專利名稱：重組人α1－胸腺肽生產(chǎn)方法及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組人α1-胸腺肽的生產(chǎn)方法及制劑。
背景技術(shù)：
α1-胸腺肽(α1-thymosin，Tα1)是Goldstein等于1977年首次在胸腺組織中發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)主要存在于胸腺細胞、T-淋巴細胞以及胸腺組織中，在肝、腎、心、肺、脾等器官也有分布，在體內(nèi)它是由111個氨基酸組成的前體α1-胸腺肽原(prothymosin)經(jīng)酶解加下產(chǎn)生。成熟的人α1-胸腺肽由28個氨基酸組成，分子量3.108KD，等電點4.2，其序列為Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-ILe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn。
人α1-胸腺肽在人體血清中的正常濃度大約為540-670pg/mL，其主要生理功能為調(diào)節(jié)機體的免疫活性，包括刺激多能干細胞分化為胸腺細胞，促進T-細胞的分化和成熟，增強T細胞的功能，并使CD3+和CD4+等細胞的數(shù)量升高等。做為一種廣譜免疫調(diào)節(jié)劑，α1-胸腺肽臨床用途包括用于治療乙型、丙型肝炎；作為免疫輔助藥物；用于腫瘤和艾滋病治療等。此外人α1-胸腺肽還與細胞周期的調(diào)控，血管生長，細胞遷移，組織修復(fù)以及精子的穿透能力等相關(guān)。
胸腺肽市場廣闊，僅以治療乙型肝炎為例，全球約有20億人曾經(jīng)感染過乙型肝炎病毒，其中有3.5億患者轉(zhuǎn)化為乙型肝炎病人。中國為乙型肝炎高發(fā)病率國家之一，估計約有1.2億乙型肝炎病人。針對乙肝的治療目前效果最顯著的方法就是補充細胞因子，調(diào)節(jié)自身免疫力，α1-胸腺肽單獨或聯(lián)合其他藥物共同作用是治療病毒性肝炎的首選方法之一，每年將產(chǎn)生接近10億元的市場銷售。
目前國內(nèi)生產(chǎn)的胸腺肽大多是從動物胸腺中提取，由于提取物為混合物，有效成分濃度低，療效不夠理想，且混合物中含動物蛋白，注射時可能會引起過敏反應(yīng)。而且因為來源不夠穩(wěn)定，使得質(zhì)量控制更為困難。目前美國等歐美國家已經(jīng)禁止臨床使用動物來源胸腺肽藥品。
近年國外人α1-胸腺肽藥品多采用化學合成方法制備，化學合成的優(yōu)點是產(chǎn)物純度與活性較高，但是傳統(tǒng)的多肽合成方法一般只能合成10個氨基酸以下的多肽，對于28個氨基酸的α1-胸腺肽來說，合成難度非常大，產(chǎn)量較低，很難滿足市場化需要。例如商品名為“日達仙”的胸腺肽藥物每支含量為1.6mg，價格為800元以上，一個療程為5萬多元，價格昂貴，普通病人難以承受。

發(fā)明內(nèi)容
針對已有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種可以大規(guī)模、低成本生產(chǎn)人α1-胸腺肽的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供由該方法生產(chǎn)的人α1-胸腺肽制劑。
具體地說，本發(fā)明通過基因工程的手段，克隆得到人α1-胸腺肽基因并連接到表達載體，構(gòu)建重組基因工程菌，通過高密度發(fā)酵與純化，制備高純度的重組人α1-胸腺肽多肽蛋白。
實現(xiàn)本發(fā)明發(fā)明目的的技術(shù)方案如下一種人α1-胸腺肽的生產(chǎn)方法，該方法依次包括如下步驟(1)人α1-胸腺肽基因工程菌的構(gòu)建α1-胸腺肽基因通過化學方法合成或者通過PCR法從人cDNA文庫中擴增得到，其合成基因包含SD序列—純化標簽—蛋白酶切位點或化學裂解點—人α1-胸腺肽基因—終止的堿基序列，然后通過內(nèi)切酶酶切，將人α1-胸腺肽基因克隆至表達載體中，表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌得到基因工程菌(2)將構(gòu)建完成的基因工程菌進行液體培養(yǎng)和發(fā)酵，通過IPTG誘導或溫度誘導，表達大量的可溶性的重組人α1-胸腺肽；所述液體培養(yǎng)和發(fā)酵所使用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基及M9培養(yǎng)基中的一種或二者的混合物，二者的配比為LB∶M9＝1∶0.1-1∶10；(3)重組人α1-胸腺肽的純化發(fā)酵生產(chǎn)的重組人α1-胸腺肽經(jīng)過菌體破碎、離心、濃縮、層析手段得到融合蛋白，通過蛋白酶切、化學裂解方式，結(jié)合親和層析及脫鹽得到較高純度的重組人α1-胸腺肽多肽；所述步驟(1)具體是a、按人α1-胸腺肽的氨基酸序列，化學合成以下DNA片斷5’-CCT