性信號(hào)而缺失共刺激信號(hào),T細(xì)胞將表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)或免疫耐受狀態(tài),甚至導(dǎo)致凋亡??梢姡泊碳ば盘?hào)是T細(xì)胞克隆擴(kuò)增、分化和發(fā)揮生物效應(yīng)所必不可少的。因此可以認(rèn)為,第一信號(hào)決定了T細(xì)胞活化的特異性,而第二信號(hào)則決定T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答能否有效進(jìn)行(Noelle RJ,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.896550,1992;Allen RC et al.,Science.259990,1993)。
近年來,分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究,共刺激分子被不斷發(fā)現(xiàn)。根據(jù)其結(jié)構(gòu),這些共刺激分子可分為兩類一類是腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體(TNF/TNFR)超家族,包括CD40/CD154、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-1BB/4-1BBL、OX40/OX40L、RANK/RANKL和Fas/FasL等。另一類是免疫球蛋白超家族,如B7-CD28/CTLA4、LAF1-ICAM-1/ICAM-2/ICAM-3、ICOS-GL50、CD2/LFA-3等(Korthauer U et al.,Nature,361539,1993)。這些共刺激分子以受體和配體相互作用的方式傳導(dǎo)信號(hào)。受體和配體一般表達(dá)在不同的細(xì)胞表面,通常一個(gè)為持續(xù)性表達(dá),一個(gè)是誘導(dǎo)性表達(dá)。在免疫應(yīng)答的不同階段,這些分子以各自獨(dú)特而又相關(guān)聯(lián)的方式參與信號(hào)傳導(dǎo),共同調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答。
人OX40配體(OX40L或CD134L)是1991年由Miura等人克隆的,它屬TNF超家族,為分子量約34-40KD的II型跨膜糖蛋白。人OX40L主要在成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)、活化的B細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞(ECV)、臍帶靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面上,以及心、骨骼肌、睪丸和肺等組織器官中表達(dá)。OX40/OX40L途徑主要在T細(xì)胞反應(yīng)的晚期發(fā)揮作用,具有促進(jìn)活化的CD4+T細(xì)胞克隆增生、增強(qiáng)細(xì)胞效應(yīng)、延長(zhǎng)細(xì)胞存活期以及增加記憶T細(xì)胞的數(shù)量等功能。另外,OX40/OX40L還能傳遞逆向信號(hào)促進(jìn)B細(xì)胞擴(kuò)增分化為漿細(xì)胞,分泌各型抗體。在OX40/OX40L信號(hào)作用下使M0期樹突狀細(xì)胞(M0-DC細(xì)胞)表型CD80、CD86、CD54、CD40的表達(dá)上調(diào),促進(jìn)分泌型CD40L(sCD40L)活化的IL-4-M0-DC細(xì)胞分泌IL-12、TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子,表明OX40L可增強(qiáng)sCD40L活化未成熟IL-4-Mo-DC的能力,促進(jìn)DC成熟。
近年來研究表明,OX40/OX40L信號(hào)通路可在介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答、抗移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病的過程中發(fā)揮重要作用。在多種自身免疫性疾病的炎癥部位,都能分離到OX40+的CD4+T細(xì)胞,而且這些炎癥部位的OX40+T細(xì)胞就是自身抗原特異性T細(xì)胞。這些抗原特異性T細(xì)胞最終可引起自身免疫反應(yīng),出現(xiàn)臨床癥狀。在小鼠實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎(EAE)模型中,阻斷OX40/OX40L通路能夠明顯地緩解動(dòng)物的癥狀。同樣,阻斷OX40/OX40L通路亦可顯著地延長(zhǎng)皮膚移植及心臟移植小鼠的生存時(shí)間。另外,腫瘤組織相應(yīng)部位的腫瘤特異性O(shè)X40+T細(xì)胞在機(jī)體抗腫瘤中也具有重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí),增強(qiáng)OX40信號(hào)可阻止小鼠腫瘤形成,同時(shí)提高荷瘤小鼠的生存率。OX40只在炎癥和腫瘤浸潤(rùn)部位的抗原特異性T細(xì)胞上特異性高表達(dá),使其成為一個(gè)理想的免疫干預(yù)的靶分子。因此,抗OX40L單抗將有希望成為臨床干預(yù)自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)和腫瘤的理想的診斷和治療劑。
盡管有關(guān)OX40/OX40L受體配體結(jié)合對(duì)的T細(xì)胞刺激功能、OX40或OX40L抗體的制備及它們的其他免疫學(xué)功能都是已知的,但如本發(fā)明的新的抗人OX40L單克隆抗體及其相對(duì)比較簡(jiǎn)單的制備方法卻未見報(bào)道。而且,文獻(xiàn)報(bào)道的抗人OX40L單克隆抗體大多是用來抑制T細(xì)胞增殖、阻斷B細(xì)胞分泌的阻斷型抗體,而本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體則具有不同的生物學(xué)功能。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一組選自9H10、4C12和1E7的抗人OX40L單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案,抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12的重鏈和輕鏈分別具有如序列表中SEQ ID NO6至SEQ ID NO9所示氨基酸序列,并且抗人OX40L單克隆抗體1E7的重鏈具有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案,如上限定的抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7是抗可溶性人OX40L的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備如上限定的抗人OX40L單克隆抗體的方法,該方法包括(1)用預(yù)制備的高表達(dá)人OX40L分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為免疫原免疫動(dòng)物;(2)分離被免疫動(dòng)物的脾淋巴細(xì)胞并在適于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的條件下與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞融合;(3)篩選并培養(yǎng)如上得到的雜交瘤細(xì)胞;(4)從細(xì)胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞的動(dòng)物的腹水液中分離并純化所需的單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案,其中產(chǎn)生抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7的雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)分別為CGMCC No.1167、CGMCCNo.1168和CGMCC No.1169。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如上限定的抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12在抑制單向和雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如上限定的抗人OX40L單克隆抗體9H10在誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化和成熟中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如上限定的抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12在刺激T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分泌抗體中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如上限定的抗人OX40L單克隆抗體1E7在體外激活T細(xì)胞中的應(yīng)用。
