專利名稱：一種番茄種子帶細(xì)菌性斑點病菌快速檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。進一步，本發(fā)明涉及一種番茄種子帶細(xì)菌性斑點病菌檢測的方法。更進一步，本發(fā)明涉及應(yīng)用免疫吸附分離病菌技術(shù)和PCR技術(shù)以使種子帶菌檢測快速、靈敏和準(zhǔn)確。
背景技術(shù)：
番茄為我國人們喜食的蔬菜，每年種植850萬畝左右，占商業(yè)蔬菜面積的6％～7％，設(shè)施農(nóng)業(yè)中，番茄也占很大比重。番茄生產(chǎn)的好壞，將直接影響我國的菜籃子工程。番茄細(xì)菌性斑點病(Pseudomonas syringae pv.tomato(0kabe)Young，Dye & Wilkie)是一種嚴(yán)重影響番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害。病菌主要為害番茄(Lycopersicon esculentum)，其寄主為番茄(Lycopersicon esculentum)和辣椒(Capsicum annuum)，接種寄主為茄子(Solanummelongena)。此病害可為害番茄莖、葉、花、葉柄和果實；病原菌接種到土壤中可抑制種子發(fā)芽并引起苗期猝倒病，還可抑制感病番茄植株發(fā)育。自1933年首次報道以來，該病在美國、前蘇聯(lián)、澳大利亞、加拿大等幾個國家和中國的臺灣省有發(fā)生報道，可造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，減產(chǎn)高達75％～100％。1998～2004年我們在東北三省、河北省、天津市、新疆和甘肅省的番茄上發(fā)現(xiàn)番茄細(xì)菌性斑點病，經(jīng)調(diào)查此病發(fā)生有上升趨勢，對我國的番茄生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅(趙廷昌孫福在等，番茄細(xì)菌性斑點病研究進展，植物病理學(xué)研究進展，中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2001，p271～275.)。
番茄細(xì)菌性斑點病的病原菌為丁香假單胞番茄致病變種[Pseudomonas syringae pv.tomato(Okabe)Young，Dye & Wilkie]。該病菌在種子、病殘體、土壤和雜草上(不顯癥)越冬。病菌在干燥種子上可存活二十年，病菌可隨種子遠距離傳播。播種帶菌種子，病菌很快侵染子葉及真葉，引起幼苗發(fā)病。幼苗發(fā)病后移栽入大田，病葉上的菌借雨水、風(fēng)、昆蟲及農(nóng)事操作等途徑傳播，形成再侵染，造成流行。由于該病危害嚴(yán)重，各發(fā)生國家都十分重視，對病原菌的鑒定、生理生化特性、致病機理、檢驗技術(shù)、接種技術(shù)、發(fā)病規(guī)律已做了一些研究，取得了一定進展。番茄細(xì)菌性斑點病的病原菌有2個生理小種，小種1號侵染品種Ottawa而不侵染品種ONT7710；小種2號侵染Ottawa和ONT7710。25℃以下的溫度和相對濕度80％以上的條件有利發(fā)病。國外研究者鑒定了大量品種的抗病性，篩選出了很多各種水平的抗性品種，研究了抗性遺傳規(guī)律。值得一提的抗性品種有pI126430、Ontario7710和Rehovot13(抗病基因不同)。在種子帶菌的快速檢測研究方面，目前所用技術(shù)和方法涉及到了病菌的富集分離和真空浸透接種、血清學(xué)、噬菌體和DNA探針雜交等。研究表明真空滲透接種方法可檢測到每克土壤中或每毫升測試懸液中含有的10個細(xì)菌細(xì)胞；含有蔗糖、赤蘚醇及DL-乳酸鹽作單一炭源的Misaghi與Grogen的缺鐵培養(yǎng)基上不同發(fā)光能力而易于區(qū)分P.syringae pv.tomato、P.syringae pv.syringae、P.viridiflava；抗血清能夠區(qū)分Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，P.syringae pv.tomato，Xanthomonascampestris pv.vesicatoria；分離并測定了鑒定用噬菌體的特性，應(yīng)用病原型指示噬菌體可快速檢測番茄葉和果部病斑上的病菌，獲得了?；删w；構(gòu)建的Pst-DNA探針可用于確定番茄上的P.syringae pv.tomato及區(qū)分P.syringae pv.tomato與P.syringae pv.syringae等其它病原菌；利用控制冠毒素(coronatine)產(chǎn)生的染色體上的5.3kb XhoI片段的探針，確定番茄上的P.syringae pv.tomato(趙廷昌 孫福在等，番茄細(xì)菌性斑點病研究進展，植物病理學(xué)研究進展，中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2001，p271～275.)。
