專利名稱：脂解酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及真菌脂解酶變體，尤其是具有改進(jìn)熱穩(wěn)定性的變體，以及制備和使用該變體的方法。
背景技術(shù)：
已知應(yīng)用真菌脂解酶例如源于Thermomyces lanuginosus(同義詞Humicola lanuginosa)的脂解酶，可以用于各種工業(yè)目的，例如改進(jìn)洗滌劑的效果和在紙漿和紙制造中消除樹脂(pitch)問題。在某些情況下，具有改進(jìn)熱穩(wěn)定性的脂解酶是人們所需要的(EP 374700，WO 9213130)。
WO 92/05249，WO 92/19726和WO 97/07202公開了T.lanuginosus(H.1anuginosa)脂酶的變體。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)真菌脂解酶的熱穩(wěn)定性可通過氨基酸序列中的某些特定取代而得以改進(jìn)。
因此，本發(fā)明提供一種親代真菌脂解酶變體，該變體包括一個或多個特定氨基酸殘基的取代并且其比親代脂解酶的熱穩(wěn)定性高。本發(fā)明還提供一種制備脂解酶變體的方法包括a)篩選親代真菌脂解酶，b)在親代脂解酶中取代至少一個特定的氨基酸殘基，c)可選地，取代一個或多個不同于b)中的氨基酸，d)制備由步驟a)-c)而得的變體，e)檢測該變體的熱穩(wěn)定性，f)篩選具有熱穩(wěn)定性升高的變體，和g)制備所篩選的變體。
特定的氨基酸殘基包括相應(yīng)于SEQ ID NO1中21，27，29，32，34-42，51，54，76，84，90-97，101，105，111，118，125，131，135，137，162，187，189，206-212，216，224-234，242-252和256的任何氨基酸殘基。
熱穩(wěn)定性可具體升高4以上?？梢杂貌煌陌被釟埢绕涫且粋€不同于Pro的氨基酸殘基進(jìn)行取代。
具體實施例方式
親代脂解酶根據(jù)酶命名法(可從http//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme得到)本發(fā)明所用的脂解酶分類為EC 3.1.1羧酸酯水解酶。底物的特異性可以包括諸如EC 3.1.1.3三酰甘油脂酶，EC 3.1.1.4磷脂酶A2，EC 3.1.1.5溶血磷脂酶，EC 3.1.1.26半乳糖脂酶(galactolipase)，EC 3.1.1.32磷脂酶A1，EC3.1.1.73阿魏酸酯酶的活性。
親代脂解酶是真菌的并且具有可與SEQ ID NO1進(jìn)行序列對比的氨基酸序列，SEQ ID NO1是顯示于US 5,869,438中的SEQ ID NO2的1-269位氨基酸序列，該序列是源于Thermomyces lanuginosus(同義詞Humicolalanuginosa)的脂酶的序列，這種脂酶在EP 258 068和EP 305 216中有描述。親代脂酶可特別與SEQ ID NO1具有至少50％的氨基酸序列同源性。除了T.lanuginosus的脂酶外，其它的實例是沙門氏柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)(P25234)的脂酶，尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)的脂酶/磷脂酶(EP 130064，WO 98/26057)，異孢鐮孢(F.heterosporum)的脂酶(R87979)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)的溶血磷脂酶(W33009)，米曲霉(A.oryzae)的磷脂酶A1(JP-A 10-155493)，米曲霉脂酶(D85895)，黑曲霉(A.niger)的脂酶/阿魏酸酯酶(Y09330)，塔賓曲霉(A.tubingensis)脂酶/阿魏酸酯酶(Y09331)，塔賓曲霉脂酶(WO 98/45453)，黑曲霉溶血磷脂酶(WO 98/31790)，具有等電點為6.9和表觀分子量為30kDa茄病鐮孢(F.solanii)的脂酶(WO 96/18729)。
其它的實例是接合菌(Zygomycetes)的脂酶家族，包括具有與SEQ IDNO2中所示序列的米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)(P19515)的脂酶有至少50％同源性的脂酶。該家族還包括反射犁頭霉(Absidia reflexa)，A.sporophora，傘枝犁頭霉(A.corymbifera)，A.blakesleeana，A.griseola(在WO 96/13578和WO 97/27276中描述)和米根霉(Rhizopus oryzae)(P21811)的脂酶。括號中的數(shù)字表示公開或登錄入EMBL，GenBank，GeneSeqp或Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫。
氨基酸取代本發(fā)明的脂解酶變體包括在上述任何區(qū)的氨基酸殘基的一個或多個取代。取代可以是例如在相應(yīng)于SEQ ID NO1的206-208，224-228，227-228，227-231，242-243和245-252的任何區(qū)中進(jìn)行。要取代的氨基酸殘基可相應(yīng)于SEQ ID NO1的Y21，D27，P29，T32，A40，F(xiàn)51，S54，I76，R84，I90，G91，N94，N101，S105，D111，R118，R125，A131，H135，D137，N162，V187，T189，E210，G212，S216，G225，L227，I238或P256殘基。一些特定的有目的取代是那些相應(yīng)于SEQ ID NO1的D27N/R/S，P29S，T32S，F(xiàn)51I/L，I76V，R84C，I90L/V，G91A/N/S/T/W，L93F，N94K/R/S，F(xiàn)95I，D96G/N，N101D，D111A/G，R118M，A131V，H135Y，D137N，N162R，V187I，F(xiàn)211Y，S216P，S224I/Y，G225P，T226N，L227F/P/G/V，L227X，V228C/I，238V和P256T。
