專利名稱：脂肪分解酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的脂肪分解酶，特別是新的脂肪分解酶，和編碼它的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及新的脂肪分解酶的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及脂肪分解酶的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
EP 1 193 314中教導(dǎo)了對糖脂有活性的脂肪分解酶在面包制作中的有益應(yīng)用。教導(dǎo)了，發(fā)現(xiàn)部分水解產(chǎn)物溶血糖脂具有很高的乳化劑功用。可是，也發(fā)現(xiàn)EP 1 193 314中教導(dǎo)的酶對甘油三酯具有顯著的非選擇性活性，會造成不必要的高游離脂肪酸。
EP 0 869 167中教導(dǎo)了來自尖鐮孢(Fusarium oxysporum)的具有磷脂酶活性的脂肪分解酶。該脂肪分解酶具有高的三?；视王ニ?脂肪酶)活性。該酶現(xiàn)在由Novozymes A/S(丹麥)以Lipopan FTM來銷售。
WO02/00852披露了五種脂肪酶和它們的編碼多核苷酸，它們分離自Fusarium venenatum、F.sulphureum、Aspergillus berkeleyanum、黃色鐮孢(F.culmorum)和腐皮鐮孢(F.solani)。所有五種酶據(jù)說具有三酰甘油水解活性、磷脂酶和半乳糖脂酶活性。
已經(jīng)生成了帶有特定氨基酸替代和融合的脂肪分解酶變體；其中一些與野生型親本酶相比，對極性脂質(zhì)具有增強的活性。WO01/39602記載了這樣一種變體，其稱為SP979，是Thermomyces lanuginosus脂肪酶和EP 0 869167中記載的尖鐮孢脂肪酶的融合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該變體對磷脂和糖脂具有與甘油三酯相比顯著高比率的活性。
WO02/094123中發(fā)現(xiàn)了，通過選擇對生面團中的極性脂質(zhì)(糖脂和磷脂)有活性但對甘油三酯或1-單-甘油酯基本上無活性的脂肪分解酶，可獲得改良的功用。
在共同未決的PCT申請PCT/IB2005/000875中教導(dǎo)了，與甘油三酯相比，對極性脂質(zhì)具有更高比率活性的野生型脂肪分解酶?？墒?，該文獻沒有教導(dǎo)來自鏈霉菌屬(Streptomyces)、喜熱裂孢菌屬(Thermobifida)或棒桿菌屬(Corynebacterium)物種的脂肪分解酶。
在本發(fā)明之前，沒有公開過來自鏈霉菌屬菌種的對糖脂具有活性或顯著活性的脂肪分解酶。同樣，沒有公開過來自喜熱裂孢菌屬物種或棒桿菌屬物種的對糖脂具有活性或顯著活性的脂肪分解酶。盡管已經(jīng)從鏈霉菌屬菌種中分離到了脂肪酶，即三酰甘油水解酶(參見例如Vujaklija等，ArchMicrobiol(2002)178124-130)，這些酶從未鑒定為具有糖脂水解活性。
發(fā)明的各方面本發(fā)明依據(jù)來自鏈霉菌屬的具有顯著半乳糖脂活性的脂肪分解酶的重大發(fā)現(xiàn)。具體而言，來自鏈霉菌屬的脂肪分解酶具有顯著的半乳糖脂水解活性和/或顯著的半乳糖脂?；D(zhuǎn)移酶活性，特別是在應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途時。
另外，本發(fā)明依據(jù)來自喜熱裂孢菌屬或棒桿菌屬的具有顯著半乳糖脂活性的脂肪分解酶的重大發(fā)現(xiàn)。具體而言，來自喜熱裂孢菌屬或棒桿菌屬的脂肪分解酶具有顯著的半乳糖脂水解活性和/或顯著的半乳糖脂?；D(zhuǎn)移酶活性，特別是在應(yīng)用于本發(fā)明的方法和用途時。
在一個廣的方面，本發(fā)明涉及至少能水解糖脂和/或至少能將?；鶑奶侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從鏈霉菌屬菌種得到的。
在另一方面，本發(fā)明涉及至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡并而與SEQ ID No.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
本發(fā)明還進一步提供包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一方面，本發(fā)明提供至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶包含SEQID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供編碼脂肪分解酶的核酸，該脂肪分解酶包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
SEQ ID No.3如圖3所示，而SEQ ID No.4如圖4所示。
本發(fā)明還進一步提供編碼脂肪分解酶的核酸，該核酸選自下組a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡并而與SEQ ID No.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
本發(fā)明還進一步提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在用于制備溶血糖脂，例如二半乳糖苷甘油單酯(DGMG)或單半乳糖苷甘油單酯(MGMG))的底物(優(yōu)選食品)中的應(yīng)用，其用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理糖脂(如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或單半乳糖苷甘油二酯(MGDG))來產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血糖脂。
在另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在用于制備溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的底物(優(yōu)選食品)中的應(yīng)用，其用根據(jù)本發(fā)明的酶處理磷脂(如卵磷脂)來產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血磷脂。
在一個廣的方面，本發(fā)明涉及制備食品的方法，該方法包括將本發(fā)明的脂肪分解酶與食品的一種或多種成分混合。
本發(fā)明的另一個廣的方面涉及由生面團制備焙烤品的方法，該方法包括將本發(fā)明的脂肪分解酶與生面團混合。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備乳制品的方法，該方法包括將本發(fā)明的脂肪分解酶與乳制品的一種或多種成分混合。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的脂肪分解酶在制備乳制品中的應(yīng)用，以降低一種或多種以下有害效應(yīng)臭味和/或異味和/或油膩口味。
在本發(fā)明的另一方面，提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品中的應(yīng)用，以產(chǎn)生溶血磷脂。
在本發(fā)明的另一方面，提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品中的應(yīng)用，以產(chǎn)生溶血糖脂。
本發(fā)明的另一方面提供植物或食用油的酶促脫膠方法，其包括用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理所述食用或植物油，從而水解極性脂質(zhì)(如磷脂和/或糖脂)的主要部分。
在另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在包括處理磷脂從而水解脂肪?；姆椒ㄖ械膽?yīng)用。
在另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在用于降低食用油中磷脂含量的方法中的應(yīng)用，其包括用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理所述油，從而水解磷脂的主要部分，并將含水解磷脂的水相與油分開。
還提供了制備根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的方法，該方法包括用包含編碼脂肪分解酶的核苷酸序列的重組核酸轉(zhuǎn)化宿主細胞，該宿主細胞能表達編碼脂肪分解酶多肽的核苷酸序列，在核酸表達的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細胞并收獲脂肪分解酶。
在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)(優(yōu)選糖脂)以制造高價值產(chǎn)品，諸如碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或蛋白質(zhì)亞基酯和/或羥酸酯中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在植物或食用油的酶促脫膠方法中的應(yīng)用，其包括用所述脂肪分解酶處理所述食用或植物油，從而水解極性脂質(zhì)的主要部分。
本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在包括處理磷脂從而水解脂肪?；姆椒ㄖ械膽?yīng)用。
本發(fā)明還進一步涉及根據(jù)本發(fā)明的固定化的脂肪分解酶。
本發(fā)明的另一方面涉及制備溶血糖脂的方法，其包括用至少一種脂肪分解酶處理含糖脂的底物來產(chǎn)生所述溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明的另一方面涉及制備溶血磷脂的方法，其包括用至少一種脂肪分解酶處理含磷脂的底物來產(chǎn)生所述溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明的另一方面涉及植物或食用油的酶促脫膠方法，其包括用可從以下屬之一得到的能水解極性脂質(zhì)主要部分的脂肪分解酶處理所述食用或植物油鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明還涉及生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價值產(chǎn)品的方法，其包括用可從以下屬之一得到的脂肪分解酶處理所述極性脂質(zhì)來產(chǎn)生所述高價值產(chǎn)品鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面涉及制備食品的方法，其包括將至少一種脂肪分解酶與食品的一種或多種成分混合，其中所述脂肪分解酶能將存在的糖脂和/或磷脂水解進或成至少一種所述成分，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明的另一方面涉及脂肪分解酶在用于制備溶血磷脂的底物中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明另外涉及可從以下屬之一得到的脂肪分解酶用于植物或食用油的酶促脫膠從而水解極性脂質(zhì)主要部分的應(yīng)用鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明的另一方面涉及可從以下屬之一得到的脂肪分解酶在包括處理磷脂從而水解脂肪酰基的方法中的應(yīng)用鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明的另一方面涉及脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價值產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明的另一方面涉及可從以下屬之一得到的脂肪分解酶在制備食品中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂和/或磷脂鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
本發(fā)明的各方面出現(xiàn)在權(quán)利要求中以及以下注釋中。
關(guān)注可用于本發(fā)明的核苷酸序列的其它方面包括包含本發(fā)明的序列的構(gòu)建物；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的載體；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的質(zhì)粒；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化細胞；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化組織；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化器官；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化宿主；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還涵蓋利用本發(fā)明中應(yīng)用的核苷酸序列來表達它的方法，諸如在宿主細胞中表達；包括轉(zhuǎn)移它的方法。本發(fā)明進一步涵蓋分離核苷酸序列的方法，諸如從宿主細胞分離。
關(guān)注可用于本發(fā)明的氨基酸序列的其它方面包括編碼本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的構(gòu)建物；編碼本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的載體；編碼本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的質(zhì)粒；表達本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化細胞；表達本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化組織；表達本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化器官；表達本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化宿主；表達本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還涵蓋利用本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列來純化它的方法，諸如在宿主細胞中表達；包括轉(zhuǎn)移它且然后純化所述序列的方法。
為了便于參考，現(xiàn)在在合適的小節(jié)標(biāo)題下論述本發(fā)明的這些和其它方面?？墒?，每個小節(jié)下的教導(dǎo)不必局限于每個特定的小節(jié)。
發(fā)明詳述適宜地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼的脂肪分解酶。
優(yōu)選地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從鏈霉菌屬菌種得到的。
在一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶優(yōu)選是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡并而與SEQ ID No.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶優(yōu)選是包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶優(yōu)選是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
優(yōu)選地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從喜熱裂孢菌屬物種，優(yōu)選褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)得到的。
優(yōu)選地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從棒桿菌屬物種，優(yōu)選Corynebacterium efficiens得到的。
在另一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼的脂肪分解酶。
在另一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是用于本文所述用途的包含SEQ ID No.5、7、8、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。
在另一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是用于本文所述用途的包含SEQ ID No.5、7或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。
更優(yōu)選地，在一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ.ID.No.16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ.ID.No.12或14所示的氨基酸序列或與其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在一個實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡并而與SEQ ID No.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以是可從，優(yōu)選就是從鏈霉菌屬菌株L130或L131得到的，根據(jù)國際承認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約，它們于2004年6月23日由Danisco A/S(Langebrogade 1，DK-1001 Copenhagen K，丹麥)保藏于國家工業(yè)、海洋和食品細菌保藏中心(NCIMB)(23 St Machar Street，Aberdeen Scotland，GB)，編號分別為NCIMB 41226和NCIMB 41227。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶至少作用于糖脂，諸如例如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)。適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶還可作用于一種或多種其它極性脂質(zhì)底物，諸如磷脂，例如卵磷脂，如磷脂酰膽堿。
本文中所用的術(shù)語“能水解糖脂”的可選表述方式可以說成脂肪分解酶具有糖脂水解活性。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶水解糖脂，諸如例如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)，而且也水解磷脂，諸如卵磷脂，如磷脂酰膽堿。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶作用于糖脂，諸如DGDG或MGDG。
在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶將DGDG水解成DGMG和/或?qū)GDG水解成MGMG。
在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶將卵磷脂水解成溶血卵磷脂。
在脂肪分解酶至少能將酰基從糖脂轉(zhuǎn)移至供體底物的情況中，極性脂質(zhì)底物在本文中可稱為“脂質(zhì)酰基供體”。
在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的酶既具有磷脂酶和/或糖脂酶活性(根據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟命名委員會的酶命名法建議(1992)，通常歸入E.C.3.1.1.26；E.C.3.1.1.4或E.C.3.1.1.32)，又具有?；D(zhuǎn)移酶活性(通常歸入E.C.2.3.1.x)，由此該酶能將?；鶑闹|(zhì)酰基供體轉(zhuǎn)移至一種或多種受體底物，諸如以下一種或多種甾醇；甾烷醇(stanol)；碳水化合物；蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)亞基；甘油。
共同未決的國際專利申請PCT/IB2004/000655中教導(dǎo)了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用。將該文件引入本文作為參考。可是，PCT/IB2004/000655中沒有教導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明來自鏈霉菌屬的脂肪分解酶。
在有些方面，應(yīng)用于本發(fā)明的方法和/或應(yīng)用中的脂肪分解酶可能能將酰基從極性脂質(zhì)(如本文所定義的)轉(zhuǎn)移至一種或多種以下?；荏w底物甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)或其亞基、或甘油。
對于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的“?；荏w”可以是包含羥基(-OH)的任何化合物，諸如例如多元醇，包括甘油；甾醇；甾烷醇；碳水化合物；羥酸，包括果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸和抗壞血酸；蛋白質(zhì)或其亞基，諸如例如氨基酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和肽(部分水解的蛋白質(zhì))；及其混合物和衍生物。
在有些方面，根據(jù)本發(fā)明的“?；荏w”可優(yōu)選不是水。
在一個實施方案中，酰基受體優(yōu)選不是甘油單酯和/或甘油二酯。
在一個方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至甾醇和/或甾烷醇。
在一個方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至碳水化合物。
在一個方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)或其亞基。適宜地，蛋白質(zhì)亞基可以是以下一種或多種氨基酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、肽、二肽、寡肽、多肽。
適宜地，在蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基中，?；荏w可以是一種或多種以下蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基成分絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)亞基是氨基酸時，適宜地，氨基酸可以是任何合適的氨基酸。適宜地，氨基酸可以是例如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸中的一種或多種。
在一個方面，優(yōu)選該酶能將酰基從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至甘油。
在一個方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至羥酸。
在一個方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至多元醇。
在一個方面，脂肪分解酶可能既能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至甾醇和/或甾烷醇，又能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至以下一種或多種碳水化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)亞基、甘油。
本文中所用的術(shù)語卵磷脂涵蓋磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。
對于有些方面，優(yōu)選脂質(zhì)底物至少是糖脂，諸如例如DGDG。
對于有些方面，優(yōu)選脂質(zhì)底物也可以是磷脂，諸如卵磷脂，例如磷脂酰膽堿。根據(jù)本發(fā)明的其它磷脂底物可以是N?；字Ｒ掖及?APE)或N?；苎字Ｒ掖及?ALPE)中的一種或多種。
優(yōu)選脂質(zhì)底物是食物脂質(zhì)，也就是說是食品的脂質(zhì)成分。
對于有些方面，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或1-甘油單酯和/或2-甘油單酯。
在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶對甘油三酯和/或1-甘油單酯和/或2-甘油單酯無活性或無顯著活性。
適宜地，脂質(zhì)底物或脂質(zhì)酰基供體可以是一種或多種以下底物中存在的一種或多種脂質(zhì)脂肪，包括豬油、牛脂和黃油脂肪；油，包括提取自或衍生自棕櫚油、向日葵油、大豆油、紅花油、棉籽油、落花生油、玉米油、橄欖油、花生油、椰子油和油菜籽油的油。來自大豆、油菜籽或蛋黃的卵磷脂也是合適的脂質(zhì)底物。脂質(zhì)底物可以是燕麥脂質(zhì)或其它基于植物的含半乳糖脂的材料。
在一個方面，脂質(zhì)底物或脂質(zhì)?；w優(yōu)選是蛋黃中的卵磷脂(諸如磷脂酰膽堿)。
對于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自具有8至22個碳的脂肪酸鏈長度的脂質(zhì)。
對于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自具有16至22個碳的脂肪酸鏈長度的脂質(zhì)，更優(yōu)選16至20個碳。
對于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自具有不超過14個碳的脂肪酸鏈長度的脂質(zhì)，適宜地選自具有4至14個碳的脂肪酸鏈長度的脂質(zhì)，適宜地4至10個碳，適宜地4至8個碳。
適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶至少展現(xiàn)糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶也可展現(xiàn)磷脂酶A2活性(E.C.3.1.1.4)和/或磷脂酶A1活性(E.C.3.1.1.32)。
對于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可只具有糖脂酶活性(E.C.3.1.1.26)。
對于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是半乳糖脂酶(E.C.3.1.1.26)?？墒牵付榘肴樘侵傅氖聦嵅⒉环恋K其具有其它附帶活性，諸如針對例如其它極性脂質(zhì)的活性。
本文中所用的術(shù)語“糖脂酶活性”和“半乳糖脂酶活性”可互換使用。
適宜地，對于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可能能將酰基從糖脂和/或磷脂轉(zhuǎn)移至一種或多種受體底物。
適宜地，受體底物可以是一種或多種以下底物甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)、甘油。
本文中所用的術(shù)語“極性脂質(zhì)”指磷脂和/或糖脂。在有些方面，術(shù)語極性脂質(zhì)優(yōu)選至少指糖脂。
酶的糖脂酶活性；磷脂酶活性和/或三酰甘油脂肪酶活性可用下文介紹的測定法來測定。
半乳糖脂酶活性的測定(糖脂酶活性測定法(GLU-7))底物將0.6％二半乳糖苷甘油二酯(Sigma D 4651)、0.4％Triton-X 100(SigmaX-100)和5mM CaCl2溶于pH 7的0.05M HEPES緩沖液。
測定流程將400μL底物加到1.5mL Eppendorf管中并在Eppendorf熱混合器中于37℃放置5分鐘。在時間t＝0分鐘時，加入50μL酶溶液。用水代替酶來進行空白分析。將樣品在Eppendorf熱混合器中于37℃以10×100rpm混合10分鐘。在時間t＝10分鐘時，將Eppendorf管在另一個熱混合器中于99℃放置10分鐘，以終止反應(yīng)。
使用WAKO GmbH的NEFA C試劑盒來分析樣品中的游離脂肪酸。
根據(jù)在測定條件下每分鐘產(chǎn)生的脂肪酸微摩爾量，計算在pH 7的酶活性GLU。
磷脂酶活性的測定(磷脂酶活性測定法(PLU-7))底物將0.6％L-α磷脂酰膽堿，95％植物(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2散布于pH 7的0.05M HEPES緩沖液。
測定流程將400μL底物加到1.5mL Eppendorf管中并在Eppendorf熱混合器中于37℃放置5分鐘。在時間t＝0分鐘時，加入50μL酶溶液。用水代替酶來進行空白分析。將樣品在Eppendorf熱混合器中于37℃以10×100rpm混合10分鐘。在時間t＝10分鐘時，將Eppendorf管在另一個熱混合器中于99℃放置10分鐘，以終止反應(yīng)。
使用WAKO GmbH的NEFA C試劑盒來分析樣品中的游離脂肪酸。
根據(jù)在測定條件下每分鐘產(chǎn)生的脂肪酸微摩爾量，計算在pH 7的酶活性PLU-7。