近年來人們開始應(yīng)用PCR的方法來對病菌進行鑒定和檢測。PCR方法靈敏、準(zhǔn)確、方便、快速，可在短時間內(nèi)擴增出數(shù)百萬個特異DNA序列的拷貝。目前研究人員已在檢測種子帶菌方面應(yīng)用PCR技術(shù)做了大量工作，設(shè)計得到了大量相關(guān)引物。利用特異引物的新方法使細(xì)菌性病害檢測能力得到加強。如用對16S和23S rRNA基因通用的引物來擴增病原物及其親緣關(guān)系相近的細(xì)菌菌系，然后分析得到的擴增片段?；趯NA序列數(shù)據(jù)的對比分析，特別是非同源部分的表現(xiàn)分析，可設(shè)計特異引物用專一性檢測某病原。
現(xiàn)已證明PCR要比ELISA或免疫熒光等方法檢測病原要靈敏得多。免疫學(xué)和PCR技術(shù)相結(jié)合的檢測方法包括免疫PCR和免疫磁性分離-PCR。免疫磁性分離所用的磁性免疫微球(IMMS)是近年發(fā)展起來的一類新型功能性材料，它是磁性微球(MMS)載體表面通過化學(xué)或物理方法連接上具有一定免疫活性的物質(zhì)作為配體而研制成的。由于磁性微球粒徑一般很小，比表面積大，故而偶聯(lián)容量較高，懸浮穩(wěn)定性較好，便于各種反應(yīng)高效而方便地進行；又因其具有順磁性，在外電場的作用下固液相的分離十分簡單，可省去過濾、離心等繁雜操作，并可在磁場作用下定位，方便地進行分離同配體相對應(yīng)的物質(zhì)。該方法應(yīng)用于種子帶菌檢測的具體做法是包被于IMMS上的抗體選擇性吸附目標(biāo)菌，洗掉未吸附的污染物，然后對目標(biāo)菌擴增培養(yǎng)，進行PCR擴增目的片段，根據(jù)所得結(jié)果判斷目標(biāo)菌是否存在。
病害防治需要快速、可靠、靈敏的種子帶菌檢測方法。種植、選擇性培養(yǎng)基和ELISA的檢測方法，在種子帶菌檢測上應(yīng)用較多，但速度慢、準(zhǔn)確率相對較低；對ELISA有時會有假陽性。隨著分子生物學(xué)，尤其是PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用與PCR技術(shù)相關(guān)聯(lián)的檢測方法逐漸發(fā)展起來。應(yīng)用免疫分離-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測目標(biāo)細(xì)菌，與上述方法相比，更能夠省時、省空間，快速、準(zhǔn)確、靈敏。將這項技術(shù)應(yīng)用于番茄細(xì)菌性斑點病的種子帶菌檢測，對于該病害的綜合防治來講是首要的，是一項開創(chuàng)性的工作，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。可為種子帶菌的快速檢驗提供技術(shù)方案，可為其他病害的種子帶菌檢測提供指導(dǎo)和借鑒，填補國內(nèi)該病害領(lǐng)域研究的空白。
本發(fā)明利用免疫吸附免疫分離的方法和PCR的方法相結(jié)合來檢測番茄種子帶細(xì)菌性斑點病菌。

發(fā)明內(nèi)容
1.番茄細(xì)菌性斑點病菌抗血清制備參照《獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)》(曹澍澤等，北京北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1992)、《植病研究方法》(方中達，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，1998)、《精編分子生物學(xué)實驗指南》(F·奧斯伯等，北京科學(xué)出版社，1998)中的方法進行菌體細(xì)胞(去鞭毛)抗原的制備、菌體全蛋白抗原的制備、免疫家兔、測定血清效價、抗體專一性(試管凝集法、間接ELISA法)、間接ELISA法測定抗原的檢測精度。