在上述區(qū)域的取代的總數(shù)通常是不高于10個，例如1，2，3，4，5，6，7或8個所述的取代。此外，本發(fā)明脂解酶變體可以任選地包括親代酶的其它修飾，通常是不超過10個，例如不超過5個所述的修飾。與親代脂解酶相比，變體可以特定地具有總數(shù)不超過10個的氨基酸修飾(尤其是取代)。變體一般與親代脂解酶具有至少80％的同源性，例如至少85％，典型的至少90％或至少95％。
脂解酶變體變體具有脂解酶活性，即其能夠水解羧酸酯鍵以釋放羧酸基(EC 3.1.1)。它可以特定地具有脂酶活性(三酰甘油脂酶活性，EC 3.1.1.3)，即在三酰甘油中水解羧酸酯鍵的活性，例如1，3-特異性活性。
特異性變體下面是一些T.lanuginosus脂酶的變體的實例。相應(yīng)的取代可通過在其它真菌脂解酶中相應(yīng)的氨基酸取代進(jìn)行


熱穩(wěn)定性本申請使用合適的緩沖液在相關(guān)的PH下測定熱穩(wěn)定性。緩沖液和PH的實例是pH10.0(50mM氨基乙酸緩沖液)，pH7.0(50mM HEPES緩沖液)或pH5.0(50mM乙酸鈉為緩沖液)。
為了比較，測定應(yīng)該在相同的緩沖液，相同的條件和相同的蛋白質(zhì)濃度下進(jìn)行。各種方法都可用于測定熱穩(wěn)定性差示掃描量熱法(Differential Scanning Calorimetry(DSC))在DSC中，加熱速度可以是每小時90度?？蓪悠芳兓镣|(zhì)(homogeneity)，熔解溫度(TM)可用來表示熱穩(wěn)定性。
殘留的酶活性可選地，熱穩(wěn)定性可通過在選定的溫度下溫育后測定殘留的脂解酶活性而得以測定。如Giver等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)12809-12813和Moore等.Nat.Biotech.14(1996)458-467所述，10mMTris-HCI中對硝基苯酯，pH 7.5可用作底物?？梢詫悠范ㄆ诘丶尤?，或只使用一種樣品，加有或沒有不同的添加劑以防止或促進(jìn)變性，例如在96孔中。
CD分光術(shù)例如如Yamaguchi等Protein engineering 9(1996)789-795中所述的CD分光術(shù)。通常酶濃度約為1mg/ml，溫度在5-80度之間。
變體的用途脂解酶變體可應(yīng)用于各種方法中，下面描述一些具體用途。變體通常在60-95℃(尤其是75-90℃，70-90℃或70-85℃)以及pH4.5-11(特別是4.5-8或5-6.5)下使用。
在紙和紙漿工業(yè)中的應(yīng)用脂酶可用在制備機械紙漿或使用機械紙漿造紙的方法中避免樹脂問題，其包括向紙漿中添加脂酶并溫育。脂酶可以添加在所謂的回水(whitewater)(再循環(huán)工藝用水)中。它還可以用于從用過的紙上除去墨跡。通常優(yōu)選的是在工業(yè)中，改進(jìn)的熱穩(wěn)定性能夠允許變體高溫下使用。這可以類似于WO 9213130，WO 9207138，JP 2160984A，EP 374700進(jìn)行。
在基于谷類的食品中的應(yīng)用脂解酶變體可以添加到生面團(tuán)中，這種生面團(tuán)可用于制備焙烤產(chǎn)品(特別是面包)，意大利面制品或面條。變體的改進(jìn)的熱穩(wěn)定性允許其在加熱步驟(烘焙，煮沸或油炸)期間較長時間地保持活性。這與WO 94/04035，WO 00/32758，PCT/DK 01/00472，EP 1057415類似。
添加變體可導(dǎo)致改進(jìn)生面團(tuán)的穩(wěn)定性，即焙烤產(chǎn)品的較大塊體積和/或焙烤期間尤其是加壓系統(tǒng)(stressed system)中，例如在過分醒發(fā)成形(over-proofing)或過分揉混(over-mixing)情況中更好地保持形狀。它還導(dǎo)致焙烤產(chǎn)品較低的初始硬度和/或更均一細(xì)微的碎屑(crumb)，改進(jìn)的碎屑結(jié)構(gòu)(較細(xì)的碎屑，較薄的孔壁(cell wall)，更圓的孔)，并且進(jìn)一步改進(jìn)生面團(tuán)的特性例如降低生面團(tuán)的柔軟性，提高彈性，降低伸展性(extensibility)。
在脂肪和油工業(yè)中的用途脂解酶變體在有機合成例如在酯的水解，合成或酯交換的方法中可用作催化劑，包括在脂解酶變體存在下酯與水的反應(yīng)，酸與乙醇的反應(yīng)或酯與酸，醇或第二種酯的酯交換。優(yōu)選地，改進(jìn)的熱穩(wěn)定性允許所述反應(yīng)在相對高的溫度下進(jìn)行，相對高的溫度有利于提高反應(yīng)的速度和處理高熔點的底物。
上述酯可以是羧酸酯，例如甘油三酸酯。酯交換可以在存在或不存在溶劑的情況下進(jìn)行。酶可以以固定化形式使用。該方法可以與WO8802775，US 6156548，US 5776741，EP 792106，EP 93602或EP 307154類似進(jìn)行。
在紡織工業(yè)中的用途變體可以用于從織物中酶去除疏水性酯的方法中，該方法包括用有效量的脂解酶處理織物以從織物中去除疏水性酯。處理可以在75℃或高于75℃的溫度下進(jìn)行例如1-24小時。處理之前先用脂酶變體的水溶液浸透織物至吸液比(1iquor pick-up ratio)為50-200％，并后接洗滌和漂清以除去脂肪酸。