三酰甘油酯脂肪酶活性的測定基于甘油三酯(三丁精)作為底物的的測定法(LIPU)基于三丁精的脂肪酶活性根據(jù)Food Chemical Codex(第四版，NationalAcademy Press，1996，p803)來測量。其中的改變是，將樣品溶于去離子水來代替甘氨酸緩沖液，而pH計設(shè)置點為5.5來代替7。
1LIPU定義為在測定條件下每分鐘能釋放出1微摩爾丁酸的酶量。
在一個實施方案中，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是野生型脂肪分解酶。
本文中所用的術(shù)語“天然”和“野生型”指天然存在的酶。也就是說是，由內(nèi)源遺傳密碼表達和從其內(nèi)源宿主生物體中分離的酶，和/或與內(nèi)源產(chǎn)生的成熟蛋白質(zhì)序列(在共翻譯和翻譯后切割事件之后)相比尚未突變(即不含氨基酸刪除、添加或替代)的異源產(chǎn)生的酶。本發(fā)明的天然和野生型蛋白質(zhì)可由為了異源表達而優(yōu)化了密碼子的多核苷酸編碼，而且也可包含為了在該宿主中表達而選擇的非內(nèi)源信號肽。
本文中所用的術(shù)語“變體”指由非內(nèi)源遺傳密碼表達的蛋白質(zhì)，其造成與天然或野生型序列相比成熟蛋白質(zhì)序列內(nèi)的一個或多個氨基酸改變(即氨基酸刪除、添加或替代)。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是可從(適宜地，可以是從)細菌得到的。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以是可從(優(yōu)選從)鏈霉菌屬菌種得到的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以是可從(優(yōu)選從)鏈霉菌屬菌株L131或鏈霉菌屬菌株L130得到的。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶包含與SEQ ID No.4所示的氨基酸序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、優(yōu)選至少80％、優(yōu)選至少90％、優(yōu)選至少95％、優(yōu)選至少98％、優(yōu)選至少99％同一性的氨基酸序列。
優(yōu)選地，編碼根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的核酸包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少75％、優(yōu)選至少80％、優(yōu)選至少85％、優(yōu)選至少90％、優(yōu)選至少95％、優(yōu)選至少98％、優(yōu)選至少99％同一性的核苷酸序列。
在一個實施方案中，酶對半乳糖脂底物的最優(yōu)pH適宜地是約6-8，優(yōu)選約6.5-7.5，更優(yōu)選約7。
適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可不受小麥粉中存在的脂肪酶抑制劑的抑制或顯著抑制。本文中所用的術(shù)語“不受顯著抑制”指根據(jù)本文中定義的標(biāo)準(zhǔn)磷脂酶(PUU-T)測定法，與LipopanFTM(Novozymes A/S，丹麥)的等效劑量(PLU)相比，酶對小麥粉中存在的脂肪酶抑制劑較不敏感。
適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶能將底物(即例如食品如生面團中的)中的至少10％半乳糖脂二酯水解成單酯。優(yōu)選地，酶能將至少20％、更優(yōu)選至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％半乳糖脂二酯水解成單酯。適宜地，半乳糖脂二酯可以是MGDG或DGDG中的一種或多種，而單酯可以分別是MGMG或DGMG中的一種或多種。
適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可分離自鏈霉菌屬菌株L131或鏈霉菌屬菌株L130的發(fā)酵液。
適宜地，酶可通過液相色譜來純化。
純化的脂肪分解酶的氨基酸序列可通過Edman降解、LC-MS和MALDI-TOF分析來測定。
適宜地，本文中所定義的酶可催化一種或多種以下反應(yīng)酯交換(interesterification)、酯轉(zhuǎn)移(transesterification)、醇解、水解。
術(shù)語“酯交換”指酶促催化的?；谥|(zhì)供體和脂質(zhì)受體間的轉(zhuǎn)移，其中脂質(zhì)供體不是游離酰基。
本文中所用的術(shù)語“酯轉(zhuǎn)移”指酶促催化的酰基從脂質(zhì)供體(除了游離脂肪酸)至?；荏w(除了水)的轉(zhuǎn)移。
本文中所用的術(shù)語“醇解”指通過與醇ROH反應(yīng)來酶促切割酸衍生物的共價鍵，使得產(chǎn)物之一與醇的H結(jié)合而另一種產(chǎn)物與醇的OR基團結(jié)合。
本文中所用的術(shù)語“醇”指含羥基的烴基化合物。
本文中所用的術(shù)語“水解”指酶促催化?；鶑闹|(zhì)至水分子OH基團的轉(zhuǎn)移。水解造成的?；D(zhuǎn)移需要解離水分子。
本文中所用的術(shù)語“食品”指適合人和/或動物消費的物質(zhì)。
適宜地，本文中所用的術(shù)語“食品”可指做好消費準(zhǔn)備的形式的食品?？墒?，或者/另外，本文中所用的的術(shù)語食品可指用于制備食品的一種或多種食物材料。僅作為示例，術(shù)語食品涵蓋由生面團產(chǎn)生的焙烤品以及用于制備所述焙烤品的生面團。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供上文定義的食品，其中所述食品選自以下一種或多種蛋，基于蛋的產(chǎn)品，包括但不限于蛋黃醬，色拉調(diào)味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黃及其制成品；焙烤品，包括面包，蛋糕，甜面產(chǎn)品，薄餅，液態(tài)奶蛋糊，松餅，油炸圈餅，餅干，薄脆餅干和曲奇餅；糖果，包括巧克力，糖果，飴糖，halawa，口香糖，包括無糖和加糖口香糖，泡泡糖，軟泡泡糖，口香糖和布??；冷凍產(chǎn)品，包括冰糕，優(yōu)選冷凍乳制品，包括冰激凌和牛奶凍；乳制品，包括奶酪，黃油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳飲料和酸牛奶；慕思，生植物奶油，肉制品，包括經(jīng)加工的肉制品；食用油和脂肪，攪打起泡和不起泡的產(chǎn)品，水包油乳狀液，油包水乳狀液，人造黃油，起酥油和涂抹物，包括低脂肪的和極低脂肪的涂抹物；調(diào)味品，蛋黃醬，蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的湯，飲料，香料乳狀液和沙司。
適宜地，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是“精制食物”，包括蛋糕、面粉糕餅、糖果、巧克力、奶油軟糖等。
在一個方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是生面團產(chǎn)品或焙烤產(chǎn)品，諸如面包、油炸產(chǎn)品、小吃、蛋糕、餡餅、核仁巧克力餅、小甜餅、面條、零食諸如薄脆餅干、全麥薄脆餅干、椒鹽脆餅干、和薯片、和意大利面制品。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是植物衍生的食物產(chǎn)品，諸如面粉、預(yù)混合料、油、脂肪、可可油、人造稀奶油、色拉調(diào)味品、人造黃油、涂抹物、花生醬、起酥油、冰激凌、烹調(diào)油。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是乳制品，包括黃油，牛奶，奶油，奶酪諸如各種形式的(包括切碎的、整塊的、切片的或搓碎的)天然的、經(jīng)加工的、和人造的干酪，奶油干酪，冰激凌，冷凍甜品，酸奶，酸奶飲料，黃油脂肪，脫水乳脂肪，其它乳制品。根據(jù)本發(fā)明的酶可提高乳制品中的脂肪穩(wěn)定性。
在奶酪中使用根據(jù)本發(fā)明的酶是特別有益的。所以，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可有利地用于生產(chǎn)奶酪。脂肪分解酶催化牛奶中磷脂的水解，這有助于增加奶酪產(chǎn)量。優(yōu)選地，在奶酪生產(chǎn)過程前或期間，可將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶加到牛奶(稱為干酪用乳)中。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是含有動物衍生成分的食物產(chǎn)品，諸如經(jīng)加工的肉制品、烹調(diào)油、起酥油。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是飲料、水果、水果什錦、蔬菜或葡萄酒。在有些情況中，飲料可含多達20g/l外加的植物甾醇。
在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是動物飼料。動物飼料可強化了植物甾醇和/或植物甾烷醇，優(yōu)選強化了β-谷甾醇/甾烷醇。適宜地，動物飼料可以是家禽飼料。當(dāng)食品是家禽飼料時，本發(fā)明可用于降低以根據(jù)本發(fā)明的食品喂養(yǎng)的家禽所產(chǎn)蛋的膽固醇含量。
在一個方面，優(yōu)選食品選自以下一種或多種蛋，基于蛋的產(chǎn)品，包括蛋黃醬，色拉調(diào)味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黃及其制成品。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的食品是含水食品。適宜地，食品可包含10-98％的水，適宜地14-98％，適宜地18-98％的水，適宜地20-98％，適宜地40-98％，適宜地50-98％，適宜地70-98％，適宜地75-98％。
對于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以不是純的植物衍生油，諸如例如橄欖油、向日葵油、花生油、油菜籽油。為了免除猜疑，在本發(fā)明的有些方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可包含油，但該食品不是主要由油或油混合物構(gòu)成的。對于有些方面，優(yōu)選食品包含少于95％的脂質(zhì)，優(yōu)選少于90％的脂質(zhì)，優(yōu)選少于85％，優(yōu)選少于80％的脂質(zhì)。所以，對于本發(fā)明的有些方面，油可以是食品的成分，但優(yōu)選食品本身不是油。
專利申請WO2004/064987，WO2004/064537，PCT/IB2004/004374和GB0513859.9中教導(dǎo)了在食物應(yīng)用中使用能轉(zhuǎn)移酰基的脂肪分解酶的優(yōu)勢，將它們引入本文作為參考。
游離脂肪酸的產(chǎn)生對食品可能是有害的。在食品中，游離脂肪酸與臭味和/或異味以及其他有害效應(yīng)(包括諸如例如奶酪的乳制品中的油膩口味)有關(guān)。適宜地，在本發(fā)明的有些實施方案中，脂肪分解酶能將脂肪酸從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至?；荏w，例如甾醇和/或甾烷醇。因此，食品中游離脂肪酸的整體水平不增加或僅僅增加到不顯著的程度。所以，在奶酪生產(chǎn)中，根據(jù)本發(fā)明的能轉(zhuǎn)移?；闹痉纸饷缚商峁┮环N或多種以下出乎預(yù)料的技術(shù)效果減少奶酪中的溢油(oiling-off)效應(yīng)；增加奶酪產(chǎn)量；增強香味；降低惡臭；降低“油膩”口味。
本文教導(dǎo)的能將酰基轉(zhuǎn)移至碳水化合物以及甾醇和/或甾烷醇的脂肪分解酶的應(yīng)用對于含蛋食品是特別有益的。具體而言，在蛋和蛋制品中，糖，特別是葡萄糖的存在常常視為是不利的。蛋黃可包含多達1％的葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明，該不想要的糖可方便地通過“酯化”糖以形成糖酯來去除。
食用油中存在甘油二酯是不利的。具體而言，食用油(特別是棕櫚油)中的甘油二酯可導(dǎo)致油的品質(zhì)低。適宜地，在本發(fā)明的有些實施方案中，本文教導(dǎo)的脂肪分解酶能將脂肪酸從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至?；荏w，這降低油中甘油二酯的水平，而不增加或顯著增加游離脂肪酸的水平。
本文教導(dǎo)的脂肪分解酶能水解食用或植物油中的磷脂的主要部分。這在植物或食用油的酶促脫膠中是高度有益的。適宜地，在本發(fā)明的有些實施方案中，脂肪分解酶可能能將脂肪酸從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至?；荏w。因此，有利的是，油中的游離脂肪酸的整體水平不增加或僅僅增加到不顯著的程度。游離脂肪酸的產(chǎn)生對食用油可能是有害的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致食用油脫膠，其中游離脂肪酸的積聚降低和/或消除。
本發(fā)明的權(quán)利要求將解釋為包括上文所列每種食品。
在本文提及的有些應(yīng)用中，特別是食物應(yīng)用，諸如面包房應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以與一種或多種常規(guī)乳化劑一起使用，包括例如甘油單酯、脂肪酸甘油單酯和二酯的二?；剖狨ァ⑻酋?、硬脂酰乳酸鈉(SSL)和卵磷脂。
另外/或者，根據(jù)本發(fā)明的酶可以與一種或多種其它合適的食用級酶一起使用。所以，除了本發(fā)明的脂肪分解酶，可將至少一種其它酶加到焙烤品和/或生面團中，這在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這樣的其它酶包括淀粉降解酶諸如內(nèi)切或外切淀粉酶，支鏈淀粉酶，脫支酶，半纖維素酶包括木聚糖酶，纖維素酶，氧化還原酶如葡萄糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，巰基氧化酶或碳水化合物氧化酶諸如氧化麥芽糖的，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶和己糖氧化酶，蛋白酶，和?；D(zhuǎn)移酶(諸如例如PCT/IB2004/000575中所述的那些)。
本發(fā)明涵蓋食物酶組合物，包括包含根據(jù)本發(fā)明的酶的面包和/或生面團改良組合物，且任選還包含其它酶，諸如一種或多種其它合適的食用級酶，包括淀粉降解酶諸如內(nèi)切或外切淀粉酶，支鏈淀粉酶，脫支酶，半纖維素酶包括木聚糖酶，纖維素酶，氧化還原酶如葡萄糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，巰基氧化酶或碳水化合物氧化酶諸如氧化麥芽糖的，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶和己糖氧化酶，蛋白酶，和酰基轉(zhuǎn)移酶(諸如例如PCT/IB2004/000575中所述的那些)。
在本文提交的有些應(yīng)用中，特別是食物應(yīng)用，諸如面包房應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以與一種或多種酶底物聯(lián)合或順序加入。僅作為示例，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以與一種或多種極性脂質(zhì)底物和/或一種或多種酰基受體底物一起加入。
在本文提及的有些應(yīng)用中，特別是食物應(yīng)用，諸如面包房應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以與一種或多種羥酸一起使用，包括例如酒石酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸或抗壞血酸。
本文中所用的術(shù)語“改良的特性”指可通過本發(fā)明脂肪分解酶的作用改良的任何性質(zhì)。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的應(yīng)用導(dǎo)致一種或多種以下特征增加焙烤品體積；改善焙烤品團粒結(jié)構(gòu)(crumb structure)；焙烤品中的抗走味(anti-staling)特性；對生面團增加強度、增加穩(wěn)定性、減少粘性和/或改善切削加工性。
通過與不添加根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶而制備的生面團和/或焙烤品進行比較，評估了改良的特性。
本文中所用的術(shù)語“焙烤品”包括由生面團制備的產(chǎn)品。可通過本發(fā)明有利地制備的焙烤品(無論是白色、淺色或深色類型的)的例子包括以下一種或多種典型地塊或卷形式的面包(包括白、粗面粉和黑面包)，蒸汽小圓面包，法國棍子面包，比塔餅，玉米面豆卷，玉米粉圓餅，小麥粉圓餅，蛋糕，薄烤餅，餅干，脆面包，意大利面制品，面條等。
根據(jù)本發(fā)明的生面團可以是經(jīng)過發(fā)酵的生面團或?qū)⑦M行發(fā)酵的生面團。生面團可以以各種方式發(fā)酵，諸如通過加入碳酸氫鈉等，或通過加入合適的酵母培養(yǎng)物，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包酵母)培養(yǎng)物。
本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶用于生產(chǎn)意大利面制品生面團的應(yīng)用，優(yōu)選由硬質(zhì)小麥粉或相當(dāng)品質(zhì)的面粉制備而來。
根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶適合用于植物或食用油的酶促脫膠。在加工植物或食用油中，用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理食用或植物油，從而水解極性脂質(zhì)(如磷脂)的主要部分。優(yōu)選由極性脂質(zhì)水解得到脂肪?；?。由于水解了極性脂質(zhì)，如磷脂的主要部分(即超過50％)，脫膠過程通常導(dǎo)致食用油中極性脂質(zhì)，特別是磷脂的含量降低。典型地，將含水解極性脂質(zhì)(如磷脂)的水相與油分離。適宜地，食用或植物油可最初(用根據(jù)本發(fā)明的酶處理前)具有50-250ppm的磷含量。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)(優(yōu)選糖脂)以制造高價值產(chǎn)品，諸如碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或蛋白質(zhì)亞基酯和/或羥酸酯中的應(yīng)用。PCT/IB2004/004374中詳述了脂肪分解酶，特別是能將?；鶑臉O性脂質(zhì)底物(優(yōu)選糖脂)轉(zhuǎn)移至?；荏w的脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)中的應(yīng)用及其優(yōu)勢，引入本文作為參考。
在一個實施方案中，用于本發(fā)明方法中的脂肪分解酶可以是固定化的。在酶是固定化的情況中，可使包含?；w、任選的?；荏w、和任選的水的混合物通過柱子，例如包含固定化酶的柱子。通過固定酶，有可能容易地重新使用它。
適宜地，固定化酶可用在流動反應(yīng)器或間歇反應(yīng)器中，其裝有包含溶于水中的脂質(zhì)?；w和任選的酰基受體的反應(yīng)混合物。當(dāng)存在酰基受體時，供體和受體處在兩相系統(tǒng)或乳狀液中。反應(yīng)混合物可任選經(jīng)攪拌或經(jīng)超聲波處理。例如，一旦反應(yīng)達到平衡，可以分離反應(yīng)混合物和固定化酶。適宜地，可以分餾反應(yīng)產(chǎn)物，例如通過疏水相互作用層析、結(jié)晶或高真空度蒸餾。
固定化脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可利用本領(lǐng)域已知的固定技術(shù)來制備。有許多制備固定化酶的方法，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯然的(例如EP 0 746608；或Balcao V.M.等，Enzyme Microb Technol.1996年5月1日，18(6)392-416；或Retz等，Chem Phys Lipids，1998年6月，93(1-2)3-14；Bornscheuer等，Trends Biotechnol.2002年10月，20(10)433-7；Plou等，Biotechnology，92(2002)55-66；Warmuth等，1992，Bio Forum 9282-283；Ferrer等，2000，J.Chem.Technol.Biotechnol.751-8；或Christensen等，1998，Nachwachsende Rohstoff 1098-105；Petersen和Christenen，2000，AppliedBiocatalysis，Harwood Academic Publishers，Amsterdam中提到的技術(shù)，將每篇文獻引入本文作為參考)。
可用于本文的技術(shù)包括例如與Eupergit C共價偶聯(lián)、吸附到聚丙烯上和硅造粒。
根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用和/或本文所述方法的脂肪分解酶優(yōu)選是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡并而與SEQ ID No.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
優(yōu)選用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用和/或本文所述方法的脂肪分解酶是包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
可是，用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用和/或本發(fā)明方法的脂肪分解酶可以是可從鏈霉菌屬菌種得到的任何脂肪分解酶，其至少能水解半乳糖脂和/或能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物。
用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用和/或本發(fā)明方法的具有半乳糖脂酶活性的合適脂肪分解酶可包含以下氨基酸序列之任一和/或由以下核苷酸序列編碼
Thermobifida\fusca GDSx 548 aaSEQ ID No.5ZP 000587171 mlphpagerg evgaffallv gtpqdrrlrl echetrplrg rcgcgerrvp pltlpgdgvl61 cttsstrdae tvwrkhlqpr pdggfrphlg vgcllagqgs pgvlwcgreg crfevcrrdt121 pglsrtrngd ssppfragws lppkcgeisq sarktpavpr ysllrtdrpd gprgrfvgsg181 praatrrrlf lgipalvlvt altlvlavpt gretlwrmwc eatqdwclgv pvdsrgqpae241 dgeflllspv qaatwgnyya lgdsyssgdg ardyypgtav kggcwrsana ypelvaeayd301 faghlsflac sgqrgyamld aidevgsqld wnsphtslvt igiggndlgf stvlktcmvr361 vplldskact dqedairkrm akfettfeel isevrtrapd arilvvgypr ifpeeptgay421 ytltasnqrw lnetiqefnq qlaeavavhd eeiaasggvg svefvdvyha ldgheigsde481 pwvngvqlrd latgvtvdrs tfhpnaaghr avgervieqi etgpgrplya tfavvagatv541 dtlagevgSEQ ID No.61 ggtggtgaac cagaacaccc ggtcgtcggc gtgggcgtcc aggtgcaggt gcaggttctt61 caactgctcc agcaggatgc cgccgtggcc gtgcacgatg gccttgggca ggcctgtggt121 ccccgacgag tacagcaccc atagcggatg gtcgaacggc agcggggtga actccagttc181 cgcgccttcg cccgcggctt cgaactccgc ccaggacagg gtgtcggcga cagggccgca241 gcccaggtac ggcaggacga cggtgtgctg caggctgggc atgccgtcgc gcagggcttt301 gagcacgtca cggcggtcga agtccttacc gccgtagcgg tagccgtcca cggccagcag361 cactttcggt tcgatctgcg cgaaccggtc gaggacgctg cgcaccccga agtcggggga421 acaggacgac caggtcgcac cgatcgcggc gcaggcgagg aatgcggccg tcgcctcggc481 gatgttcggc aggtaggcca cgacccggtc gccggggccc accccgaggc tgcggagggc541 cgcagcgatc gcggcggtgc gggtccgcag ttctccccag gtccactcgg tcaacggccg601 gagttcggac gcgtgccgga tcgccacggc tgatgggtca cggtcgcgga agatgtgctc661 ggcgtagttg agggtggcgc cggggaacca gacggcgccg ggcatggcgt cggaggcgag721 cactgtggtg tacggggtgg cggcgcgcac ccggtagtac tcccagatcg cggaccagaa781 tccttcgagg tcggttaccg accagcgcca cagtgcctcg tagtccggtg cgtccacacc841 gcggtgctcc cgcacccagc gggtgaacgc ggtgaggttg gcgcgttctt tgcgctcctc901 gtcgggactc cacaggatcg gcggctgcgg cttgagtgtc atgaaacgcg accccttcgt961 ggacggtgcg gatgcggtga gcgtcgggtg cctcccctaa cgctccccgg tgacggagtg1021 ttgtgcacca catctagcac gcgggacgcg gaaaccgtat ggagaaaaca cctacaaccc1081 cggccggacg gtgggtttcg gccacactta ggggtcgggt gcctgcttgc cgggcagggc1141 agtcccgggg tgctgtggtg cgggcgggag ggctgtcgct tcgaggtgtg ccggcgggac1201 actccgggcc tcagccgtac ccgcaacggg gacagttctc ctcccttccg ggctggatgg1261 tcccttcccc cgaaatgcgg cgagatctcc cagtcagccc ggaaaacacc cgctgtgccc1321 aggtactctt tgcttcgaac agacaggccg gacggtccac gggggaggtt tgtgggcagc1381 ggaccacgtg cggcgaccag acgacggttg ttcctcggta tccccgctct tgtacttgtg1441 acagcgctca cgctggtctt ggctgtcccg acggggcgcg agacgctgtg gcgcatgtgg1501 tgtgaggcca cccaggactg gtgcctgggg gtgccggtcg actcccgcgg acagcctgcg1561 gaggacggcg agtttctgct gctttctccg gtccaggcag cgacctgggg gaactattac1621 gcgctcgggg attcgtactc ttcgggggac ggggcccgcg actactatcc cggcaccgcg
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1381 cgccgccgcc cacggcttca ccttcggcga cgtacgcacc accttcaccg gccacgagct1441 gtgctccggc agcccctggc tgcacagcgt caactggctg aacatcggcg agtcgtacca1501 ccccaccgcg gccggccagt ccggtggcta cctgccggtc ctcaacggcg ccgcctgacc1561 tcaggcggaa ggagaagaag aaggagcgga gggagacgag gagtgggagg ccccgcccga1621 cggggtcccc gtccccgtct ccgtctccgt cccggtcccg caagtcaccg agaacgccac1681 cgcgtcggac gtggcccgca ccggactccg cacctccacg cgcacggcac tctcgaacgc1741 gccggtgtcg tcgtgcgtcg tcaccaccac gccgtcctgg cgcgagcgct cgccgcccga1801 cgggaaggac agcgtccgcc accccggatc ggagaccgac ccgtccgcgg tcacccaccg1861 gtagccgacc tccgcgggca gccgcccgac cgtgaacgtc gccgtgaacg cgggtgcccg1921 gtcgtgcggc ggcggacagg cccccgagta gtgggtgcgc gagcccacca cggtcacctc1981 caccgactgc gctgcggggc//S.avermitilis\GDSx 269 aaSEQ ID No.14NP 827753.