附圖簡(jiǎn)要說明
圖1顯示L929/OX40L轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建示意圖。
圖2顯示以流式細(xì)胞術(shù)分析抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞上OX40L分子的識(shí)別。其中灰色峰為陰性對(duì)照,一抗為小鼠IgG,二抗為熒光素PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG。透明峰顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與抗人OX40L單抗反應(yīng)的結(jié)果,其中第一抗體分別是商品化抗人OX40L單抗TAG-34(陽(yáng)性對(duì)照)及我們自己制備的3株抗人OX40L單抗9H10、4C12和1E7,第二抗體是熒光素PE標(biāo)記的羊抗鼠IgG。
圖3顯示9H10、4C12和1E7雜交瘤細(xì)胞株染色體的核型分析(×1000倍)。
圖4顯示以流式細(xì)胞術(shù)分析9H10、4C12和1E7識(shí)別成熟DC及活化的B細(xì)胞上的OX40L分子。A美洲商陸(PWM)活化3天的B細(xì)胞。其中灰色峰為陰性對(duì)照,B細(xì)胞首先與小鼠IgG反應(yīng),然后加入二抗熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG,最后加入熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人CD19直標(biāo)單抗;透明峰為B細(xì)胞分別與3株抗人OX40L單抗9H10、4C12和1E7反應(yīng)后再加熒光素FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG作用,最后加入熒光素PE標(biāo)記的鼠抗人CD19直標(biāo)單抗。B抗人CD40單抗激發(fā)2天的DC。其中灰色峰為陰性對(duì)照,一抗為生物素標(biāo)記的小鼠IgG,二抗為PE標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素(Streptavidin-PE);透明峰為DC分別與生物素標(biāo)記的3株抗人OX40L單抗9H10、4C12和1E7反應(yīng)后再加入Streptavidin-PE作用。
圖5顯示以流式細(xì)胞術(shù)分析單抗9H10、4C12和1E7識(shí)別的抗原位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。1灰色峰為陰性對(duì)照,其中一抗為生物素標(biāo)記的小鼠IgG,二抗為Streptavidin-PE。虛線透明峰為陽(yáng)性對(duì)照,其中一抗為生物素標(biāo)記的4C12,二抗為Streptavidin-PE;實(shí)線透明峰顯示9H10與4C12對(duì)位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。將9H10加入L929/OX40L反應(yīng)后再與生物素標(biāo)記的4C12作用,最后加入Streptavidin-PE。2灰色峰為陰性對(duì)照,其中一抗為生物素標(biāo)記的小鼠IgG,二抗為Streptavidin-PE;虛線透明峰為陽(yáng)性對(duì)照,其中一抗為生物素標(biāo)記的1E7,二抗為Streptavidin-PE;實(shí)線透明峰顯示9H10與1E7對(duì)位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制,將9H10加入L929/OX40L反應(yīng)后再與生物素標(biāo)記的1E7作用,最后加入Streptavidin-PE。3灰色峰為陰性對(duì)照,其中一抗為生物素標(biāo)記的小鼠IgG,二抗為Streptavidin-PE;虛線透明峰為陽(yáng)性對(duì)照,其中一抗為生物素標(biāo)記的1E7,二抗為Streptavidin-PE;實(shí)線透明峰顯示4C12與1E7對(duì)位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制,將4C12加入L929/OX40L反應(yīng)后再與生物素標(biāo)記的1E7作用,最后再加入Streptavidin-PE。
圖6顯示W(wǎng)estern blot免疫印跡分析。M為分子量標(biāo)準(zhǔn)(KD);2、4、6為誘導(dǎo)表達(dá)GST-OX40L融合蛋白工程菌的菌體蛋白,其中加入的抗體2為9H10,4為4C12,6為1E7;1、3、5為以未誘導(dǎo)的菌體蛋白作為陰性對(duì)照,其中加入的抗體1為9H10,3為4C12,而5為1E7。
圖7顯示以3H-TdR摻入法分析單抗9H10和4C12抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。其中縱坐標(biāo)為cpm值,橫坐標(biāo)為不同反應(yīng)組。A為單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),即抗人OX40L單抗9H10和4C12及其聯(lián)合抗人B7-1單抗抑制成熟樹突細(xì)胞(CD)對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用。B為雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。其中1人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC1)樣品;2另一份人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC2)樣品;3PBMC1+PBMC2;4PBMC1+PBMC2+IgG;5PBMC1+PBMC2+9H10;6PBMC1+PBMC2+4C12。
圖8顯示流式細(xì)胞儀分析9H10對(duì)DC細(xì)胞成熟的促進(jìn)作用?;疑屣@示陰性對(duì)照,其中使用熒光素PE標(biāo)記的小鼠IgG直標(biāo)單抗;透明峰顯示DC與PE標(biāo)記的不同直標(biāo)單抗(CD80-PE、CD86-PE、CD83-PE和CXCR4)的反應(yīng)。
圖9顯示酶聯(lián)免疫法分析9H10激發(fā)的DC促進(jìn)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。橫坐標(biāo)為細(xì)胞反應(yīng)天數(shù),縱坐標(biāo)為細(xì)胞因子的含量。
圖10顯示酶聯(lián)免疫法分析單抗9H10和4C12促進(jìn)T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分泌IgG??v坐標(biāo)為人IgG含量,橫坐標(biāo)為不同反應(yīng)組。
圖11顯示以3H-TdR摻入法分析單抗1E7對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用??v坐標(biāo)為cpm值,橫坐標(biāo)為不同反應(yīng)組。