該方法與US 5578489或US 6077316中的類似。
在洗滌劑中的用途變體可用做洗滌劑添加劑，例如濃度為(表示為純酶蛋白)0.001-10(例如0.0l-1)mg/g洗滌劑或0.001-100(例如0.01-10)mg/升洗液。這可與WO 97/04079，WO 97/07202，WO 97/41212，WO 98/08939和WO 97/43375類似進(jìn)行。
皮革中的用途類似于GB 2233665或EP 505920，本發(fā)明的變體還可用于皮革工業(yè)中。
氨基酸取代的命名本文用于定義氨基酸取代的命名法使用的是如WO 92/05249中所述的單字母代碼。
因此，D27N表示的是在位置27用N取代D。D27N/R表示用N或R取代D27。L227X表示用任一氨基酸取代L227。D27N+D111A表示兩種取代的組合。
同源性和序列對比為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，同源性的程度可以通過本領(lǐng)域已知的計算機程序測定，例如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)中提供的GAP，使用GAP和下列設(shè)置用于多肽序列的比較GAP生成罰分(creation penalty)3.0和GAP延伸罰分(extension penalty)0.1。
在本發(fā)明中，米赫根毛霉(rhimi)，德列馬根霉(rhidl)，Thermomyceslanuginosa(former；Humicola lanuginosa)(SP400)，沙門氏柏干酪青霉(Pcl)和尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)(FoLnp11)脂酶序列中相應(yīng)的(或同源)位置通過與WO 00/32758的

圖1所示序列對比確定。
為了找到在序列對比中未顯示的脂酶序列的同源性位置，將目的序列與圖1中所示的序列進(jìn)行對比。將新序列通過使用GAP序列對比與由GAP程序發(fā)現(xiàn)的最高同源性序列于圖1中排列進(jìn)行對比。GCG程序包中提供GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)。使用下列設(shè)置進(jìn)行多肽序列的比較GAP生成罰分3.0和GAP延伸罰分0.1。
獲得熱穩(wěn)定變體的方法脂解酶的變體可以通過本領(lǐng)域已知的方法獲得，例如描述于WO9522615或WO 0032758中的例如定點突變，隨機突變或定位突變。
給定的親代脂解酶的熱穩(wěn)定變體可以通過下面標(biāo)準(zhǔn)的方法獲得突變(易錯，摻雜的寡核苷酸(doped oligo)，spiked oligo)初次篩選更高溫度穩(wěn)定突變體的鑒定維持(甘油培養(yǎng)，LB-Amp板，小量制備)在另一試驗板上劃線-第二次篩選(比初次篩選高1度)DNA測序在曲霉屬菌株中轉(zhuǎn)化100ml規(guī)模的培養(yǎng)，純化，DSC初次篩選實驗下面的鑒定方法用于篩選脂解酶變體并鑒定具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的變體。
例如通過易錯PCR，隨機誘變或定域隨機誘變或通過有利的突變體和飽和誘變組合制備攜帶有脂解酶變體基因的大腸桿菌細(xì)胞。
在LB瓊脂平板上使用濾膜實施鑒定。大腸桿菌細(xì)胞在由LB瓊脂平板提供營養(yǎng)成分的醋酸纖維素濾膜上并且在添加氨芐西林的LB瓊脂平板選擇壓下生長。包括所需酶的蛋白質(zhì)在位于LB瓊脂和醋酸纖維素濾膜之間的硝酸纖維素濾膜上收集。硝酸纖維素濾膜在所需pH(通常6.0)的緩沖液和所需溫度下溫育15分鐘(例如對于T.lanuginosus脂酶為78度)。在冰水中猝滅濾膜后，殘留的脂酶活性如Kynclova，E等(Joumal of MolecularRecognition 8(1995)139-145)所述，通過裂解吲哚乙酸鹽并且隨后用氮藍(lán)四唑氯化物染色反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測定。
調(diào)節(jié)所使用的熱處理使親代具有輕微活性，即與室溫溫育樣品相比，約5-10％的活性。這有利于鑒定有用的突變體。
實施例實施例l脂酶的表達(dá)質(zhì)粒pMT2188米曲霉表達(dá)質(zhì)粒pCaHj 483(WO 98/00529)由基于黑曲霉中性淀粉酶II啟動子與構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶非翻譯前導(dǎo)序列(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶終止子(amyloglycosidase terminater(Tamg))融合的表達(dá)盒構(gòu)成。質(zhì)粒中還有來自構(gòu)巢曲霉的曲霉選擇性標(biāo)記amdS，其能在以乙酰胺為唯一氮源時生長。將這些元件克隆入大腸桿菌載體pUC19(New EnglandBiolabs)。能在大腸桿菌中進(jìn)行篩選的該質(zhì)粒的氨芐西林抗性標(biāo)記被釀酒糖酵母的URA3標(biāo)記置換，這可彌補大腸桿菌中pyrF突變，置換以下面的方式進(jìn)行pUC19復(fù)制起點是以引物142779(SEQ ID NO3)和142780(SEQ IDNO4)進(jìn)行自pCaHj483的PCR擴增。
引物142780在PCR片段中引入Bbul位點。按照制造商對此和隨后PCR的擴增的說明使用Expand PCR系統(tǒng)(Roche Molecular Biochemicals，Basel，Switserland)擴增。