1 mrrsritayv tslllavgca ltgaataqas paaaatgyva lgdsyssgvg agsylsssgd61 ckrsskaypy lwqaahspss fsfmacsgar tgdvlanqlg tlnsstglvs ltiggndagf121 sdvmttcvlq sdsaclsrin takayvdstl pgqldsvyta istkapsahv avlgyprfyk181 lggsclagls etkrsainda adylnsaiak raadhgftfg dvkstftghe icssstwlhs241 ldllnigqsy hptaagqsgg ylpvmnsva//SEQ ID No.151 ccaccgccgg gtcggcggcg agtctcctgg cctcggtcgc ggagaggttg gccgtgtagc61 cgttcagcgc ggcgccgaac gtcttcttca ccgtgccgcc gtactcgttg atcaggccct121 tgcccttgct cgacgcggcc ttgaagccgg tgcccttctt gagcgtgacg atgtagctgc181 ccttgatcgc ggtgggggag ccggcggcga gcaccgtgcc ctcggccggg gtggcctggg241 cgggcagtgc ggtgaatccg cccacgaggg cgccggtcgc cacggcggtt atcgcggcga301 tccggatctt cttgctacgc agctgtgcca tacgagggag tcctcctctg ggcagcggcg361 cgcctgggtg gggcgcacgg ctgtgggggg tgcgcgcgtc atcacgcaca cggccctgga421 gcgtcgtgtt ccgccctggg ttgagtaaag cctcggccat ctacgggggt ggctcaaggg481 agttgagacc ctgtcatgag tctgacatga gcacgcaatc aacggggccg tgagcacccc541 ggggcgaccc cggaaagtgc cgagaagtct tggcatggac acttcctgtc aacacgcgta601 gctggtacga cggttacggc agagatcctg ctaaagggag gttccatgag acgttcccga661 attacggcat acgtgacctc actcctcctc gccgtcggct gcgccctcac cggggcagcg721 acggcgcagg cgtccccagc cgccgcggcc acgggctatg tggccctcgg cgactcgtac781 tcgtccggtg tcggcgccgg cagctacctc agctccagcg gcgactgcaa gcgcagttcg841 aaggcctatc cgtacctctg gcaggccgcg cattcaccct cgtcgttcag tttcatggct901 tgctcgggcg ctcgtacggg tgatgtcctg gccaatcagc tcggcaccct gaactcgtcc961 accggcctgg tctccctcac catcggaggc aacgacgcgg gcttctccga cgtcatgacg1021 acctgtgtgc tccagtccga cagcgcctgc ctctcccgca tcaacacggc gaaggcgtac1081 gtcgactcca ccctgcccgg ccaactcgac agcgtgtaca cggcgatcag cacgaaggcc
1141 ccgtcggccc atgtggccgt gctgggctac ccccgcttct acaaactggg cggctcctgc1201 ctcgcgggcc tctcggagac caagcggtcc gccatcaacg acgcggccga ctatctgaac1261 agcgccatcg ccaagcgcgc cgccgaccac ggcttcacct tcggcgacgt caagagcacc1321 ttcaccggcc atgagatctg ctccagcagc acctggctgc acagtctcga cctgctgaac1381 atcggccagt cctaccaccc gaccgcggcc ggccagtccg gcggctatct gccggtcatg1441 aacagcgtgg cctgagctcc cacggcctga atttttaagg cctgaatttt taaggcgaag1501 gtgaaccgga agcggaggcc ccgtccgtcg gggtctccgt cgcacaggtc accgagaacg1561 gcacggagtt ggacgtcgtg cgcaccgggt cgcgcacctc gacggcgatc tcgttcgaga1621 tcgttccgct cgtgtcgtac gtggtgacga acacctgctt ctgctgggtc tttccgccgc1681 tcgccgggaa ggacagcgtc ttccagcccg gatccgggac ctcgcccttc ttggtcaccc1741 agcggtactc cacctcgacc ggcacccggc ccaccgtgaa ggtcgccgtg aacgtgggcg1801 cctgggcggt gggcggcggg caggcaccgg agtagtcggt gtgcacgccg gtgaccgtca1861 ccttcacgga ctgggccggc ggggtcgtcg taccgccgcc gccaccgccg cctcccggag1921 tggagcccga gctgtggtcg cccccgccgt cggcgttgtc gtcctcgggg gttttcgaac//Thermobifida\fusca\-GDSxSEQ ID No.161 mgsgpraatr rrlflgipal vlvtaltlvl avptgretlw rmwceatqdw clgvpvdsrg61 qpaedgefll lspvqaatwg nyyalgdsys sgdgardyyp gtavkggcwr sanaypelva121 eaydfaghls flacsgqrgy amldaidevg sqldwnspht slvtigiggn dlgfstvlkt181 cmvrvpllds kactdqedai rkrmakfett feelisevrt rapdarilvv gyprifpeep241 tgayytltas nqrwlnetiq efnqqlaeav avhdeeiaas ggvgsvefvd vyhaldghei301 gsdepwvngv qlrdlatgvt vdrstfhpna aghravgerv ieqietgpgr plyatfavva361 gatvdtlage vg//Thermobifida\fusca\-GDSxSEQ ID No.171 ctgcagacac ccgccccgcc ttctcccgga tcgtcatgtt cggcgactcc ctcagcgaca61 ccggcaagat gtactccaag atgcgcggct acctgccgtc ctccccgccg tactacgagg121 gccgcttcte gaacggcccg gtctggctgg agcagctgac gaagcagttc cccggcctga181 cgatcgccaa cgaggccgag gggggcgcga ccgcagtcgc ctacaacaag atctcctgga241 acccgaagta ccaggtcatt aacaacctcg actacgaggt cacccagttc ttgcagaagg301 actcgttcaa gcccgacgac ctggtcatcc tgtgggtggg cgccaacgac tacctggcct361 acggttggaa cacggagcag gacgccaagc gggtgcgcga cgccatctcg gacgcggcaa421 accgcatggt cctgaacggc gcgaagcaga tcctgctgtt caacctgccc gacctgggcc481 agaacccgtc cgcccgctcc cagaaggtcg tcgaggccgt ctcgcacgtg tccgcctacc541 acaacaagct gctcctcaac ctcgcccggc agctcgcccc gacgggcatg gtcaagctgt601 tcgagatcga caagcagttc gcggagatgc tgcgcgaccc ccagaacttc ggcctgagcg661 acgtggagaa cccgtgctac gacggcggct acgtgtggaa gccgttcgcc acccggtccg721 tctcgaccga ccggcagctg tcggccttct cgccccagga gcgcctggcg atcgctggca781 acccgctcct ggcacaggcg gtagcttcgc cgatggcccg ccgctcggcc tcgcccctca
841 actgcgaggg caagatgttc tgggaccagg tccaccccac caccgtggtc cacgccgccc901 tctcggagcg cgccgccacc ttcatcgaga cccagtacga gttcctcgcc cactagtcta961 gaggatcc所以，在另一方面，本發(fā)明提供了脂肪分解酶在食品中用于制備溶血糖脂，例如二半乳糖苷甘油單酯(DGMG)或單半乳糖苷甘油單酯(MGMG))的應(yīng)用，其通過用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理糖脂(如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或單半乳糖苷甘油二酯(MGDG))來產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在另一方面，本發(fā)明還進一步提供了脂肪分解酶在食品中用于制備溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的應(yīng)用，其通過用酶處理磷脂(如卵磷脂)來產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在另一方面，本發(fā)明還進一步提供了脂肪分解酶在蛋或基于蛋的產(chǎn)品中用于水解磷脂和/或糖脂的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在另一方面，本發(fā)明提供了脂肪分解酶在底物(優(yōu)選食品)中用于水解脂肪?；膽?yīng)用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在另一方面，本發(fā)明提供了脂肪分解酶在食用油中用于降低磷脂含量的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在另一方面，本發(fā)明涉及脂肪分解酶在底物(優(yōu)選含極性脂質(zhì)(優(yōu)選糖脂)的生物轉(zhuǎn)化混合物)中用于生產(chǎn)高價值產(chǎn)品，諸如碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或蛋白質(zhì)亞基酯和/或羥酸酯的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ ID No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及用于本文中所述用途的包含SEQ ID No.8、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。
更優(yōu)選地，本發(fā)明涉及包含SEQ ID No.16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶的應(yīng)用。
在一個廣的方面，本發(fā)明可提供至少能水解糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從喜熱裂孢菌屬(Thermobifida)物種，優(yōu)選褐色喜熱裂孢菌(T.fusca)得到的。
在另一個廣的方面，本發(fā)明可提供至少能水解糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從棒桿菌屬(Corynebacterium)物種，優(yōu)選C.efficiens得到的。
在另一個廣的方面，本發(fā)明可提供至少能水解糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)得到的。
在另一方面，本發(fā)明可提供至少能水解糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體的脂肪分解酶，其中該酶包含SEQ ID No.5、7、8、12、或16或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，或該酶由SEQ ID No.6、9、13、或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在另一方面，本發(fā)明可提供至少能水解糖脂和/或至少能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w的脂肪分解酶，其中該酶包含SEQ ID No.14或與其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，或該酶由SEQ ID No.15所示的核苷酸序列或與其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在另一方面，本發(fā)明可提供至少能水解糖脂和/或至少能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w的脂肪分解酶，其中該酶包含SEQ ID No.16或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的氨基酸序列，或該酶由SEQ ID No.17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％同一性的核苷酸序列之任一編碼。
在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選可從中(或就是從中)得到脂肪分解酶的鏈霉菌屬菌種不是龜裂鏈霉菌(Streptomyces rimosus)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選可從中(或就是從中)得到脂肪分解酶的鏈霉菌屬菌種不是天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)。
優(yōu)點本發(fā)明的一個優(yōu)點是脂肪分解酶具有顯著的糖脂水解活性。對于來自鏈霉菌屬菌種的脂肪分解酶來說，這是令人驚訝的。另外，對于來自喜熱裂孢菌屬和棒桿菌屬物種的脂肪分解酶來說，這是令人驚訝的。
本發(fā)明的另一優(yōu)點是脂肪分解酶不具有三酰甘油水解活性或具有不顯著的三酰甘油水解活性。
分離的在一個方面，優(yōu)選序列是分離形式的。術(shù)語“分離的”指序列至少基本上不含至少一種在自然界中找到時和在自然界中與該序列天然相連的其它成分。
純化的在一個方面，優(yōu)選序列是純化形式的。術(shù)語“純化的”指序列處于相對純的狀態(tài)-如至少約90％純、或至少約95％純或至少約98％純。
核苷酸序列本發(fā)明的范圍涵蓋編碼具有本文定義的特定特性的酶的核苷酸序列。
本文中所用的術(shù)語“核苷酸序列”指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其變體、同源物、片段和衍生物(諸如其部分)。核苷酸序列可以是基因組或合成或重組來源的，它可以是雙鏈的或單鏈的，無論代表有義或反義鏈。
本發(fā)明涉及的術(shù)語“核苷酸序列”包括基因組DNA、cDNA、合成DNA、和RNA。優(yōu)選它指DNA，更優(yōu)選編碼本發(fā)明的cDNA序列。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明實質(zhì)范圍所涉及和涵蓋的核苷酸序列不包括在其天然環(huán)境中以及與其天然相連序列連接時的根據(jù)本發(fā)明的天然核苷酸序列，其中天然相連序列也在其天然環(huán)境中。為了便于提及，我們稱這種優(yōu)選的實施方案為“非天然核苷酸序列”。在這點上，術(shù)語“天然核苷酸序列”指在其天然環(huán)境中且與其天然相連的完整啟動子可操作連接時的完整核苷酸序列，其中啟動子也在其天然環(huán)境中?？墒?，在其天然生物體中的核苷酸序列表達之后，可以分離和/或純化本發(fā)明范圍所涵蓋的氨基酸序列?？墒莾?yōu)選本發(fā)明范圍所涵蓋的氨基酸序列可由其天然生物體中的核苷酸序列表達，但其中核苷酸序列不受該生物體中與之天然相連的啟動子的控制。
核苷酸序列的制備典型地，利用重組DNA技術(shù)(即重組DNA)來制備本發(fā)明范圍所涵蓋的核苷酸序列?？墒牵诒景l(fā)明的一個可選實施方案中，利用本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)方法(參見Caruthers MH等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)，可完整或部分合成核苷酸序列。
可以從產(chǎn)生所述酶的任何細胞或生物體鑒定和/或分離和/或純化編碼具有本文定義的特定特性的酶的核苷酸序列。本領(lǐng)域眾所周知用于鑒定和/或分離和/或純化核苷酸序列的多種方法。舉例來說，一旦鑒定和/或分離和/或純化到合適的序列，則可通過PCR擴增技術(shù)來制備更多序列。
進一步舉例來說，可以使用來自產(chǎn)生酶的生物體的染色體DNA或信使RNA來構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。如果知道酶的氨基酸序列或酶的部分氨基酸序列，則可以合成帶標(biāo)記的寡核苷酸探針，并用于從由生物體制備的基因組文庫鑒定編碼酶的克隆。或者，可使用含有與其它已知酶基因同源的序列的帶標(biāo)記寡核苷酸探針來鑒定編碼酶的克隆。在后一種情況中，使用較低嚴(yán)謹度的雜交和洗滌條件。
或者，可如下鑒定編碼酶的克隆，將基因組DNA片段插入表達載體，諸如質(zhì)粒，用得到的基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化酶陰性細菌，然后將轉(zhuǎn)化細菌涂布到含酶底物(如葡糖苷酶(麥芽糖酶)生成酶用麥芽糖)的瓊脂平板上，從而可鑒定表達酶的克隆，由此可鑒定編碼酶的克隆。
又或者，可通過已確定的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成制備編碼酶的核苷酸序列，如Beucage S.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869所述的亞磷酰胺(phosphoroamidite)法，或Matthes等，(1984)EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在亞磷酰胺法中，合成寡核苷酸，如在自動DNA合成儀中，純化，退火，連接并克隆到合適的載體中。
核苷酸序列可以是混合的基因組和合成來源的、混合的合成和cDNA來源的，或混合的基因組和cDNA來源的，其按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過連接合成、基因組或cDNA來源的(如果合適)的片段來制備。每個連接的片段對應(yīng)于完整核苷酸序列的各部分。也可使用特定引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來制備DNA序列，例如US 4,683,202或Saiki R K等，Science(1988)239，pp487-491中所述。
由于遺傳密碼的簡并性，可以方便地制備如下核苷酸序列，其中對于由原始核苷酸序列編碼的有些或所有氨基酸，三聯(lián)體密碼子的使用率已經(jīng)改變，從而產(chǎn)生與原始核苷酸序列具有低同源性但編碼如原始核苷酸序列所編碼的相同或變體氨基酸序列的核苷酸序列。例如，對于大多數(shù)氨基酸，遺傳密碼的簡并性位于三聯(lián)體密碼子中的第三位(擺動位)(參見Stryer，Lubert，Biochemistry，第三版，F(xiàn)reeman Press，ISBN 0-7167-1920-7)，因此，其中所有三聯(lián)體密碼子在第三位都“擺動”的核苷酸序列與原始核苷酸序列將具有約66％的同一性，可是改變后的核苷酸序列將編碼如原始核苷酸序列所編碼的相同、或變體一級氨基酸序列。
因此，本發(fā)明還涉及如下任何核苷酸序列，對于至少一種編碼氨基酸的三聯(lián)體密碼子，具有可變的三聯(lián)體密碼子使用率，但編碼如原始核苷酸序列所編碼多肽序列的相同、或變體多肽序列。
另外，特定生物體通常對使用哪些三聯(lián)體密碼子來編碼氨基酸具有偏好。優(yōu)選的密碼子使用率表可廣泛獲得，并可用于制備密碼子優(yōu)化基因。這樣的密碼子優(yōu)化技術(shù)常規(guī)用于優(yōu)化異源宿主中轉(zhuǎn)基因的表達。
分子進化一旦分離得到編碼酶的核苷酸序列，或者鑒定得到推定的編碼酶的核苷酸序列，可能希望更改選擇的核苷酸序列，例如可能希望對序列進行突變，從而制備根據(jù)本發(fā)明的酶。
可以使用合成寡核苷酸來導(dǎo)入突變。這些寡核苷酸含有期望突變位點側(cè)翼的核苷酸序列。
Morinaga等，Biotechnology，1984，2646-649中公開了一種合適的方法。Nelson和Long，Analytical Biochemistry，1989，180147-151中描述了將突變導(dǎo)入編碼酶的核苷酸序列的另一種方法。
除了定點誘變，諸如上文所述，可以隨機導(dǎo)入突變，例如使用商品化試劑盒，諸如Stratagene的GeneMorph PCR誘變試劑盒或Clontech的DiversifyPCR隨機誘變試劑盒。EP 0 583 265涉及優(yōu)化基于PCR的誘變的方法，它也可以聯(lián)合使用誘變性DNA類似物，諸如EP 0 866 796中所述。錯誤傾向PCR技術(shù)適于生成具有優(yōu)選特征的脂肪分解酶變體。WO 02/06457涉及脂肪酶的分子進化。
獲取新序列的第三種方法是使用任何數(shù)目的限制酶或諸如DNA酶I等酶將不同的核苷酸序列片段化，并重新裝配成編碼功能性蛋白質(zhì)的全長核苷酸序列?；蛘撸梢允褂靡环N或多種不同的核苷酸序列，并在重新裝配全長核苷酸序列的過程中導(dǎo)入突變。DNA改組和家族改組技術(shù)適于生成具有優(yōu)選特征的脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶變體。EP 0 752 008、EP 1 138 763、EP 1 103606中可找到適于進行“改組”的方法。改組還可以聯(lián)合其它形式的DNA誘變，正如US 6,180,406和WO 01/34835中所述。
由此，有可能在體內(nèi)或在體外在核苷酸序列中生成大量的定點或隨機誘變，并隨后通過多種手段對所編碼多肽篩選改進的功能性?？梢允褂美鏸n silico(計算機芯片)和exo介導(dǎo)的重組方法(見WO 00/58517、US6,344,328、US 6,361,974)來進行分子進化，其中所生成的變體保留與已知酶或蛋白質(zhì)的很低同源性。由此獲得的此類變體可能具有與已知脂肪分解酶的顯著結(jié)構(gòu)類似性，但是它們具有很低的氨基酸序列同源性。
作為一個非限制性實例，還可以將多核苷酸序列的突變或天然變體與野生型或其它突變或天然變體重組以生成新的變體。也可以對此類新變體篩選所編碼多肽的改進的功能性。