發(fā)明的具體內(nèi)容本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽,更具體地說,本發(fā)明涉及抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7,其制備方法以及這些單克隆抗體在體外抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、刺激T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化成熟、刺激T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化及抗體分泌中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用抗OX40L單克隆抗體生產(chǎn)用于提高人或哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)的藥物組合物。在T細(xì)胞被其所接觸的特定抗原激發(fā)后,投用這樣的藥物組合物可有效地增加宿主體內(nèi)細(xì)胞因子的產(chǎn)生量和記憶T細(xì)胞的數(shù)目,通過加強(qiáng)T細(xì)胞對(duì)抗原的識(shí)別能力提高免疫系統(tǒng)針對(duì)特異性抗原(例如腫瘤細(xì)胞或其他病原因子)的免疫反應(yīng)。
本說明書中所說的“OX40受體”是指抗原活化的CD4+T細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì);OX40配體是某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞上表達(dá)的可與OX40受體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“OX40L”包括完整的OX40配體、可溶性O(shè)X40配體及包括OX40配體之功能活性部分的融合蛋白。術(shù)語(yǔ)“抗OX40L抗體”可以是OX40特異性單克隆或多克隆抗體或它們的免疫學(xué)活性部分。本發(fā)明中,優(yōu)選的是單克隆抗體,特別是小鼠抗人OX40L抗體。
可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7(參見Kohler and Milrtein,Nature 256495-96,1975;Harlowand Lane,Aatibodies,A Laboratory,Cold Spring Harbor Laboritory,1988)。必要時(shí),也可以按照美國(guó)專利5,585,089中所述的方法制備相應(yīng)的人源化形式的抗OX40單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案,最好使用被攜帶人OX40L基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的并可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下高效表達(dá)人OX40多肽的重組體細(xì)胞作為制備本發(fā)明單克隆抗體的免疫原。
因此,為了制備本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體,首先構(gòu)建高表達(dá)人OX40L的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(L929/OX40L)。高表達(dá)人OX40L分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/OX40L具有較強(qiáng)的免疫原性,并且所表達(dá)的抗原分子的空間構(gòu)型能以自然狀態(tài)暴露于細(xì)胞膜表面,從而可更有效地激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。另外,由于L929細(xì)胞是鼠源性的成纖維細(xì)胞,細(xì)胞表面其他分子具有相對(duì)較弱的抗原性,因此用該細(xì)胞作為免疫原將會(huì)減少非特異性抗體的產(chǎn)生,使單克隆抗體的篩選更為方便并大大提高陽(yáng)性檢出率。
為了制備L929/OX40L細(xì)胞,可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的DNA操作技術(shù)(例如參見Sambrook et al.,Molecular CloningA Laboratory Manual,ColdSpring Harbour,1989)進(jìn)行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建及擴(kuò)增、核苷酸序列的分析與鑒定、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)。例如,首先,通過RT-PCR技術(shù)從成熟的樹突狀細(xì)胞中擴(kuò)增出人OX40L基因。將OX40L基因裝入逆轉(zhuǎn)錄載體pEGZ-Term,得到重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/OX40L。然后,使用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/OX40L與輔助病毒pHIT456和pHIT60一起共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48小時(shí)后,收集含病毒顆粒的293T細(xì)胞培養(yǎng)物上清,以其感染L929細(xì)胞,連續(xù)感染3天。最后,用含Zeocin的選擇培養(yǎng)基篩選,待抗性單克隆生長(zhǎng)至足夠大,挑取單克隆集落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。按上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的OX40L表達(dá)率高達(dá)97%以上。
已按照布達(dá)佩斯條約和中國(guó)專利法實(shí)施細(xì)則第25條的規(guī)定,于2004年6月2日將產(chǎn)生抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7的雜交瘤細(xì)胞株保藏在中國(guó)北京中國(guó)普通微生物保藏管理中心(CGMCC),保藏編號(hào)分別為CGMCC No.1167、CGMCC No.1168和CGMCC No.1169。
可以按照本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法(Kohler and Milstein,Nature 265495-497,1975)制備本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7。簡(jiǎn)單地說,用轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/OX40L免疫BALB/C小鼠。當(dāng)被免疫動(dòng)物的血清抗體水平達(dá)到峰值時(shí),分離動(dòng)物的脾細(xì)胞并制備單細(xì)胞懸液。必要時(shí),可使用免疫吸附方法篩選脾細(xì)胞。例如,可以將脾細(xì)胞懸液加到OX40L抗原蛋白質(zhì)包被的平板或小孔內(nèi),表達(dá)OX40L多肽特異性免疫球蛋白的B細(xì)胞即結(jié)合到平板上,而不能被其余的懸液洗掉。然后可以收集所得到的B細(xì)胞或所有解離的脾細(xì)胞,并在適當(dāng)?shù)娜诤蟿├缇垡叶嫉恼T導(dǎo)下與骨髓瘤融合以形成雜交瘤,并在選擇性培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)以篩選融合的雜交瘤細(xì)胞。然后,用流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽(yáng)性抗性細(xì)胞株。于體外(例如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠腹水)培養(yǎng)所選擇的分泌抗人OX40L抗體的雜交瘤,并從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化所需的抗體。
