專(zhuān)利名稱(chēng)：脂肪分解酶及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的脂肪分解 酶，特別是新的脂肪分解酶，和編碼它的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及新的脂肪分解酶的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明還涉及脂肪分解酶的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
EP1193314中教導(dǎo)了對(duì)糖脂有活性的脂肪分解酶在面包制作中的有益應(yīng)用。教導(dǎo)了，發(fā)現(xiàn)部分水解產(chǎn)物溶血糖脂具有很高的乳化劑功用?？墒?，也發(fā)現(xiàn)EP1193314中教導(dǎo)的酶對(duì)甘油三酯具有顯著的非選擇性活性，會(huì)造成不必要的高游離脂肪酸。EP0869167中教導(dǎo)了來(lái)自尖鐮孢(Fusarium oxysporum)的具有磷脂酶活性的脂肪分解酶。該脂肪分解酶具有高的三?；视王ニ?脂肪酶)活性。該酶現(xiàn)在由NovozymesA/S (丹麥)以L(fǎng)ipopan F 來(lái)銷(xiāo)售。W002/00852披露了五種脂肪酶和它們的編碼多核苷酸，它們分離自Fusariumvenenatum、F. sulphureum、Aspergillus berkeleyanum、黃色鍵抱(F. culmorum)和腐皮鍵孢(F. solani)。所有五種酶據(jù)說(shuō)具有三酰甘油水解活性、磷脂酶和半乳糖脂酶活性。已經(jīng)生成了帶有特定氨基酸替代和融合的脂肪分解酶變體；其中一些與野生型親本酶相比，對(duì)極性脂質(zhì)具有增強(qiáng)的活性。W001/39602記載了這樣一種變體，其稱(chēng)為SP979，是Thermomyces Ianuginosus脂肪酶和EP0869167中記載的尖鐮孢脂肪酶的融合物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該變體對(duì)磷脂和糖脂具有與甘油三酯相比顯著高比率的活性。W002/094123中發(fā)現(xiàn)了，通過(guò)選擇對(duì)生面團(tuán)中的極性脂質(zhì)(糖脂和磷脂)有活性但對(duì)甘油三酯或I-單-甘油酯基本上無(wú)活性的脂肪分解酶，可獲得改良的功用。在共同未決的PCT申請(qǐng)PCT/IB2005/000875中教導(dǎo)了，與甘油三酯相比，對(duì)極性脂質(zhì)具有更高比率活性的野生型脂肪分解酶?？墒?，該文獻(xiàn)沒(méi)有教導(dǎo)來(lái)自鏈霉菌屬(Streptomyces)、喜熱裂抱菌屬(Thermobifida)或棒桿菌屬(Corynebacterium)物種的脂肪分解酶。在本發(fā)明之前，沒(méi)有公開(kāi)過(guò)來(lái)自鏈霉菌屬菌種的對(duì)糖脂具有活性或顯著活性的脂肪分解酶。同樣，沒(méi)有公開(kāi)過(guò)來(lái)自喜熱裂孢菌屬物種或棒桿菌屬物種的對(duì)糖脂具有活性或顯著活性的脂肪分解酶。盡管已經(jīng)從鏈霉菌屬菌種中分離到了脂肪酶，即三酰甘油水解酶(參見(jiàn)例如Vujaklija等，ArchMicrobiol (2002) 178 :124-130)，這些酶從未鑒定為具有糖脂水解活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明依據(jù)來(lái)自鏈霉菌屬的具有顯著半乳糖脂活性的脂肪分解酶的重大發(fā)現(xiàn)。具體而言，來(lái)自鏈霉菌屬的脂肪分解酶具有顯著的半乳糖脂水解活性和/或顯著的半乳糖脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性，特別是在應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途時(shí)。另外，本發(fā)明依據(jù)來(lái)自喜熱裂孢菌屬或棒桿菌屬的具有顯著半乳糖脂活性的脂肪分解酶的重大發(fā)現(xiàn)。具體而言，來(lái)自喜熱裂孢菌屬或棒桿菌屬的脂肪分解酶具有顯著的半乳糖脂水解活性和/或顯著的半乳糖脂酰基轉(zhuǎn)移酶活性，特別是在應(yīng)用于本發(fā)明的方法和用途時(shí)。在一個(gè)廣的方面，本發(fā)明涉及至少能水解糖脂和/或至少能將?；鶑奶侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從鏈霉菌屬菌種得到的。在另一方面，本發(fā)明涉及至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡(jiǎn)并而與SEQ ID No. 3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No. 3所不的核苷酸序列具有至少70%同一'丨生的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明還進(jìn)一步提供包含SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或與其具有至少60%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在另一方面，本發(fā)明提供至少能水解半乳糖脂和/或至少能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶包含SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或與其具有至少60%同一性的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供編碼脂肪分解酶的核酸，該脂肪分解酶包含SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或與其具有至少60%同一性的氨基酸序列。SEQ ID No. 3 如圖 3 所示，而 SEQ ID No. 4 如圖 4 所示。本發(fā)明還進(jìn)一步提供編碼脂肪分解酶的核酸，該核酸選自下組a)包含SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡(jiǎn)并而與SEQ ID No. 3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No. 3所不的核苷酸序列具有至少70%同一'丨生的核苷酸序列的核酸。本發(fā)明還進(jìn)一步提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在用于制備溶血糖脂，例如二半乳糖苷甘油單酯(DGMG)或單半乳糖苷甘油單酯(MGMG))的底物(優(yōu)選食品)中的應(yīng)用，其用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理糖脂(如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)或單半乳糖苷甘油二酯(MGDG))來(lái)產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血糖脂。在另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在用于制備溶血磷脂，例如溶血卵磷脂的底物(優(yōu)選食品)中的應(yīng)用，其用根據(jù)本發(fā)明的酶處理磷脂(如卵磷脂)來(lái)產(chǎn)生部分水解產(chǎn)物，即溶血磷脂。在一個(gè)廣的方面，本發(fā)明涉及制備食品的方法，該方法包括將本發(fā)明的脂肪分解酶與食品的一種或多種成分混合。本發(fā)明的另一個(gè)廣的方面涉及由生面團(tuán)制備焙烤品的方法，該方法包括將本發(fā)明的脂肪分解酶與生面團(tuán)混合。
在另一方面，本發(fā)明涉及制備乳制品的方法，該方法包括將本發(fā)明的脂肪分解酶與乳制品的一種或多種成分混合。在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的脂肪分解酶在制備乳制品中的應(yīng)用，以降低一種或多種以下有害效應(yīng)臭味和/或異味和/或油膩口味。在本發(fā)明的另一方面，提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品中的應(yīng)用，以產(chǎn)生溶血磷脂。在本發(fā)明的另一方面，提 供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在處理蛋或基于蛋的產(chǎn)品中的應(yīng)用，以產(chǎn)生溶血糖脂。本發(fā)明的另一方面提供植物或食用油的酶促脫膠方法，其包括用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理所述食用或植物油，從而水解極性脂質(zhì)(如磷脂和/或糖脂)的主要部分。在另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在包括處理磷脂從而水解脂肪?；姆椒ㄖ械膽?yīng)用。在另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在用于降低食用油中磷脂含量的方法中的應(yīng)用，其包括用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理所述油，從而水解磷脂的主要部分，并將含水解磷脂的水相與油分開(kāi)。