采用硫酸銨沉淀法純化抗血清中免疫球蛋白(IgG)。在4℃不斷攪拌下，往2體積的含有IgG的混合物中，逐滴加入1體積pH7.0的SAS溶液。加完后置于4℃，不間斷地攪拌此混合物2～4小時以形成沉淀，12,000g離心20min。用預(yù)冷的33％SAS溶液在旋渦混合器上振蕩洗滌沉淀，所用溶液的體積與原含IgG的混合物等體積。12,000g離心20min，盡棄上清，加入與原含IgG混合液等體積的PBS(pH7.4)，在旋渦混合器上溫和振蕩以將沉淀溶解。4℃透析IgG溶液48h以上，期間換3次緩沖液(每次換4L)。將透析管內(nèi)溶物分裝于1.5mL eppendorf管，-20℃冷凍。
2.番茄細(xì)菌性斑點病菌PCR檢測參照《精編分子生物學(xué)實驗指南》(F·奧斯伯等，北京科學(xué)出版社，1998)方法提取番茄細(xì)菌性斑點病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)的染色體DNA，電泳檢測。以番茄細(xì)菌性斑點病菌染色體DNA為模板，用高保真DNA Taq plusI DNA多聚酶進行PCR擴增。實驗參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》(盧圣棟，北京高等教育出版社，1993)進行。所用引物含有如下序列引物1(+)(正向引物)5’ACA TCA TTG CCA GTT ACG GTA C 3’引物1(-)(反向引物)5’CGT CAT AAA TGC TGT ACT AAA GAG G 3’上海生工生物技術(shù)有限公司(中國上海市松江工業(yè)區(qū)茸興路111號)合成引物，利用瓊脂糖電泳檢測擴增結(jié)果，按照天為時代公司(中國北京清華大學(xué)學(xué)研大廈B座1115室)提供的PCR Fragment Recovery Kit使用說明書進行PCR產(chǎn)物的回收。把PCR回收產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，重組質(zhì)粒的提取(堿裂解法)后，進行PCR的鑒定。對PCR鑒定得到陽性克隆進行序列測定，DNA序列測定由上海博亞生物工程公司(中國上海市龍吳路1594號)完成。獲得冠毒素基因的DNA序列(SEQ ID NO2)。引物特異性檢測的PCR反應(yīng)，使用上述的引物，以全部靶標(biāo)菌和非靶標(biāo)菌的染色體DNA為模板，使用上海生工生物公司(中國上海市松江工業(yè)區(qū)茸興路111號)的Taq DNA Polymerase，選用Mg2+分裝buffer，以50μl體系進行擴增。實驗參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》(盧圣棟，北京高等教育出版社，1993)進行。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進行電泳，(溴化乙錠)EB染色后，在凝膠成像儀中檢測擴增結(jié)果。用無菌水配制目標(biāo)菌菌株3×108～3×101CFU/ml菌懸液和非靶標(biāo)菌3×108CFU/ml菌懸液，吸取1ml置于1.5ml EP管中，沸水煮15分鐘。吸取2μl作為模板，以50μl體系進行擴增。實驗參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》(盧圣棟，北京高等教育出版社，1993)進行。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進行電泳，(溴化乙錠)EB染色后，在凝膠成像儀中檢測擴增結(jié)果。
3.番茄細(xì)菌性斑點病病菌的IMS-PCR檢測將免疫磁珠(IMBs)充分震蕩2min至磁性液體變?yōu)榫粦覞嵋?，從中吸?00μl(約2×108)，放入4ml離心管。用PBS(pH7.2)洗滌IMBs 3-4次，每次洗滌后將EP管放在磁珠架上，待磁珠沉淀后，吸去上清液。洗滌完畢，加入3ml PBS重懸磁珠。加入純化的IgG100μg，于4℃緩慢搖動孵育24h。用4ml PBS-BSA洗滌IMBs 3～4次，并將IMBs重懸于3mlPBS-BSA，使包被后的磁珠的最終濃度約為1×107個/ml，待用。吸取包被過的IMBs 50μl加到裝有稀釋成各種濃度的菌懸液或待檢測液的EP管中，混勻。室溫緩慢搖動孵育1h，將EP管置于磁珠架上，靜置5min，吸去上清液，用PBS-BSA洗滌2遍，無菌水洗滌1遍，用50μl無菌水重懸磁珠。將重懸液煮沸15min，取4μl上清液用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系與直接菌體PCR反應(yīng)相同。反應(yīng)后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。
