專利名稱：一種檢測水稻種子是否帶細菌性褐條病菌的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物檢測技術，具體的說是涉及一種檢測水稻種子是否帶細菌性 褐條病菌的方法。
背景技術：
水稻細菌性褐條病是由燕麥噬酸菌燕麥亞種(Acidovorax avenae subsp. avenae)引起，首先在日本被報道，隨后在亞洲，非洲，美洲和歐洲的許多國家相繼報道。在 中國，該病的致病菌通常被認為是黍假單胞菌(Pseudomonas panici stapp)或丁香假單胞 (Pseudomonas syringae pv. panici)，但均未見到由上述兩種菌引起的水稻細菌性褐條病 病原鑒定報告。A. avenae subsp. avenae還是玉米、燕麥、大麥、高粱、甘蔗、黍、狐尾草等多 種禾本科植物的致病菌。水稻細菌性褐條病是通過種子傳播的病害，在中國只有個別文獻報道了 A. avebae subsp. avebae引起田間發(fā)病，所以在田間很難觀察到苗期癥狀。通常情況下，病原菌只能在 水稻種子上分離得到，然而在水稻種子上有許多其它的腐生菌和假單胞屬的其他菌給分離 鑒定帶來了很大的困難，Song W, Y等在Detection of Acidovorax avenae ssp. avenae in rice seedsusing BIO-PCR —文中報道研究了一對 BIO-PCR 引物用于檢測 A. avebaesubsp. avenae,然而，該檢測技術要求專業(yè)人員才能完成，需要PCR等貴重儀器設備，且不能區(qū)別 活細菌與死細菌。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種簡單易操作的檢測水稻種子是否帶細菌性褐條病菌的方法。一種檢測水稻種子是否帶細菌性褐條病菌的方法，包括將發(fā)芽的水稻種子栽培到經滅菌的珍珠巖中，待水稻幼苗生長至3 4葉期，如水 稻幼苗出現(xiàn)細菌性褐條病癥狀，則判斷水稻種子帶細菌性褐條病菌。水稻種子一般栽培在稻田土當中，稻田土營養(yǎng)物質豐富，有利于微生物的生長，因 此還有許多其它種類的微生物，微生物之間存在競爭抑制作用，水稻不易發(fā)??；而珍珠巖中 營養(yǎng)物質匱乏，水稻抗病性較弱，而且微生物種類和數(shù)量較少，水稻容易發(fā)病。所述的水稻種子栽培條件為白天16h，溫度29 31°C，黑夜8h，溫度24 26。C。所述的珍珠巖粒徑大小在2 4mm，培養(yǎng)的濕度為80 90%本發(fā)明還提供了一種檢測水稻種子細菌性褐條病菌帶菌率的方法，包括 將若干發(fā)芽的水稻種子栽培到經滅菌珍珠巖中，待水稻幼苗生長至3 4葉期，對 表現(xiàn)出細菌性褐條病癥狀的水稻幼苗計數(shù)，計算得到水稻種子細菌性褐條病菌的帶菌率。 該方法是一個粗略的方法，但基本能反應實際情況。 本發(fā)明方法通過將水稻種子栽培在珍珠巖中，帶細菌性條病致病菌的種子長成幼 苗后就會表現(xiàn)出相應癥狀，檢測方法簡單，易操作。


圖1是本發(fā)明水稻褐條病菌典型菌株R1001的FAME脂肪酸圖譜；圖2是本發(fā)明水稻細菌性褐條病病原菌16S樹狀圖；圖3是本發(fā)明不同培養(yǎng)基質中水稻細菌性褐條病發(fā)病情況。
具體實施例方式實施例1水稻幼苗的培養(yǎng)水稻種子用滅菌蒸餾水浸種，在30°C恒搖床浸種24h，后均勻的擺放在裝有濾紙 (由杭州沃華濾紙有限公司提供，直徑9cm)的培養(yǎng)皿中，加IOml滅菌蒸餾水濕潤，30°C催芽 12h，后將發(fā)芽一致的種子分別播種到裝有珍珠巖(粒徑2 4mm)和稻田土(珍珠巖和稻 田土均在121°C滅菌20min)的紙杯(直徑7. 5cm)中，每杯3棵，各15個杯子，放在人工氣 候箱內培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設置為夜間8h，25°C，白天16h，30°C，待水稻幼苗長到3 4葉期， 發(fā)現(xiàn)水稻品種中浙優(yōu)1號(浙江勿忘農股份有限責任公司)在珍珠巖培養(yǎng)基質中有大量類 似水稻細菌性褐條病癥狀的水稻幼苗，但在稻田土中的水稻苗沒有發(fā)現(xiàn)類似的癥狀，其他 品種[中優(yōu)218 (合肥豐樂種業(yè)股份有限公司)，豐優(yōu)58 (合肥豐樂種業(yè)股份有限公司)，天 優(yōu)998(安徽徽商農家福有限公司)]在這兩種培養(yǎng)基質中幾乎沒有上述癥狀發(fā)生。人工 氣候箱在培養(yǎng)水稻前已經經過消毒處理，排除了在水稻幼苗培養(yǎng)的過程中受病菌侵染致病 的可能性，在珍珠巖培養(yǎng)基質中有大量的水稻細菌性褐條病癥狀的水稻幼苗，說明中浙優(yōu)1 號水稻種子帶有病原菌。實施例2菌株分離純化取發(fā)病幼苗葉片病健交接處，用70%的酒精表面消毒5min，用無菌蒸餾水沖洗3 次，用無菌剪刀將葉片剪碎放入裝有Iml滅菌蒸餾水的1. 