還提供了制備根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的方法，該方法包括用包含編碼脂肪分解酶的核苷酸序列的重組核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞能表達(dá)編碼脂肪分解酶多肽的核苷酸序列，在核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞并收獲脂肪分解酶。在另一方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)(優(yōu)選糖月旨)以制造高價(jià)值產(chǎn)品，諸如碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或蛋白質(zhì)亞基酯和/或羥酸酯中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在植物或食用油的酶促脫膠方法中的應(yīng)用，其包括用所述脂肪分解酶處理所述食用或植物油，從而水解極性脂質(zhì)的主要部分。本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在包括處理磷脂從而水解脂肪?；姆椒ㄖ械膽?yīng)用。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及根據(jù)本發(fā)明的固定化的脂肪分解酶。本發(fā)明的另一方面涉及制備溶血糖脂的方法，其包括用至少一種脂肪分解酶處理含糖脂的底物來(lái)產(chǎn)生所述溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明的另一方面涉及制備溶血磷脂的方法，其包括用至少一種脂肪分解酶處理含磷脂的底物來(lái)產(chǎn)生所述溶血磷脂，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明的另一方面涉及植物或食用油的酶促脫膠方法，其包括用可從以下屬之一得到的能水解極性脂質(zhì)主要部分的脂肪分解酶處理所述食用或植物油鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明還涉及生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價(jià)值產(chǎn)品的方法，其包括用可從以下屬之一得到的脂肪分解酶處理所述極性脂質(zhì)來(lái)產(chǎn)生所述高價(jià)值產(chǎn)品鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面涉及制備食品的方法，其包括將至少一種脂肪分解酶與食品的一種或多種成分混合，其中所述脂肪分解酶能將存在的糖脂和/或磷脂水解進(jìn)或成至少一種所述成分，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明的另一方面涉及脂肪分解酶在用于制備溶血磷脂的底物中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶具有磷脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明另外涉及可從以下 屬之一得到的脂肪分解酶用于植物或食用油的酶促脫膠從而水解極性脂質(zhì)主要部分的應(yīng)用鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明的另一方面涉及可從以下屬之一得到的脂肪分解酶在包括處理磷脂從而水解脂肪?；姆椒ㄖ械膽?yīng)用鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明的另一方面涉及脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價(jià)值產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)，且其中所述脂肪分解酶可從以下屬之一得到鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明的另一方面涉及可從以下屬之一得到的脂肪分解酶在制備食品中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂和/或磷脂鏈霉菌屬、棒桿菌屬和喜熱裂孢菌屬。本發(fā)明的各方面出現(xiàn)在權(quán)利要求中以及以下注釋中。關(guān)注可用于本發(fā)明的核苷酸序列的其它方面包括包含本發(fā)明的序列的構(gòu)建物；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的載體；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的質(zhì)粒；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化組織；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化器官；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化宿主；包含本發(fā)明中應(yīng)用的序列的轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還涵蓋利用本發(fā)明中應(yīng)用的核苷酸序列來(lái)表達(dá)它的方法，諸如在宿主細(xì)胞中表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移它的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涵蓋分離核苷酸序列的方法，諸如從宿主細(xì)胞分離。關(guān)注可用于本發(fā)明的氨基酸序列的其它方面包括編碼本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的構(gòu)建物；編碼本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的載體；編碼本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的質(zhì)粒；表達(dá)本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞；表達(dá)本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化組織；表達(dá)本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化器官；表達(dá)本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化宿主；表達(dá)本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列的轉(zhuǎn)化生物體。本發(fā)明還涵蓋利用本發(fā)明中應(yīng)用的氨基酸序列來(lái)純化它的方法，諸如在宿主細(xì)胞中表達(dá)；包括轉(zhuǎn)移它且然后純化所述序列的方法。為了便于參考，現(xiàn)在在合適的小節(jié)標(biāo)題下論述本發(fā)明的這些和其它方面?？墒?，每個(gè)小節(jié)下的教導(dǎo)不必局限于每個(gè)特定的小節(jié)。
具體實(shí)施例方式適宜地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No. 4、
5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No. 3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一編碼的脂肪分解酶。
優(yōu)選地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從鏈霉菌屬菌種得到的。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶優(yōu)選是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No. 3所示的核 苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡(jiǎn)并而與SEQ ID No. 3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No. 3所不的核苷酸序列具有至少70%同一性的核苷酸序列的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶優(yōu)選是包含SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或與其具有至少60%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶優(yōu)選是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶包含SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或與其具有至少60%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從喜熱裂孢菌屬物種，優(yōu)選褐色喜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)得到的。