上述和類似分子進化方法的應(yīng)用容許在沒有關(guān)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的任何現(xiàn)有知識的條件下鑒定和選擇具有優(yōu)選特征的本發(fā)明酶變體，且容許生成不可預(yù)測的但有利的突變或變體。分子進化在本領(lǐng)域中用于優(yōu)化或改變酶活性的應(yīng)用有許多例子，這樣的例子包括但不限于以下一種或多種優(yōu)化在宿主細胞中或在體外的表達和/或活性、提高酶活性、改變底物和/或產(chǎn)物特異性、提高或降低酶或結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、改變在優(yōu)選環(huán)境條件(如溫度、pH、底物)中的酶活性/特異性。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚知道的，使用分子進化工具，可以改變酶以改進酶的功能性。
適宜地，本發(fā)明所使用的脂肪分解酶可以是變體，即與親本酶相比可包含至少一處氨基酸替代、刪除或添加。酶變體保留與親本酶的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％同源性。合適的親本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。優(yōu)選地，親本酶對得上pfam00657共有序列。
在一個優(yōu)選的實施方案中，脂肪分解酶變體保留或摻入在GDSx、GANDY和HPT模塊中發(fā)現(xiàn)的至少一個或多個pfam00657共有序列氨基酸殘基。
可以使用分子進化工具對酶諸如在水性環(huán)境中沒有或具有低半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性的脂肪酶進行突變以導(dǎo)入或增強半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性，由此生成適用于本發(fā)明組合物和方法的具有顯著半乳糖脂酶和/或磷脂酶活性的脂肪分解酶。
適宜地，酶變體對甘油三酯和/或甘油單酯和/或甘油二酯可以不具有活性。
或者，本發(fā)明所使用的酶變體對甘油三酯可以具有升高的活性，和/或?qū)σ韵乱环N或多種也可以具有升高的活性極性脂質(zhì)、磷脂、卵磷脂、磷脂酰膽堿、糖脂、二半乳糖苷甘油單酯、單半乳糖苷甘油單酯。
氨基酸序列本發(fā)明的范圍還涵蓋具有本文定義的特定特性的酶的氨基酸序列。
本文中所用的術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“多肽”和/或術(shù)語“蛋白質(zhì)”同義。在有些情況中，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“肽”同義。在有些情況中，術(shù)語“氨基酸序列”與術(shù)語“酶”同義。
可以由合適的來源制備/分離氨基酸序列，或者可以人工合成，或是可以使用重組DNA技術(shù)來制備。
本發(fā)明所涵蓋的酶可與其它酶聯(lián)合使用。因此，本發(fā)明還覆蓋酶的組合，其中該組合包含本發(fā)明的酶和其它酶，它可以是根據(jù)本發(fā)明的其它酶。這方面在以后的節(jié)中討論。
優(yōu)選地，本發(fā)明實質(zhì)范圍所涉及和涵蓋的氨基酸序列不是天然的酶。在這點上，術(shù)語“天然的酶”指在其天然環(huán)境中且由其天然核苷酸序列表達的完整的酶。
同一性/同源性本發(fā)明還涵蓋酶的任何氨基酸序列或編碼這種酶的任何核苷酸序列的同源物的應(yīng)用。
在本文中，術(shù)語“同源物”指與氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的實體。在本文中，術(shù)語“同源性”可以等同于“同一性”。這些術(shù)語在本文中可互換使用。
在本文的背景中，認為同源氨基酸序列包括與序列可以是至少87或90％相同的氨基酸序列，優(yōu)選與序列至少95、96、97、98或99％相同。典型地，同源物將包含與主題氨基酸序列相同的例如活性位點等。盡管同源性也可認為是相似性(即具有相似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)，但是在本發(fā)明的背景中，優(yōu)選以序列同一性來表示同源性。
在本文的背景中，認為同源核苷酸序列包括與編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列(主題序列)可以是至少85或90％相同的核苷酸序列，優(yōu)選至少95、96、97、98或99％相同。典型地，同源物將包含與主題序列相同的編碼活性位點等的序列。盡管同源性也可認為是相似性(即具有相似化學(xué)特性/功能的氨基酸殘基)，但是在本發(fā)明的背景中，優(yōu)選以序列同一性來表示同源性。
對于氨基酸序列和核苷酸序列，可以目測進行同源性比較，或者更常用的是借助易于獲得的序列比較程序。這些商業(yè)性計算機程序能計算兩種或多種序列之間的％同源性。
可以對毗鄰序列計算％同源性，即將一種序列與其它序列進行對比，并將一種序列中的每一個氨基酸與其它序列中的相應(yīng)氨基酸直接進行比較，每次一個殘基。這稱為“無缺口”對比。通常，只對較短數(shù)目的殘基進行這種無缺口對比。
盡管這是一種非常簡單且可靠的方法，然而它未能考慮例如在其它方面相同的成對序列中一處插入或刪除將引起后面的氨基酸殘基無法進行對比，由此可能導(dǎo)致在進行整體對比時％同源性大大降低。因此，大多數(shù)序列比較方法設(shè)計成在考慮到可能的插入和刪除的條件下生成最佳對比，不過度處罰整體同源性得分。這是通過在序列對比中插入“缺口”以設(shè)法使局部同源性最大化而實現(xiàn)的。
可是，這些更加復(fù)雜的方法給對比中發(fā)生的每個缺口賦予“缺口罰分”，使得對于相同數(shù)目的相同氨基酸而言，具有盡可能少的缺口的序列對比-反應(yīng)了兩種比較序列之間的較高相關(guān)性-將獲得比具有更多缺口的其它序列對比更高的得分。通常使用“仿射缺口代價(affine gap costs)”，即對缺口的存在處以較高代價，而對缺口中的每一個后續(xù)殘基處以較小罰分。這是最常用的缺口評分系統(tǒng)。高缺口罰分當(dāng)然將以較少缺口生成優(yōu)化對比。大多數(shù)對比程序容許更改缺口罰分?？墒?，在使用這種軟件進行序列比較時，優(yōu)選使用缺省值。例如在使用GCG Wisconsin Bestfit軟件包時，氨基酸序列的缺省缺口罰分是缺口-12且每個延伸-4。
因此，最大％同源性的計算首先需要生成最佳對比，其中要考慮缺口罰分。適用于進行這種對比的一種計算機程序是GCG Wisconsin Bestfit軟件包(Devereux等，1984，Nuc.Acids Research，12387)?？梢赃M行序列比較的其它軟件的實例包括但不限于BLAST軟件包(見Ausubel等，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，第4版，第18章)、FASTA(Altschul等，1990，J.Mol.Biol.403-410)、和GENEWORKS比較工具套。BLAST和FASTA都能進行離線和在線搜索(見Ausubel等，1999，Short Protocols in MolecularBiology，7.58-7.60)。
可是，對于有些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG Bestfit程序。還可以使用稱為BLAST 2 Sequences的一種新工具來比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列(見FEMSMicrobiol Lett 1999，174(2)247-50；及FEMS Microbiol Lett 1999，177(1)187-8)。
盡管最終的％同源性可以根據(jù)同一性進行測量，然而對比過程自身通常不是基于“全是或全非”成對比較。而是，通常使用尺度相似性評分矩陣根據(jù)化學(xué)相似性或進化距離給每對比較賦予得分。常用的此類矩陣的一個實例是BLOSUM62矩陣-BLAST程序套的缺省矩陣。GCG Wisconsin程序通常使用公開的缺省值或定制的符號比較表，如果提供的話(進一步的細節(jié)見用戶手冊)。對于有些應(yīng)用，優(yōu)選使用GCG軟件包的公開缺省值，或者在其它軟件的情況中，使用缺省矩陣，諸如BLOSUM62。
或者，可以使用以與CLUSTAL(Higgins DG和Sharp PM，1988，Gene73(1)237-244)類似的算法為基礎(chǔ)的DNASISTM(Hitachi Software)中的多重對比特色來計算百分比同源性。
一旦軟件生成了最佳對比，就有可能計算％同源性，優(yōu)選％序列同一性。軟件通常作為序列比較的一部分來執(zhí)行它，并生成一個數(shù)值結(jié)果。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，使用以下軟件和設(shè)置來計算百分比序列同源性/同一性。對于氨基酸序列，使用AlignX VectorNTI(Vector NTI Advance9.1，Invitrogen Corporation，Carlsbad，California，美國)為每個可能的氨基酸序列對來計算同一性(同源性)或“正數(shù)”百分比。設(shè)置是缺省參數(shù)(缺口開始罰分-10，缺口延伸罰分0.1)。
對于核酸序列，使用Informax Inc.(美國)的AlignX VectorNTI程序為每個可能的核酸序列對計算同一性(同源性)或“正數(shù)”百分比。設(shè)置是缺省設(shè)置，對于DNA為缺口開始罰分15和缺口延伸罰分6.66(對于多重對比，使用相同設(shè)置)。
優(yōu)選地，橫跨全長氨基酸序列(如SEQ ID No.4、5、7、8、10、12和14)計算氨基酸同一性(同源性)，或?qū)τ诤怂?，則是編碼各自全長氨基酸序列的相應(yīng)多核苷酸。優(yōu)選的是，可以通過對成熟多肽，即經(jīng)過共翻譯或翻譯后加工，例如N-末端信號肽切割、或C-末端切割事件的多肽序列比較同源性/同一性來計算氨基酸或核酸同一性(同源性)。
序列還可以具有生成沉默改變并導(dǎo)致功能等同物的氨基酸殘基刪除、插入或替代?？梢愿鶕?jù)氨基酸特性(諸如殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或兩親性本質(zhì))的相似性進行審慎的氨基酸替代，因此以功能組形式將氨基酸在一起分組是有用的?？蓛H僅根據(jù)氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)將它們在一起分組?？墒?，另外包括突變數(shù)據(jù)是更有用的。如此衍生的氨基酸組出于結(jié)構(gòu)原因可能是保守的。這些組可以范氏(Venn)圖的形式描述(Livingstone C.D.和Barton G.J.，1993，″Protein sequence alignmentsa strategy for the hierarchical analysis of redisue conservation″，Comput.Appl.Biosci.，9745-756；Taylor W.R.，1986，″Theclassification of amino acid conservation″，J.Theor.Biol.，119205-218)。例如根據(jù)下表所描述的普遍接受的氨基酸范氏圖分組，可進行保守替代。
本發(fā)明還涵蓋可以發(fā)生的同源替代(替代和替換在本文中都用于指用可選氨基酸殘基交換現(xiàn)有殘基)，即相似替代，諸如堿性替代堿性、酸性替代酸性、極性替代極性等。也可以發(fā)生非同源替代，即由一類殘基變成另一類，或者牽涉非天然氨基酸，諸如鳥氨酸(下文稱為Z)、二氨基丁酸鳥氨酸(下文稱為B)、正亮氨酸鳥氨酸(下文稱為O)、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸和苯甘氨酸。
還可以用非天然氨基酸進行替換。
氨基酸序列變體可以包含合適的間隔基團，它可以插入序列的任何兩個氨基酸殘基之間，除了氨基酸間隔物諸如甘氨酸或β-丙氨酸殘基以外，還包括烴基，諸如甲基、乙基或丙基。變異的另一種形式牽涉類肽(peptoid)形式的一個或多個氨基酸殘基的存在，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員充分理解的。為了避免疑惑，“類肽形式”用于指氨基酸殘基變體，其中α-碳取代基位于殘基的氮原子上而非α-碳原子。本領(lǐng)域知道用于制備類肽形式的肽的方法，例如Simon RJ等，PNAS，1992，89(20)9367-9371；及Horwell DC，TrendsBiotechnol.1995，13(4)132-134。
本發(fā)明所使用的核苷酸序列可以在其中包含合成的或修飾的核苷酸。本領(lǐng)域知道對寡核苷酸的許多不同類型修飾。這些修飾包括甲基膦酸酯(methylphosphonate)和硫代磷酸酯(phosphorothioate)主鏈和/或在分子的3′和/或5′端添加吖啶或多賴氨酸鏈。出于本發(fā)明的目的，應(yīng)當(dāng)理解可以通過本領(lǐng)域可利用的任何方法來修飾本文所述核苷酸序列?？梢詾榱嗽鰪姳景l(fā)明核苷酸序列的體內(nèi)活性或壽命而進行這些修飾。
本發(fā)明還涵蓋與本文所述序列或其任何衍生物、片段或衍生物互補的核苷酸序列的用途。如果序列與其片段互補，那么該序列可作為探針用于在其它生物體中鑒定相似編碼序列等。
可以以多種方式獲得與本發(fā)明序列不是100％同源但屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸?？梢酝ㄟ^例如探查由一群個體例如來自不同人群的個體制備的DNA文庫來獲得本文所述序列的其它變體。另外，可以獲得其它同源物，而且這些同源物及其片段一般能與本文序列表中所示序列發(fā)生選擇性雜交?？梢酝ㄟ^由其它物種制備cDNA文庫或基因組DNA文庫并在中等至高嚴(yán)謹度條件下用包含所附序列表中任一序列的完整或部分序列的探針探查這些文庫來獲得這些序列。類似考慮應(yīng)用于獲得本發(fā)明多肽或核苷酸序列的物種同源物和等位基因變體。
還可以使用簡并PCR獲得變體和株系/物種同源物，其中所用引物設(shè)計成靶向變體和同源物中編碼本發(fā)明序列中保守氨基酸序列的序列?？梢酝ㄟ^例如對比來自幾個變體/同源物的氨基酸序列來預(yù)測保守序列?？梢允褂帽绢I(lǐng)域知道的計算機軟件來進行序列對比。例如廣泛使用GCG WisconsinPileUp程序。
簡并PCR所使用的引物將包含一個或多個簡并位置，而且將在比用針對已知序列的單一序列引物來克隆序列時更低的嚴(yán)謹條件使用。
或者，可以通過已鑒定序列的定點誘變來獲得這些多核苷酸。這在例如為了對多核苷酸序列將要在其中表達的特定宿主細胞優(yōu)化密碼子偏愛性而需要沉默密碼子序列改變時可能是有用的。為了導(dǎo)入限制酶識別位點或改變由多核苷酸編碼的多肽的特性或功能，可能還需要其它序列改變。
本發(fā)明的多核苷酸(核苷酸序列)可用于生成引物，例如PCR引物，用于進行可選擴增反應(yīng)的引物，探針，例如使用放射性或非放射性標(biāo)記物通過常規(guī)手段用顯現(xiàn)標(biāo)記物標(biāo)記的探針，或者可以將多核苷酸克隆到載體中。這些引物、探針和其它片段的長度將是至少15個、優(yōu)選至少20個、例如至少25個、30個或40個核苷酸，而且同樣由本文所使用的術(shù)語本發(fā)明多核苷酸所涵蓋。
可以重組、合成或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何手段來生成根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸，諸如DNA多核苷酸和探針。還可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來克隆它們。
一般而言，將通過合成手段來生成引物，牽涉逐步制造期望的核酸序列，每次一個核苷酸。使用自動化技術(shù)實現(xiàn)這一目的的技術(shù)在本領(lǐng)域是易于獲得的。
通常將使用重組手段例如PCR(聚合酶鏈反應(yīng))克隆技術(shù)來生成較長的多核苷酸。引物可以設(shè)計成包含合適的限制酶識別位點，從而能夠?qū)U增的DNA克隆到合適的克隆載體中。
有生物學(xué)活性的優(yōu)選地，變體序列等至少與本文所示序列一樣有生物學(xué)活性。
本文中所用的“有生物學(xué)活性的”指具有與天然存在序列相似的結(jié)構(gòu)功能(但不必是相同程度)、和/或相似的調(diào)節(jié)功能(但不必是相同程度)、和/或相似的生化功能(但不必是相同程度)的序列。
雜交本發(fā)明還涵蓋與本發(fā)明的核酸序列互補的序列或是能與本發(fā)明的序列或其互補序列發(fā)生雜交的序列。
本文中所用的術(shù)語“雜交”應(yīng)當(dāng)包括“一條核酸鏈與一條互補鏈通過堿基配對而結(jié)合的過程”，以及在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)中進行的擴增過程。
本發(fā)明還涵蓋能與本文所示序列或其任何衍生物、片段或衍生物的互補序列發(fā)生雜交的核苷酸序列的用途。
術(shù)語“變體”還涵蓋能與本文所示核苷酸序列發(fā)生雜交的序列的互補序列。
優(yōu)選地，術(shù)語“變體”涵蓋能在嚴(yán)謹條件(如50℃和0.2x SSC{1x SSC＝0.15M NaCl2、0.015M檸檬酸三鈉pH 7.0})下與本文所示核苷酸序列發(fā)生雜交的序列的互補序列。
更優(yōu)選地，術(shù)語“變體”涵蓋能在高嚴(yán)謹條件(如65℃和0.1x SSC{1xSSC＝0.15M NaCl2、0.015M檸檬酸三鈉pH 7.0})下與本文所示核苷酸序列發(fā)生雜交的序列的互補序列。
本發(fā)明還涉及能與本發(fā)明核苷酸序列(包括本文所示那些的互補序列)發(fā)生雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及能與本發(fā)明核苷酸序列(包括本文所示那些的互補序列)發(fā)生雜交的序列的互補核苷酸序列。
本發(fā)明的范圍還包括能在中度至最高嚴(yán)謹條件下與本文所示核苷酸序列發(fā)生雜交的多核苷酸序列。
在一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明覆蓋能在嚴(yán)謹條件(如50℃和0.2x SSC)下與本發(fā)明核苷酸序列或其互補序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
在一個更優(yōu)選的方面，本發(fā)明覆蓋能在高嚴(yán)謹條件(如65℃和0.1xSSC)下與本發(fā)明核苷酸序列或其互補序列發(fā)生雜交的核苷酸序列。
重組的在一個方面，用于本發(fā)明的序列是重組序列-即利用重組DNA技術(shù)制備的序列。
這些重組DNA技術(shù)在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。文獻中闡明了這些技術(shù)，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，1-3冊，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。
合成的在一個方面，用于本發(fā)明的序列是合成的序列-即通過體外化學(xué)或酶促合成制備的序列。它包括但不限于用宿主生物體的最優(yōu)密碼子使用率而得到的序列-諸如甲基營養(yǎng)型酵母畢赤酵母屬(Pichia)和漢遜酵母屬(Hansenula)。
酶的表達可以將本發(fā)明所使用的核苷酸序列摻入重組可復(fù)制載體。該載體可用于在相容宿主細胞中和/或由相容宿主細胞復(fù)制和表達所述核苷酸序列(以酶的形式)。
可以使用控制序列，如調(diào)節(jié)序列來控制表達。
根據(jù)所使用的序列和/或載體，由宿主重組細胞通過表達核苷酸序列而生成的酶可以是分泌的，或者可以是包含在細胞內(nèi)的。編碼序列可以設(shè)計成含有信號序列，它指導(dǎo)序列所編碼物質(zhì)穿過特定原核或真核細胞膜的分泌。
表達載體術(shù)語“表達載體”指能夠在體內(nèi)或在體外進行表達的構(gòu)建物。
優(yōu)選地，將表達載體摻入合適宿主生物體的基因組。術(shù)語“摻入”優(yōu)選覆蓋穩(wěn)定的摻入基因組。
本發(fā)明的核苷酸序列可以存在于載體中，其中核苷酸序列可操作連接調(diào)節(jié)序列，該調(diào)控序列能夠通過合適的宿主生物體提供核苷酸序列的表達。
可以如下文所述將本發(fā)明所使用的載體轉(zhuǎn)化到合適的宿主細胞中，以提供本發(fā)明多肽的表達。
載體的選擇，例如質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體，常常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細胞。
本發(fā)明所使用的載體可以含有一種或多種選擇標(biāo)記基因，諸如賦予抗生素抗性的基因，例如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性?；蛘?，可以通過共轉(zhuǎn)化來進行選擇(如WO 91/17243中所述)。
可以在體外使用載體，例如用于生成RNA或用于轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或感染宿主細胞。
由此，在另一個實施方案中，通過將本發(fā)明的核苷酸序列導(dǎo)入可復(fù)制載體，將載體導(dǎo)入相容宿主細胞，并在促使載體復(fù)制的條件下培養(yǎng)宿主細胞，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明的核苷酸序列的方法。
載體還可以包含使得載體能夠在所討論宿主細胞中進行復(fù)制的核苷酸序列。這些序列的實例有質(zhì)粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點。
調(diào)節(jié)序列在有些應(yīng)用中，本發(fā)明所使用的核苷酸序列可操作連接調(diào)節(jié)序列，它能夠通過諸如選擇的宿主細胞提供核苷酸序列的表達。舉例來說，本發(fā)明覆蓋包含本發(fā)明核苷酸序列且其與這種調(diào)節(jié)序列可操作連接的載體，即載體是表達載體。
術(shù)語“可操作連接”指位置毗鄰，其中所述組件的相互關(guān)系容許它們以其預(yù)期方式發(fā)揮功能。與編碼序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列的連接方式使得能夠在與控制序列相容的條件下實現(xiàn)編碼序列的表達。
術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動子和增強子和其它表達調(diào)節(jié)信號。
術(shù)語“啟動子”采用本領(lǐng)域常用含義，例如RNA聚合酶結(jié)合位點。
還可以通過選擇異源調(diào)節(jié)區(qū)，例如啟動子、分泌前導(dǎo)序列、和終止子區(qū)，來實現(xiàn)編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的表達增強。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列可操作連接至少一個啟動子。
適于指導(dǎo)核苷酸序列在細菌、真菌或酵母宿主中轉(zhuǎn)錄的啟動子的實例在本領(lǐng)域是眾所周知的。
構(gòu)建物術(shù)語“構(gòu)建物”-與諸如“綴合物”、“盒”和“雜合物”等術(shù)語同義-包含根據(jù)本發(fā)明使用的核苷酸序列且其直接或間接與啟動子相連。
間接相連的實例在本發(fā)明的啟動子和核苷酸序列之間提供合適的間隔區(qū)，諸如內(nèi)含子序列，諸如Shl內(nèi)含子或ADH內(nèi)含子。術(shù)語“融合”在本發(fā)明中也是如此，包括直接或間接相連。在有些情況中，該術(shù)語不覆蓋編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列與通常相連的野生型基因啟動子的天然組合，且它們都處于其天然環(huán)境中。
構(gòu)建物甚至可以包含或表達容許選擇基因構(gòu)建物的標(biāo)記。
對于有些應(yīng)用，優(yōu)選的是，本發(fā)明的構(gòu)建物包含至少一種本發(fā)明的核苷酸序列且其可操作連接啟動子。
宿主細胞術(shù)語“宿主細胞”在涉及本發(fā)明時包括包含上文所述核苷酸序列或表達載體且用于重組生產(chǎn)具有本文定義的特定特性之酶的任何細胞。