5ml離心管中制得懸液，180r/min 震蕩3min，然后用移液器取10 μ 1于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(即NA培養(yǎng)基，含牛肉浸膏l(xiāng)g，蛋白 胨5g,酵母膏5g，氯化鈉5g，蔗糖IOg,瓊脂20g,水1000ml)中，用劃線法進行分離，重復3 次，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，挑取典型菌落，經培養(yǎng)純化后作為供試菌株。將分離純化得到的細菌菌株進行煙草過敏反應測定，接著將24h內有典型過敏反 應的15個菌株用于水稻致病性檢測，待水稻植株長到3 4葉期，在水稻莖部用昆蟲針蘸 取已純化的細菌菌株的懸浮液針刺接種，然后用塑料袋套住保濕，在人工培養(yǎng)箱維持相對 濕度100%，培養(yǎng)72h，然后移到溫室25°C恒溫培養(yǎng)，觀察發(fā)病癥狀，每個處理3個植株，該實 驗重復2次。一周后觀察到和先前發(fā)現(xiàn)的病苗相類似的癥狀。實施例3菌株鑒定分離得到的15株菌株主要形態(tài)及生物學特征如下菌體短桿狀，不成串，具1根極鞭，大小為(0. 93 2.5) μ mX (0.5 0.7) μ m，革
蘭氏染色陰性反應，能游動，好氣性，不產生芽孢。在NA培養(yǎng)基上于28°C下生長48h，菌落 灰白至暗褐色，平滑有光澤，濕潤而呈黏液狀，直徑2 3mm。分離到的15株菌株經Biolog、FAME脂肪酸分析(如圖1所示)、16S rDNA序列比 對和Aaaf5或Aaaf3/Aaar2PCR特異性鑒定。Biolog鑒定結果顯示，分離到的菌株均被鑒定為A.avenae subsp. avenae，相似 度在0. 65 0. 83之間；脂肪酸鑒定結果和Biolog —致，相似度在0. 58 0. 71之間；
4對典型的4個菌株進行16S測序，并將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，相應的序列號分別 為HM240856 HM240859，通過序列比對結果顯示測定的4個典型菌株與ATCC19882T (序 列號為DQ360414)相似度為99 % ；引用Aaaf 5或Aaaf 3/Aaar2引物PCR擴增，能產生 A. avenaesubsp. avenae 特異性的條帶。最 近，Schaad 等 在 Reclassification of subspecies ofAcidovorax avenae asA.Avenae (Manns,1905)emend. , A.cattleyae (Pavarino,1911)comb.nov., A. citrulli(Schaad et al. ,1978)comb. nov. , and proposal ofA. oryzae sp.nov. 一 文中提出一個新種，將分離自水稻上的A. avenae subsp. avenae重新命名為Acidovorax oryzae，但該分類系統(tǒng)還沒有得到最終的確認。我們從水稻上分離得到的病原菌與從玉米 等作物上分離得到的A. avenae subsp. avenae相似性非常高，所以我們最終將上述分離的 菌株鑒定為燕麥噬酸菌燕麥亞種(A. avenae subsp. avenae)，即水稻細菌性褐條病菌。實施例4種子帶菌率的檢測1)細菌的分離隨機選取100粒上述中浙優(yōu)1號(浙江勿忘農股份有限責任公司)和中優(yōu)218(合 肥豐樂種業(yè)股份有限公司)品種的水稻種子，用升汞表面消毒8min，然后用滅菌蒸餾水沖 洗2次，然后將每粒種子研碎，分別放入編號為1 100的加有Iml滅菌蒸餾水的1. 5ml離 心管中，180r/min震蕩3min，然后用移液器取200μ 1于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(即NA培養(yǎng)基，含 牛肉浸膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，酵母膏2g，氯化鈉5g，蔗糖10g，瓊脂20g，水1000ml)中，用涂布器 均勻涂布，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，挑取與褐條病原菌類似菌落，經培養(yǎng)純化后 作為供試菌株。2) DNA 的提取用接種環(huán)分別挑取上述供試菌株1 2環(huán)，置于1. 5ml離心管中，然后分別加入 lmol/L 的 NaOH 1 μ 1，2% 的 SDS (十六烷基磺酸鈉)2. 5 μ 1，ddH2016. 5 μ 1,95 水浴 15min, 然后加入180 μ 1 ddH20，保存到-20°C待用。