優(yōu)選地，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物的脂肪分解酶，其中該酶是可從，優(yōu)選就是從棒桿菌屬物種，優(yōu)選Corynebacterium efficiens得到的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No. 4、5、7、8、12、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一，或由SEQ ID No. 3、6、9、13、15或17所示的核苷酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的核苷酸序列之任一編碼的脂肪分解酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是用于本文所述用途的包含SEQ ID No. 5、7、8、14或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是用于本文所述用途的包含SEQ ID No. 5、7或16所示的氨基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列之任一的脂肪分解酶。更優(yōu)選地，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ. ID. No. 16所示的氨基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%,97%或98%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ. ID. No. 12或14所示的氨基酸序列或與其具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是包含SEQ ID No. 8所示的氨基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和用途中的脂肪分解酶可以是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No. 3所示的 核苷酸序列的核酸；b)因遺傳密碼簡(jiǎn)并而與SEQ ID No. 3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No. 3所不的核苷酸序列具有至少70%同一'丨生的核苷酸序列的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以是可從，優(yōu)選就是從鏈霉菌屬菌株L130或L131得到的，根據(jù)國(guó)際承認(rèn)的用于專(zhuān)利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，它們于2004年6月23日由丹尼斯科公司(Danisco A/S) (Langebrogade I, DK-1001Copenhagen K,丹麥)保藏于英國(guó)蘇格蘭阿伯丁圣馬恰爾街23號(hào)(23 St Machar Street,Aberdeen Scotland，GB)英國(guó)食品工業(yè)與海洋細(xì)菌菌種保藏中心(NCMB)，編號(hào)分別為NCMB41226 和 NCMB 41227。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶至少作用于糖脂，諸如例如二半乳糖苷甘油二酯(D⑶G)。適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶還可作用于一種或多種其它極性脂質(zhì)底物，諸如磷脂，例如卵磷脂，如磷脂酰膽堿。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“能水解糖脂”的可選表述方式可以說(shuō)成脂肪分解酶具有糖脂水解活性。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶水解糖脂，諸如例如二半乳糖苷甘油二酯(DGDG)，而且也水解磷脂，諸如卵磷脂，如磷脂酰膽堿。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶作用于糖脂，諸如D⑶G或MGDG。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶將DGDG水解成DGMG和/或?qū)GDG水解成MGMG。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶將卵磷脂水解成溶血卵磷脂。在脂肪分解酶至少能將?；鶑奶侵D(zhuǎn)移至供體底物的情況中，極性脂質(zhì)底物在本文中可稱(chēng)為“脂質(zhì)酰基供體”。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的酶既具有磷脂酶和/或糖脂酶活性(根據(jù)國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟命名委員會(huì)的酶命名法建議(1992)，通常歸入E. C. 3. I. I. 26 ；E. C. 3. I. 1.4*E. C. 3. I. I. 32)，又具有?；D(zhuǎn)移酶活性(通常歸入E. C. 2. 3. 1.x)，由此該酶能將?；鶑闹|(zhì)?；w轉(zhuǎn)移至一種或多種受體底物，諸如以下一種或多種留醇；甾燒醇(stanol);碳水化合物；蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)亞基；甘油。共同未決的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/IB2004/000655中教導(dǎo)了脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶及其應(yīng)用。將該文件引入本文作為參考。可是，PCT/IB2004/000655中沒(méi)有教導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明來(lái)自鏈霉菌屬的脂肪分解酶。在有些方面，應(yīng)用于本發(fā)明的方法和/或應(yīng)用中的脂肪分解酶可能能將酰基從極性脂質(zhì)(如本文所定義的)轉(zhuǎn)移至一種或多種以下?；荏w底物留醇、留烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)或其亞基、或甘油。對(duì)于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的“酰基受體”可以是包含羥基(-0H)的任何化合物，諸如例如多元醇，包括甘油；留醇；留烷醇；碳水化合物；羥酸，包括果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸和抗壞血酸；蛋白質(zhì)或其亞基，諸如例如氨基酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物和肽(部分水解的蛋白質(zhì))；及其混合物和衍生物。在有些方面，根據(jù)本 發(fā)明的“?；荏w”可優(yōu)選不是水。在一個(gè)實(shí)施方案中，酰基受體優(yōu)選不是甘油單酯和/或甘油二酯。在一個(gè)方面，優(yōu)選該酶能將酰基從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至留醇和/或留烷醇。在一個(gè)方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至碳水化合物。在一個(gè)方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)或其亞基。適宜地，蛋白質(zhì)亞基可以是以下一種或多種氨基酸、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、肽、二肽、寡肽、多肽。適宜地，在蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基中，酰基受體可以是一種或多種以下蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)亞基成分絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)亞基是氨基酸時(shí)，適宜地，氨基酸可以是任何合適的氨基酸。適宜地，氨基酸可以是例如絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸中的一種或多種。在一個(gè)方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至甘油。在一個(gè)方面，優(yōu)選該酶能將酰基從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至羥酸。在一個(gè)方面，優(yōu)選該酶能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至多元醇。在一個(gè)方面，脂肪分解酶可能既能將酰基從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至留醇和/或留烷醇，又能將?；鶑闹|(zhì)轉(zhuǎn)移至以下一種或多種碳水化合物、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)亞基、甘油。