由此，本發(fā)明的另一個實施方案提供了經(jīng)核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染而表達本發(fā)明酶的宿主細胞。將要選擇與所述載體相容的細胞，而且可以是例如原核(例如細菌)、真菌、酵母或植物細胞。優(yōu)選地，宿主細胞不是人類細胞。
合適的細菌宿主生物體的實例有革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌物種。
根據(jù)編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列的本質(zhì)和/或進一步加工所表達蛋白質(zhì)的愿望，真核宿主可能是優(yōu)選的，諸如酵母或其它真菌。一般而言，酵母細胞比真菌細胞更加優(yōu)選，因為它們易于操作?？墒?，有些蛋白質(zhì)或是難以由酵母細胞分泌，或是在有些情況中難以正確加工(例如在酵母中過度糖基化)。在這些情況中，應(yīng)當(dāng)選擇不同的真菌宿主生物體。
使用合適的宿主細胞，諸如酵母、真菌和植物宿主細胞，可以提供翻譯后修飾(例如肉豆蔻?；?、糖基化、截短、lapidation以及酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化)，這可能是賦予本發(fā)明重組表達產(chǎn)物以最佳生物學(xué)活性所需要的。
宿主細胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶減除的菌株。
可修改宿主細胞的基因型以改善表達。
宿主細胞修飾的例子包括蛋白酶缺陷、補充罕見的tRNA、和修改細胞質(zhì)中的還原勢(reductive potential)以增強二硫鍵形成。
例如，如Kane，Curr Opin Biotechnol，1995，6494-500，″Effects of rarecodon clusters on high-level expression of heterologous proteins in E.coli″中所示例/描述的，宿主細胞大腸桿菌可過度表達罕見的tRNA以改善異源蛋白質(zhì)的表達。如Bessette，Proc Natl Acad Sci USA，1999，9613703-13708，″Efficient folding of proteins with multiple disulphide bonds in the Escherichiacoli cytoplasm″中所示例/描述的，宿主細胞可以是許多還原酶缺陷的，由此適宜形成穩(wěn)定的二硫鍵。
在一個實施方案中，宿主細胞是細菌，優(yōu)選革蘭氏陽性細菌，優(yōu)選宿主細胞選自放線細菌(Actinobacteria)，諸如雙歧桿菌屬(Biofidobacteria)和氣單胞菌屬(Aeromonas)，特別優(yōu)選殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)。仍更優(yōu)選放線菌目(Actinomicetales)，諸如棒桿菌屬，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)和諾卡氏菌屬(Nocardia)。特別優(yōu)選鏈霉菌科(Streptomycetaceae)，諸如鏈霉菌屬，特別是淺青紫鏈霉菌(S.lividans)。
微生物宿主可用于表達半乳糖脂酶基因，如真細菌、古細菌或真菌，包括酵母。優(yōu)選真細菌，例如后壁菌門(Firmicutes)(低GC的革蘭氏陽性細菌)，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其它芽孢桿菌屬物種，乳酸細菌，諸如乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)的物種。
也優(yōu)選革蘭氏陰性的變形菌(Proteobacteria)，特別是伽馬變形菌(Gammaproteobacteria)，諸如屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和埃希氏桿菌屬(Escherichia)的宿主物種，尤其是大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)。
在另一個實施方案中，宿主細胞與天然宿主物種是同一個屬的，即在與分離得到重組基因的物種同一屬的物種中重新引入并表達重組基因。
在另一個實施方案中，宿主細胞是天然宿主物種，即在與分離得到重組基因的同一物種中重新引入并表達重組基因。
生物體術(shù)語“生物體”在涉及本發(fā)明時包括能夠包含編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的核苷酸序列和/或由其獲得的產(chǎn)物，和/或其中啟動子在存在于生物體中時能夠容許根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列表達的任何生物體。
合適的生物體可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物體”在涉及本發(fā)明時包括包含編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的核苷酸序列和/或由其獲得的產(chǎn)物，和/或其中啟動子能夠容許編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列在生物體內(nèi)表達的任何生物體。優(yōu)選地，將核苷酸序列摻入生物體的基因組。
術(shù)語“轉(zhuǎn)基因生物體”不覆蓋處于其天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列，此時它們處于其天然啟動子的控制之下，而后者同樣處于其天然環(huán)境中。
因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因生物體包括包含編碼根據(jù)本發(fā)明的酶的核苷酸序列、根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)建物、根據(jù)本發(fā)明的載體、根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒、根據(jù)本發(fā)明的細胞、根據(jù)本發(fā)明的組織、或其產(chǎn)物中的任何一種或組合的生物體。
例如，轉(zhuǎn)基因生物體還可以包含編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列且其處于異源啟動子的控制之下。
宿主細胞/生物體的轉(zhuǎn)化如上所述，宿主生物體可以是原核或真核生物體。合適的原核宿主的實例包括大腸桿菌和枯草桿菌。
關(guān)于原核宿主轉(zhuǎn)化的講授在本領(lǐng)域有很好的記錄，例如見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在轉(zhuǎn)化前進行合適的修改，諸如清除內(nèi)含子。
可以使用本領(lǐng)域知道的多種方法轉(zhuǎn)化絲狀真菌細胞，諸如牽涉以已知方式形成原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，隨后再生細胞壁的過程。EP 0 238 023中描述了使用曲霉(Aspergillus)作為宿主微生物。
另一種宿主生物體可以是植物。關(guān)于轉(zhuǎn)化植物的一般技術(shù)的綜述見Potrykus，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1991，42205-225；及Christou，Agro-Food-Industry Hi-Tech，1994年3月/4月，17-27。關(guān)于植物轉(zhuǎn)化的其它講授見EP-A-0449375。
下面的節(jié)介紹了關(guān)于轉(zhuǎn)化真菌、酵母和植物的一般教導(dǎo)。
轉(zhuǎn)化的真菌宿主生物體可以是真菌，諸如絲狀真菌。合適的這種宿主的實例包括屬于嗜熱霉屬(Thermomyces)、支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、毛霉屬(Mucor)、鏈孢霉屬(Neurospora)、木霉屬(Trichoderma)等的任何成員。
講授絲狀真菌轉(zhuǎn)化的綜述見US-A-5741665，它聲明用于轉(zhuǎn)化絲狀真菌和培養(yǎng)真菌的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在本領(lǐng)域是眾所周知的。關(guān)于應(yīng)用于粗糙鏈孢霉(N.crassa)的技術(shù)的綜述見例如Davis和de Serres，Methods Enzymol，1971，17A79-143。
關(guān)于轉(zhuǎn)化絲狀真菌的其它技術(shù)的綜述見US-A-5674707。
在一個方面，宿主生物體可以是曲霉屬的，諸如黑曲霉(Aspergillusniger)。
還可以通過遵循例如Martinelli S.D.、Kinghorn J.R.編的《Aspergillus50years on Progress in industrial microbiology》，第29卷，Elsevier Amsterdam1944，p641-666中Turner G(1944)著的“Vectors for genetic manipulation”的講授來制備根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因曲霉。
關(guān)于絲狀真菌中的基因表達的綜述見Punt等，2002，Trends Biotechnol，2002年5月，20(5)200-6；Archer和Peberdy，Crit Rev Biotechnol，1997，17(4)273-306。
轉(zhuǎn)化的酵母在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因生物體可以是酵母。
關(guān)于異源基因在酵母中表達的原理的綜述見例如Methods Mol Biol，1995，49341-54及Curr Opin Biotechnol，1997年10月，8(5)554-60。
在這個方面，可以使用酵母作為異源基因表達的媒介，諸如物種啤酒糖酵母(Saccharomyces cereviseae)或巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)(見FEMS Microbiol Rev，2000，24(1)45-66)。
關(guān)于在啤酒糖酵母中表達異源基因和分泌基因產(chǎn)物的原理的綜述見EHinchcliffe和E Kenny，1993，“Yeast as a vehicle for the expression ofheterologous genes”，Yeast，Vol.5，Anthony H Rose和J Stuart Harrison編，第2版，Academic Press Ltd.。
關(guān)于酵母的轉(zhuǎn)化，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種轉(zhuǎn)化方案。例如，可以通過遵循Hinnen等，1978，Proceedings of the National Academy of Science of the USA，751929；Beggs，JD，1978，Nature，London，275104；及Ito，H等，1983，JBacteriology，153163-168的講授來制備根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因糖酵母。
可以使用多種選擇標(biāo)記來選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的酵母細胞，諸如營養(yǎng)缺陷標(biāo)記和顯性抗生素抗性標(biāo)記。
轉(zhuǎn)化的植物/植物細胞適于本發(fā)明的宿主生物體可以是植物。關(guān)于一般技術(shù)的綜述可以見Potrykus，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1991，42205-225及Christou，Agro-Food-Industry Hi-Tech，1994年3月/4月，17-27的論文。
培養(yǎng)和生產(chǎn)可以在有益于生成所編碼酶且易于從細胞和/或培養(yǎng)基中回收酶的條件下培養(yǎng)經(jīng)過本發(fā)明核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)所討論宿主細胞且使得酶表達的任何常規(guī)培養(yǎng)基。
由重組細胞生成的蛋白質(zhì)可以展示在細胞表面上。
可利用公知的方法，從宿主細胞分泌酶并方便地從培養(yǎng)基中回收。
分泌通常希望表達宿主將酶分泌到培養(yǎng)基中，由此可以更加容易地回收酶。根據(jù)本發(fā)明，可以根據(jù)期望的表達宿主來選擇分泌前導(dǎo)序列。雜合信號序列也可用于本發(fā)明的背景。
異源分泌前導(dǎo)序列的典型實例有來自真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-18和24個氨基酸的兩種形式，例如來自曲霉屬)、α-因子基因(酵母，例如糖酵母屬、克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)、和漢遜氏酵母)、或α-淀粉酶基因(芽孢桿菌屬)的分泌前導(dǎo)序列。
舉例來說，關(guān)于大腸桿菌中異源蛋白質(zhì)分泌的綜述見Methods Enzymol，1990，182132-43。
檢測本領(lǐng)域知道用于檢測和測量氨基酸序列表達的多個方案。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、和熒光激活細胞分揀術(shù)(FACS)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道多種標(biāo)記物和綴合技術(shù)，它們可用于多種核酸和氨基酸測定法。
許多公司，諸如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)、和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)，供應(yīng)用于這些流程的商品化試劑盒和方案。
合適的報道分子或標(biāo)記物包括那些放射性核素、酶、熒光、化學(xué)發(fā)光、或顯色劑，以及底物、輔因子、抑制劑、磁性粒子等。講授這些標(biāo)記物的用途的專利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
同樣，可以如US-A-4,816,567中所述生成重組免疫球蛋白。
融合蛋白可以以融合蛋白的形式生成根據(jù)本發(fā)明使用的氨基酸序列，例如以便于它的提取和純化。融合蛋白配偶體的實例包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA結(jié)合和/或轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域)、和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶體與目的蛋白質(zhì)序列之間包含蛋白水解切割位點從而能夠切除融合蛋白序列也是方便的。
優(yōu)選地，融合蛋白將不會妨礙蛋白質(zhì)序列的活性。
關(guān)于大腸桿菌中的基因融合表達系統(tǒng)的綜述見Curr.Opin.Biotechnol.1995，6(5)501-6。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以將氨基酸序列與異源序列連接以編碼融合蛋白。例如，為了對肽庫篩選能夠影響物質(zhì)活性的試劑，編碼表達受到商品化抗體識別的異源表位的嵌合物可能是有用的。
大規(guī)模應(yīng)用在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將氨基酸序列用于大規(guī)模應(yīng)用。
優(yōu)選地，培養(yǎng)宿主生物體后產(chǎn)生的氨基酸序列的量為1g每升至約2g每升總細胞培養(yǎng)液體積。
優(yōu)選地，培養(yǎng)宿主生物體后產(chǎn)生的氨基酸序列的量為100mg每升至約900mg每升總細胞培養(yǎng)液體積。
優(yōu)選地，培養(yǎng)宿主生物體后產(chǎn)生的氨基酸序列的量為250mg每升至約500mg每升總細胞培養(yǎng)液體積。
食物本發(fā)明的組合物可用作-或用于制備-食物。本文中，術(shù)語“食物”以廣義來使用，并覆蓋用于人的食物以及用于動物的食物(即飼料)。在一個優(yōu)選的方面，食物是用于人消費的。
食物可以是溶液的形式或作為固體-這取決于用途和/或應(yīng)用模式和/或施用模式。
食物成分本發(fā)明的組合物可用作食物成分。
本文中所用的術(shù)語“食物成分”包括加到或可加到功能食物或食品中的配方，并包括在需要例如酸化或乳化的極其多種產(chǎn)品中能以低水平使用的配方。
食物成分可以是溶液的形式或作為固體-這取決于用途和/或應(yīng)用模式和/或施用模式。
食物產(chǎn)品本發(fā)明的組合物可用于制備諸如以下一種或多種的食物產(chǎn)品糖果產(chǎn)品、乳制品、肉制品、禽產(chǎn)品、魚產(chǎn)品和焙烤品。
本發(fā)明還提供了制備食物或食物成分的方法，該方法包括將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶與其它食物成分混合。
在附帶的權(quán)利要求書中和在以下附圖和實施例中呈現(xiàn)了進一步優(yōu)選的方面。
附圖描述

圖1顯示了PCR片段SEQ ID No.1，其是部分非酶編碼多核苷酸；該序列是廣泛用于分類學(xué)比較的核糖體16S RNA基因；圖2顯示了PCR片段SEQ ID No.2，其是部分非酶編碼多核苷酸；該序列是廣泛用于分類學(xué)比較的核糖體16S RNA基因；圖3顯示了編碼根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的多核苷酸(SEQ ID No.3)；圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.4)；圖5顯示了脂肪分解酶表達載體pGTK(L131)和pET11(131-51)的結(jié)構(gòu)；
圖6顯示了來自鏈霉菌屬菌種L130的脂肪分解酶對生面團中的二半乳糖苷甘油二酯的效果圖；圖7顯示了來自鏈霉菌屬菌種L131的脂肪分解酶對生面團中的二半乳糖苷甘油二酯的效果圖；圖8顯示了來自鏈霉菌的脂肪分解酶對生面團中的甘油三酯的效果圖；圖9顯示了得自鏈霉菌屬菌種L131的脂肪分解酶對半乳糖脂底物的pH圖譜；圖10顯示了提取自經(jīng)標(biāo)記為#236的大腸桿菌中表達的鏈霉菌脂肪分解酶處理的生面團的脂質(zhì)的TLC板；泳道1＝對照；泳道2＝#236，0.225PLU-7/g面粉；泳道3＝#236，0.45PLU-7/g面粉；泳道4＝#236，0.675PLU-7/g面粉；泳道5＝DGDG參照材料。
圖11顯示了由pUC18(L131R)和pIJ48構(gòu)建的表達載體pRX487；圖12以圖的形式顯示了溫度對來自鏈霉菌屬菌種L131的脂肪分解酶的穩(wěn)定性和活性的影響；圖13以圖的形式顯示了來自鏈霉菌屬菌種L131、除蟲鏈霉菌、Corynebacterium efficiens、和褐色喜熱裂孢菌的半乳糖脂酶的底物特異性；圖14顯示了用于在谷氨酸棒桿菌中表達褐色喜熱裂孢菌脂肪酶的表達載體pCB5(TF)的結(jié)構(gòu)；圖15顯示了L131與同源除蟲鏈霉菌和褐色喜熱裂孢菌的序列對比；圖16顯示了粗制大豆油樣品的酶處理反應(yīng)產(chǎn)物的HPTLC板。泳道1＝對照，泳道2＝99％粗制油和1％K371的10％水溶液，泳道3＝98％粗制油和2％K371的10％水溶液，泳道4＝97％粗制油和3％K371的10％水溶液，泳道5＝99.7％粗制油和0.3％Lecitase UltraTM#3108的1％水溶液，泳道6＝99％粗制油、0.3％Lecitase UltraTM#3108和0.7％水的1％水溶液。分析磷脂酰膽堿(PC)作為參照；和圖17顯示了粗制大豆油樣品的酶處理反應(yīng)產(chǎn)物的HPTLC板。泳道1＝對照，泳道2＝99％粗制油和1％K371的10％水溶液，泳道3＝98％粗制油和2％K371的10％水溶液，泳道4＝97％粗制油和3％K371的10％水溶液，泳道5＝99.7％粗制油和0.3％Lecitase UltraTM#3108的1％水溶液，泳道6＝99％粗制油、0.3％Lecitase UltraTM#3108和0.7％水的1％水溶液，以及膽固醇酯、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯和植物甾醇的參考泳道。
實施例1產(chǎn)半乳糖脂酶的細菌菌株的鑒定。
從芬蘭南部收集的土壤中分離得到具有相似表型的兩個微生物菌株，編號為L130和L131。使用寡核苷酸引物536f(CAGCMGCCGCGGTAATWC)和1392r-引物(ACGGGCGGTGTGTRC)通過標(biāo)準(zhǔn)PCR擴增這兩個菌株的16S RNA基因。對得到的PCR片段部分測序。SEQ ID No.1和2是非酶編碼多核苷酸。這些序列是廣泛用于分類學(xué)比較的核糖體16S RNA基因。發(fā)現(xiàn)SEQ ID No.1和SEQ ID No.2具有高度相似性。然后將該序列與GenBank中的16S RNA基因序列作比較。對于這兩個分離株，觀察到與Streptomycesthermosacchari的16S RNA基因序列有最高同源性(97％)。所以，將菌株命名為鏈霉菌屬菌種L130和鏈霉菌屬菌種L131。
實施例2鏈霉菌屬菌種L130和L131菌株的脂肪分解酶(半乳糖脂酶)樣品的制備。
將鏈霉菌L130接種0.5升LB培養(yǎng)基并在旋轉(zhuǎn)搖床上以200rpm和30℃培養(yǎng)2天。將該培養(yǎng)物作為接種體接種10升裝有相同培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。以30℃、攪拌速率600rpm和通氣量0.5v/v繼續(xù)培養(yǎng)3天。將發(fā)酵液通過離心(15分鐘、5000rpm)澄清并加入Triton X-100至終濃度0.1％。用Vivaflow200超濾器(Vivascience AG，Hannover，德國)將溶液濃縮至300ml。將濃縮液用10升含2mM CaCl2和2mM MgCl2的20mM Tris HCl緩沖液pH 7透析，然后用0.5升85％甘油透析。根據(jù)上文定義的測定法(GLU-7)，得到的制品含90U半乳糖脂酶活性。
在相同條件下培養(yǎng)鏈霉菌L131菌株，并通過相同流程濃縮培養(yǎng)液。得到的半乳糖脂酶制品含70U活性。
實施例3烘焙實驗來自細菌分離株L130和L131的半乳糖脂酶對極性脂質(zhì)底物，半乳糖脂(DGDG)和磷脂顯示出高活性(半乳糖脂酶和磷脂酶活性)，與尖鐮孢脂肪酶(Lipopan FTMNovozymes A/S丹麥)相當(dāng)可是，發(fā)現(xiàn)來自細菌分離株L130和L131的半乳糖脂酶(即根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶)對甘油三酯不具有顯著的活性。這與尖鐮孢脂肪酶-LipopanFTM的活性形成極大反差。
如實施例2中所述制備細菌分離株L130和L131的脂肪分解酶，并在標(biāo)準(zhǔn)測定條件中和在生面團中進行分析以表征它們對糖脂、磷脂和甘油三酯的活性。
小規(guī)模進行烘焙實驗和生面團模型系統(tǒng)。兩種酶在面粉中對半乳糖脂很有活性。
材料和方法如實施例3制備每種酶的三個樣品。每個樣品如表1所示進行標(biāo)注表1
通過上文提到的磷脂酶活性測定法(PLU-7)和半乳糖脂酶活性測定法(GLU-7)來評估酶的磷脂酶和半乳糖脂酶活性。
生面漿實驗在12ml有蓋離心管中稱取0.8克小麥粉。加入1.5ml含酶的水。在樣品在回轉(zhuǎn)器(Whirley)上混合并在加熱箱中于30℃放置60分鐘。加入6ml 9∶1的正丁醇∶乙醇，再次混合樣品直至面粉很好的分散到溶劑中。將試管在水浴中于95℃放置10分鐘。然后再次混合并在旋轉(zhuǎn)設(shè)備上以45rpm放置45分鐘。