URA3基因自通常的釀酒糖酵母克隆載體pYES2(Invitrogencorporaion，Carlsbad，Ca，USA)使用引物140288(SEQ ID 5)和142778(SEQID 6)擴增。
引物140288在PCR片段中引入EcoRl位點。兩種PCR片段通過將其混合并且使用引物142780和140288擴增通過重疊的方法(overlap method)在剪接中融合(Horton et al(1989)Gene，77，61-68)。
所得的片段用EcoRl和Bbul消化并且與用相同酶消化的pCaHj 483的最大片段連接。連接混合物用于轉(zhuǎn)化通過Mandel和Higa方法(Mandel，M.and A.Higa(1970)J.Mol.Biol.45，154)制備的感受態(tài)pyrF大腸桿菌菌株DB6507(ATCC 35673)。轉(zhuǎn)化體在添加有1g/l酪蛋白氨基酸，500μg/l硫胺素和10mg/l卡那霉素的固體M9培養(yǎng)基上篩選(Sambrook et.al(1989)Molecular cloning，a laboratory manual，2.edition，Cold Spring HarborLaboratory Press)。
來自所選轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒稱為pCaHj 527。將存在于pCaHj527的Pna2/tpi啟動子通過單PCR方法進(jìn)行定點突變。
使用突變引物141223(SEQ ID NO9)將核苷酸134-144從SEQ IDNO7改變?yōu)镾EQ ID NO8。
使用突變引物141222(SEQ ID 12)將核苷酸423-436從SEQ ID NO10改變?yōu)镾EQ ID NO11。
所得的質(zhì)粒稱為pMT2188。
質(zhì)粒pENI1849為了截短pyrG基因成pyrG表達(dá)的必需序列以減少質(zhì)粒的大小，由此而改進(jìn)轉(zhuǎn)化頻率而制備質(zhì)粒pENI1849。使用pENI1299(在WO 00/24883中描述)為模板以及引物270999J8(SEQ ID 13)和270999J9(SEQ ID 14)制備PCR片段(約1800bp)。
使用限制酶StuI和SphI切割該PCR-片段，并克隆入也用StuI和SphI切割的pEN11298中(在WO 0024883中描述)；克隆通過測序證實。
質(zhì)粒pENI1861制備質(zhì)粒pEN11861使在表達(dá)質(zhì)粒中具有曲霉啟動子表達(dá)質(zhì)粒狀態(tài)，以及大量的用于克隆的限制位點。
使用pMT2188(見上)作為模板以及引物051199J1(SEQ ID 15)和1298TAKA(SEQ ID 16)制備PCR片段(約620 bp)。
用BssHII和BglII切割片段，并克隆入也用BssHII和BglII切割的pENI1849中?？寺⊥ㄟ^測序證實。
質(zhì)粒pENI1902制備質(zhì)粒pENI1902以使其具有能在大腸桿菌和曲霉中作用的啟動子。這通過使用由Stratagene推薦的“Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒”通過獨特的位點去除實現(xiàn)。
質(zhì)粒pENI1861用作模板以及具有5’磷酸化的下面的引物用作篩選引物177996(SEQ ID 17)，135640(SEQ ID 18)和135638(SEQ ID 19)。
具有5’磷酸化的080399J19引物(SEQ ID NO20)用作突變引物以在曲霉菌屬表達(dá)啟動子中引入-35和-10啟動子共有序列(自大腸桿菌)。通過測序證實突變的引入。
質(zhì)粒pSMin001
制備質(zhì)粒pSMin001以允許T.lanuginosus脂酶在大腸桿菌和曲霉中表達(dá)。
使用質(zhì)粒pAHL(在WO 9205249中描述)為模板利用下面的引物進(jìn)行PCR以擴增T.lanuginosus脂酶基因19671(SEQ ID NO21)和991213J5(SEQ ID NO22)。引物991213J5將SacII位點引入PCR片段中。利用BamHI和SacII切割PCR片段(約1100 bp)并克隆入用相同酶切割的pEni1902中。通過DNA測序證實克隆。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α，脂酶的表達(dá)通過使用所述的濾膜法檢測。
使用新開發(fā)的質(zhì)粒有可能在沒有任何修飾的曲霉屬菌株中表達(dá)所需的酶。在大腸桿菌中獲得的表達(dá)率相當(dāng)?shù)?，但足以夠篩選試驗。
實施例2制備熱穩(wěn)定的脂酶變體應(yīng)用幾項技術(shù)在T.lanuginosus脂酶基因中產(chǎn)生多樣性(diversity)易錯PCR，摻雜寡核苷酸輔助的定域隨機誘變，和定點誘變。
顯示更高溫度穩(wěn)定性的變體通過上面所述的初次篩選進(jìn)行篩選，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并如上第二次篩選試驗所述在試驗板上再次劃線。第二次篩選試驗溫度要高1-1.5度。對在這些條件下仍然具有活性的突變體的DNA進(jìn)行測序并轉(zhuǎn)化入曲霉以獲得更高量的蛋白質(zhì)，接著層析純化。純化的酶用于DSC分析以證明增加了穩(wěn)定性。
接著，將在有利變體中發(fā)現(xiàn)的氨基酸取代組合，使用飽和誘變以確保所有的20種氨基酸在所需的位置引入。