3PCR 檢測采用2條A. avenae subsp. avenae特異性引物對上述菌株進行PCR擴增，Aaaf3 5，-GTCATCCTCCACCAACCAAG-3，，Aaar2 :5，-AGAACAATTCGTCATTATGAA-3，，擴增反應用的 25 μ 1 體系包 10XPCR buffer 2.5uL,1. 5mmol/L MgCl2,200 μ mol/L dNTPs，4pmol Aaaf3，4pmol Aaar2，IU Taq DNA聚合酶，2 μ 1 DNA模板。反應采用熱啟動94°C下預變性 IOmin ；94°C、53°C、72°C下各30S，共25個循環(huán)；72°C下延伸7min。取1μ 1產物作為DNA模 板，94°C下預變性 5min ；94°C、60°C、72°C下各 30S，共 3 個循環(huán)；94°C、48°C、72°C下各 30S， 也是3個循環(huán)；94°C、53°C、72°C下各30S，共25個循環(huán)，最后在72°C下延伸7min。取8μ 1 PCR擴增產物在1. 2%的瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色20min，在紫外燈下觀察結果。結果顯示在中浙優(yōu)1號的100粒種子中有31粒種子上分離到細菌經PCR擴增， 可產生特異性條帶，即有31%的種子帶有褐條病病原菌。然而在中優(yōu)218的100粒種子中 沒有檢測到褐條病病原菌。實施例5發(fā)病率檢測上述中浙優(yōu)1號和中優(yōu)218水稻種子用滅菌蒸餾水浸種，30°C，160r/min浸種 24h，然后均勻的擺放在裝有濾紙(由杭州沃華濾紙有限公司提供，直徑9. 0cm)的培養(yǎng)皿
5中，加IOml滅菌蒸餾水濕潤，30°C催芽12h，選擇出芽一致的水稻種子均勻播種到育秧盤 (長45. 1cm，寬30. 3cm，高5. 4cm)中，培養(yǎng)基質分別用珍珠巖和稻田土，各播種200粒，育秧 盤放在人工氣候箱，夜間8h，25°C，白天16h，30°C培養(yǎng)，五天后調查并記錄發(fā)病情況，該實 驗重復2次。結果顯示珍珠巖基質中中浙優(yōu)1號水稻發(fā)病率為25%，中優(yōu)218水稻的發(fā)病率 為0，在稻田土基質中兩個水稻品種均未觀察到明顯發(fā)病癥狀。與此同時我們對珍珠巖基質 中中浙優(yōu)1號發(fā)病水稻幼苗進行了病原菌的分離與鑒定，確定這些發(fā)病水稻幼苗是由水稻 細菌性褐條病菌引起的。根據(jù)實施例4，在中優(yōu)218水稻種子中沒有檢測到褐條病菌的存在，說明中優(yōu)218 水稻種子不帶褐條病菌。中優(yōu)218在珍珠巖和稻田土兩種基質中均未觀察到明顯的發(fā)病癥 狀，進一步證明水稻細菌性褐條病在珍珠巖中大量發(fā)生是因為種子帶有褐條病菌，而不是 外界病原菌侵染造成的。根據(jù)實施例4，中浙優(yōu)1號有31%的種子帶有褐條病病原菌，然而中浙優(yōu)1號水稻 在珍珠巖基質中的發(fā)病率為25%，即我們的珍珠巖基質對水稻種子帶褐條病菌的檢出率為 80. 6%。
權利要求
一種檢測水稻種子是否帶細菌性褐條病菌的方法，包括將發(fā)芽的水稻種子栽培到經滅菌的珍珠巖中，待水稻幼苗生長至3～4葉期，如水稻幼苗出現(xiàn)細菌性褐條病癥狀，則判斷水稻種子帶細菌性褐條病菌。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的水稻種子栽培條件為白天16h， 溫度29 31 °C，黑夜8h，溫度24 26°C。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的珍珠巖粒徑大小為2 4mm。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的栽培濕度為80 90%。
5.一種檢測水稻種子細菌性褐條病菌帶菌率的方法，包括將若干發(fā)芽的水稻種子栽培到經滅菌珍珠巖中，待水稻幼苗生長至3 4葉期，對表現(xiàn) 出細菌性褐條病癥狀的水稻幼苗計數(shù)，計算得到水稻種子細菌性褐條病菌的帶菌率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測水稻種子是否帶細菌性褐條病菌的方法，包括將發(fā)芽的水稻種子栽培到經滅菌的珍珠巖中，待水稻幼苗生長至3～4葉期，如水稻幼苗出現(xiàn)細菌性褐條病癥狀，則判斷水稻種子帶細菌性褐條病菌。本發(fā)明方法通過將水稻種子栽培在珍珠巖中，帶細菌性條病致病菌的種子長成幼苗后就會表現(xiàn)出相應癥狀，檢測方法簡單，易操作。
文檔編號C12Q1/04GK101948903SQ20101051000
公開日2011年1月19日 申請日期2010年10月18日 優(yōu)先權日2010年10月18日
發(fā)明者劉寶平, 唐喬梅, 李斌, 石雨, 謝關林, 陶中云 申請人:浙江大學