然后將樣品以2000g離心10分鐘。將2ml上清液轉(zhuǎn)移至10ml打蘭杯(dram glass)。在氮氣下于70℃蒸發(fā)掉溶劑。
通過GLC分析分離的脂質(zhì)。
氣相色譜Perkin Elmer 8420毛細管氣相層析，裝有WCOT熔融石英柱，12.5m×0.25mm ID×0.1μm 5％苯基-甲基-硅樹脂(購自Crompack的CP SiI 8CB)。
載體氦。
注射1.5μL，分流(with split)。
檢測儀FID.385℃。
烤爐程序 1 2 3 4烤爐溫度[℃] 80200240360等溫時間[分鐘] 2 0 0 10升溫速率[℃/分鐘]2010 12樣品制備將從0.2克面粉提取的脂質(zhì)溶于2mL 2∶1的庚烷∶吡啶，其中含有2mg/mL內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)十七烷。將500μL樣品轉(zhuǎn)移至曲頸瓶。加入100μLMSTFA(N-甲基-N-三甲基硅烷基-三氟乙酰胺)并于90℃將反應(yīng)保溫15分鐘。
計算根據(jù)這些成分的參照混合物來測定甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯、游離脂肪酸和半乳糖脂的響應(yīng)因子。根據(jù)這些響應(yīng)因子來計算生面團中的脂質(zhì)。
結(jié)果。
對來自鏈霉菌屬的酶的樣品分析磷脂酶和半乳糖脂酶活性，其結(jié)果如表2所示。還計算了PLU-7/GLU-7活性比率。樣品的平均比率是1.4，但在有些樣品中有些偏差，其可由分析偏差來解釋。
表2
生面團實驗。
在如材料和方法所述的生面漿實驗中測試酶對小麥脂質(zhì)的活性。通過GLC分析來自生面團的分離脂質(zhì)，如表3所示。
表3.生面團脂質(zhì)的GLC分析(以面粉重量為基準(zhǔn)的％)。FFA＝游離脂肪酸。MGMG＝單半乳糖苷甘油單酯。DGMG＝二半乳糖苷甘油單酯。MGDG＝單半乳糖苷甘油二酯。DGDG＝二半乳糖苷甘油二酯。TRI＝甘油三酯。
表3的結(jié)果確認了，在鏈霉菌屬菌種L130和L131的發(fā)酵上清液中分離出的酶對生面團中的半乳糖脂很有活性。二酯DGDG和MGDG水解成相應(yīng)的單酯DGMG和MGMG。圖6和7也圖示了結(jié)果。這些結(jié)果確認了，這兩種酶在0-0.2單位/g面粉的低劑量很有活性并產(chǎn)生了相應(yīng)量的單酯。在0.4-1單位/克面粉的更高劑量時，DGDG進一步降解，但也觀察到一些單酯水解。這可能暗示，酶對半乳糖脂分子中的脂肪酸位置不是特異性的。
如圖8所示，幾乎不存在酶對甘油三酯的活性。因此得出結(jié)論，所測試的酶對甘油三酯不具有顯著的效果。這也與以三丁精作為底物進行的一些實驗一致，其中沒有觀察到有活性。
小結(jié)在鏈霉菌屬菌種的發(fā)酵上清液中分離出脂肪分解酶。
發(fā)現(xiàn)脂肪分解酶具有磷脂酶和半乳糖脂酶兩種活性，但對甘油三酯無顯著活性。對于所測試的樣品，磷脂酶∶半乳糖脂酶活性的比率約為1.4。
生面漿實驗確認了，酶對面粉中的半乳糖脂有活性。酶在0-0.2單位/g面粉的很低劑量時在生面團中有活性。商品化的磷脂酶，像Lipopan FTM(Novozymes A/S，丹麥)，需要高3-4倍的劑量才能獲得對半乳糖脂的相同效果。生面漿實驗還確認了，來自鏈霉菌屬菌種的酶對甘油三酯不具有可測量的活性。
實施例4從鏈霉菌屬菌種L131克隆脂肪分解酶基因。
利用修正的標(biāo)準(zhǔn)方法從鏈霉菌屬菌種L131分離染色體DNA。將細菌在旋轉(zhuǎn)搖床上在30℃和高通氣條件下(每個0.5升帶有障板的燒瓶裝有100ml培養(yǎng)基，200rpm)在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至早期穩(wěn)定期。從500ml細菌培養(yǎng)液離心收集細胞，并用裂解緩沖液(550mM葡萄糖、100mM Tris、2mMEDTA，pH 8.0)洗滌一次。
將細胞團重懸于10ml裂解緩沖液，并加入溶菌酶至1mg/ml。將細胞于37℃保溫至少15分鐘。溶菌酶消化后，將細菌懸浮液的等分試樣轉(zhuǎn)移至1％SDS溶液中，并于600nm測量所得混合物的吸光度。調(diào)整溶菌酶量和保溫時間，使得根據(jù)A600的降低情況所有細胞中至少70-90％得到裂解。在該時間點，向細菌懸浮液中加入SDS至1％和蛋白酶至0.1mg/ml。將懸浮液于56℃保溫30分鐘，然后用苯酚和氯仿抽提。氯仿抽提后，用醋酸鈉(0.5M終濃度)和異丙醇(0.6vol/vol)沉淀DNA，并用70％乙醇洗滌DNA團，真空干燥并溶于含RNA酶A(0.01mg/ml)的TE緩沖液(10mM Tris、1mMEDTA)。
用限制性內(nèi)切核酸酶Sau3A部分消化DNA，并將水解產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠上分離。通過電泳從瓊脂糖凝膠上分離出3-10kb的Sau3A片段。使用Stratagene(La Jolla，美國)的ZAP表達/預(yù)消化載體/Gigapack克隆試劑盒(產(chǎn)品#239615)將該DNA制品用來構(gòu)建基因文庫。按照Stratagene提供的方案，進行連接、包裝、擴增文庫并將其轉(zhuǎn)變成噬菌粒形式。在如下制備的指示板上篩選質(zhì)粒形式的所得基因文庫。將80ml含25mg/l卡那霉素的無菌LB瓊脂置于每個15cm皮氏培養(yǎng)皿中并使之凝固。隨后，加入10ml上層瓊脂層，其含有0.5％DGDG和0.0005％番紅O。以約5000個克隆每個15cm平板的密度涂布基因文庫。將平板于37℃保溫24小時，然后于室溫保溫4天。從文庫中挑選在指示板上形成紅暈的克隆，并通過在新的指示板上克隆來純化。
將從該克隆分離的質(zhì)粒(命名為pBK(L131))用于重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL1-Blue MRF′，使之帶有卡那霉素抗性。所有這些轉(zhuǎn)化子都表現(xiàn)出半乳糖脂酶陽性表型。pBK(L131)含有約7.5kb的插入物。對該插入物測序。發(fā)現(xiàn)一個測出序列的區(qū)域(SEQ ID No.3)含有可讀框(SEQ ID No.4)，其編碼顯示出與來自龜裂鏈霉菌的已知脂肪酶有同源性的蛋白質(zhì)。該脂肪酶，脂肪酶/酯酶/?；D(zhuǎn)移酶的所謂GDSX家族的一個成員，僅已知能水解中性脂質(zhì)和人造脂肪酶底物。
構(gòu)建原始插入物的一系列刪除體和亞克隆，并測試半乳糖脂酶活性。發(fā)現(xiàn)攜帶原始插入物的3kb EcoRI-SacI片段的刪除衍生物仍保持全部的DGDG酶活性。該數(shù)據(jù)與部分DNA的結(jié)果高度關(guān)聯(lián)。一個區(qū)域證明了與已知脂肪酶有同源性。該區(qū)域隨后測得完整序列。將該序列與GenBank作比較，揭示了經(jīng)過生化表征的L131半乳糖脂酶的最接近同源物(58.5％)是來自龜裂鏈霉菌的脂肪酶，在WO04/064987和WO04/064537中鑒定為脂質(zhì)∶?；D(zhuǎn)移酶。
L131半乳糖脂酶在大腸桿菌中的表達。
使用標(biāo)準(zhǔn)pET系統(tǒng)，其中基因在T7噬菌體啟動子的控制之下，在大腸桿菌中表達L131半乳糖脂酶。
L131半乳糖脂酶在淺青紫鏈霉菌中的表達。
用于在淺青紫鏈霉菌中表達L131半乳糖脂酶的穿梭載體pRX487-5(圖11)(衍生自pIJ4987Kieser T.等，Practical Streptomyces genetics.The JohnInnes Foundation，Crowes，Norwich，英格蘭，2000)組合了大腸桿菌質(zhì)粒pUC18和淺青紫鏈霉菌質(zhì)粒pIJ487。在pRX487-5中，pUC18的lac啟動子置于pIJ487的無啟動子的卡那霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的上游。事實上，經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不僅具有氨芐青霉素抗性而且具有至少低水平(5mg/l)的卡那霉素抗性。載體含有未經(jīng)修飾的S.thermosacchari染色體DNA的EcoRI-XbaI片段，其包含完整的半乳糖脂酶基因編碼序列，約有160bp上游非編碼序列和420bp下游非編碼序列。根據(jù)指示板上暈形成的判斷，所有轉(zhuǎn)化子顯示出相似水平的半乳糖脂酶活性。相似地，在以10升水平培養(yǎng)攜帶pRX487-5的淺青紫鏈霉菌并在指示板上克隆時，所有克隆表現(xiàn)出能產(chǎn)生等量的半乳糖脂酶活性。在用直接來自平板的無性繁殖細胞接種的小搖瓶培養(yǎng)物中，轉(zhuǎn)化子通常在培養(yǎng)3天后產(chǎn)生約10-20mU/ml半乳糖脂酶活性。在用重組淺青紫鏈霉菌的孢子接種搖瓶培養(yǎng)物時，與更高的生物量積累對應(yīng)，測得更高的半乳糖脂酶活性(約30mU/ml)。在發(fā)酵罐中在高通氣條件下以補料分批模式培養(yǎng)攜帶pRX487-5的淺青紫鏈霉菌(詳情參見材料和方法)，在該實驗中，生物量積累達到了170g/升(濕重)。因此，檢測到更高的半乳糖脂酶活性-約1U/ml。
L131的生化特性。
測試了L131的一些生化特性。發(fā)現(xiàn)酶的最適pH約為6.5-7.5(圖9)。酶對DGDG在約50℃的溫度展示出最大活性。在該溫度以上發(fā)生失活，但不劇烈，于90℃保溫20分鐘后檢測到約10％的剩余活性(圖12)。
實施例5根據(jù)本發(fā)明的鏈霉菌屬L131脂肪分解酶基因在大腸桿菌中的表達用引物oL131-5(GGTGAATTCATGAGATTGACCCGATCCCTGTCGG，有義引物)和oL131-3(ACTTCTAGAGCGGCGCCACCGTGACGTACA，反義引物)通過PCR擴增pBK(L131)的可讀框，其編碼根據(jù)本發(fā)明的推定脂肪分解酶。用EcoRI和XbaI消化擴增的DNA片段并克隆到枯草桿菌-大腸桿菌穿梭載體pGTK44中。該載體是通過用pGT44(Kerovuo J.等，Biotechnology Letters 22，1311-1317，2000)的EcoRI-SalI片段替換含degQ36啟動子的質(zhì)粒pGTK44(Povelainen等，Biochem J.371，191-197，2003)的SalI-EcoRI片段而構(gòu)建的。
利用指示板在用所得質(zhì)粒pGTK44(L131)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中檢測到半乳糖脂酶活性(圖5)。對照轉(zhuǎn)化子(含親本質(zhì)粒pGTK44)是半乳糖脂酶陰性的。所以，SEQ ID No 4所代表的蛋白質(zhì)序列確實擁有半乳糖脂酶活性。相同的引物對從鏈霉菌屬菌種L130的染色體DNA擴增出相同大小的片段(通過瓊脂糖凝膠電泳)，進一步確認了先前關(guān)于兩個分離株及其半乳糖脂酶基因密切相似的觀察結(jié)果。
對于在T7噬菌體啟動子控制下的大腸桿菌中的表達，用鏈霉菌屬菌種L131d染色體DNA作為模板，并用兩種寡核苷酸引物(oL131-51GGTCATGCTAGCATGAGATTGACCCGATCCCTGTCGG和oL131-31GCATGGATCCGCGGCGCCACCGTGACGTACA)通過PCR擴增推算的半乳糖脂酶編碼區(qū)。用NheI和BamHI消化PCR產(chǎn)物并與用相同限制性內(nèi)切核酸酶消化的pET11a(Novagen，美國)載體連接。將連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XL-Blue1 MRF′，分離出具有與pET11(131-51)結(jié)構(gòu)對應(yīng)的限制性樣式的12個不同質(zhì)?？寺?圖4)。將每個質(zhì)粒克隆分別用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，并在含半乳糖脂酶活性指示層的LB-氨芐青霉素上培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化子(實施例4)。大多數(shù)克隆確實表達了有活性的半乳糖脂酶。選擇一個克隆(pET11(131-51)-12)作為后續(xù)表征的重組半乳糖脂酶來源。
分析了在大腸桿菌中表達的酶(標(biāo)記為#236)，并在使用本文中教導(dǎo)的GLU-7測定法和PLU-7測定法進行分析時，發(fā)現(xiàn)其具有0.33GLU/ml和0.36PLU/ml。
在液體培養(yǎng)中，大腸桿菌BL21(DE3)在LB-氨芐青霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)40小時后(37℃，200rpm搖動)表達約2mU/ml半乳糖脂酶活性?；旧显谂囵B(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了所有活性。在用pET11a(Novagen，美國)轉(zhuǎn)化并在相同條件下培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)中沒有檢測到半乳糖脂酶活性。
將約4升含半乳糖脂酶的培養(yǎng)液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至約300ml，并在15升含2mM CaCl2和2mM MgCl2的20mM Tris HCl緩沖液pH 7中進行透析。將透析后的材料在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上再次濃縮至約30ml并在2升50％甘油中進行透析。得到的制品(18ml)含有約100mU/ml半乳糖脂酶活性。
還在生面團中測試了在大腸桿菌中表達的酶(標(biāo)記為#236)。如顯示TLC板的圖10所示，在生面團中觀察到對半乳糖脂的高活性。
實施例6來自鏈霉菌屬菌種L131的根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶基因在不同宿主中的表達。
實施例5中概述了載體pGTK44(L131)的構(gòu)建。除了大腸桿菌，該載體可用于在芽胞桿菌中生成根據(jù)本發(fā)明的鏈霉菌屬L131脂肪分解酶。利用該載體僅僅是在芽胞桿菌中表達根據(jù)本發(fā)明的L131脂肪分解酶的許多可能途徑之一。例如，pGTK44(L131)中采用的pst啟動子可用在芽胞桿菌中有活性的任何其它強組成性或受調(diào)節(jié)啟動子替換。本領(lǐng)域知道許多這樣的啟動子。例如，degQ36啟動子(Yang M等，J.Bacteriol.166113-119，1986)、cdd啟動子，也稱為p43(Wang PZ、Doi RH，J.Biol.Chem.2598619-8625，1984)、淀粉酶或中性蛋白酶啟動子等。除了pGTK44(L131)和基于pTZ12復(fù)制子的其它芽胞桿菌載體(Aoki T.等，Mol.Gen.Genet.208348-352，1987)，可使用任何其它質(zhì)粒載體(如pUB110及其衍生物，Gryczan TJ等，J.Bacteriol.134318-29，1978)。
用于表達根據(jù)本發(fā)明的鏈霉菌屬L131脂肪分解酶基因的其它優(yōu)選宿主是高GC的革蘭氏陽性細菌，特別是鏈霉菌屬(例如淺青紫鏈霉菌(S.lividans)、天藍色鏈霉菌(S.coelicolor)、灰色鏈霉菌(S.griseus)、納塔爾鏈霉菌(S.natalensis)、銹赤鏈霉菌(S.rubiginosus)、橄欖鏈霉菌(S.olivaceus)、橄欖產(chǎn)色鏈霉菌(S.olivochromogenes)、紫紅鏈霉菌(S.violaceoruber))，在這些宿主中，可以在多拷貝載體(如利用pIJ110衍生物，諸如pIJ486，Ward等，Mol.Gen.Genet.203468-478，1986)上在其自身啟動子之下導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶基因，或者置于強鏈霉菌啟動子的控制之下，例如ermE*(Schmitt-John T、Engels JW，Appl.Microbiol.Biotechnol.36493-498，1992)或硫鏈絲菌素可誘導(dǎo)的tipA啟動子(Kieser T等，在《Practical StreptomycesGenetics》中，p.386，The John Innes Foundation，Norwich，英國，2000)。
除了原核宿主，可以在許多合適的真菌物種之一中表達L131脂肪分解酶基因。具體而言，諸如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德畢氏酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)等酵母是合適的。在酵母中，可以將脂肪分解酶基因置于任何已知強酵母啟動子的控制下，諸如糖酵解啟動子(PGK、GDH、ENO等)、磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)的啟動子諸如PHO5、乙醇/甲醇代謝的啟動子諸如釀酒酵母中的ADH1啟動子、或多形漢遜酵母或巴斯德畢氏酵母中的甲醇可誘導(dǎo)啟動子。
在任何宿主中表達脂肪分解酶時，構(gòu)建編碼序列SEQ ID No.4的合成或半合成基因?qū)⑹怯幸娴?。同樣，根?jù)可通過實施例4中所解釋的計算機同源性檢索得到的序列，可以設(shè)計部分或完全合成的基因。這種序列可引入野生型脂肪分解酶基因中缺乏的許多有用特征。例如，可修正密碼子偏好以更好地適應(yīng)表達宿主的密碼子偏好?？捎糜谒兴拗鞯拿艽a子偏好修正的一個特殊例子是將SEQ ID No 3的GTG起始密碼子轉(zhuǎn)變成ATG。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的另一項典型修正是將L131脂肪分解酶的天然鏈霉菌信號序列換成在所選表達宿主中天然的或已知有功能的信號序列。
前面用于L131脂肪分解酶的有用表達系統(tǒng)的例子集中于利用質(zhì)粒載體將脂肪分解酶基因?qū)氡磉_宿主。這確實是實現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)選模式?？墒牵瑢⒈磉_盒(包括啟動子、脂肪分解酶基因編碼區(qū)和任選的轉(zhuǎn)錄終止子)整合到染色體中的一種可選方法也是可行的。具體而言，將表達盒多拷貝的整合到宿主染色體中將是有效的。
可以有益地突變表達脂肪分解酶基因的重組宿主以降低培養(yǎng)基中的蛋白酶活性水平。任何此類重組宿主的培養(yǎng)可在存在穩(wěn)定酶的化合物時進行。此類化合物可以是各種蛋白質(zhì)(如酪蛋白、血清清蛋白的胨)或不同的脂質(zhì)、溶血脂質(zhì)或洗滌劑(如半乳糖脂、單和二酰甘油或Triton X-100)。
實施例7鏈霉菌屬L131脂肪分解酶及其衍生物的?；D(zhuǎn)移酶活性有些脂肪酶可能還具有?；D(zhuǎn)移酶活性。具體而言，GDSX家族的有些成員，例如嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)?；D(zhuǎn)移酶(P10480)(在共同未決的國際申請PCT/IB2004/000655中有教導(dǎo))，具有高?；D(zhuǎn)移酶活性。所以，預(yù)測鏈霉菌屬L131脂肪分解酶可能也具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性。通過隨機突變/定向進化可進一步增強該活性。另外，由于嗜水氣單胞菌?；D(zhuǎn)移酶和鏈霉菌屬L131脂肪分解酶共享相同的整體蛋白質(zhì)折疊，有可能將鏈霉菌屬L131脂肪分解酶的底物特異性與氣單胞菌屬酶的高轉(zhuǎn)移酶效率結(jié)合起來?？赏ㄟ^靶向誘變/蛋白質(zhì)設(shè)計或通過基因改組的已知技術(shù)來實現(xiàn)該結(jié)合。
實施例8來自其它鏈霉菌屬物種的可選脂肪分解酶的鑒定。
GDSX酯酶家族(Upton C、Buckley JT，Trends Biochem.Sic.20178-179，1995，pfam00657.11)是在活性位點絲氨酸周圍共享特定序列基序(GDSX，其中X是疏水氨基酸殘基)的一組酯酶/脂肪酶/酰基轉(zhuǎn)移酶。該組酶也稱為脂肪酶家族II(Arpigny JL、Jaeger K-E，Biochem.J.343177-183，1999)。盡管該家族包括許多不同類型的酯酶、脂肪酶和?；D(zhuǎn)移酶，但是根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是GDSX酶。
所以，本發(fā)明教導(dǎo)的鏈霉菌屬菌種L131脂肪分解酶(半乳糖脂酶)序列可用于在計算機上鑒定來自其它鏈霉菌屬物種的其它半乳糖脂酶。
為了確定蛋白質(zhì)是否具有根據(jù)本發(fā)明的GDSX基序，優(yōu)選將序列與pfam數(shù)據(jù)庫的隱蔽馬爾科夫(Markov)模型序型(profile)(HMM序型)進行比較。
pfam是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域家族的數(shù)據(jù)庫。pfam包含排列好的每個家族的多重序列對比，以及用于在新序列中鑒定這些結(jié)構(gòu)域的序型隱蔽馬爾科夫模型(序型HMM)。關(guān)于pfam的介紹見Bateman A等，2002，Nucleic Acids Res.30276-280。隱蔽馬爾科夫模型在致力于蛋白質(zhì)分類的許多數(shù)據(jù)庫中得到采用，綜述見Bateman A和Haft DH，2002，Brief Bioinform 3236-245。
http//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&list uids＝12230032&dopt＝Abstracthttp//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？cmd＝Retrieve&db＝PubMed&list uids＝11752314&dopt＝Abstract關(guān)于隱蔽馬爾科夫模型的詳細解釋和它們在pfam數(shù)據(jù)庫中是如何應(yīng)用的見Durbin R、Eddy S和Krogh A，1998，Biological sequence analysis；probabilistic models of proteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4。Hammer軟件包可以從華盛頓大學(xué)(St Louis，USA)獲得。
或者，可以使用Hammer軟件包來鑒定GDSX基序，指令見Durbin R、EddyS和Krogh A，1998，Biological sequence analysis；probabilistic models ofproteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4及其參考文獻，以及此說明書中提供的HMMER2序型。
可以通過例如目前位于下列網(wǎng)站的幾個服務(wù)器訪問PFAM數(shù)據(jù)庫。
http//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtmlhttp//pfam.wustl.edu/http//pfam.jouy.inra.fr/http//pfam.cgb.ki.se/數(shù)據(jù)庫提供了能夠輸入蛋白質(zhì)序列的搜索工具。使用數(shù)據(jù)庫的默認參數(shù)，就將對蛋白質(zhì)序列分析是否存在Pfam結(jié)構(gòu)域。GDSX結(jié)構(gòu)域是數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)確定的結(jié)構(gòu)域，因此它在任何檢索序列中的存在都將受到識別。數(shù)據(jù)庫將對檢索序列報告其與Pfam00657共有序列的對比。
優(yōu)選地，在與Pfam00657共有序列對比時，本發(fā)明組合物/方法所使用的脂肪分解酶具有GDSx模塊、GANDY模塊和HPT模塊中的至少一個、優(yōu)選超過一個、優(yōu)選超過兩個。適宜地，脂肪分解酶可以具有GDSx模塊和GANDY模塊?；蛘?，酶可以具有GDSx模塊和HPT模塊。優(yōu)選地，酶包含至少GDSx模塊。