4.模擬種子帶菌直接檢測把培養(yǎng)24小時新鮮的番茄細(xì)菌性斑點病菌(Pst26)配成3×108CFU/ml菌懸液浸泡滅菌的番茄種子4小時，然后晾干。把上述種子與健康種子一起放入液體KB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8小時。帶菌種子比率分別為20/100，10/100，1/100，2/500，1/500，1/1000。取其中的1ml液體做IMS-PCR。
本發(fā)明應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)相結(jié)合的檢測技術(shù)檢測目標(biāo)細(xì)菌，與單一的種植、選擇性培養(yǎng)基和ELISA的檢測方法相比，更能夠省時、省空間、準(zhǔn)確、靈敏，更能建立快速、準(zhǔn)確的種子帶菌檢測技術(shù)。該技術(shù)可應(yīng)用于對番茄種子帶細(xì)菌性斑點病菌進行快速分子檢測，可為番茄的安全生產(chǎn)、種子引進和外銷提供技術(shù)保障，具有實際的應(yīng)用價值。


圖1為抗體試管凝集法效價測定結(jié)果。
圖2為抗體ELISA法效價測定結(jié)果。
圖3為抗體87特異性測定結(jié)果。
圖4為抗體18特異性測定結(jié)果。
圖5為全抗體特異性測定結(jié)果。
圖6為抗體87 ELISA法測定部分目標(biāo)菌及部分非目標(biāo)菌的結(jié)果。
圖7供試菌株總DNA電泳圖譜。
其中，道M代表λDNA/HindIII；道1代表Pst的DNA；道2、3、4、5、6、7、8、9、10和11分別代表非Pst菌株的DNA。
圖8為Pst26的總DNA的PCR結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8和9分別代表λDNA/Marker II；鎂離子是1.0Mm；1.0Mm；1.0Mm1.0Mm；1.5mM；1.5mM；1.5mM；2.0mM；2.0mM；2.0mM；道1，4，7號為對應(yīng)的陰性CK。
圖9為不同菌株P(guān)CR的結(jié)果其中，上排，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11分別代表λDNA/Marker II；Pst26；陰性對照；psl-1；JM109；cm；2038；3935；c.m.s；Isl-4；Pslb-27；Aac13。下排道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11分別代表DNA/Marker II；Pst26；陰性對照；00224；Po41；2814；SDTB；Eccz；1526；5796；xv；2835。
圖10為全菌體的不同濃度的PCR結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、M分別代表λDNA/Marker II；菌的濃度為3×108CFU/ml；3×107CFU/ml；3×106CFU/ml；3×105CFU/ml；3×104CFU/ml；3×103CFU/ml；3×102CFU/ml；3×101CFU/ml；3×100CFU/ml；λDNA/Marker II。
圖11為為全菌體的不同濃度的IMS-PCR結(jié)果。
其中，道M、1、2、3、4、5和6分別代表λDNA/Marker II；Pst菌體濃度3×105CFU/ml；3×104CFU/ml；3×103CFU/ml；3×102CFU/ml；3×108CFU/ml的雜菌；空白對照。
圖12為種子帶菌IMS-PCR檢測結(jié)果其中，道M、1、2、3、4、5、6、7和8分別代表λDNA/Marker II；Pst26DNA；陰性對照；帶菌種子占總種子比率20/100；10/100；1/100；2/500；1/500；1/1000。
具體實施例方式以下敘述本發(fā)明的實施例。應(yīng)該說明的是，本發(fā)明的實施例對于本發(fā)明只有說明作用，而沒有限制作用。