CTA GAA ATA ATT TTG TTT AAC TTT AAG AAG GAG ATATAC ATA TGT CTG GAT CAG GTC ATC ATC ATC ATC ATC ATT CTT CTG GTACCG ATG ACG ACG ACA AGA GCG ATG CCG CCG TGG ATA CCA GCA GCGAAA TTA CCA CCA AAG ATC TGA AAG AAA AAA AAG AAG TGG TGG AAGAAG CCG AAA ACT AAG ACT AGT GAA TTC AC-3’；b，將該片斷用內(nèi)切酶酶切，凝膠回收，構(gòu)建PET系列表達載體或pGEM質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆，進行重組質(zhì)粒的序列測定；c、序列正確的表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌，得到基因工程菌；其中(1)步驟中所述的純化標簽為His-tag或GST，蛋白酶為腸激酶、凝血酶或Xa因子，所述的化學裂解試劑為溴化氰，所使用的表達載體包括PET系列、pGEM質(zhì)粒，所述宿主菌為大腸桿菌，包括DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)。
所述步驟(3)中取菌體按比例加入咪唑-NaCl-PB破菌緩沖液中，進行高壓勻漿破菌，破菌操作壓力為70Mpa～80Mpa，離心收集上清液。將離心收集的上清液裝入金屬鎳離子螯合親和層析柱內(nèi)，用緩沖液咪唑-NaCl-PB平衡至基線平穩(wěn)，pH值為8.0，咪唑-NaCl-PB洗脫收集人α1-胸腺肽融合蛋白主峰；再使用Phenyl Sepharose進行疏水層析，收集穿透峰，SDS-PAGE檢測；使用G-25脫鹽，收集α1-胸腺肽融合蛋白主峰；10倍稀釋溶解于含CaCl2的PB中，pH值為7.0，加入腸激酶進行酶解；酶解后使用Source 30RPC介質(zhì)，在AKTA explorer上進行反相層析，梯度洗脫，收集主峰，并經(jīng)G-25脫鹽除去乙腈即得到高純度的重組人α1-胸腺肽。
所述的菌體破碎方法包括溶菌酶裂解、化學裂解、超聲破碎、高壓勻漿，所述的層析方法包括親和層析、疏水層析、反相層析、離子層析或幾種方法的組合。
將得到的純度較高的重組人α1-胸腺肽多肽原液，根據(jù)要求在無菌條件下加入注射用水配置的緩沖液和保護劑，進行稀釋，并在分裝密封以后進行凍干，制備注射用重組人α1-胸腺肽粉針劑；所述每只針劑中含重組人α1-胸腺肽0.5-30mg；所述保護劑包括甘露醇、甘油、甘氨酸、蔗糖、乳糖、葡萄糖的其中一種或幾種。
本發(fā)明制備的重組人α1-胸腺肽，單獨應(yīng)用或與其它藥物聯(lián)合使用，用以治療或者預(yù)防病毒性流行性感冒、非典型性肺炎(SARS)、肝炎、免疫功能低下、惡性腫瘤等疾病，或者作為輔助用藥，用以腫瘤化療后免疫功能的恢復(fù)。
本發(fā)明所述的人α1-胸腺肽制備方法具有可保證產(chǎn)品質(zhì)量一致性，不受原料來源限制，且成本較低，可以大規(guī)模生產(chǎn)等許多優(yōu)點，所生產(chǎn)的產(chǎn)品可以作為注射制劑，用于免疫功能低下等疾病的預(yù)防、治療和輔助治療。


下面的附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案。
圖1為表達質(zhì)粒pET-32a-Tα1的構(gòu)建過程圖；圖2為本發(fā)明的工藝流程圖；圖3重組人α1-胸腺肽的純化工藝流程圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例及附圖1-圖3，進一步詳述本發(fā)明是如何實施的。實施例旨在舉例闡述本發(fā)明的實施方式，而不是以任何形式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的啟示，結(jié)合本領(lǐng)域的常識所做的各種變更，均在本發(fā)明專利申請權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