本文中所用的術(shù)語(yǔ)卵磷脂涵蓋磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰甘油。對(duì)于有些方面，優(yōu)選脂質(zhì)底物至少是糖脂，諸如例如D⑶G。對(duì)于有些方面，優(yōu)選脂質(zhì)底物也可以是磷脂，諸如卵磷脂，例如磷脂酰膽堿。根據(jù)本發(fā)明的其它磷脂底物可以是N酰基磷脂酰乙醇胺(APE)或N?；苎字Ｒ掖及?ALPE)中的一種或多種。優(yōu)選脂質(zhì)底物是食物脂質(zhì)，也就是說(shuō)是食品的脂質(zhì)成分。對(duì)于有些方面，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶不能或基本不能作用于甘油三酯和/或I-甘油單酯和/或2-甘油單酯。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶對(duì)甘油三酯和/或I-甘油單酯和/或2-甘油單酯無(wú)活性或無(wú)顯著活性。適宜地，脂質(zhì)底物或脂質(zhì)?；w可以是一種或多種以下底物中存在的一種或多種脂質(zhì)脂肪，包括豬油、牛脂和黃油脂肪；油，包括提取自或衍生自棕櫚油、向日葵油、大豆油、紅花油、棉籽油、落花生油、玉米油、橄欖油、花生油、椰子油和油菜籽油的油。來(lái)自大豆、油菜籽或蛋黃的卵磷脂也是合適的脂質(zhì)底物。脂質(zhì)底物可以是燕麥脂質(zhì)或其它基于植物的含半乳糖脂的材料。在一個(gè)方面，脂質(zhì)底物或脂質(zhì)?；w優(yōu)選是蛋黃中的卵磷脂(諸如磷脂酰膽堿)。對(duì)于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自具有8至22個(gè)碳的脂肪酸鏈長(zhǎng)度的脂質(zhì)。
對(duì)于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自具有16至22個(gè)碳的脂肪酸鏈長(zhǎng)度的脂質(zhì)，更優(yōu)選16至20個(gè)碳。對(duì)于本發(fā)明的有些方面，脂質(zhì)可以選自具有不超過(guò)14個(gè)碳的脂肪酸鏈長(zhǎng)度的脂質(zhì)，適宜地選自具有4至14個(gè)碳的脂肪酸鏈長(zhǎng)度的脂質(zhì)，適宜地4至10個(gè)碳，適宜地4至8個(gè)碳。適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶至少展現(xiàn)糖脂酶活性(E. C. 3. I. I. 26)。適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶也可展現(xiàn)磷 脂酶A2活性(E. C. 3. I. I. 4)和/或磷脂酶Al活性(E. C. 3. I. I. 32)。對(duì)于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可只具有糖脂酶活性(E. C. 3. I. I. 26)。對(duì)于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是半乳糖脂酶(E. C. 3. I. I. 26)?？墒牵付榘肴樘侵傅氖聦?shí)并不妨礙其具有其它附帶活性，諸如針對(duì)例如其它極性脂質(zhì)的活性。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“糖脂酶活性”和“半乳糖脂酶活性”可互換使用。適宜地，對(duì)于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可能能將?；鶑奶侵?或磷脂轉(zhuǎn)移至一種或多種受體底物。適宜地，受體底物可以是一種或多種以下底物甾醇、甾烷醇、碳水化合物、蛋白質(zhì)、甘油。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“極性脂質(zhì)”指磷脂和/或糖脂。在有些方面，術(shù)語(yǔ)極性脂質(zhì)優(yōu)選至少指糖脂。酶的糖脂酶活性；磷脂酶活性和/或三酰甘油脂肪酶活性可用下文介紹的測(cè)定法來(lái)測(cè)定。半乳糖脂酶活性的測(cè)定(糖脂酶活性測(cè)定法(GLU-7))底物將O. 6% 二半乳糖苷甘油二酯(Sigma D4651)、0· 4%Triton_X100 (SigmaX-100)和5mM CaCl2 溶于 pH7 的 0. 05M HEPES 緩沖液。測(cè)定流程將400 μ L底物加到I. 5mL Eppendorf管中并在Eppendorf熱混合器中于37°C放置5分鐘。在時(shí)間t=0分鐘時(shí)，加入50 μ L酶溶液。用水代替酶來(lái)進(jìn)行空白分析。將樣品在Eppendorf熱混合器中于37°C以IOxlOOrpm混合10分鐘。在時(shí)間t=10分鐘時(shí)，將Eppendorf管在另一個(gè)熱混合器中于99°C放置10分鐘，以終止反應(yīng)。使用WAKO GmbH的NEFAC試劑盒來(lái)分析樣品中的游離脂肪酸。根據(jù)在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生的脂肪酸微摩爾量，計(jì)算在pH7的酶活性GLU。磷脂酶活性的測(cè)定(磷脂酶活性測(cè)定法(PLU-7))底物將O. 6%L- α 磷脂酰膽堿，95% 植物(Avanti#441601)、0· 4%Triton_X100 (SigmaX-100)和 5mM CaCl2 散布于 pH7 的 0. 05M HEPES 緩沖液。測(cè)定流程將400 μ L底物加到I. 5mL Eppendorf管中并在Eppendorf熱混合器中于37°C放置5分鐘。在時(shí)間t=0分鐘時(shí)，加入50 μ L酶溶液。用水代替酶來(lái)進(jìn)行空白分析。將樣品在Eppendorf熱混合器中于37°C以IOxlOOrpm混合10分鐘。在時(shí)間t=10分鐘時(shí)，將Eppendorf管在另一個(gè)熱混合器中于99°C放置10分鐘，以終止反應(yīng)。使用WAKO GmbH的NEFAC試劑盒來(lái)分析樣品中的游離脂肪酸。根據(jù)在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生的脂肪酸微摩爾量，計(jì)算在pH7的酶活性PLU-7。三酰甘油酯脂肪酶活性的測(cè)定基于甘油三酯(三丁精)作為底物的的測(cè)定法(LIPU)基于三丁精的脂肪酶活性 根據(jù)Food Chemical Codex(第四版,National AcademyPress, 1996, p803)來(lái)測(cè)量。其中的改變是，將樣品溶于去離子水來(lái)代替甘氨酸緩沖液，而pH計(jì)設(shè)置點(diǎn)為5. 5來(lái)代替7。ILIPU定義為在測(cè)定條件下每分鐘能釋放出I微摩爾丁酸的酶量。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是野生型脂肪分解酶。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“天然”和“野生型”指天然存在的酶。也就是說(shuō)是，由內(nèi)源遺傳密碼表達(dá)和從其內(nèi)源宿主生物體中分離的酶，和/或與內(nèi)源產(chǎn)生的成熟蛋白質(zhì)序列(在共翻譯和翻譯后切割事件之后)相比尚未突變(即不含氨基酸刪除、添加或替代)的異源產(chǎn)生的酶。本發(fā)明的天然和野生型蛋白質(zhì)可由為了異源表達(dá)而優(yōu)化了密碼子的多核苷酸編碼，而且也可包含為了在該宿主中表達(dá)而選擇的非內(nèi)源信號(hào)肽。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“變體”指由非內(nèi)源遺傳密碼表達(dá)的蛋白質(zhì)，其造成與天然或野生型序列相比成熟蛋白質(zhì)序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變(即氨基酸刪除、添加或替代)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶是可從(適宜地，可以是從)細(xì)菌得到的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以是可從(優(yōu)選從)鏈霉菌屬菌種得到的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以是可從(優(yōu)選從)鏈霉菌屬菌株L131或鏈霉菌屬菌株L130得到的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶包含與SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列具有至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%、優(yōu)選至少98%、優(yōu)選至少
99%同一性的氨基酸序列。優(yōu)選地，編碼根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的核酸包含與SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列具有至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、優(yōu)選至少95%、優(yōu)選至少98%、優(yōu)選至少99%同一性的核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，酶對(duì)半乳糖脂底物的最優(yōu)pH適宜地是約6-8，優(yōu)選約