需特別指出的是，盡管在實施例中詳盡描述了番茄細(xì)菌性斑點病菌的抗血清獲得、特異性引物的設(shè)計，然而這并不意味本發(fā)明的引物序列只限于用番茄帶細(xì)菌性斑點病菌的檢測。因此，使用本發(fā)明所描述的番茄細(xì)菌性斑點病菌的檢測技術(shù)(免疫磁性分離-PCR技術(shù)(IMS-PCR))，檢測用引物，以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具有的任何涉及上述的引物、方法檢測其他作物病原細(xì)菌和其他方面的應(yīng)用，均包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。由于本發(fā)明是對番茄細(xì)菌性斑點病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)的檢測，因此應(yīng)用本發(fā)明對任何種子帶細(xì)菌性斑點病菌的檢測均也包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。
實施例1.番茄細(xì)菌性斑點病菌的抗血清獲得參照《獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)》、《植病研究方法》、《精編分子生物學(xué)實驗指南》中的方法進行菌體細(xì)胞(去鞭毛)抗原的制備、菌體全蛋白抗原的制備、免疫家兔、測定血清效價和抗體專一性(試管凝集法、間接ELISA法)、間接ELISA法測定抗原的檢測精度。
制備無鞭毛的整個菌體抗原和硫酸銨沉淀法制備菌體蛋白抗原，將得到的干燥蛋白配成濃度300μg/ml的蛋白溶液，即為注射用蛋白抗原。參照《植病研究方法》免疫家兔，取血收集全部血清，加NaN3防腐。試管凝集法(見圖1)和ELISA法測定效價(見圖2)，全菌體免疫家兔得到效價為640的血清。兩種蛋白抗原Pst2844-87菌體蛋白抗原及pst18菌體蛋白抗原免疫家兔，得到效價均在1280以上，但不到2560(見圖3、圖4、圖5)，三種抗血清分別記為抗全菌體血清、抗87血清和抗18血清。間接ELISA確定合適待測菌懸液濃度和檢測抗體專一性，3×106可作為檢測用濃度。三種抗體對所有供試pst菌都呈陽性反應(yīng)，與非抗原菌有假陽性反應(yīng)(見圖6)。說明所獲得的血清直接用于病菌的檢測存在著假陽性的風(fēng)險，但對于本發(fā)明來說只是利用抗血清的免疫分離作用，完全可以利用所獲得的抗血清。
實施例2.番茄細(xì)菌性斑點病菌的常規(guī)PCR檢測參照《精編分子生物學(xué)實驗指南》，采用CTAB法提取所有靶標(biāo)及非靶標(biāo)細(xì)菌(表1和表2)的染色體DNA，見圖7，為部分菌株染色體DNA。
表1供試番茄細(xì)菌性斑點病(靶標(biāo))菌株


表2供試非番茄細(xì)菌性斑點病(非靶標(biāo))菌株


運用Beacon Designer 2.0和DNA Club等軟件進行引物設(shè)計，確定引物為(SEQ ID NO1)Primer1(+)(正向引物)5’ACA TCA TTG CCA GTT ACG GTA C3’22bpPrimer1(-)(反向引物)5’CGT CAT AAA TGC TGT ACT AAA GAG G3’25bp使用所設(shè)計的斑點病菌引物進行引物專一性檢測，以全部靶標(biāo)菌和非靶標(biāo)菌的染色體DNA為模板，使用上海生工生物公司(中國上海市松江工業(yè)區(qū)茸興路111號)的Taq DNAPolymerase，選用Mg2+分裝buffer，以50μl體系進行擴增。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進行電泳，溴化乙錠染色后，在凝膠成像儀中檢測擴增結(jié)果。經(jīng)過多次PCR，進行反應(yīng)條件和Mg2+濃度的摸索，最終確定退火溫度為60℃，Mg2+濃度為1.5mM。在此反應(yīng)條件下進行PCR，以所有靶標(biāo)菌株染色體DNA為模板的反應(yīng)均成陽性，擴增產(chǎn)生670bp條帶一條(SEQID NO2，黑體字母之間為為冠毒素部分基因DNA序列)，而全部非靶標(biāo)菌均呈陰性(見圖8)。圖9為以部分靶標(biāo)和非靶染色體DNA為模板進行PCR的電泳結(jié)果。表明引物是特異性的，可用于區(qū)分目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌。