說明書及以下實施例中所用質(zhì)粒、菌體等，以及未注明具體條件的實驗方法，可按本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的常規(guī)條件進行，或按商品供貨商所建議的條件進行。
實施例1高表達人α1-胸腺肽的基因工程菌構(gòu)建1、人α1-胸腺肽基因全長堿基序列獲得按人α1-胸腺肽的氨基酸序列，合成以下DNA片斷5’-CCT CTA GAA ATA ATT TTG TTT AAC TTT AAG AAG GAG ATA TACATA TGT CTG GAT CAG GTC ATC ATC ATC ATC ATC ATT CTT CTG GTA CCGATG ACG ACG ACA AGA GCG ATG CCG CCG TGG ATA CCA GCA GCG AAATTA CCA CCA AAG ATC TGA AAG AAA AAA AAG AAG TGG TGG AAG AAGCCG AAA ACT AAG ACT AGT GAA TTC AC-3’該片段依次包含SD序列、純化標簽His-tag、腸激酶酶切位點、全長人α1-胸腺肽基因和終止密碼子。
2、將該片段在37℃水浴中用XbaI/EoRI雙酶切，凝膠回收，與pET-32a(+)的XbaI/EoRI雙酶切回收的大片段連接，構(gòu)建表達載體pET-32a-Tα1(如圖1所示)；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α制備的感受態(tài)細胞；挑取陽性克隆，用酶切法、PCR法和測序法鑒定；3、序列鑒定正確的pET-32a-Tα1載體轉(zhuǎn)化宿主菌，擴增培養(yǎng)，使用IPTG誘導，收集菌體，超聲破碎，離心并收集上清液，SDS-PAFE電泳顯示，誘導后有大量人α1-胸腺肽融合蛋白表達。
實施例2基因工程菌發(fā)酵1、將構(gòu)建完成的基因工程菌取接種于100ml LB培養(yǎng)基中(含100ug/ml氨芐青霉素)，37℃搖瓶培養(yǎng)12-14h；按照10％接種量吸取菌液加入到500ml LB培養(yǎng)基中，37℃，230r/min搖瓶培養(yǎng)6h，完成種子液制備；2、在30升發(fā)酵罐(瑞士Bioengineering公司)中將種子液按5％接種量加入裝有12L M9+LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37℃，300r/min培養(yǎng)，通氣量為10L/min，控制pH值在7.0左右，溶氧控制30％以上，培養(yǎng)至OD600約為12時，開始補加補料培養(yǎng)基，于第OD600約為18時，加入IPTG誘導，至終濃度為0.8mmol/L，控制溶氧曲線和pH基本平穩(wěn)但略有下降，誘導4h后收菌，完成發(fā)酵。
實施例3重組人α1-胸腺肽純化(參見附圖2)1、收集菌體，6000～7000g連續(xù)流或分批離心，每批離心時間8～10分鐘；沉淀菌體用破菌緩沖液[30mmol/L咪唑-200mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)]懸浮，進行高壓勻漿破菌，破菌時采用的操作壓力為70Mpa～80Mpa，鏡檢破菌完成后離心除去雜質(zhì)；2、制備金屬鎳離子螯合親和層析柱，取Chelating Sepharose FF 180mL(Amersham Biosciences公司)裝柱，用50mmol/L NiSO4溶液洗滌3個柱體積進行掛Ni2+；將上述離心上清液(或通過超濾濃縮的上清液)上樣，用緩沖液[30mmol/L咪唑-200mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)]平衡至基線平穩(wěn)；60mmol/L咪唑-200mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)淋洗雜蛋白至基線平衡，100mmol/L咪唑-200mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)洗脫收集人α1-胸腺肽融合蛋白主峰；再使用Phenyl Sepharose(Amersham Biosciences公司)20ml進行疏水層析，收集穿透峰，SDS-PAGE檢測；3、使用G-25 50mL脫鹽，收集α1-胸腺肽融合蛋白主峰；10倍稀釋溶解于含1mmol/L CaCl2的20mmol/L PB(pH7.0)中，加入腸激酶進行酶解；酶解后溶液上金屬鎳離子螯合親和層析柱，80mmol/L咪唑-100mmol/L NaCl-20mmol/L PB(pH8.0)洗脫得到α1-胸腺肽多肽；使用Source 30RPC 20mL介質(zhì)，在AKTA explorer上進行反相層析，梯度洗脫(流動相為A液20mmol/L KH2PO4(pH5.9)，B液乙腈；B液從0-30％)收集主峰，并經(jīng)G-25脫鹽除去乙腈即得到純度＞95％的重組人α1-胸腺肽。