實施例3脂酶變體的熱穩(wěn)定性實施例2中初次和第二次篩選中鑒定為熱穩(wěn)定性高的所有樣品純化至同質(zhì)，并且它們的穩(wěn)定性通過差示掃描熱量測定(DSC)在pH5.0和/或7.0檢測以測定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，通過熔解溫度(TM)給定。包括T.lanuginosus親代脂酶進(jìn)行比較。
發(fā)現(xiàn)8種變體在pH5.0的熱穩(wěn)定性升高，4種變體顯示熱穩(wěn)定性升高在4℃以上。在pH7.0檢測兩種變體發(fā)現(xiàn)具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性。
實施例4通過DSC確定脂酶變體的熱穩(wěn)定性制備大量的T.lanuginosus脂酶變體并進(jìn)行純化，通過差示掃描熱量測定(DSC)在pH5.0檢測熱穩(wěn)定性以測定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，通過熔解溫度(TM)給定。包括T.lanuginosus親代脂酶用于比較。
發(fā)現(xiàn)下面的變體的熱穩(wěn)定性比親代脂酶高

發(fā)現(xiàn)下面的變體的熱穩(wěn)定性比親代脂酶的熔解溫度至少升高4℃。


實施例5平板鑒定熱穩(wěn)定性制備大量的T.lanuginosus脂酶變體并如上“初次篩選實驗”所述的檢測熱穩(wěn)定性。包括T.la-nuginosus親代脂酶用于比較。
發(fā)現(xiàn)下面的變體的熱穩(wěn)定性比親代脂酶高


序列表<110>諾維信公司(Novozymes A/S)<120>脂解酶變體<130>10133<160>22<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>269<212>PRT<213>Thermomyces lanuginosus<400>1Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe Asn Leu Phe Ala Gln Tyr1 5 10 15Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr20 25 30Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp35 40 45Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr50 55 60Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe65 70 75 80Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp85 90 95Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly100 105 110Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val115 120 125Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly
130 135 140His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg145 150 155 160Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Val165 170 175Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly Gly Thr180 185 190Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg Leu Pro Pro195 200 205Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr Trp Ile Lys Ser210 215 220Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile Val Lys Ile Glu Gly225 230 235 240Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro Asn Ile Pro Asp Ile Pro245 250 255Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly Thr Cys Leu260 265<210>2<211>269<212>PRT<213>米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)<400>2Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu1 5 10 15Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val20 25 30Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp35 40 45Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala50 55 60Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg65 70 75 80Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Ala Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro85 90 95Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu100 105 110Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp115 120 125Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser130 135 140Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg145 150 155 160Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln165 170 175Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly180 185 190Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu195 200 205Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile210 215 220Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu225 230 235 240Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp245 250 255His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Ser260 265<210>3<211>31<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>142779<400>3ttgaattgaa aatagattga tttaaaactt c 31<210>4<211>25<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>142780<400>4ttgcatgcgt aatcatggtc atagc 25<210>5<211>26<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>140288<400>5ttgaattcat gggtaataac tgatat 26<210>6<211>32<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>142778<400>6aaatcaatct attttcaatt caattcatca tt 32<210>7<211>11<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>gtactaaaacc<400>7gtactaaaac c 11<210>8<211>11<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>ccgttaaattt<400>8ccgttaaatt t 11<210>9<211>45<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>141223<400>9ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc 45<210>10<211>14<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>atgcaatttaaact<400>10atgcaattta aact 14<210>11<211>14<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>cggcaatttaacgg<400>11cggcaattta acgg 14<210>12<211>44<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>141222<400>12ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc44<210>13<211>26<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>270999J8<400>13tctgtgaggc ctatggatct cagaac26<210>14<211>27<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>270999J9<400>14gatgctgcat gcacaactgc acctcag 27<210>15<211>59<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>051 199J1<400>15cctctagatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctggatcc ccagttgtg59<210>16<211>33<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>1298TAKA<400>16gcaagcgcgc gcaatacatg gtgttttgat cat 33<210>17<211>30<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>177996<400>17gaatgacttg gttgacgcgt caccagtcac 30<210>18<211>25<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>135640<400>18cttattagta