6.5-7. 5，更優(yōu)選約7。適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可不受小麥粉中存在的脂肪酶抑制劑的抑制或顯著抑制。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“不受顯著抑制”指根據(jù)本文中定義的標(biāo)準(zhǔn)磷脂酶(PUU-T)測(cè)定法，與LipopanF (Novozymes A/S，丹麥)的等效劑量(PLU)相比，酶對(duì)小麥粉中存在的脂肪酶抑制劑較不敏感。適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶能將底物(即例如食品如生面團(tuán)中的)中的至少10%半乳糖脂二酯水解成單酯。優(yōu)選地，酶能將至少20%、更優(yōu)選至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%半乳糖脂二酯水解成單酯。適宜地，半乳糖脂二酯可以是MGDG或DGDG中的一種或多種，而單酯可以分別是MGMG或DGMG中的一種或多種。
適宜地，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可分離自鏈霉菌屬菌株L131或鏈霉菌屬菌株L130的發(fā)酵液。適宜地，酶可通過(guò)液相色譜來(lái)純化。純化的脂肪分解酶的氨基酸序列可通過(guò)Edman降解、LC-MS和MALDI-T0F分析來(lái)測(cè)定。適宜地，本文中所定義的酶 可催化一種或多種以下反應(yīng)酯交換(interesterification)、酯轉(zhuǎn)移(transesterification)、醇解、水解。術(shù)語(yǔ)“酯交換”指酶促催化的?；谥|(zhì)供體和脂質(zhì)受體間的轉(zhuǎn)移，其中脂質(zhì)供體不是游離酰基。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“酯轉(zhuǎn)移”指酶促催化的酰基從脂質(zhì)供體(除了游離脂肪酸)至?；荏w(除了水)的轉(zhuǎn)移。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“醇解”指通過(guò)與醇ROH反應(yīng)來(lái)酶促切割酸衍生物的共價(jià)鍵，使得產(chǎn)物之一與醇的H結(jié)合而另一種產(chǎn)物與醇的OR基團(tuán)結(jié)合。 本文中所用的術(shù)語(yǔ)“醇”指含羥基的烴基化合物。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“水解”指酶促催化?；鶑闹|(zhì)至水分子OH基團(tuán)的轉(zhuǎn)移。水解造成的?；D(zhuǎn)移需要解離水分子。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“食品”指適合人和/或動(dòng)物消費(fèi)的物質(zhì)。適宜地，本文中所用的術(shù)語(yǔ)“食品”可指做好消費(fèi)準(zhǔn)備的形式的食品。可是，或者/另外，本文中所用的的術(shù)語(yǔ)食品可指用于制備食品的一種或多種食物材料。僅作為示例，術(shù)語(yǔ)食品涵蓋由生面團(tuán)產(chǎn)生的焙烤品以及用于制備所述焙烤品的生面團(tuán)。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供上文定義的食品，其中所述食品選自以下一種或多種蛋，基于蛋的產(chǎn)品，包括但不限于蛋黃醬，色拉調(diào)味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黃及其制成品；倍烤品，包括面包，蛋糕，甜面團(tuán)(sweet dough)廣品，置層面團(tuán)廣品(laminated dough),液態(tài)奶蛋糊,松餅,油炸圈餅,餅干,薄脆餅干和曲奇餅；糖果,包括巧克力，糖果，飴糖，halawa，膠皮糖(gum)，包括無(wú)糖和加糖膠皮糖，泡泡糖，軟泡泡糖，口香糖和布丁 ；冷凍產(chǎn)品，包括冰糕，優(yōu)選冷凍乳制品，包括冰激凌和牛奶凍；乳制品，包括奶酪，黃油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳飲料和酸牛奶；慕思，生植物奶油，肉制品，包括經(jīng)加工的肉制品；食用油和脂肪，攪打起泡和不起泡的產(chǎn)品，水包油乳狀液，油包水乳狀液，人造黃油，起酥油和涂抹物，包括低脂肪的和極低脂肪的涂抹物；調(diào)味品，蛋黃醬，蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的湯，飲料，香料乳狀液和沙司。適宜地，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是“精制食物”，包括蛋糕、面粉糕餅、糖果、巧克力、奶油軟糖等。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是生面團(tuán)產(chǎn)品或焙烤產(chǎn)品，諸如面包、油炸產(chǎn)品、小吃、蛋糕、餡餅、核仁巧克力餅、小甜餅、面條、零食諸如薄脆餅干、全麥薄脆餅干、椒鹽脆餅干、和薯片、和意大利面制品。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是植物衍生的食物產(chǎn)品，諸如面粉、預(yù)混合料、油、脂肪、可可油、人造稀奶油、色拉調(diào)味品、人造黃油、涂抹物、花生醬、起酥油、冰激凌、烹調(diào)油。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是乳制品，包括黃油，牛奶，奶油，奶酪諸如各種形式的(包括切碎的、整塊的、切片的或搓碎的)天然的、經(jīng)加工的、和人造的干酪，奶油干酪，冰激凌，冷凍甜品，酸奶，酸奶飲料，黃油脂肪，脫水乳脂肪，其它乳制品。根據(jù)本發(fā)明的酶可提聞乳制品中的脂肪穩(wěn)定性。在奶酪中使用根據(jù)本發(fā)明的酶是特別有益的。所以，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可有利地用于生產(chǎn)奶酪。脂肪分解酶催化牛奶中磷脂的水解，這有助于增加奶酪產(chǎn)量。優(yōu)選地，在奶酪生產(chǎn)過(guò)程前或期間，可將根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶加到牛奶(稱(chēng)為干酪用乳)中。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是含有動(dòng)物衍生成分的食物產(chǎn)品，諸如經(jīng)加工的肉制品、烹調(diào)油、起酥油。在另一方面，根據(jù)本發(fā) 明的食品可以是飲料、水果、水果什錦、蔬菜或葡萄酒。在有些情況中，飲料可含多達(dá)20g/l外加的植物甾醇。在另一方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以是動(dòng)物飼料。動(dòng)物飼料可強(qiáng)化了植物留醇和/或植物留烷醇，優(yōu)選強(qiáng)化了 β_谷留醇/留烷醇。適宜地，動(dòng)物飼料可以是家禽飼料。當(dāng)食品是家禽飼料時(shí)，本發(fā)明可用于降低以根據(jù)本發(fā)明的食品喂養(yǎng)的家禽所產(chǎn)蛋的膽固醇含量。在一個(gè)方面，優(yōu)選食品選自以下一種或多種蛋，基于蛋的產(chǎn)品，包括蛋黃醬，色拉調(diào)味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黃及其制成品。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的食品是含水食品。適宜地，食品可包含10-98%的水，適宜地14-98%，適宜地18-98%的水，適宜地20_98%，適宜地40_98%，適宜地50_98%，適宜地70-98%,適宜地 75-98%。對(duì)于有些方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可以不是純的植物衍生油，諸如例如橄欖油、向日葵油、花生油、油菜籽油。為了免除猜疑，在本發(fā)明的有些方面，根據(jù)本發(fā)明的食品可包含油，但該食品不是主要由油或油混合物構(gòu)成的。對(duì)于有些方面，優(yōu)選食品包含少于95%的脂質(zhì)，優(yōu)選少于90%的脂質(zhì)，優(yōu)選少于85%，優(yōu)選少于80%的脂質(zhì)。所以，對(duì)于本發(fā)明的有些方面，油可以是食品的成分，但優(yōu)選食品本身不是油。專(zhuān)利申請(qǐng)W02004/064987，W02004/064537，PCT/IB2004/004374 和 GB0513859. 9 中