核苷酸序列分析結(jié)果顯示,本發(fā)明的純化的三株抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12重鏈和輕鏈的核苷酸編碼序列分別如序列表中SEQ ID NO1至SEQ ID NO4所示,并且抗人OX40L單克隆抗體1E7輕鏈具有SEQ ID NO5所示的核苷酸編碼序列;根據(jù)單克隆抗體9H10和4C12的核苷酸編碼序列推測(cè)的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO6至SEQ ID NO9所示,并且抗人OX40L單克隆抗體1E7輕鏈具有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。其中所有氨基酸序列都是以氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫符表示的。
流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,本發(fā)明提供的抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7均能不同程度地識(shí)別成熟DC和活化B細(xì)胞表面上表達(dá)的OX40L分子。競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示,本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體9H10與4C12可識(shí)別部分相同的抗原位點(diǎn),而1E7則識(shí)別完全不同的抗原位點(diǎn)。因此,有可能利用9H10和1E7或4C12和1E7制備用于檢測(cè)可溶性人OX40L的試劑盒。
為了鑒定本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體的生物學(xué)功能,本發(fā)明首先進(jìn)行了混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)是一種用于判斷移植術(shù)是否適合進(jìn)行和監(jiān)測(cè)移植后排斥反應(yīng)的程度的重要試驗(yàn)。我們的單向和雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果表明,本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12均能阻斷OX40/OX40L結(jié)合,以劑量依賴方式抑制T淋巴細(xì)胞的增殖,并且能夠與抗人B7-1阻斷型單抗發(fā)揮協(xié)同作用。移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病都表現(xiàn)為T細(xì)胞的過度活化,因此,可利用本發(fā)明的這兩株阻斷型抗人OX40L單克隆抗體抑制T細(xì)胞的活化增殖,進(jìn)而抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答,以預(yù)防和治療移植排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病。
本發(fā)明的另一株抗人OX40L單克隆抗體1E7則具有相反的生物學(xué)活性。實(shí)驗(yàn)表明,該抗體能夠與激發(fā)型CD3單抗協(xié)同促進(jìn)T細(xì)胞的增殖。眾所周知,腫瘤發(fā)生是因細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視而發(fā)生惡性增殖的結(jié)果。免疫逃避機(jī)制之一是由于機(jī)體抗原遞呈細(xì)胞特別是樹突狀細(xì)胞在數(shù)量和功能上的異常,致使機(jī)體的腫瘤抗原特異性T細(xì)胞處于免疫耐受狀態(tài)。因此,有可能利用本發(fā)明的激發(fā)型抗人OX40L單克隆抗體1E7改變T細(xì)胞免疫耐受狀態(tài),并激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫反應(yīng),以清除和控制腫瘤細(xì)胞。
樹突狀細(xì)胞(DC)是活體內(nèi)專門化的抗原遞呈細(xì)胞,為原發(fā)和繼發(fā)免疫反應(yīng)的開啟者。DC是唯一可以激發(fā)幼稚性T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞,其抗原遞呈能力較其他抗原細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞)大100倍以上,因此在誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫中起著極其重要的作用。在使用低劑量CD40單抗激發(fā)的基礎(chǔ)上,本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體9H10能進(jìn)一步上調(diào)DC上的共刺激分子CD80、CD86、CD83以及趨化性細(xì)胞因子受體CXCR4分子的表達(dá)。也就是說,9H10可促進(jìn)DC的分化成熟。而且,與單獨(dú)使用CD40單抗激發(fā)的DC相比,聯(lián)合抗人OX40L單抗(9H10)激發(fā)的DC能促進(jìn)T細(xì)胞分泌更多的IL-2和IFN-γ,而IL-4和IL-10的變化則不大。這些研究結(jié)果說明,抗人OX40L單抗能進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞向Th1方向分化。
使用DC體外激發(fā),或同時(shí)負(fù)載腫瘤抗原或者目的基因轉(zhuǎn)染的DC作為疫苗,免疫接種后可有效地激發(fā)機(jī)體的特異性抗腫瘤主動(dòng)免疫反應(yīng),對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷作用。在應(yīng)用DC進(jìn)行腫瘤治療中關(guān)鍵的技術(shù)之一是設(shè)法在體外獲得大量用于治療目的的DC。體外擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞所采用的方法通常是在粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和人重組白細(xì)胞介素4(IL-4)存在下體外培養(yǎng)單核細(xì)胞,刺激6天后再加入激發(fā)型抗人CD40單克隆抗體。我們的研究發(fā)現(xiàn),如果同時(shí)加入抗人OX40L單抗9H10,可更有效地促進(jìn)DC的成熟。這些DC不僅能夠增強(qiáng)對(duì)T細(xì)胞的激發(fā)作用,而且還可促進(jìn)T細(xì)胞向Th1分化,從而增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)。
B細(xì)胞在體液免疫中起著重要的作用。在T細(xì)胞依賴的美洲商陸(PWM)激發(fā)的B細(xì)胞培養(yǎng)體系中,本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體9H10或4C12的培養(yǎng)上清IgG含量明顯增加,表明這兩株單抗有助于B細(xì)胞的分化并能促進(jìn)T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞的抗體分泌。
以下借助非限制性實(shí)施例舉例詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā)明的基本精神和原則前提下,改變或改動(dòng)本說明書中描述的某些技術(shù)內(nèi)容或技術(shù)環(huán)節(jié)。但人們可以理解到,這些平行的改變或改動(dòng)均將包括在本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1抗人OX40L單克隆抗體的制備本實(shí)施例描述本發(fā)明的抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7的制備。