本發(fā)明得到的1-胸腺肽的主要技術(shù)指標及檢測方法如下1、人α1-胸腺肽分子量測定采用三羥甲基甘氨酸-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)法測定，制備16％T，6％C的分離膠和6％T，3％C的濃縮膠(90mm×70mm×0.75mm)。先50V恒壓約1.5小時，當樣品進入分離膠后，電壓升到70V約2小時，經(jīng)0.2％考馬斯亮蘭R-250染色，與對照品和分子量標準比較。兩者表觀分子量相同，但因含有較多負電荷氨基酸，與理論值(3108)不符。
2、人α1-胸腺肽等電點測定等電聚焦—聚丙烯酰胺凝膠電泳法，采用Pharmacia LKB公司儀器，玻璃紙作為支持膜，配制7.5％膠做凝膠膜片。將凝膠膜片鋪在4℃的平板上，分別放上浸有電極液的陰、陽電極條，調(diào)節(jié)電壓2000V，電流10mA，功率10W，進行預(yù)電泳10min，加樣后調(diào)節(jié)電壓2000V，電流15mA，功率15W，電泳80min，切斷電源，結(jié)束聚膠，觀察主區(qū)帶位置。樣品PI值為3.79，比對照品略小，是在N段缺少乙酰化的結(jié)果。
3、人α1-胸腺肽純度測定以高壓液相層析方法檢測，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Hypersil BDS250mm×4.6mm，5μm)；以磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鉀9.5克，溶于1600mL水中，用1mol/L NaOH調(diào)pH值至5.7，加水稀釋至2000m L)為流動相A，乙睛為流動相B，流速為1.0m L/min，按0-20min中流動相B從0-30％的梯度洗脫，檢測波長為210mm，進樣量為20μL，測得樣品純度為98.3％。
4、人α1-胸腺肽生物活性測定按照文獻方法(“合成胸腺素α1的生物活性研究”，藥物生物技術(shù)，1998，5(2)103)，生物活性以使脫E受體后的胸腺T細胞恢復(fù)其E受體的功能的增高率為表示單位，在對照品和樣品均在100μg/mL的濃度作用下，樣品組增高率為24.39％，好于對照組19.17％。
SEQUENCE LISTING<110>上海華新生物高技術(shù)有限公司<120>重組人α1-胸腺肽生產(chǎn)方法及制劑<140>CurrentAppNumber200510112134.3<141>CurrentFilingDate2005-12-28<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>206<212>DNA<213>Human<400>1cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgtct ggatcaggtc60atcatcatca tcatcattct tctggtaccg atgacgacga caagagcgat gccgccgtgg120ataccagcag cgaaattacc accaaagatc tgaaagaaaa aaaagaagtg gtggaagaag180ccgaaaacta agactagtga attcac 20權(quán)利要求
1.一種人α1-胸腺肽的生產(chǎn)方法，該方法依次包括如下步驟(1)人α1-胸腺肽基因工程菌的構(gòu)建α1-胸腺肽基因通過化學方法合成或者通過PCR法從人cDNA文庫中擴增得到，其合成基因包含SD序列—純化標簽—蛋白酶切位點或化學裂解點—人α1-胸腺肽基因—終止的堿基序列，然后通過內(nèi)切酶酶切，將人α1-胸腺肽基因克隆至表達載體中，表達載體轉(zhuǎn)入宿主菌得到基因工程菌；(2)將構(gòu)建完成的基因工程菌進行液體培養(yǎng)和發(fā)酵，通過IPTG誘導或溫度誘導，表達大量的可溶性的重組人α1-胸腺肽；所述液體培養(yǎng)和發(fā)酵所使用的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基及M9培養(yǎng)基中的一種或二者的混合物，二者的配比為LB∶M9＝1∶0.1-1∶10；(3)重組人α1-胸腺肽的純化發(fā)酵生產(chǎn)的重組人α1-胸腺肽經(jīng)過菌體破碎、離心、濃縮、層析手段得到融合蛋白，通過蛋白酶切、化學裂解方式，結(jié)合親和層析及脫鹽得到較高純度的重組人α1-胸腺肽多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人α1-胸腺肽的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟(1)具體是a、按人α1-胸腺肽的氨基酸序列，化學合成以下DNA片斷5’-CCT