教導(dǎo)了在食物應(yīng)用中使用能轉(zhuǎn)移?；闹痉纸饷傅膬?yōu)勢(shì)，將它們引入本文作為參考。游離脂肪酸的產(chǎn)生對(duì)食品可能是有害的。在食品中，游離脂肪酸與臭味和/或異味以及其他有害效應(yīng)(包括諸如例如奶酪的乳制品中的油膩口味)有關(guān)。適宜地，在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，脂肪分解酶能將脂肪酸從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至酰基受體，例如留醇和/或甾烷醇。因此，食品中游離脂肪酸的整體水平不增加或僅僅增加到不顯著的程度。所以，在奶酪生產(chǎn)中，根據(jù)本發(fā)明的能轉(zhuǎn)移?；闹痉纸饷缚商峁┮环N或多種以下出乎預(yù)料的技術(shù)效果減少奶酪中的溢油(Oiling-OfT)效應(yīng)；增加奶酪產(chǎn)量；增強(qiáng)香味；降低惡臭；降低“油膩” 口味。本文教導(dǎo)的能將?；D(zhuǎn)移至碳水化合物以及留醇和/或留烷醇的脂肪分解酶的應(yīng)用對(duì)于含蛋食品是特別有益的。具體而言，在蛋和蛋制品中，糖，特別是葡萄糖的存在常常視為是不利的。蛋黃可包含多達(dá)1%的葡萄糖。根據(jù)本發(fā)明，該不想要的糖可方便地通過(guò)“酯化”糖以形成糖酯來(lái)去除。食用油中存在甘油二酯是不利的。具體而言，食用油(特別是棕櫚油)中的甘油二酯可導(dǎo)致油的品質(zhì)低。適宜地，在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的脂肪分解酶能將脂肪酸從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至?；荏w，這降低油中甘油二酯的水平，而不增加或顯著增加游離脂肪酸的水平。本文教導(dǎo)的脂肪分解酶能水解食用或植物油中的磷脂的主要部分。這在植物或食用油的酶促脫膠中是高度有益的。適宜地，在本發(fā)明的有些實(shí)施方案中，脂肪分解酶可能能將脂肪酸從脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至酰基受體。因此，有利的是，油中的游離脂肪酸的整體水平不增加或僅僅增加到不顯著的程度。游離脂肪酸的產(chǎn)生對(duì)食用油可能是有害的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致食用油脫膠，其中游離脂肪酸的積聚降低和/或消除。本發(fā)明的權(quán)利要求將解釋為包括上文所列每種食品。在本文提及的有些應(yīng)用中，特 別是食物應(yīng)用，諸如面包房應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以與一種或多種常規(guī)乳化劑一起使用，包括例如甘油單酯、脂肪酸甘油單酯和二酯的二?；剖狨?、糖酯、硬脂酰乳酸鈉(SSL)和卵磷脂。另外/或者，根據(jù)本發(fā)明的酶可以與一種或多種其它合適的食用級(jí)酶一起使用。所以，除了本發(fā)明的脂肪分解酶，可將至少一種其它酶加到焙烤品和/或生面團(tuán)中，這在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這樣的其它酶包括淀粉降解酶諸如內(nèi)切或外切淀粉酶，支鏈淀粉酶，脫支酶，半纖維素酶包括木聚糖酶，纖維素酶，氧化還原酶如葡萄糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，巰基氧化酶或碳水化合物氧化酶諸如氧化麥芽糖的，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶和己糖氧化酶，蛋白酶，和酰基轉(zhuǎn)移酶(諸如例如PCT/IB2004/000575中所述的那些)。本發(fā)明涵蓋食物酶組合物，包括包含根據(jù)本發(fā)明的酶的面包和/或生面團(tuán)改良組合物，且任選還包含其它酶，諸如一種或多種其它合適的食用級(jí)酶，包括淀粉降解酶諸如內(nèi)切或外切淀粉酶，支鏈淀粉酶，脫支酶，半纖維素酶包括木聚糖酶，纖維素酶，氧化還原酶如葡萄糖氧化酶，吡喃糖氧化酶，巰基氧化酶或碳水化合物氧化酶諸如氧化麥芽糖的，例如己糖氧化酶(HOX)，脂肪酶，磷脂酶和己糖氧化酶，蛋白酶，和?；D(zhuǎn)移酶(諸如例如PCT/IB2004/000575中所述的那些)。在本文提交的有些應(yīng)用中，特別是食物應(yīng)用，諸如面包房應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以與一種或多種酶底物聯(lián)合或順序加入。僅作為示例，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以與一種或多種極性脂質(zhì)底物和/或一種或多種?；荏w底物一起加入。在本文提及的有些應(yīng)用中，特別是食物應(yīng)用，諸如面包房應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶可以與一種或多種羥酸一起使用，包括例如酒石酸、檸檬酸、乳酸、琥珀酸或抗壞血酸。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“改良的特性”指可通過(guò)本發(fā)明脂肪分解酶的作用改良的任何性質(zhì)。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶的應(yīng)用導(dǎo)致一種或多種以下特征增加焙烤品體積；改善焙烤品團(tuán)粒結(jié)構(gòu)(crumb structure);焙烤品中的抗走味(anti-staling)特性；對(duì)生面團(tuán)增加強(qiáng)度、增加穩(wěn)定性、減少粘性和/或改善切削加工性。通過(guò)與不添加根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶而制備的生面團(tuán)和/或焙烤品進(jìn)行比較，評(píng)估了改良的特性。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“焙烤品”包括由生面團(tuán)制備的產(chǎn)品?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明有利地制備的焙烤品(無(wú)論是白色、淺色或深色類(lèi)型的)的例子包括以下一種或多種典型地塊或卷形式的面包(包括白、粗面粉和黑面包)，蒸汽小圓面包，法國(guó)棍子面包，比塔餅，玉米面豆卷，玉米粉圓餅，小麥粉圓餅，蛋糕，薄烤餅，餅干，脆面包，意大利面制品，面條等。
根據(jù)本發(fā)明的生面團(tuán)可以是經(jīng)過(guò)發(fā)酵的生面團(tuán)或?qū)⑦M(jìn)行發(fā)酵的生面團(tuán)。生面團(tuán)可以以各種方式發(fā)酵，諸如通過(guò)加入碳酸氫鈉等，或通過(guò)加入合適的酵母培養(yǎng)物，諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(面包酵母)培養(yǎng)物。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶用于生產(chǎn)意大利面制品生面團(tuán)的應(yīng)用，優(yōu)選由硬質(zhì)小麥粉或相當(dāng)品質(zhì)的面粉制備而來(lái)。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶適合用于植物或食用油的酶促脫膠。在加工植物或食用油中，用根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶處理 食用或植物油，從而水解極性脂質(zhì)(如磷脂)的主要部分。優(yōu)選由極性脂質(zhì)水解得到脂肪?；Ｓ捎谒饬藰O性脂質(zhì)，如磷脂的主要部分(即超過(guò)50%)，脫膠過(guò)程通常導(dǎo)致食用油中極性脂質(zhì)，特別是磷脂的含量降低。典型地，將含水解極性脂質(zhì)(如磷脂)的水相與油分離。適宜地，食用或植物油可最初(用根據(jù)本發(fā)明的酶處理前)具有50-250ppm的磷含量。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)(優(yōu)選糖脂)以制造高價(jià)值產(chǎn)品，諸如碳水化合物酯和/或蛋白質(zhì)酯和/或蛋白質(zhì)亞基酯和/或羥酸酯中的應(yīng)用。PCT/IB2004/004374中詳述了脂肪分解酶，特別是能將酰基從極性脂質(zhì)底物(優(yōu)選糖脂)轉(zhuǎn)移至?；荏w的脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)中的應(yīng)用及其優(yōu)勢(shì)，引入本文作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明方法中的脂肪分解酶可以是固定化的。在酶是固定化的情況中，可使包含?；w、任選的?；荏w、和任選的水的混合物通過(guò)柱子，例如包含固定化酶的柱子。通過(guò)固定酶，有可能容易地重新使用它。適宜地，固定化酶可用在流動(dòng)反應(yīng)器或間歇反應(yīng)器中，其裝有包含溶于水中的脂質(zhì)酰基供體和任選的?；荏w的反應(yīng)混合物。當(dāng)存在?；荏w時(shí)，供體和受體處在兩相系統(tǒng)或乳狀液中。反應(yīng)混合物可任選經(jīng)攪拌或經(jīng)超聲波處理。例如，一旦反應(yīng)達(dá)到平衡，可以分離反應(yīng)混合物和固定化酶。適宜地，可以分餾反應(yīng)產(chǎn)物，例如通過(guò)疏水相互作用層析、結(jié)晶或高真空度蒸餾。固定化脂質(zhì)?；D(zhuǎn)移酶可利用本領(lǐng)域已知的固定技術(shù)來(lái)制備。有許多制備固定化酶的方法，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的(例如EP0746608 ;或Balcao V. M.等，Enzyme Microb Technol. 