(1)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/OX40L和L929/mock的建立(a)人OX40L基因的克隆使用TRIZOL試劑(Gibco,BRL)抽提抗原誘導(dǎo)成熟的DC的總RNA。按照MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書推薦的方法,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取5μl cDNA為模板,使用上游引物5’-AACTG CAGATG GAA AGG GTC CAA CCC-3’(SEQ ID NO11),和下游引物5’-CG GGATTC TCA AAG GAC ACA GAA TTC-3’(SEQ ID NO12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(94℃變性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸1分鐘,30個(gè)循環(huán)后72℃延伸5分鐘)。純化后,在T4DNA連接酶作用下直接將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接過夜。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌TOP10,并對(duì)篩選的陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定以及DNA測(cè)序。結(jié)果顯示,所獲得的cDNA序列與GenBank中注冊(cè)的人OX40L cDNA序列完全一致。
(b)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建分別用核酸內(nèi)切酶PstI和BamHI消化測(cè)序正確的pMD18-T/OX40L質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term(現(xiàn)代免疫學(xué),2004,24(2)99-103)(37℃,4小時(shí))?;厥蘸康幕虻钠?,并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。用上述方法鑒定證實(shí)后,將所獲得的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體定名為pEGZ-Term/OX40L。
(c)穩(wěn)定表達(dá)人OX40L的L929轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的構(gòu)建按照?qǐng)D1所示的流程,首先以試劑盒操作手冊(cè)推薦的脂質(zhì)體法,用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term/OX40L和輔助病毒pHIT456與pHIT60(現(xiàn)代免疫學(xué),2004,24(2)99-103)(體積比2∶1∶1)共轉(zhuǎn)染6孔板中60-70%匯合生長(zhǎng)成片的293T細(xì)胞。48小時(shí)后收集含病毒顆粒的293T培養(yǎng)上清,以其感染L929細(xì)胞。加入polybrene至終濃度為8ng/ml,繼續(xù)37℃感染6小時(shí)。再加入含10%胎牛血清(FCS)的1640培養(yǎng)基(2ml/孔,隔天換液)。重復(fù)感染3次后收集細(xì)胞,將1∶6稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)物置于含Zeocin(Invitrogen,500μg/ml)的選擇培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)2周。待抗性單克隆生長(zhǎng)至足夠大,挑取單克隆菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。同時(shí)制備用作陰性對(duì)照的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/mock。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,L929/OX40L細(xì)胞膜上人OX40L蛋白的表達(dá)率約為97%。
(2)抗人OX40L單克隆抗體的制備使用如上得到的高表達(dá)OX40L分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(L929/OX40L)作為免疫原,三次免疫接種Balb/c小鼠(107/500μl/只)(間隔3周)。末次免疫后第四天,取小鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞融合(共20塊96孔板)。以高表達(dá)OX40L分子的L929/OX40L為陽(yáng)性對(duì)照及表達(dá)OX40L分子的L929/mock為陰性對(duì)照,用間接免疫熒光法對(duì)雜交瘤培養(yǎng)物上清進(jìn)行初步篩選、蛋白鑒定及Ig亞類鑒定(參見圖2)。陽(yáng)性克隆經(jīng)3次有限稀釋后,克隆的陽(yáng)性率達(dá)到約95%。經(jīng)復(fù)篩及亞克隆后獲得穩(wěn)定地分泌特異性鼠抗人OX40L的雜交瘤細(xì)胞株,并分別被命名為9H10(CGMCC No.1167)、4C12(CGMCCNo.1168)和1E7(CGMCC No.1169)。這些雜交瘤細(xì)胞經(jīng)體外持續(xù)傳代(40代)后,仍能穩(wěn)定地分泌特異性抗體。對(duì)雜交瘤細(xì)胞株9H10、4C12和1E7的染色體分析顯示,這三株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)目為80-110(參見圖3)。
(3)抗人OX40L單克隆抗體的生產(chǎn)與特性鑒定(a)采用本室建立的腹水體內(nèi)誘生方法生產(chǎn)單克隆抗體。取6-8周齡的雌性Balb/c小鼠,腹腔內(nèi)注入Pristane(0.5ml/只)。一周后腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞(1×107/只),同時(shí)再次腹腔內(nèi)注射Pristane與福氏不完全佐劑的等體積混合物(0.2ml/只)。5-10天后收獲腹水,并離心取上清于-80℃保存。
(b)腹水型單抗的純化和定量。腹水液經(jīng)去除纖維蛋白和鹽析處理后,以蛋白G親和柱層析法純化。收集蛋白峰流出液,對(duì)磷酸鹽緩沖液(PBS)透析后用751紫外分光光度計(jì)測(cè)定抗體蛋白濃度為0.8~10mg/ml。間接免疫熒光法分析,純化后單抗的效價(jià)為1∶1000以上。
(c)Ig亞類鑒定。采用試紙快速測(cè)定(Argen公司)法,鑒定Ig亞類,結(jié)果顯示9H10和1E7均為小鼠IgG1型,4C12為IgG2b型。
(d)間接免疫熒光法分析OX40L在活化B細(xì)胞及成熟DC上的表達(dá)。取出美洲商陸(PWM)活化3天的扁桃體淋巴細(xì)胞,加入單抗9H10、4C12或1E7(每管2μg),4℃孵育30分鐘。洗滌后用FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG處理細(xì)胞并用PE標(biāo)記的CD19直接標(biāo)記抗體,4℃孵育30分鐘后進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果可見,三株單抗均能識(shí)別活化B細(xì)胞上表達(dá)的OX40L分子(圖3)。同樣,用相似方法檢測(cè)的結(jié)果證實(shí),本發(fā)明的三株單克隆抗體也均能識(shí)別成熟DC上表達(dá)的OX40L分子(參見圖4)。
(e)抗體識(shí)別抗原位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)。在L929/OX40L細(xì)胞(5×105/管)懸液分別加入單克隆抗體(每管2μg),4℃孵育45分鐘。洗細(xì)胞后依次加入生物素標(biāo)記的單抗,和streptavidine-PE,并分別4℃孵育30分鐘。再次洗滌后用流式細(xì)胞儀分析,同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照。如圖5所示,單抗9H10部分阻斷單抗4C12與L929/OX40L細(xì)胞上OX40L分子的結(jié)合,單抗9H10和4C12均不能阻斷單抗1E7與L929/OX40L細(xì)胞上OX40L分子的結(jié)合。由此表明,9H10與4C12識(shí)別的OX40L分子抗原位點(diǎn)不完全相同,而1E7則具有不同于9H10和4C12的抗原識(shí)別位點(diǎn)。