ggttggtact tcgag 25<210>19<211>37<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>135638<400>19gtecccagag tagtgtcact atgtcgaggc agttaag 37<210>20<211>64<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>080399J19<400>20gtatgtccct tgacaatgcg atgtatcaca tgatataatt actagcaagg gaagccgtgc60ttgg64<210>21<211>24<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>19671<400>21ctcccttctc tgaacaataa accc 24<210>22<211>66<212>DNA<213>人工的/未知<220><221>misc feature<222>()..()<223>991213J5<400>22cctctagatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctgcgcca ggtgtcagtc60accctc 6權(quán)利要求
1.一種親代真菌脂解酶的變體，其中該變體a)與親代真菌脂解酶相比，所具有的氨基酸序列包括相應(yīng)于SEQ IDNO1中21，27，29，32，34-42，51，54，76，84，90-97，101，105，111，118，125，131，135，137，162，187，189，206-212，216，224-234，242-252和256的任何氨基酸的氨基酸殘基的取代，和b)比親代脂解酶的熱穩(wěn)定性高。
2.前述權(quán)利要求的變體，其比親代脂解酶的熱穩(wěn)定性至少高4℃。
3.前述權(quán)利要求之一的變體，其中所述的氨基酸殘基被不同于Pro的氨基酸殘基取代。
4.任何前述權(quán)利要求之一的變體，其中親代脂解酶與SEQ ID NO1具有至少50％的同源性。
5.前述權(quán)利要求之一的變體，其中親代脂解酶是通過Thermomyceslanuginosus DSM 4109制備并且具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
6.前述權(quán)利要求之一的變體，包括相應(yīng)于SEQ ID NO1的Y21，D27，P29，T32，A40，F(xiàn)51，S54，I76，R84，I90，G91，N94，N101，S105，D111，R118，R125，A131，H135，D137，N162，V187，T189，E210，G212，S216，G225，L227，I238或P256的氨基酸殘基的取代。
7.前述權(quán)利要求之一的變體，包括相應(yīng)于SEQ ID NO1的D27N/R/S，P29S，T32S，F(xiàn)51I/L，I76V，R84C，I90L/V，G91A/N/S/T/W，L93F，N94K/R/S，F(xiàn)95I，D96G/N，N101D，D111A/G，R118M，A131V，H135Y，D137N，N162R，V187I，F(xiàn)211Y，S216P，S224I/Y，G225P，T226N，L227F/P/G/V，L227X，V228C/I，238V和P256T的一個或更多個取代。
8.前述權(quán)利要求之一的變體，具有1，2，3，4，5，6，7或8個所述的取代。
9.前述權(quán)利要求之一的變體，進(jìn)一步包括一個或多個不是權(quán)利要求1中所列那些的氨基酸殘基取代，該取代優(yōu)選是1-5個。
10.前述權(quán)利要求之一的變體，包括相應(yīng)于SEQ ID NO1中的下述取代a)D27Nb)D111G+S216Pc)L227Fd)L227F+V228Ie)G225Pf)S224I+G225W+T226N+L227P+V228Cg)S224Y+G225W+T226N+L227P+V228Ch)D27R+D111G+S216Pi)D27S+D111G+S216Pj)D27N+D111Ak)D27R+D111G+S216P+L227P+P256Tl)D27R+D111G+S216P+L227G+P256Tm)D27R+D111G+S216P+L227F+P256Tn)D27R+D111G+S216P+L227V+P256To)D27R+D111G+S216P+L227Gp)D27R+D111G+S216P+L227Xq)D27P+D111G+S216P+L227Xr)S224I+G225W+T226N+L227P+V228Cs)W221C+G246Ct)D27R+D111G+S216Pu)D27N+D111Av)D27R+D111G+S216P+L227G+P256Tw)D27R+D111G+S216P+L227F+P256Tx)D27R+D111G+S216P+L227Gy)D27S+D111G+S216Pz)D27R+D111A+S216P+L227G+P256Taa)D27R+D111G+S216P+G225P+L227G+P256Tbb)D27R+T37S+D111G+S216P+L227G+P256Tcc)D27R+N39F+D111G+S216P+L227G+P256Tdd)D27R+G38C+D111G+S216P+L227G+P256Tee)D27R+D111G+S216P+L227G+T244I+P256Tff)D27R+G91A+D111G+S216P+L227G+P256Tgg)N25I+D27R+D111A+S216P+L227G+P256Thh)N25L+D27