1996 年 5 月 I 日，18 (6) :392-416 ；或 Retz 等，Chem PhysLipids,1998 年 6 月，93 (1-2) :3-14 ；Bornscheuer 等，Trends Biotechnol. 2002 年 10月，20 (10) :433-7 ；Plou 等，Biotechnology, 92 (2002) :55-66 ；ffarmuth 等，1992，BioForum9 :282-283 ;Ferrer 等，2000, J. Chem. Technol. Biotechnol. 75 :1_8 ;或 Christensen等，1998, Nachwachsende RohstofflO :98-105 ；Petersen 和 Christenen, 2000, AppliedBiocatalysis,Harwood Academic Publishers,Amsterdam 中提到的技術(shù)，將每篇文獻(xiàn)引入本文作為參考)?？捎糜诒疚牡募夹g(shù)包括例如與Eupergit C共價(jià)偶聯(lián)、吸附到聚丙烯上和娃造粒。根據(jù)本發(fā)明的脂肪分解酶用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用和/或本文所述方法的脂肪分解酶優(yōu)選是至少能水解半乳糖脂和/或至少能將?；鶑陌肴樘侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物的脂肪分解酶，其中該酶由選自下組的核酸編碼a)包含SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列的核酸；
b)因遺傳密碼簡(jiǎn)并而與SEQ ID No. 3的核苷酸序列相關(guān)的核酸；和c)包含與SEQ ID No. 3所不的核苷酸序列具有至少70%同一'丨生的核苷酸序列的核酸。優(yōu)選用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用和/或本文所述方法的脂肪分解酶是包含SEQ IDNo. 4所示的氨基酸序列或與其具有至少60%同一性的氨基酸序列的脂肪分解酶。可是，用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用和/或本發(fā)明方法的脂肪分解酶可以是可從鏈霉菌屬菌種得到的任何脂肪分解酶 ，其至少能水解半乳糖脂和/或能將酰基從半乳糖脂轉(zhuǎn)移至一種或多種?；荏w底物。用于根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用和/或本發(fā)明方法的具有半乳糖脂酶活性的合適脂肪分解酶可包含以下氨基酸序列之任一和/或由以下核苷酸序列編碼ThermobifidaXfusca GDSx548aaSEQ ID No. 5ZP00058717I mlphpagerg evgaffallv gtpqdrrlrl echetrplrg rcgcgerrvp pltlpgdgvl61 cttsstrdae tvwrkhlqpr pdggfrphlg vgcllagqgs pgvlwcgreg crfevcrrdt121 pglsrtrngd ssppfragws lppkcgeisq sarktpavpr ysllrtdrpd gprgrfvgsg181 praatrrrlf lgipalvlvt altlvlavpt gretlwrmwc eatqdwclgv pvdsrgqpae241 dgeflllspv qaatwgnyya lgdsyssgdg ardyypgtav kggcwrsana ypelvaeayd301 faghlsflac sgqrgyamld aidevgsqld wnsphtslvt igiggndlgf stvlktcmvr361 vplldskact dqedairkrm akfettfeel isevrtrapd arilvvgypr ifpeeptgay421 ytltasnqrw lnetiqefnq qlaeavavhd eeiaasggvg svefvdvyha ldgheigsde481 pwvngvqlrd latgvtvdrs tfhpnaaghr avgervieqi etgpgrplya tfavvagatv541 dtlagevgSEQ ID No. 6I ggtggtgaac cagaacaccc ggtcgtcggc gtgggcgtcc aggtgcaggt gcaggttctt61 caactgctcc agcaggatgc cgccgtggcc gtgcacgatg gccttgggca ggcctgtggt121 ccccgacgag tacagcaccc atagcggatg gtcgaacggc agcggggtga actccagttc181 cgcgccttcg cccgcggctt cgaactccgc ccaggacagg gtgtcggcga cagggccgca241 gcccaggtac ggcaggacga cggtgtgctg caggctgggc atgccgtcgc gcagggcttt301 gagcacgtca cggcggtcga agtccttacc gccgtagcgg tagccgtcca cggccagcag361 cactttcggt tcgatctgcg cgaaccggtc gaggacgctg cgcaccccga agtcggggga421 acaggacgac caggtcgcac cgatcgcggc gcaggcgagg aatgcggccg tcgcctcggc481 gatgttcggc aggtaggcca cgacccggtc gccggggccc accccgaggc tgcggagggc541 cgcagcgatc gcggcggtgc gggtccgcag ttctccccag gtccactcgg tcaacggccg601 gagttcggac gcgtgccgga tcgccacggc tgatgggtca cggtcgcgga agatgtgctc661 ggcgtagttg agggtggcgc cggggaacca gacggcgccg ggcatggcgt cggaggcgag721 cactgtggtg tacggggtgg cggcgcgcac ccggtagtac tcccagatcg cggaccagaa781 tccttcgagg tcggttaccg accagcgcca cagtgcctcg tagtccggtg cgtccacacc841 gcggtgctcc cgcacccagc gggtgaacgc ggtgaggttg gcgcgttctt tgcgctcctc
901gtcgggactc cacaggatcg gcggctgcggcttgagtgtc atgaaacgcg accccttcgt961ggacggtgcg gatgcggtga gcgtcgggtgcctcccctaa cgctccccgg tgacggagtg1021ttgtgcacca catctagcac gcgggacgcggaaaccgtat ggagaaaaca cctacaaccc1081cggccggacg gtgggtttcg gccacacttaggggtcgggt gcctgcttgc cgggcagggc1141agtcccgggg tgctgtggtg cgggcgggagggctgtcgct tcgaggtgtg ccggcgggac1201actccgggcc tcagccgtac ccgcaacggggacagttctc ctcccttccg ggctggatgg1261tcccttcccc cgaaatgcgg cgagatctcccagtcagccc ggaaaacacc cgctgtgccc1321aggtactctt tgcttcgaac agacaggccggacggtccac gggggaggtt tgtgggcagc1381ggaccacgtg cggcgaccag acgacggttgttcctcggta tccccgctct tgtacttgtg1441acagcgctca cgctggtctt ggctgtcccgacggggcgcg agacgctgtg gcgcatgtgg1501tgtgaggcca cccaggactg gtgcctgggggtgccggtcg actcccgcgg acagcctgcg1561gaggacggcg agtttctgct gctttctccggtccaggcag cgacctgggg gaactattac1621gcgctcgggg attcgtactc ttcgggggacggggcccgcg actactatcc cggcaccgcg1681gtgaagggcg gttgctggcg gtccgctaacgcctatccgg agctggtcgc cgaagcctac1741gacttcgccg gacacttgtc gttcctggcctgcagcggcc agcgcggcta cgccatgctt1801gacgctatcg acgaggtcgg ctcgcagctggactggaact cccctcacac gtcgctggtg1861acgatcggga tcggcggcaa cgatctggggttctccacgg ttttgaagac ctgcatggtg1921cgggtgccgc tgctggacag caaggcgtgcacggaccagg aggacgctat ccgcaagcgg1981atggcgaaat tcgagacgac gtttgaagagctcatcagcg aagtgcgcac ccgcgcgccg2041gacgcccgga tccttgtcgt gggctacccccggatttttc cggaggaacc gaccggcgcc2101tactacacgc tgaccgcgag caaccagcggtggctcaacg aaaccattca ggagttcaac2161cagcagctcg