CTA GAA ATA ATT TTG TTT AAC TTT AAG AAG GAG ATATAC ATA TGT CTG GAT CAG GTC ATC ATC ATC ATC ATC ATT CTTCTG GTA CCG ATG ACG ACG ACA AGA GCG ATG CCG CCG TGG ATACCA GCA GCG AAA TTA CCA CCA AAG ATC TGA AAG AAA AAA AAGAAG TGG TGG AAG AAG CCG AAA ACT AAG ACT AGT GAA TTC AC-3’；b，將該片斷用內(nèi)切酶酶切，凝膠回收，構(gòu)建PET系列表達載體或pGEM質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆，進行重組質(zhì)粒的序列測定；c、序列正確的表達載體轉(zhuǎn)化宿主菌，得到基因工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項權(quán)利要求所述的人α1-胸腺肽的生產(chǎn)方法，其特征在于其中(1)步驟中所述的純化標簽為His-tag或GST，蛋白酶為腸激酶、凝血酶或Xa因子，所述的化學裂解試劑為溴化氰，所使用的表達載體包括PET系列、pGEM質(zhì)粒，所述宿主菌為大腸桿菌，包括DH5α、BL21(DE3)或BLR(DE3)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項權(quán)利要求所述的人α1-胸腺肽的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟(3)中取菌體按比例加入咪唑-NaCl-PB破菌緩沖液中，進行高壓勻漿破菌，破菌操作壓力為70Mpa～80Mpa，離心收集上清液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人α1-胸腺肽的生產(chǎn)方法，其特征在于將離心收集的上清液裝入金屬鎳離子螯合親和層析柱內(nèi)，用緩沖液咪唑-NaCl-PB平衡至基線平穩(wěn)，pH值為8.0，咪唑-NaCl-PB洗脫收集人α1-胸腺肽融合蛋白主峰；再使用Phenyl Sepharose進行疏水層析，收集穿透峰，SDS-PAGE檢測；使用G-25脫鹽，收集α1-胸腺肽融合蛋白主峰；10倍稀釋溶解于含CaCl2的PB中，pH值為7.0，加入腸激酶進行酶解；酶解后使用Source 30RPC介質(zhì)，在AKTA explorer上進行反相層析，梯度洗脫，收集主峰，并經(jīng)G-25脫鹽除去乙腈即得到高純度的重組人α1-胸腺肽。
6.將權(quán)利要求1-5得到的高純度重組人α1-胸腺肽原液，在無菌條件下加入注射用水配置的緩沖液和保護劑，進行稀釋，并在分裝密封以后進行凍干，制備出注射用重組人α1-胸腺肽粉針劑，每只針劑中含重組人α1-胸腺肽0.5-30mg。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組人α1-胸腺肽粉針劑，其特征在于所述保護劑包括甘露醇、甘油、甘氨酸、蔗糖、乳糖、葡萄糖的其中一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明公開了生產(chǎn)人α1－胸腺肽的方法及由該方法生產(chǎn)的人α1－胸腺肽制劑，該方法包括人α1－胸腺肽基因工程菌的構(gòu)建、基因工程菌的液體培養(yǎng)和發(fā)酵，重組人α1－胸腺肽的純化等步驟。本發(fā)明所述的入α1－胸腺肽生產(chǎn)方法具有可保證產(chǎn)品質(zhì)量一致性，不受原料來源限制，且成本較低，可以大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，所生產(chǎn)的產(chǎn)品可以作為注射制劑，用于免疫功能低下等疾病的預(yù)防、治療和輔助治療。
文檔編號C12N15/12GK1990862SQ20051011213
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者常志遠, 楊忠, 王偉 申請人:上海華新生物高技術(shù)有限公司