(f)單抗的Western印跡鑒定。0.1μg表達(dá)GST-OX40L工程菌的菌體蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳,并電轉(zhuǎn)移(0.65mA/cm2)至硝酸纖維膜上,用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜。翌日加入純化的抗體室溫孵育1小時(shí)。用TBST溶液洗去未結(jié)合的抗體,加入AP標(biāo)記的二抗,30分鐘。孵育后加入底物顯色。如圖6所示,9H10、4C12和1E7均能與OX40L蛋白特異性結(jié)合,形成陽(yáng)性條帶。表明這三株單抗均具有識(shí)別OX40L分子的良好特異性。
實(shí)施例2抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12抑制單向和雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)本實(shí)施例描述以3H-TdR摻入法檢測(cè)單克隆抗體9H10和4C12對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的抑制作用。
(1)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)的制備取正常志愿者外周血100ml(得自蘇州紅十字血站),分離(Ficoll)得到單個(gè)核細(xì)胞。洗細(xì)胞后,用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至3×106/ml。置于6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中培養(yǎng)2小時(shí)(5%CO2,37℃后)輕輕吸出懸浮細(xì)胞,即得到PBMC。在培養(yǎng)板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)和含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),3天換液一次。第6天加入激發(fā)型抗人CD40單抗(本室研制,5μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)。第8天用常規(guī)方法收集成熟的DC。T細(xì)胞同樣取自正常志愿者外周血并按照常規(guī)綿羊紅細(xì)胞結(jié)合法分離獲得(純度>90%)。
(2)單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)將T細(xì)胞(1×105/孔)和體外誘導(dǎo)成熟的DC以20∶1比例加入96孔板中。加入不同濃度的單抗9H10或4C12,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,同時(shí)設(shè)小鼠IgG同型對(duì)照。于培養(yǎng)第5天加入3H-TdR(0.5μCi/孔),繼續(xù)培養(yǎng)16-18小時(shí)。培養(yǎng)后將細(xì)胞收集于49#玻璃纖維紙上,烘干并測(cè)定放射性核素的每分鐘閃爍計(jì)數(shù)值(cpm)。結(jié)果可見,兩株單抗均能按劑量依賴方式不同程度地抑制成熟DC對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用(參見圖7A)。
(3)雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)將得自于兩個(gè)獻(xiàn)血員的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)等比例加入96孔板中(1×105/孔),然后向各孔內(nèi)加入單抗9H10或4C12(10μg/ml),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于培養(yǎng)第7天再加入3H-TdR(0.5μCi/孔)并繼續(xù)培養(yǎng)16-18小時(shí)。培養(yǎng)后將細(xì)胞收集到49#玻璃纖維紙上,烘干并測(cè)定放射性核素的每分鐘閃爍計(jì)數(shù)值(cpm)。結(jié)果可見,兩株單抗均能不同程度地抑制雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(參見圖7B)。
實(shí)施例3抗人OX40L單克隆抗體9H10促進(jìn)樹突狀細(xì)胞(DC)成熟并進(jìn)而激發(fā)T細(xì)胞本實(shí)施例描述分別以流式細(xì)胞術(shù)和酶聯(lián)免疫法檢測(cè)單克隆抗體9H10對(duì)DC的促分化作用。
(1)抗人OX40L單克隆抗體9H10促進(jìn)DC分化成熟取正常志愿者外周血200m1(得自蘇州紅十字血站),分離得到單個(gè)核細(xì)胞。洗細(xì)胞后,用含10%小牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至3×106/ml,并置于6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中培養(yǎng)2小時(shí)(5%CO2,37℃)。然后輕輕吸出懸浮細(xì)胞,在培養(yǎng)板中加入含GM-CSF(100ng/ml)、IL-4(50ng/ml)和10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),3天換液一次。第6天加入激發(fā)型抗人CD40單抗(為本室研制,2μg/ml)和抗人OX40L單抗9H10(5μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)。兩天后取出DC,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD80、CD86、CD83和CXCR4的表達(dá)。結(jié)果可見,在抗人CD40單抗激發(fā)的基礎(chǔ)上,單抗9H10能上調(diào)DC表面上某些分子如CD80、CD86、CD83和CXCR4的表達(dá),,表明9H10能進(jìn)一步促進(jìn)DC成熟(參見圖8)。
(2)以1∶20比例在DC細(xì)胞培養(yǎng)物中加入T細(xì)胞,分別于第1、3、5、7天取培養(yǎng)物上清,用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)其中細(xì)胞因子的存在。如圖9所示,與單用抗人CD40單抗或OX40L單抗激發(fā)的DC相比,聯(lián)合使用9H10和CD40單抗激發(fā)的DC能促進(jìn)T細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ,而對(duì)IL-4和IL-10的分泌水平則變化不大。此結(jié)果表明抗人OX40L單抗激發(fā)的DC能促進(jìn)T細(xì)胞向Th1方向分化。
實(shí)施例4抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12促進(jìn)T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞的抗體分泌本實(shí)施例描述以酶聯(lián)免疫法檢測(cè)單克隆抗體9H10和4C12對(duì)受激發(fā)的B細(xì)胞IgG分泌水平的影響。
(1)扁桃體淋巴細(xì)胞的制取剝離手術(shù)切除的扁桃體的包膜,常規(guī)制備單細(xì)胞懸液,并從中分離(Ficoll)扁桃體淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞純度約為50%)。