使用所設(shè)計的斑點病菌引物，以菌株P(guān)st-26的染色體DNA為模板，使用上海生工生物公司的Taq Plus DNA Polymerase及相應(yīng)buffer，以50μl體系進行擴增。實驗參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》進行。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進行電泳，EB(溴化乙錠)染色后，在凝膠成像儀中檢測擴增結(jié)果。經(jīng)過PCR產(chǎn)物的回收、測序，獲得擴增產(chǎn)物的全序列(SEQ ID NO2序列)，即為番茄細(xì)菌性斑點病菌的冠毒素基因部分DNA序列。
用無菌水配制果斑病菌菌株P(guān)st-26的3×108～3×101CFU/ml菌懸液，吸取1ml置于1.5ml離心管中，沸水煮15分鐘。分別取4μl作為菌體PCR的模板，進行PCR反應(yīng)。實驗參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)》進行。反應(yīng)結(jié)束后，用1％agarose、TAE緩沖液進行電泳，(溴化乙錠)EB染色后，在凝膠成像儀中檢測擴增結(jié)果。確定以Pst-26進行直接菌體PCR，其反應(yīng)呈陽性的最小菌濃度約為3×105CFU/ml，如圖10所示。
實施例3.免疫吸附PCR(IMS-PCR)檢測番茄斑點病菌在4℃不斷攪拌下，往2體積的含有IgG的混合物中，逐滴加入1體積pH7.0的SAS溶液。加完后置于4℃，不間斷地攪拌此混合物2～4小時以形成沉淀，12,000g離心20min。用預(yù)冷的33％SAS溶液在旋渦混合器上振蕩洗滌沉淀，所用溶液的體積與原含IgG的混合物等體積。12,000g離心20min，盡棄上清，加入與原含IgG混合液等體積的PBS(pH7.4)，在旋渦混合器上溫和振蕩以將沉淀溶解。4℃透析IgG溶液48h以上，期間換3次緩沖液(每次換4L)。將透析管內(nèi)溶物分裝于1.5mL eppendorf管，-20℃冷凍。
將免疫磁珠(IMBs)充分震蕩2min至磁性液體變?yōu)榫粦覞嵋海瑥闹形?00μl(約2×108)，放入4ml離心管。用PBS(pH7.2)洗滌IMBs 3-4次，每次洗滌后將EP管放在磁珠架上，待磁珠沉淀后，吸去上清液。洗滌完畢，加入3ml PBS重懸磁珠。加入純化的IgG100μg，于4℃緩慢搖動孵育24h。用4ml PBS-BSA洗滌IMBs 3~4次，并將IMBs重懸于3mlPBS-BSA，使包被后的磁珠的最終濃度約為1×107個/ml，待用。
吸取包被過的IMBs 50μl加到裝有稀釋成各種濃度的菌懸液或待檢測液的EP管中，混勻。室溫緩慢搖動孵育1h，將EP管置于磁珠架上，靜置5min，吸去上清液，用PBS-BSA洗滌2遍，無菌水洗滌1遍，用50μl無菌水重懸磁珠。將重懸液煮沸15min，取4μl上清液用于PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系與直接菌體PCR反應(yīng)相同。反應(yīng)后用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。
不同濃度的全菌體IMS-PCR結(jié)果，由圖11可知，菌的濃度從到106CFU/ml到102CFU/ml都有帶，帶的亮度隨菌的濃度增加而變亮；而雜菌和對空白照都沒有帶。也就是說IMS-PCR的檢出臨界值是102CFU/ml。
實施例4模擬種子帶菌直接檢測帶菌種子抽樣的模擬，將健康番茄種子1000粒置于500ml三角瓶，121℃滅菌20分鐘，待用。制備Pst-26 3×108CFU/ml菌懸液，浸泡無菌正常種子30分鐘，于超凈工作臺吹干。將不同數(shù)量的種子放入三角瓶中，模擬帶菌種子比率分別為20/100，10/100，1/100，2/500，1/500，1/1000。取其中的1ml液體做IMS-PCR。吸取1ml培養(yǎng)液，置于1.5ml EP管中。加入包被過的IMBs 50μl，室溫緩慢搖動孵育1h，將離心管置于磁性分離架上，靜置5分鐘，吸取上清液，用PBS-BSA洗滌2遍，無菌水洗滌1遍，用50μl無菌水重懸磁珠。將重懸液煮沸15分鐘，取4μl上清液用于常規(guī)PCR。經(jīng)過IMS-PCR，發(fā)現(xiàn)每千粒滅菌種子中含有的一粒病種子仍可以檢測到(見圖12)。