R+D111A+S216P+L227G+P256Tii)N26D+D27R+D111A+S216P+L227G+P256Tjj)D27R+K46R+D111A+S216P+L227G+P256Tkk)D27R+V60N+D111A+S216P+L227G+P256Tll)D27R+D111A+P136A+S216P+L227G+P256Tmm)D27R+D111A+S216P+L227G+P256T+I265Fnn)D27R+S58Y+D111A+S216P+L227G+P256T+oo)N26D+D27R+E56Q+D111A+S216P+L227G+P256Tpp)D27R+G91A+D96E+L97Q+D111A+S216P+L227G+P256Tqq)D27R+G91A+D111A+S216P+L227G+P256T+rr)D27R+G91T+N94S+D111A+S216P+L227G+P256Tss)D27R+G91S+D111A+S216P+L227G+P256T+tt)D27R+G91N+D111A+S216P+L227G+P256Tuu)D27R+D96E+D111A+S216P+L227G+P256Tvv)D27R+I90L+G91A+N94K+D111A+S216P+L227G+P256Tww)D27R+G91S+F95V+D111A+S216P+L227G+P256T
11.前述權(quán)利要求之一的變體，具有的變性溫度比親代脂解酶至少高5℃，該溫度優(yōu)選的是在PH5-7測定。
12.一種編碼任何前述權(quán)利要求之一變體的DNA序列。
13.一種包括前述權(quán)利要求所述的DNA序列的載體。
14.一種攜帶有權(quán)利要求12的DNA序列或權(quán)利要求13的載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
15.一種制備權(quán)利要求1-11中任一項的變體的方法，包括a)培養(yǎng)權(quán)利要求14的細(xì)胞以表達(dá)并且優(yōu)選的是分泌該變體，和b)回收該變體。
16.一種制備脂解酶變體的方法，包括a)篩選親代真菌脂解酶，b)在親代脂解酶中取代至少一個相應(yīng)于SEQ ID NO1中21，27，29，32，34-42，51，54，76，84，90-97，101，105，111，118，125，131，135，137，162，187，189，206-212，216，224-234，242-252和256的氨基酸殘基，c)可選地，取代一個或多個不同于b)中的氨基酸，d)制備由步驟a)-c)而得的變體，e)檢測該變體的熱穩(wěn)定性，f)篩選具有增高熱穩(wěn)定性的變體，和g)制備所篩選的變體。
17.前述權(quán)利要求之一的方法，其中親代脂解酶與SEQ ID NO1具有至少50％的同源性。
18.前述權(quán)利要求之一的方法，其中親代脂解酶是通過Thermomyceslanuginosus DSM 4109制備并且具有SEQ ID NO1所示的序列。
19.前述權(quán)利要求之一的方法，包括相應(yīng)于SEQ ID NO1的Y21，D27，P29，T32，A40，F(xiàn)51，S54，I76，R84，I90，G91，N94，N101，S105，D111，R118，R125，A131，H135，D137，N162，V187，T189，E210，G212，S216，G225，L227，I238或P256的氨基酸殘基的取代。
20.前述權(quán)利要求之一的方法，包括相應(yīng)于SEQ ID NO1的D27N/R/S，P29S，T32S，F(xiàn)51I/L，I76V，R84C，I90L/V，G91A/N/S/T/W，L93F，N94K/R/S，F(xiàn)95I，D96G/N，N101D，D111A/G，R118M，A131V，H135Y，D137N，N162R，V187I，F(xiàn)211Y，S216P，S224I/Y，G225P，T226N，L227F/P/G/V，L227X，V228C/I，238V和P256T的氨基酸取代。
21.一種水解羧酸酯的方法，包括將該酯與權(quán)利要求1-11的任何脂酶在有水的情況下溫育。
22.一種在制備機械紙漿或使用機械紙漿造紙的方法中控制樹脂問題的方法，包括將權(quán)利要求1-11的任何脂酶添加到紙漿中并溫育。
23.前述權(quán)利要求之一的方法，其中所述溫育是在溫度60-95℃，尤其是75-90℃進(jìn)行。
24.前述權(quán)利要求之一的方法，其中溫育在PH4.5-11，尤其是5-6.5進(jìn)行。
25.一種制備生面團(tuán)或由生面團(tuán)制備的焙烤產(chǎn)品的方法，包括將權(quán)利要求1-11的任何脂解酶添加到生面團(tuán)中。
26.一種水解，合成或酯交換酯的方法，包括在權(quán)利要求1-11的任何脂解酶存在下酯與水的反應(yīng)，酸與醇的反應(yīng)或酯與酸，醇或第二種酯的酯交換。
27.一種從織物中用酶去除疏水性酯的方法，包括用有效量的權(quán)利要求1-11的任何脂解酶處理織物以從織物中去除疏水性酯。
全文摘要
通過取代真菌脂解酶中某些特定的氨基酸殘基獲得具有改進(jìn)的熱穩(wěn)定性的脂解酶變體。熱穩(wěn)定脂解酶變體可用于例如在制備機械紙漿或使用機械紙漿的造紙方法中控制樹脂問題。
文檔編號A21D8/04GK1484693SQ02803585
公開日2004年3月24日 申請日期2002年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月10日
發(fā)明者斯蒂芬·明寧, 杰斯珀·文德, 桑尼·O·S·格拉德, 斯蒂芬·丹尼爾森, 金·博爾奇, 丹尼爾森, 文德, O S 格拉德, 爾奇, 斯蒂芬 明寧 申請人:諾維信公司