(2)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)人IgG水平將所得到的B細(xì)胞加入24孔板中(5×105/孔),同時(shí)加入PWM(4μg/ml)以活化B細(xì)胞。向各孔中加入抗人OX40L單克隆抗體9H10或4C12,培養(yǎng)10天后收集培養(yǎng)物上清,并以酶聯(lián)免疫法檢測(cè)其中的人IgG水平。結(jié)果顯示,抗人OX40L單抗9H10和4C12均能不同程度地促進(jìn)T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞的IgG分泌(參見圖10)實(shí)施例5抗人OX40L單克隆抗體1E7用于體外擴(kuò)增T細(xì)胞本實(shí)施例描述以3H-TdR摻入法檢測(cè)單克隆抗體1E7對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用。
(1)T細(xì)胞制備使用常規(guī)綿羊紅細(xì)胞結(jié)合法從正常志愿者外周血淋巴細(xì)胞中分離T細(xì)胞(純度>90%)。
(2)單抗1E7對(duì)T細(xì)胞的促增殖作用將激發(fā)型抗人CD3單抗(0.5μg/ml)加入96孔板中包板,4℃孵育過夜。用PBS洗細(xì)胞(兩次)后,向其中加入T細(xì)胞,并加入不同濃度的抗人OX40L單抗1E7(2.5、5和10μg/ml)。于培養(yǎng)第3天再加入3H-TdR(0.5μCi/孔)并繼續(xù)培養(yǎng)16-18小時(shí)。然后將細(xì)胞收集到49#玻璃纖維紙上,烘干并測(cè)定放射性核素的每分鐘閃爍計(jì)數(shù)值(cpm)。結(jié)果顯示,本發(fā)明的抗人OX40L單抗1E7能夠以劑量依賴方式顯著地促進(jìn)T細(xì)胞的增殖,(參見圖11)。
雜交瘤樣品保藏鑒于陽(yáng)性雜交瘤特別是以高產(chǎn)率產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的雜交瘤篩選的偶然機(jī)遇性,也是作為對(duì)本說明書文字描述部分的補(bǔ)充,本申請(qǐng)人在保藏用作免疫原的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的同時(shí),還在同一微生物保藏機(jī)構(gòu)(中國(guó)普通微生物保藏管理中心,CGMCC)保藏了分別產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體9H10、4C12和1E7的三個(gè)雜交瘤細(xì)胞株,它們的保藏編號(hào)分別為CGMCC No.1167、CGMCCNo.1168和CGMCC No.1169。
序列表<110>蘇州大學(xué)生物技術(shù)研究所<120>抗OX40L單克隆抗體制備及應(yīng)用<140>
<141>
<160>12<210>1<211>468<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的抗人OX40L單克隆抗體9H10重鏈的核苷酸編碼序列。
<400>11 GTCAAGCTGC AGCAGTCTGG GCCTGAGCTG GTAAAGCCTG GGGCTTCAGT51 GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAG ATTCACTAGC TATGTTATGC101 ACTGGGTGAA GCAGAAGCCT GGGCAGGGCC TTGAGTGGAT TGGATATATT151 AATCCTTACA ATGATGGAAC TAAGTACAAT GAGAAGTTCA AAGGCAAGGC201 CACACTGACT TCAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG GAGCTCAGCA251 GCCTGACCTC TGAGGACTCT GCGTTCTATT ACTGTGCAAG AGAGCCGGGA301 ATTTACTTTG ATTACGGCGG GGTGGGCCGG TTTCCTTACT GGGGCCAAGG351 GACTCTGGTC ACTGTCTCTG CAGCCAAAAC GACACCCCCA TCTGTCTATC401 CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT GACCCTGGGA451 TGCCTGGTCA AGGGCTAT<210>2<211>345<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的抗人OX40L單克隆抗體9H10輕鏈的核苷酸編碼序列。
<400>21 ATTGACATTC TGATGACCCA GTCTCCAGCA ATCATGCCTG CATCTCCAGG51 GGAGAAGGTC ACCATGACCT GCAGTGCCAG CTCAAGTGTA AGTTATATGC101 ACTGGTACCA GCAGAAGTCA GGCACCTCCC CCACAAGATG GATTTATGAC151 ACATCCAAAG TGGCTTCTGG AGTCCCTGCT CGCTTCAGTG GCAGTGGGTC201 TGGGACCTCT TACTCTCTCA CAATCAGCAG CATGGAGGCT GAAGATGCTG251 CCACCTATTA CTGCCAGCAG TGGAGTAGTA ACCCACCGAC GTTCGGTGGA301 GGGACCAAGC TGGAGATCAA AAGTGCTGAT GCTGCACCAA CTGTA<210>3<211>456<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>合成的抗人OX40L單克隆抗體4C12重鏈的核苷酸編碼序列。
<400>31 GTCCAACTGC AGGAGTCAGG AGGAGGCTTG GTACAGCCTG GGGGTTCTCT51 GAGACTCTCC TGTGCAACTT CTGGGTTCAC CTTAAGTGAT TTTTACATGG101 ACTGGGTCCG CCAGCCTCCA GGGAAGAGAC TGGAGTGGAT TGCTGCAAGT151 AGAAATAAAG CTAATAATTA TACAACAGAG TACAGTGCAT CTGTGAAGGG201 TCGGTTCATC GTCTCCAGAG ACACTTCCCA CAGCATCCTC TACCTTCAGA251 TGAAAGCCCT GAGACCTGAG GACACTGCCG TTTATTACTG TACAAGAGTC301 TATTATAAGT CCTGGTACTT CGATGTCTGG GGCGCAGGGA CCACGGTCAC351 CGTCTCCTCA GCCAAAACAA CACCCCCATC AGTCTATCCA CTGGCCCCTG401 GGTGTGGAGA TACAACTGGT TCCTCCGTGA CTCTGGGATG CCTGGTCAAG451 GGCTAT<210>4<211>348<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的抗人OX40L單克隆抗體4C12輕鏈的核苷酸編碼序列。
<400>41 CATTGTGATG ACCCAGTCTC CAGATTCATG TCCACATCAA TAGGAGACAG51 GGTCAGTATC ACCTGCACGG CCAGTCAGGA TGTGGGTAGG ACTGTAGCCT101 GGTATCAACA GAAACCAGGG CAATCTCCTA AACTACTGAT TTACTGGGCT151 TCCACCCGGC ACACTGGAGT CCCTGATCGC TTCACAGGCA GTGGATCTGG201 GACAGATTTC ACTCTCACCA TTAGCAATGT GCAGTCTGAA GACTTGGCAG251 ATTATTTCTG TCAGCAATAC ACCAGCTATC CGTATATATA CACGTTCGGA301 GGGGGGACCA AGCTGGAGAT CAAAAGTGCT GATGCTGCAC CAACTGTA<210>5<211>342<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的抗人OX40L單克隆抗體1E7輕鏈的核苷酸編碼序列。