pfam00657 GDSX結(jié)構(gòu)域是區(qū)分具有此結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與其它酶的獨特鑒別物。
另外/或者，通過與SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示一種或多種PCR序列片段進行序列同一性比較和/或雜交，可以從其它鏈霉菌屬物種鑒定可選脂肪分解酶。適宜地，可以與包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中超過15個核苷酸的片段，優(yōu)選與包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中超過20個核苷酸的片段進行比較。適宜地，可以使用SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的完整序列。優(yōu)選地，在高或很高嚴(yán)謹條件下進行雜交。與SEQ ID No.1或SEQ ID No.2具有至少80％、優(yōu)選至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的核苷酸序列指示可能是根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶，即半乳糖脂酶的來源的鏈霉菌屬菌株。
實施例9應(yīng)用于本申請方法和用途中的半乳糖脂酶的鑒定如上所述，新的Streptomyces thermosacchari L131序列提供了在計算機上鑒定新的家族II半乳糖脂酶的可能性。在這方面，特別感興趣的一個特別區(qū)域是GDSX基序。
GDSX基序由四個保守氨基酸構(gòu)成。優(yōu)選地，基序中的絲氨酸是脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶的催化性絲氨酸。適宜地，GDSX基序的絲氨酸可以位于與Brumlik和Buckley，Journal of Bacteriology，1996年4月，Vol.178，No.7，p 2060-2064中講授的嗜水氣單胞菌脂肪分解酶中Ser-16對應(yīng)的位置。
為了確定蛋白質(zhì)是否具有GDSX基序，優(yōu)選將序列與pfam數(shù)據(jù)庫的隱蔽馬爾科夫模型序型(HMM序型)進行比較。如實施例8中所述，pfam是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域家族的數(shù)據(jù)庫。所以，pfam數(shù)據(jù)庫還可用于鑒定來自鏈霉菌屬以外的屬的合適的酶。
或者，可以使用Hammer軟件包來鑒定GDSX基序，指令見Durbin R、EddyS和Krogh A，1998，Biological sequence analysis；probabilistic models ofproteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN 0-521-62041-4及其參考文獻，以及此說明書中提供的HMMER2序型。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶包含GDSX基序。
在與pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公開的L131序列(SEQ ID No 4)對比時，i)本發(fā)明的、或應(yīng)用于本發(fā)明方法中的半乳糖脂酶/脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選具有GDSx基序，更優(yōu)選GDSY基序。
和/或ii)本發(fā)明的、或應(yīng)用于本發(fā)明方法中的半乳糖脂酶/脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶，優(yōu)選具有GANDY模塊，更優(yōu)選GANDY模塊，其包含氨基酸GGNDx，更優(yōu)選GGNDA或GGNDL。
和/或iii)本發(fā)明的、或應(yīng)用于本發(fā)明方法中的酶，優(yōu)選具有HTP模塊。
并優(yōu)選iv)本發(fā)明的、或應(yīng)用于本發(fā)明方法中的半乳糖脂酶/脂質(zhì)酰基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)選具有GDSY基序和GANDY模塊和HTP模塊(保守的組氨酸)，所述GANDY模塊包含氨基酸GGNDx，優(yōu)選GGNDA或GGNDL。
在這點上，本發(fā)明人鑒定了與鏈霉菌屬L131同源但不含GDSX基序的序列即Novosphingobium aromaticivorans(NAL)Novosphingobium\aromaticivorans\GDSx 284 aaSEQ ID No.10ZP 000941651 mgqvklfarr capvllalag lapaatvare aplaegaryv algssfaagp gvgpnapgsp61 ercgrgtlny phllaealkl dlvdatcsga tthhvlgpwn evppqidsvn gdtrlvtlti121 ggndvsfvgn ifaaacekma spdprcgkwr eiteeewqad eermrsivrq iharaplarv181 vvvdyitvlp psgtcaamai spdrlaqsrs aakrlarita rvareegasl lkfshisrrh241 hpcsakpwsn glsapaddgi pvhpnrlgha eaaaalvklv klmk/SEQ ID No.111 tgccggaact caagcggcgt ctagccgaac tcatgcccga aagcgcgtgg cactatcccg61 aagaccaggt ctcggacgcc agcgagcgcc tgatggccgc cgaaatcacg cgcgaacagc121 tctaccgcca gctccacgac gagctgccct atgacagtac cgtacgtccc gagaagtacc181 tccatcgcaa ggacggttcg atcgagatcc accagcagat cgtgattgcc cgcgagacac241 agcgtccgat cgtgctgggc aagggtggcg cgaagatcaa ggcgatcgga gaggccgcac301 gcaaggaact ttcgcaattg ctcgacacca aggtgcacct gttcctgcat gtgaaggtcg361 acgagcgctg ggccgacgcc aaggaaatct acgaggaaat cggcctcgaa tgggtcaagt421 gaagctcttc gcgcgccgct gcgccccagt acttctcgcc cttgccgggc tggctccggc481 ggctacggtc gcgcgggaag caccgctggc cgaaggcgcg cgttacgttg cgctgggaag541 ctccttcgcc gcaggtccgg gcgtggggcc caacgcgccc ggatcgcccg aacgctgcgg601 ccggggcacg ctcaactacc cgcacctgct cgccgaggcg ctcaagctcg atctcgtcga661 tgcgacctgc agcggcgcga cgacccacca cgtgctgggc ccctggaacg aggttccccc721 tcagatcgac agcgtgaatg gcgacacccg cctcgtcacc ctgaccatcg gcggaaacga
781 tgtgtcgttc gtcggcaaca tcttcgccgc cgcttgcgag aagatggcgt cgcccgatcc841 gcgctgcggc aagtggcggg agatcaccga ggaagagtgg caggccgacg aggagcggat901 gcgctccatc gtacgccaga tccacgcccg cgcgcctctc gcccgggtgg tggtggtcga961 ttacatcacg gtcctgccgc catcaggcac ttgcgctgcc atggcgattt cgccggaccg1021 gctggcccag agccgcagcg ccgcgaaacg gcttgcccgg attaccgcac gggtcgcgcg1081 agaagagggt gcatcgctgc tcaagttctc gcatatctcg cgccggcacc atccatgctc1141 tgccaagccc tggagcaacg gcctttccgc cccggccgac gacggcatcc cggtccatcc1201 gaaccggctc ggacatgctg aagcggcagc ggcgctggtc aagcttgtga aattgatgaa1261 gtagctactg cactgatttc aaatagtatt gcctgtcagc tttccagccc ggattgttgc1321 agcgcaacag aaacttgtcc gtaatggatt gatggtttat gtcgctcgca aattgccgtc1381 gaagggaacg ggcgcgtcgc tcgttaacgt cctgggtgca gcagtgacgg agcgcgtgga1441 tgagtgatac tggcggtgtc atcggtgtac gcgccgccat tcccatgcct gtacgcgccg//該酶包含序列“GSSF”而不是GDSX。
測試后發(fā)現(xiàn)該酶不包含根據(jù)本發(fā)明的糖脂酶活性。
所以，在嘗試鑒定其它合適的半乳糖脂酶時，GDSx基序可能是重要的。
注意，已經(jīng)純化和生化鑒定并顯示出與鏈霉菌屬L131約56％序列同源性的來自龜裂鏈霉菌的酶(Abramic M.等，1999；Vujaklija D.等，2002)，已知水解中性脂質(zhì)，諸如三油精或脂肪的硝基苯基酯。來自龜裂鏈霉菌的酶還可水解根據(jù)本發(fā)明的半乳糖脂酶。相似地，可得到其基因組序列數(shù)據(jù)的其它兩個鏈霉菌屬物種-天藍色鏈霉菌A2(3)和除蟲鏈霉菌可能含有具有半乳糖脂酶活性的酶，例如NP_625998和NP_827753在GenBank中現(xiàn)在注釋為“推測的分泌型水解酶”。
通過相似方法可鑒定鏈霉菌屬L131半乳糖脂酶的許多其它有用同源物。利用Align X、VectorNTI的Clustal W成對對比算法使用缺省設(shè)置，通過與L131序列對比，可鑒定適用于本發(fā)明方法中的半乳糖脂酶/脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶。
或者，通過與pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)對比，可鑒定適用于本發(fā)明方法中的半乳糖脂酶。
圖15顯示了L131與來自除蟲鏈霉菌和褐色喜熱裂孢菌的同源物的序列對比。圖15圖示了保守的GDSx基序(在L131和除蟲鏈霉菌和褐色喜熱裂孢菌中的GDSY)、或為GGNDA或為GGNDL的GANDY盒、和HPT模塊(認為是保守的催化性組氨酸)。這三個保守模塊在圖15中突出顯示。
在與pfam Pfam00657共有序列(如WO04/064987中所述)和/或本文公開的L131序列(SEQ ID No 4)對比時，有可能鑒定出三個保守區(qū)，GDSx模塊、GANDY模塊和HTP模塊(進一步詳情可見WO04/064987)。
實施例10基因克隆和表達載體的構(gòu)建使用Corynebacterium efficiens DSM 44549、褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fiisca)DSM 43792和除蟲鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)DSM 46492來分離與S.thermosacchari L131的半乳糖脂酶基因同源的基因。
符合DSM編號的菌株保藏于德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏機構(gòu)(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)并可公開獲得。
使用大腸桿菌菌株XL-Blue MRF′、BL21(DE3)(Novagen)和S17-1(Simon R.等，1983)、枯草桿菌BD 170、淺青紫鏈霉菌菌株1326(John LinesCentre)、谷氨酸棒桿菌DSM 20300作為異源表達的宿主。還使用殺鮭氣單胞菌菌株DSM 12609作為表達宿主。
我們實驗室從自然環(huán)境中分離到了S.thermosacchari L131、弗氏檸檬酸菌(Citrobacter freundii)P3-42和超壓腸桿菌(Enterobacter nimipressuralis)P1-60并通過16S rRNA基因測序進行了分類學(xué)鑒定。
此項研究中使用以下培養(yǎng)基。使用LB(5g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨、10g/l NaCl，pH 7.0)、2xYT(10g/l NaCl、10g/l酵母提取物、16g/l胰蛋白胨)來培養(yǎng)大腸桿菌和其它革蘭氏陰性細菌。使用營養(yǎng)肉湯(3g/l牛肉提取物、5g/l蛋白胨，pH 7.0)來培養(yǎng)C.efficiens和N.aromaticivorans，使用YM肉湯(3g/l酵母提取物、3g/l麥芽提取物、5g/l蛋白胨、10g/l右旋糖，pH 7.0)來培養(yǎng)除蟲鏈霉菌，培養(yǎng)基65(4g/l葡萄糖、4g/l胰蛋白胨、10g/l麥芽提取物、2g/l CaCO3，pH 7.2)用于褐色喜熱裂孢菌。
DNA分離。
通過標(biāo)準(zhǔn)堿裂解流程結(jié)合Qiagen柱純化方法來分離質(zhì)粒。從鏈霉菌中制備性分離質(zhì)粒DNA是一個例外。在該情況中，使用CsCl梯度平衡離心作為最終的純化步驟。
用于將DNA導(dǎo)入微生物菌株的方法。
通過電穿孔使用1mm電擊杯和以下電穿孔參數(shù)設(shè)置來轉(zhuǎn)化大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌菌株1800V，25。200μl枯草桿菌BD170通過基于天然感受態(tài)(natural competence)的“巴黎”法來轉(zhuǎn)化(Harwood C.R.和Cutting S.M.，1990)。淺青紫鏈霉菌通過原生質(zhì)體法來轉(zhuǎn)化(Kieser T.等，2000)。利用Harayama等(1980)的濾器交配(filter mating)法通過與大腸桿菌的接合而將DNA導(dǎo)入殺鮭氣單胞菌。
殺鮭氣單胞菌的利福平抗性突變體的構(gòu)建。
將來自殺鮭氣單胞菌DSM 12609過夜培養(yǎng)物的約108個細胞置于含5-30mg/l利福平的一系列LB瓊脂板上。使用SpectroLinker XL-1500設(shè)備(Spectronics Corp.美國)用短波紫外線照射平板。照射劑量為4-6J/M2。將平板于30℃保溫2天。挑選在30mg/l利福平上生長的幾個克隆并在50mg/l利福平上進行額外的測試。選出了耐受50mg/l利福平的一個克隆(命名為R1)進行后續(xù)工作。
用于L131半乳糖脂酶同源物的大腸桿菌表達載體的構(gòu)建。
通過PCR，利用染色體DNA作為模板并利用兩種寡核苷酸引物oSAL-5(GGGAATTCCATATGAGACGTTCCCGAATTACG)和oSAL-3(GCATGGATCCGGTGACCTGTGCGACGG)，擴增除蟲鏈霉菌的脂肪酶基因。對于褐色喜熱裂孢菌和Corynebacterium efficiens脂肪酶基因的擴增，所用寡核苷酸引物分別是oTFL-5(GGGAATTCCATATGGGCAGCGGACCACGTG)和oTFL-3(GCATGGATCCGACACGCACGGCTCAACG)、oCEL-5(GGGAATTCCATATGAGGACAACGGTCATCG)和oCEL-3(GCATGGATCCGGCATCGGGCTCATCC)。用NdeI和BamHI消化PCR產(chǎn)物并與用相同限制性內(nèi)切核酸酶消化的pET11a(Novagen，美國)連接。
如下構(gòu)建用于淺青紫鏈霉菌的L131半乳糖脂酶表達載體。質(zhì)粒pUC18(L131RX)含有攜帶L131脂肪酶基因的原始克隆DNA片段(pBK(L131))的1.37kb EcoRI-XbaI片段，用EcoRI消化該質(zhì)粒并與用EcoRI消化的pIJ487(Kieser等，2000)連接。該連接導(dǎo)致形成了pIJ487和pUC18(L131RX)相對取向不同的兩種重組質(zhì)粒。為了后續(xù)工作，根據(jù)限制性分析選擇其中pUC18的lac啟動子位于pIJ487的無啟動子neoR基因側(cè)翼的變體。該構(gòu)建物命名為pRX487-5(圖11)。除了氨芐青霉素抗性，該質(zhì)粒還賦予大腸桿菌對至少3mg/l卡那霉素的抗性。用0.1-10μg pRX487-5轉(zhuǎn)化淺青紫鏈霉菌1326的原生質(zhì)體，使之帶有硫鏈絲菌素(1.2mg/l)和卡那霉素(5mg/l)抗性。根據(jù)DGDG-番紅指示板測定法的判斷，這些轉(zhuǎn)化子生成活性半乳糖脂酶。將轉(zhuǎn)化子置于添加有5mg/ml卡那霉素的SM板(Kieser等，2000)上，并使之形成孢子。將得到的孢子用于接種搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)物。
用于谷氨酸棒桿菌的表達載體的構(gòu)建。
用于此項工作的所有表達載體都是基于質(zhì)粒pCB5的，該質(zhì)粒是攜帶質(zhì)粒pSR1(Yoshihama等，1985)的谷氨酸棒桿菌復(fù)制子和大腸桿菌的ColE1復(fù)制子的穿梭載體。該載體中所使用的啟動子衍生自編碼谷氨酸棒桿菌主要分泌蛋白-PS1的cop1基因。酶由它們的天然基因來表達，包括未修飾的信號肽，如褐色喜熱裂孢菌(圖14)。
發(fā)酵條件產(chǎn)脂肪酶的鏈霉菌屬菌株的發(fā)酵。
在搖瓶中，在含有(每升)10g蛋白胨、5g酵母提取物、2g K2HPO4和10g葡萄糖(pH 7.0)并添加合適抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)脂肪酶的重組淺青紫鏈霉菌菌株使用濃度硫鏈絲菌素為1.2mg/l、卡那霉素為20mg/l、氯霉素為1.5mg/l而紅霉素為1.5mg/l。使用通過在SM板上培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子而產(chǎn)生的孢子懸浮液來起動培養(yǎng)。
對于補料-分批發(fā)酵，使用Braun Biostat E發(fā)酵罐(10升)。初始培養(yǎng)基(7升)含有(每升)蛋白胨20g、酵母提取物10g、葡萄糖20g和上述合適的抗生素(除了硫鏈絲菌素，其不用于10升培養(yǎng))。以30℃、恒定的10升/分鐘通氣量和600rpm攪拌速率進行培養(yǎng)。如前面段落中所述，在2升愛倫美氏(Erlenmeyer)燒瓶中培養(yǎng)接種體(每次發(fā)酵2×250ml)。發(fā)酵以分批模式進行18-20小時，然后將含30％葡萄糖和12.5％蛋白胨的溶液以0.5ml/分鐘的速率投入發(fā)酵罐培養(yǎng)物中。每天兩次無菌采集培養(yǎng)物樣品(30ml)。
重組谷氨酸棒桿菌菌株的發(fā)酵。
在含50mg/l卡那霉素的LB中以30℃和200rpm搖動速率培養(yǎng)谷氨酸棒桿菌的搖瓶培養(yǎng)物。
重組殺鮭氣單胞菌菌株的發(fā)酵。
在搖瓶中，在添加了鏈霉素和卡那霉素(為20mg/l)的2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組殺鮭氣單胞菌菌株。為了誘導(dǎo)tac啟動子，向生長培養(yǎng)基中加入IPTG(1-5mM)或乳糖(1-10％)。
以發(fā)酵罐規(guī)模測試用于在殺鮭氣單胞菌中生產(chǎn)重組?；D(zhuǎn)移酶的兩組條件。在第一個實驗中，初始培養(yǎng)基(7升)是添加有2％葡萄糖、50mg/l卡那霉素和50mg/l鏈霉素的2xYT，而補料溶液(3升)含有25％葡萄糖、10％胰蛋白胨和5％酵母提取物、100mg/l卡那霉素和鏈霉素。以10升/分鐘通氣量、600rpm攪拌速率和28℃進行培養(yǎng)。用25％NH3和10％磷酸將pH調(diào)至7.5。用0.5升殺鮭氣單胞菌過夜培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐，并以分批模式培養(yǎng)24小時。在該時間點，加入IPTG至5mM并以50ml/h的速率開始補料。
在第二個實驗中，修改初始培養(yǎng)基，即用乳糖代替葡萄糖。補料溶液為2升20％乳糖。發(fā)酵溫度提高至30℃，并將培養(yǎng)基的pH降至7.0。如第一個實驗進行接種，并在初始培養(yǎng)基中培養(yǎng)20小時后開始補料(100ml/h)。
酶測定法番紅板篩選方法。
在番紅板篩選中，底層含有培養(yǎng)基+添加劑，1.5％瓊脂糖和0.002％番紅(0.2％儲存水溶液，無菌過濾)，而頂層為0.7％瓊脂糖、1％DGDG和0.002％番紅。
半乳糖脂酶活性的測定(糖脂酶活性測定法(GLU-7))底物將0.6％二半乳糖苷甘油二酯(Sigma D 4651)、0.4％Triton-X 100(SigmaX-100)和5mM CaCl2溶于pH 7的0.05M HEPES緩沖液。
測定流程將400μL底物加到1.5mL Eppendorf管中并在Eppendorf熱混合器中于37℃放置5分鐘。在時間t＝0分鐘時，加入50μL酶溶液。用水代替酶來進行空白分析。將樣品在Eppendorf熱混合器中于37℃以10×100rpm混合10分鐘。在時間t＝10分鐘時，將Eppendorf管在另一個熱混合器中于99℃放置10分鐘，以終止反應(yīng)。
使用WAKO GmbH的NEFA C試劑盒來分析樣品中的游離脂肪酸。
根據(jù)在測定條件下每分鐘產(chǎn)生的脂肪酸微摩爾量，計算在pH 7的酶活性GLU。
磷脂酶活性的測定(磷脂酶活性測定法(PLU-7))底物將0.6％L-α磷脂酰膽堿，95％植物(Avanti#441601)、0.4％Triton-X 100(Sigma X-100)和5mM CaCl2散布于pH 7的0.05M HEPES緩沖液。
測定流程將400μL底物加到1.5mL Eppendorf管中并在Eppendorf熱混合器中于37℃放置5分鐘。在時間t＝0分鐘時，加入50μL酶溶液。用水代替酶來進行空白分析。將樣品在Eppendorf熱混合器中于37℃以10×100rpm混合10分鐘。在時間t＝10分鐘時，將Eppendorf管在另一個熱混合器中于99℃放置10分鐘，以終止反應(yīng)。
使用WAKO GmbH的NEFA C試劑盒來分析樣品中的游離脂肪酸。
根據(jù)在測定條件下每分鐘產(chǎn)生的脂肪酸微摩爾量，計算在pH 7的酶活性PLU-7。
使用棕櫚酸對硝基苯酯(pNPP)進行的分光光度測定法。
通過在30℃進行的分光光度測定法測量脂肪酶活性，其中以pNPP作為底物并使用含0.4％Triton X-100和0.1％阿拉伯樹膠的50mM Tris-馬來酸鹽緩沖液(pH 6.5)。在二噁烷中制備底物儲存液(100mM)。通過將酶加入反應(yīng)混合物中來開始動力學(xué)測量。為了評估初始水解活性，用Spectramax讀板儀每20秒測定410nm處吸收的增加達20分鐘。一個單位的脂肪酶活性定義為每分鐘釋放出1μmol對硝基酚的酶量。通過使用1mM每種底物，以相同方式測量了對其它p-NP酯的活性(Abramic M.等，1999)。
pH和溫度對脂肪酶活性的影響的測定。
為了測定pH對酶活性的影響，通過半乳糖脂酶活性測定法對pH 2-10的范圍進行了測量，只是實驗中所用的緩沖液如下pH 2-3.5的甘氨酸-HCl；pH 4-5的NaOAc；pH 5.5-7.5的Tris-馬來酸鹽；pH 7.5-9的Tris-HCl；pH 10的CAPS。
通過將酶的等分試樣在冰上保溫60分鐘后在各種溫度(22℃-90℃)保溫20分鐘，來測定溫度對半乳糖脂酶穩(wěn)定性的影響。通過半乳糖脂酶活性測定法來分析剩余活性。
為了檢測對半乳糖脂酶活性的最佳溫度，在所需溫度(范圍為20℃-70℃)平衡常用的測定混合物，并加入2或4μl酶開始反應(yīng)。通過半乳糖脂酶活性測定法來分析活性，但使用較短的時間(20分鐘)。