附本發(fā)明所涉及的核苷酸序列SEQ ID NO1(番茄細(xì)菌性斑點病菌檢測用引物)正向引物(22bp)5’acatcattgc cagttacggt ac 3’反向引物(25bp)5’cgtcataaat gctgtactaa agagg 3’SEQ ID NO2(番茄細(xì)菌性斑點病菌(Pst26)菌株冠毒素基因DNA部分測序)aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac gattacatca ttgccagtta60cggtacgggc taggagaaag tgttgacatt cgaattgatc cgctcgggtt catagtcgca120acaaatcgct ctggagacgg tgggatgtcg gcatggatac ccattgcgtg ctgcagagct180tcgcgcatgt cactccaatc agttatagcg ctacgcatat cgtccacatt ctcatgtggc240agcattcccg gattgattcc tgacgctccc gtcatgtacc tatgctgcat gtccgccata300tccagtgttc tttgcgtatg tgagtaaaga ttgttgtagc gatttctcag gctttgaggt360gcttggctac taacaaattc atgctgatct cttggtagac cagcagactc cgcaagttga420tgtctgacgc tcagcagttg actggacgtt acgttatctt cgtcacccga gttgttacta480actcggtctg gggagttcac ctgatgggcc atcctggatc cgccgacaca tatatttccc540attcgtatac cctctttagt acagcattta tgacgaatct ctagaggatc cccgggtacc600gagctcgaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgta tccgctcaca660attccacaca 670
權(quán)利要求
1.一種番茄細(xì)菌性斑點病種子帶菌快速檢測的方法，其特征是該方法包括如下步驟1)制備番茄細(xì)菌性斑點病菌抗血清，用該血清制備免疫磁珠。2)以番茄細(xì)菌性斑點病菌染色體DNA或病菌菌體為模板，進行PCR擴增。3)免疫磁珠吸附富集番茄細(xì)菌性斑點病病菌，進行PCR擴增。4)帶菌番茄種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，免疫磁珠吸附富集菌體，進行PCR擴增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種番茄細(xì)菌性斑點病種子帶菌快速檢測的方法，其特征在于以含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列為引物進行PCR特異性擴增。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種番茄細(xì)菌性斑點病種子帶菌快速檢測的方法，其特征在于特異性擴增產(chǎn)物含有SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
4.一種來自番茄細(xì)菌性斑點病菌的冠毒素基因的DNA序列，其特征是該序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明為“一種番茄種子帶細(xì)菌性斑點病菌快速檢測的方法”，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的番茄種子帶細(xì)菌性斑點病菌快速檢測方法，其特征是該方法應(yīng)用免疫吸附分離和PCR相結(jié)合的方法，從而提高了靈敏度和準(zhǔn)確性并且快速。還涉及PCR引物序列、番茄細(xì)菌性斑點病菌冠毒素基因的DNA序列。本發(fā)明在番茄細(xì)菌性斑點病防治和種子帶菌檢測方面，具有很高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12P19/34GK1831137SQ20051005146
公開日2006年9月13日 申請日期2005年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月8日
發(fā)明者趙廷昌 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所