<400>51 GACATTCAGA TGACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA51 GAAGGTCACC ATGACCTGCA GTGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATGCACT101 GGTACCAGCA GAAGCCAGGC ACCTCCCCCA AAAAATGGAT TTTTGACACA151 TCCAAACTGG CTTCTGGAGT CCCTACTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG201 GACCTCTTAT TCTCTCACAA TCAGCAACAT GGAGGCTGGA GATGCTGCCA251 CTTATTACTG CCATCAGCAG AATAATTACC CGTACACGTT CGGAGGGGGG301 ACCAAGCTGG AGATCAAAAG TGCTGATGCT GCACCAACTG TA
<210>6<211>156<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的抗人OX40L單克隆抗體9H10的重鏈核苷酸編碼序列推測(cè)的重鏈氨基酸序列。
<400>61 VKLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYRFTS YVMHWVKQKP GQGLEWIGYI51 NPYNDGTKYN EKFKGKATLT SDKSSSTAYM ELSSLTSEDS AFYYCAREPG101 IYFDYGGVGR FPYWGQGTLV TVSAAKTTPP SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG151 CLVKGY<210>7<211>156<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的抗人OX40L單克隆抗體9H10的輕鏈核苷酸編碼序列推測(cè)的輕鏈氨基酸序列。
<400>71 VKLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYRFTS YVMHWVKQKP GQGLEWIGYI51 NPYNDGTKYN EKFKGKATLT SDKSSSTAYM ELSSLTSEDS AFYYCAREPG101 IYFDYGGVGR FPYWGQGTLV TVSAAKTTPP SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG151 CLVKGY<210>8<211>115<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的抗人OX40L單克隆抗體4C12的重鏈核苷酸編碼序列推測(cè)的重鏈氨基酸序列。
<400>81 IDILMTQSPA IMPASPGEKV TMTCSASSSV SYMHWYQQKS GTSPTRWIYD51 TSKVASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA EDAATYYCQQ WSSNPPTFGG101 GTKLEIKSAD AAPTV<210>9<211>115<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的抗人OX40L單克隆抗體4C12的輕鏈核苷酸編碼序列推測(cè)的輕鏈氨基酸序列。
<400>91 IDILMTQSPA IMPASPGEKV TMTCSASSSV SYMHWYQQKS GTSPTRWIYD51 TSKVASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA EDAATYYCQQ WSSNPPTFGG101 GTKLEIKSAD AAPTV<210>10<211>
<212>氨基酸<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)合成的抗人OX40L單克隆抗體1E7的輕鏈核苷酸編碼序列推測(cè)的輕鏈氨基酸序列。
<400>10<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì),以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>7AACTGCAGAT GGAAAGGGTC CAACCC<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì),以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>8CGGGATTCTC AAAGGACACA GAATTC
權(quán)利要求
1.選自一組包括9H10、4C12和1E7的抗人OX40L單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗人OX40L單克隆抗體,特征在于抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12的重鏈和輕鏈分別具有如序列表中SEQ ID NO6至SEQID NO9所示氨基酸序列,并且抗人OX40L單克隆抗體1E7的重鏈具有SEQ IDNO10所示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗人OX40L單克隆抗體,特征在于這些抗體是抗可溶性人OX40L的單克隆抗體。
4.制備權(quán)利要求1的的抗人OX40L單克隆抗體的方法,該方法包括(1)用預(yù)制備的高表達(dá)人OX40L分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞作為免疫原免疫動(dòng)物;(2)分離被免疫動(dòng)物的脾淋巴細(xì)胞并在適于產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的條件下與適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞融合;(3)篩選并培養(yǎng)如上得到的雜交瘤細(xì)胞;(4)從細(xì)胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細(xì)胞的動(dòng)物的腹水液中分離并純化所需的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求6的方法,其中產(chǎn)生抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7的雜交瘤細(xì)胞株的保藏編號(hào)分別為CGMCC No.1167、CGMCC No.1168和CGMCC No.1169。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12在抑制單向和雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的抗人OX40L單克隆抗體9H10和4C12在刺激T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞的抗體分泌中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的抗人OX40L單克隆抗體9H10在誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化和成熟中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的抗人OX40L單克隆抗體1E7在體外激活T細(xì)胞中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽,更具體地說,本發(fā)明涉及抗人OX40L單克隆抗體9H10、4C12和1E7,其制備方法以及這些單克隆抗體在抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)、刺激T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞分化成熟、刺激T細(xì)胞依賴性B細(xì)胞分化及抗體分泌中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N5/16GK1844145SQ200510038729
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2005年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月7日
發(fā)明者張學(xué)光, 王勤, 陳永井, 施勤 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)