ccgaggctgt cgcggtccacgacgaggaga ttgccgcgtc gggcggggtg2221ggcagcgtgg agttcgtgga cgtctaccacgcgttggacg gccacgagat cggctcggac2281gagccgtggg tgaacggggt gcagttgcgggacctcgcca ccggggtgac tgtggaccgc2341agtaccttcc accccaacgc cgctgggcaccgggcggtcg gtgagcgggt catcgagcag2401atcgaaaccg gcccgggccg tccgctctatgccactttcg cggtggtggc gggggcgacc2461gtggacactc tcgcgggcga ggtggggtgacccggcttac cgtccggccc gcaggtctgc2521gagcactgcg gcgatctggt ccactgcccagtgcagttcg tcttcggtga tgaccagcgg2581cggggagagc cggatcgttg agccgtgcgtgtctttgacg agcacacccc gctgcaggag2641ccgttcgcac agttctcttc cggtggccagagtcgggtcg acgtcgatcc cagcccacag2701gccgatgctg cgggccgcga ccacgccgttgccgaccagt tggtcgaggc gggcgcgcag2761cacgggggcg agggcgcgga catggtccaggtaagggccg tcgcggacga ggctcaccac2821ggcagtgccg accgcgcagg cgagggcgttgccgccgaag gtgctgccgt gctggccggg2881gcggatcacg tcgaagactt ccgcgtcgcctaccgccgcc gccacgggca ggatgccgcc2941gcccagcgct ttgccgaaca ggtagatatcggcgtcgact ccgctgtggt cgcaggcccg//Thermobif ida\fusca\-GDSxSEQ ID No. 7I vgsgpraatr rrlflgipal vlvtaltlvl avptgretlw rmwceatqdw clgvpvdsrg
權(quán)利要求
1.制備溶血糖脂的方法，所述方法包括用至少一種脂肪分解酶處理含糖脂的底物來(lái)產(chǎn)生所述溶血糖脂，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從棒桿菌屬得到。
2.生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價(jià)值產(chǎn)品的方法，所述方法包括用可從棒桿菌屬得到的脂肪分解酶處理所述極性脂質(zhì)來(lái)產(chǎn)生所述高價(jià)值產(chǎn)品，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述高價(jià)值產(chǎn)品是以下一種或多種碳水化合物酯、蛋白質(zhì)酷、蛋白質(zhì)亞基酷和輕酸酷。
4.制備食品的方法，所述方法包括將至少一種脂肪分解酶與食品的一種或多種成分混合，其中所述脂肪分解酶能水解存在于至少一種所述成分中的糖脂或能水解作為至少一種所述成分的糖脂，且其中所述脂肪分解酶可從棒桿菌屬得到。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之任何一項(xiàng)的方法，其中所述脂肪分解酶能將?；鶑奶侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之任何一項(xiàng)的方法，其中所述脂肪分解酶的氨基酸序列如SEQ.ID. No. 8所示或與SEQ. ID. No. 8具有至少70%同一性，或由SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列編碼或由與SEQ ID No. 9具有至少70%同一性的核苷酸序列編碼。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述脂肪分解酶的氨基酸序列如SEQ.ID. No. 8所示或由SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列編碼。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述食品選自以下一種或多種蛋，基于蛋的產(chǎn)品，包括但不限于蛋黃醬，色拉調(diào)味品，沙司，冰激凌，蛋粉，改良蛋黃及其制成品；焙烤品，包括面包，蛋糕，甜面團(tuán)產(chǎn)品，疊層面團(tuán)產(chǎn)品，液態(tài)奶蛋糊，松餅，油炸圈餅，餅干，薄脆餅干和曲奇餅；糖果，包括巧克力，糖果，飴糖，halawa，膠皮糖，包括無(wú)糖和加糖膠皮糖，泡泡糖，軟泡泡糖，口香糖和布丁 ；冷凍產(chǎn)品，包括冰糕，優(yōu)選冷凍乳制品，包括冰激凌和牛奶凍；乳制品，包括奶酪，黃油，牛奶，稀奶油，生奶油，乳蛋糕乳脂，乳飲料和酸牛奶；慕思，生植物奶油，肉制品，包括經(jīng)加工的肉制品；食用油和脂肪，攪打起泡和不起泡的產(chǎn)品，水包油乳狀液，油包水乳狀液，人造黃油，起酥油和涂抹食品，包括低脂肪的和極低脂肪的涂抹物；調(diào)味品，蛋黃醬，蘸料，基于奶油的沙司，基于奶油的湯，飲料，香料乳狀液和沙司。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述食品是焙烤品，且至少一種所述成分是生面團(tuán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述食品是蛋或基于蛋的產(chǎn)品。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述食品是乳制品。
12.脂肪分解酶在底物中用于制備溶血糖脂的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶具有糖脂酶活性，且其中所述脂肪分解酶可從棒桿菌屬得到。
13.脂肪分解酶在生物轉(zhuǎn)化極性脂質(zhì)以制造高價(jià)值產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解所述極性脂質(zhì)，且其中所述脂肪分解酶可從棒桿菌屬得到。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的應(yīng)用，其中所述高價(jià)值產(chǎn)品是以下一種或多種碳水化合物酯、蛋白質(zhì)酷、蛋白質(zhì)亞基酷和輕酸酷。
15.可從棒桿菌屬得到的脂肪分解酶在制備食品中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15之任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能將?；鶑奶侵D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物。
17.根據(jù)權(quán)利要求12至16之任何一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶的氨基酸序列如SEQ. ID. No. 8所示或與SEQ. ID. No. 8具有至少70%同一性，或由SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列編碼或由與SEQ ID No. 9具有至少70%同一性的核苷酸序列編碼。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶的氨基酸序列如SEQ.ID. No. 8所示或由SEQ ID No. 9所示的核苷酸序列編碼。
19.根據(jù)權(quán)利要求12的應(yīng)用，其中所述溶血糖脂是DGMG或MGMG。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述食品是乳制品。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的應(yīng)用，其中所述食品是蛋或基于蛋的產(chǎn)品，且其中所述脂肪分解酶能將?；D(zhuǎn)移至一種或多種酰基受體底物以降低一種或多種以下有害效應(yīng)臭味和/或異味和/或油膩口味。
22.根據(jù)權(quán)利要求15的應(yīng)用，其中所述食品是焙烤品。
全文摘要
本發(fā)明涉及可從棒桿菌屬(Corynebacterium)得到的脂肪分解酶在各種方法和用途中的應(yīng)用，其中所述脂肪分解酶能水解糖脂或磷脂或者將酰基從糖脂或磷脂轉(zhuǎn)移至?；荏w。優(yōu)選地，應(yīng)用于這些方法和用途中的脂肪分解酶包含SEQ.ID.No.8所示的氨基酸序列或與其具有至少70%同一性的氨基酸序列，或包含SEQ ID No.9所示的核苷酸序列或與其具有至少70%同一性的核苷酸序列。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102876739SQ201210258079
公開(kāi)日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2005年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月16日
發(fā)明者安德雷·米亞斯尼科夫, 喬恩·B·索, 喬恩·D·米凱爾森, 米拉·波夫萊南, 弗夫·皮特卡南 申請(qǐng)人:杜邦營(yíng)養(yǎng)生物科學(xué)有限公司