實施例11生物多樣性研究中的半乳糖脂酶候選物的表征。
Streptomyces thermosacchari L131半乳糖脂酶序列提供了在計算機上鑒定新的家族II半乳糖脂酶的可能性。
可鑒定出鏈霉菌屬L131半乳糖脂酶的許多其它有用同源物，例如來自褐色喜熱裂孢菌的“推測的蛋白質(zhì)”(ZP_00058717)和來自Corynebacteriumefficiens的“推測的蛋白質(zhì)”(NP_738716)。
我們克隆并表達了鏈霉菌屬L131半乳糖脂酶的3種同源物除蟲鏈霉菌(SAL)、褐色喜熱裂孢菌(TFL)、和Corynebacterium efficiens(CEL)的基因。利用pET表達系統(tǒng)在大腸桿菌中表達所有基因。首先利用含番紅的DGDG-指示板來分析重組大腸桿菌菌株，發(fā)現(xiàn)除蟲鏈霉菌、褐色喜熱裂孢菌和C.efficiens的酶具有半乳糖脂酶活性。
進一步檢驗顯示半乳糖脂酶活性的酶。研究了那些半乳糖脂酶候選物的底物特異性(圖13)。測試了候選酶針對DGDG、卵磷脂、橄欖油、丁酸硝基苯酯、癸酸硝基苯酯(NP-D)和棕櫚酸硝基苯酯的活性。發(fā)現(xiàn)酶具有非常不同的底物特異性圖譜。在使用NP-D作為底物的測定法中測試了?；D(zhuǎn)移酶活性，并用NEFA試劑盒量化釋放出的硝基酚和游離脂肪酸。初步數(shù)據(jù)提示，至少來自褐色喜熱裂孢菌的酶具有針對甘油和葡萄糖的轉(zhuǎn)移酶活性。
測試了半乳糖脂酶候選物的熱穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)Corynebacterium efficiens的酶是對熱最穩(wěn)定的，而除蟲鏈霉菌的酶是對熱最敏感的。
實施例12Streptomyces thermosacchari L131的脫膠試驗在粗制大豆油中測試來自Streptomyces thermosacchari L131的磷脂酶。
材料和方法K371將在淺青紫鏈霉菌中表達的Streptomyces thermosacchari L131酶在淀粉上冷凍干燥。
(活性108PLU-7/g)。
Lecitase Ultra(#3108)，來自Novozymes，丹麥膽固醇酯Fluka 26950植物甾醇Generol 122N，來自Henkel，德國粗制大豆油來自The Solae Company，Aarhus，丹麥卵磷脂L-α磷脂酰膽堿，95％植物(Avanti#441601)磷脂酶活性磷脂酶測定法與實施例10中所用的相同。
HPTLC進樣儀自動TLC取樣器4，CAMAGHPTLC板20×10cm，Merck no.1.05641。使用前在160℃活化30分鐘。
加樣利用自動TLC進樣儀將1μl含8％油的緩沖液溶液加進HPTLC板。
運行緩沖液475∶25∶4的氯仿∶甲醇∶水運行緩沖液570∶30∶1的P-醚(P-ether)∶甲基-叔丁基酮∶醋酸加樣/洗脫時間運行緩沖液420分鐘運行緩沖液510分鐘TLC顯影將平板在烤爐中于160℃干燥10分鐘，冷卻，并浸入含6％乙酸銅的16％H3PO4。于160℃另外干燥10分鐘，并直接進行評估。
脫膠實驗將Streptomyces thermosacchari L131(K371)以表4所示配方用于脫膠研究。
將樣品于40℃放置18小時并搖動，然后采集樣品進行HPTLC分析，將樣品溶于2∶1的氯仿∶甲醇。
表4.粗制大豆油用Streptomvces thermosacchari L131和Lecitase UltraTM脫膠
HPTLC分析結(jié)果如圖16和圖17所示。
圖16顯示了根據(jù)表4的粗制大豆油樣品的酶處理反應(yīng)產(chǎn)物的TLC板(緩沖液4)。作為參照，還分析了磷脂酰膽堿(PC)。也顯示了磷脂酰乙醇胺(PE)和溶血磷脂酰膽堿(LPC)。
圖16中的TLC結(jié)果清楚顯示了磷脂酰膽堿完全被加入油中的Streptomyces thermosacchari L131去除了。只有最低劑量(泳道2)未能完全水解磷脂。在有5％的水(泳道6)時，Lecitase UltraTM也水解油中的磷脂，但不添加額外的水(泳道5)則只有部分磷脂水解。
圖17顯示了根據(jù)表4的粗制大豆油樣品的酶處理反應(yīng)產(chǎn)物的TLC(緩沖液5)。膽固醇酯、甘油單酯、甘油二酯、甘油三酯和植物甾醇作為參照。也顯示了游離脂肪酸(FFA)。
圖17所示的結(jié)果顯示了磷脂的水解與游離脂肪酸的形成一致。
結(jié)論。
上述結(jié)果確證了，Streptomyces thermosacchari L131有效水解粗制大豆油中的磷脂，并是對植物油脫膠的合適的可選的酶。
將以上說明書中提及的所有文獻引入本文作為參考。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明范圍和精神的情況下，本發(fā)明所述的方法和系統(tǒng)的各種修改和變化將是顯而易見的。盡管本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合具體的優(yōu)選實施方案進行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，所要求的發(fā)明不應(yīng)過度局限于這些具體的實施方案。實際上，對于生化和生物技術(shù)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的用于實施本發(fā)明的所述模式的各種修改意圖包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
參考文獻Abramic M.，Lescic I.，Korica T.，Vitale L.，Saenger W.，Pigac J.Purification and properties ofextracellular lipase from Streptomyces rimosus.Enzyme and Microbial Technology 25，522-529(1999)Harayama S.，Masataka T.，Iino T.High-frequency mobilisation of the chromosome ofEscherichia coli by a mutant of plasmid RP4 temperature sensitive for maintenance.Mol.Gen.Genet.180，47-56(1980)。
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布達佩斯條約關(guān)于用于專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格
保藏證明由本頁底部所指明的國際保藏單位根據(jù)細則7.1對初始保藏物出具
1當(dāng)適用于細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。
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存活證明由下頁所指明的國際保藏單位根據(jù)細則10.2出具
1指的是初始保藏日，或者，當(dāng)進行了新的保藏或保藏的轉(zhuǎn)換時，指的是最相關(guān)的日期(新保藏的日期或是轉(zhuǎn)保藏的日期)。
2對于那些法規(guī)10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。
3用打叉表示選定。
4如果要求該信息并且如果檢驗為陰性，則填寫此項。
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權(quán)利要求
1.至少能水解半乳糖脂和/或能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶可從鏈霉菌屬菌種得到。
2.能水解極性脂質(zhì)和/或能將?；鶑臉O性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡并而與SEQ ID No.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的脂肪分解酶，其包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
4.可從分別以編號NCIMB 41226和NCIMB 41227保藏的鏈霉菌屬菌株L130或L131得到的脂肪分解酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4之任何一項或多項的脂肪分解酶，其中該酶至少能水解半乳糖脂和/或能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的脂肪分解酶，其中該酶能水解另一種極性脂質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的脂肪分解酶，其中所述極性脂質(zhì)是磷脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的脂肪分解酶，其中該脂肪分解酶能將?；鶑臉O性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至一種或多種以下酰基受體底物甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)或其亞基、或甘油。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求之任何一項的脂肪分解酶，其中該酶是野生型酶。
10.編碼脂肪分解酶的核酸，該脂肪分解酶包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列。
11.編碼脂肪分解酶的核酸，該核酸選自下組a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡并而與SEQ ID No.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-9之任何一項的脂肪分解酶在制備溶血糖脂，例如二半乳糖苷甘油單酯(DGMG)或單半乳糖苷甘油單酯(MGMG)的方法中的應(yīng)用，其用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理糖脂(如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或單半乳糖苷甘油二酯(MGDG))來產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血糖脂。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-9之任何一項的脂肪分解酶在制備溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的方法中的應(yīng)用，其用根據(jù)本發(fā)明的酶處理磷脂(如卵磷脂)來產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血磷脂。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-9之任何一項的脂肪分解酶在植物或食用油的酶促脫膠方法中的應(yīng)用，其包括用所述脂肪分解酶處理所述食用或植物油，從而水解極性脂質(zhì)的主要部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-9之任何一項的脂肪分解酶在包括處理磷脂從而水解脂肪?；姆椒ㄖ械膽?yīng)用。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-9之任何一項的脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價值產(chǎn)品的方法中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的應(yīng)用，其中所述高價值產(chǎn)品是以下一種或多種碳水化合物酯、蛋白質(zhì)酯、蛋白質(zhì)亞基酯和羥酸酯。
18.制備食品的方法，該方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1-9之任何一項的脂肪分解酶與食品的一種或多種成分混合。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述食品選自以下一種或多種蛋，基于蛋的產(chǎn)品，包括但不限于蛋黃醬，色拉調(diào)味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黃及其制成品；焙烤品，包括面包，蛋糕，甜面產(chǎn)品，薄餅，液態(tài)奶蛋糊，松餅，油炸圈餅，餅干，薄脆餅干和曲奇餅；糖果，包括巧克力，糖果，飴糖，halawa，口香糖，包括無糖和加糖口香糖，泡泡糖，軟泡泡糖，口香糖和布?。焕鋬霎a(chǎn)品，包括冰糕，優(yōu)選冷凍乳制品，包括冰激凌和牛奶凍；乳制品，包括奶酪，黃油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳飲料和酸牛奶；慕思，生植物奶油，肉制品，包括經(jīng)加工的肉制品；食用油和脂肪，攪打起泡和不起泡的產(chǎn)品，水包油乳狀液，油包水乳狀液，人造黃油，起酥油和涂抹物，包括低脂肪的和極低脂肪的涂抹物；調(diào)味品，蛋黃醬，蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的湯，飲料，香料乳狀液和沙司。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述食品是乳制品。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述食品是蛋或基于蛋的產(chǎn)品。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述食品是乳制品。
23.制備溶血糖脂的方法，其包括用至少一種脂肪分解酶處理含糖脂的底物來產(chǎn)生所述溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
24.制備溶血磷脂的方法，其包括用至少一種脂肪分解酶處理含磷脂的底物來產(chǎn)生所述溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
25.植物或食用油的酶促脫膠方法，其包括用可從以下屬之一得到的能水解極性脂質(zhì)主要部分的脂肪分解酶處理所述食用或植物油鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
26.生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價值產(chǎn)品的方法，其包括用可從以下屬之一得到的脂肪分解酶處理所述極性脂質(zhì)來產(chǎn)生所述高價值產(chǎn)品鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述高價值產(chǎn)品是以下一種或多種碳水化合物酯、蛋白質(zhì)酯、蛋白質(zhì)亞基酯和羥酸酯。
28.制備食品的方法，其包括將至少一種脂肪分解酶與食品的一種或多種成分混合，其中所述脂肪分解酶能將存在的糖脂和/或磷脂水解進或成至少一種所述成分，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
29.根據(jù)權(quán)利要求23-28之任何一項的方法，其中所述脂肪分解酶能將?；鶑奶侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物。
30.根據(jù)權(quán)利要求23-28之任何一項的方法，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％同一性的氨基酸序列，或包含SEQ ID No.6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％同一性的核苷酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.5、7、或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.8所示的氨基酸序列或與其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.12或14所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述食品選自以下一種或多種蛋，基于蛋的產(chǎn)品，包括但不限于蛋黃醬，色拉調(diào)味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黃及其制成品；焙烤品，包括面包，蛋糕，甜面產(chǎn)品，薄餅，液態(tài)奶蛋糊，松餅，油炸圈餅，餅干，薄脆餅干和曲奇餅；糖果，包括巧克力，糖果，飴糖，halawa，口香糖，包括無糖和加糖口香糖，泡泡糖，軟泡泡糖，口香糖和布??；冷凍產(chǎn)品，包括冰糕，優(yōu)選冷凍乳制品，包括冰激凌和牛奶凍；乳制品，包括奶酪，黃油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳飲料和酸牛奶；慕思，生植物奶油，肉制品，包括經(jīng)加工的肉制品；食用油和脂肪，攪打起泡和不起泡的產(chǎn)品，水包油乳狀液，油包水乳狀液，人造黃油，起酥油和涂抹食品，包括低脂肪的和極低脂肪的涂抹物；調(diào)味品，蛋黃醬，蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的湯，飲料，香料乳狀液和沙司。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述食品是焙烤品，且至少一種所述成分是生面團。
36.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述食品是蛋或基于蛋的產(chǎn)品。
37.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述食品是乳制品。
38.脂肪分解酶在用于制備溶血糖脂的底物中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
39.脂肪分解酶在用于制備溶血磷脂的底物中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
40.可從以下屬之一得到的脂肪分解酶用于植物或食用油的酶促脫膠從而水解極性脂質(zhì)主要部分的應(yīng)用鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
41.可從以下屬之一得到的脂肪分解酶在包括處理磷脂從而水解脂肪?；姆椒ㄖ械膽?yīng)用鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
42.脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價值產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的應(yīng)用，其中所述高價值產(chǎn)品是以下一種或多種碳水化合物酯、蛋白質(zhì)酯、蛋白質(zhì)亞基酯和羥酸酯。
44.可從以下屬之一得到的脂肪分解酶在制備食品中的應(yīng)用鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂和/或磷脂。
45.根據(jù)權(quán)利要求38至44的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能將?；鶑奶侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物。
46.根據(jù)權(quán)利要求38至44之任何一項的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％同一性的氨基酸序列之任一，或包含SEQ ID No.6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％同一性的核苷酸序列。
47.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.5、7、或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％同一性的氨基酸序列之任一。
48.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.8所示的氨基酸序列或與其具有至少70％同一性的氨基酸序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.12或14所示的氨基酸序列或與其具有至少80％同一性的氨基酸序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求38之任何一項的應(yīng)用，其中所述溶血糖脂是DGMG或MGMG。
51.根據(jù)權(quán)利要求44的應(yīng)用，其中所述食品是乳制品。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的應(yīng)用，其中所述食品是蛋或基于蛋的產(chǎn)品，且其中所述脂肪分解酶能將?；D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物以降低一種或多種以下有害效應(yīng)臭味和/或異味和/或油膩口味。
53.根據(jù)權(quán)利要求51的應(yīng)用，其中所述食品是焙烤品。
54.根據(jù)權(quán)利要求38的應(yīng)用，其中所述底物是食用油。
55.參照附帶的說明書和附圖，上文描述的脂肪分解酶。
56.參照附帶的說明書和附圖，上文描述的方法。
57.參照附帶的說明書和附圖，上文描述的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明還涵蓋可從以下屬之一得到的脂肪分解酶在各種方法和用途中的應(yīng)用鏈霉菌屬(Streptomyces)、棒桿菌屬(Corynebacterium)和喜熱裂孢菌屬(Thermobifida)，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂或磷脂或者將酰基從糖脂或磷脂轉(zhuǎn)移至?；荏w。優(yōu)選地，應(yīng)用于這些方法和用途中的脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70％同一性的氨基酸序列之任一，或包含SEQ ID No.3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70％同一性的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及至少能水解半乳糖脂或能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中所述酶可從鏈霉菌屬菌種得到并包括包含SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或與其具有至少60％同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。所述酶可由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No.3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡并而與SEQ ID No.3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少70％同一性的核苷酸序列的核酸。
文檔編號A23C9/13GK101052702SQ200580024003
公開日2007年10月10日 申請日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者安德雷·米亞斯尼科夫, 喬恩·B·索, 喬恩·D·米凱爾森, 米拉·波夫萊南, 弗夫·皮特卡南 申請人:丹尼斯科公司