專利名稱：解脂耶氏酵母的高花生四烯酸酸生產(chǎn)菌株的制作方法
本申請(qǐng)要求2004年11月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/624812的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及含油酵母解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的工程化菌株，它能夠以高濃度有效生產(chǎn)花生四烯酸(一種ω-6多不飽和脂肪酸)。

背景技術(shù)：
花生四烯酸(ARA；順式-5，8，11，14-二十碳四烯酸；ω-6)是生產(chǎn)類二十烷酸(如前列腺素、血栓烷、前列環(huán)素和leukot)的重要前體。此外，ARA被認(rèn)為是(1)一種必須的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)；(2)人腦中的主要ω-6脂肪酸；(3)母乳和很多嬰兒配方中的重要成分，這是基于它在早期神經(jīng)和視覺(jué)發(fā)育中的作用。盡管成人很容易從食物，如肉類、蛋和乳中獲得ARA(并且也可以從飲食亞麻酸(LA)低效合成ARA)，但ARA油的商業(yè)來(lái)源典型地由天然植物來(lái)源(如被孢霉(絲狀真菌)屬、蟲霉屬、腐霉屬和Porphyridium(紅藻)的微生物)生產(chǎn)。最值得注意的是，Martek Biosciences Corporation(Columbia，MD)生產(chǎn)一種含ARA的真菌油(

U.S.5,658,767)，其基本不含EPA，并且來(lái)源于高山被孢霉或Pythiuminsidiuosum。這種油的主要市場(chǎng)之一是嬰兒配方；例如，含有Martek公司的ARA油的配方目前在世界范圍內(nèi)的60多個(gè)國(guó)家可以獲得。
盡管可以從例如上文描述的天然微生物來(lái)源獲得ARA，預(yù)計(jì)用重組方法通過(guò)微生物生產(chǎn)ARA相對(duì)于從天然微生物來(lái)源生產(chǎn)具有一些優(yōu)點(diǎn)。例如，可以使用具有用于生產(chǎn)油的優(yōu)選特征的重組微生物，因?yàn)橥ㄟ^(guò)在宿主中導(dǎo)入新的生物合成途徑和/或通過(guò)阻抑不需要的途徑，可以改變宿主的天然存在的微生物脂肪酸譜，從而導(dǎo)致需要的PUFAs(或其共軛形式)的生產(chǎn)水平增加和不需要的PUFAs的生產(chǎn)減少。其次，重組微生物可以提供特定形式的PUFAs，其可能具有特定用途。最后，可以通過(guò)控制培養(yǎng)條件操作微生物油生產(chǎn)，特別是通過(guò)提供微生物表達(dá)的酶的特定底物來(lái)源，或通過(guò)加入化合物/基因工程，以阻抑不需要的生物化學(xué)途徑。因此，例如，可以改變?nèi)绱水a(chǎn)生的ω-3與ω-6脂肪酸的比例，或工程生產(chǎn)特定PUFA(如ARA)，而不顯著積累其它PUFA下游或上游產(chǎn)物。后一種可能性在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中特別感興趣，其中需要含有高濃度ARA的微生物油的重組來(lái)源，該微生物油額外地缺乏γ-亞麻酸(GLA；γ-亞麻酸；順式-6，9，12-十八碳三烯酸；ω-6)。
GLA是從LA生物合成具有生物活性的前列腺素的重要中間體。盡管GLA也被認(rèn)為是具有顯著臨床、生理和藥物價(jià)值的必需ω-6PUFA，存在一些應(yīng)用，其中GLA與ARA起相反作用。因此，商業(yè)生產(chǎn)包含ARA并且不含GLA的油將在某些應(yīng)用中有用。
大多數(shù)微生物生產(chǎn)的ARA是通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑(其主要存在于藻類、苔蘚、真菌、線蟲和人類)合成的，并且其中1.)通過(guò)Δ12去飽和酶的作用，油酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)A；2.)通過(guò)Δ6去飽和酶的作用，LA轉(zhuǎn)化為GLA；3.)通過(guò)C18/20延伸酶的作用，GLA轉(zhuǎn)化為DGLA；和4.)通過(guò)Δ5去飽和酶的作用，DGLA轉(zhuǎn)化為ARA(

圖1)。但是，在一些生物，如類眼蟲鞭毛藻物種中，具有用于合成EPA的替代的Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑，它是形成C20PUFAs的主要途徑(Wallis，J.G.，and Browse，J.Arch.Biochem.Biophys.365307-316(1999)；WO 00/34439；和Qi，B.et al.FEBS Letters.510159-165(2002))。在此途徑中，通過(guò)Δ9延伸酶，LA轉(zhuǎn)化為EDA，通過(guò)Δ8去飽和酶，EDA轉(zhuǎn)化為DGLA，DGLA最終轉(zhuǎn)化為ARA。
盡管目前已經(jīng)從多種生物鑒定和表征了編碼Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶和Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑的基因，并且其中的一些已經(jīng)與其它PUFA去飽和酶和延伸酶一起異源表達(dá)，但這兩種途徑都還沒(méi)有導(dǎo)入微生物，如酵母，并且通過(guò)復(fù)雜代謝工程進(jìn)行操作，使得能夠商業(yè)生產(chǎn)商業(yè)量的EPA(即大于總脂肪酸的10％)。此外，關(guān)于這些工程化的宿主生物的最合適的選擇，還存在顯著的分歧。
最近，Picataggio et al.(WO 2004/101757和共同未決的美國(guó)專利No.60/624812)開(kāi)發(fā)了含油酵母，特別是解脂耶氏酵母(以前分類為解脂假絲酵母)作為用于生產(chǎn)PUFAs如ARA和EPA的微生物的優(yōu)選類型的用途。含油酵母定義為天然能夠合成并積累油的酵母，其中油的積累可以是細(xì)胞干重的最多大約80％。盡管這些生物中ω-6和ω-3脂肪酸的生產(chǎn)存在天然缺陷(由于天然生產(chǎn)的PUFAs限于18:2脂肪酸(較不常見(jiàn)是18:3脂肪酸))，Picataggio等人(上文)用相對(duì)簡(jiǎn)單的基因工程方法證明了在解脂耶氏酵母中生產(chǎn)了1.3％ ARA和1.9％ EPA(占總脂肪酸的比例)。但是，還沒(méi)有實(shí)施更復(fù)雜的代謝工程化以便能夠在這種特定宿主生物中進(jìn)行ARA的經(jīng)濟(jì)的商業(yè)化生產(chǎn)。
申請(qǐng)人:通過(guò)采用Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑，通過(guò)對(duì)能夠生產(chǎn)總油級(jí)分的10-14％的ARA的解脂耶氏酵母菌株的工程化菌株解決了指出的問(wèn)題(從而生產(chǎn)含有25-29％ GLA的10-11％ ARA油或不含GLA的10-11％ ARA油)。提供了其它代謝工程化和發(fā)酵方法，以便進(jìn)一步增強(qiáng)這些含油酵母中的ARA生產(chǎn)。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及具有用于生產(chǎn)花生四烯酸的酶途徑的耶氏酵母屬的重組生產(chǎn)宿主。
因此，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因 a)至少一種編碼Δ6去飽和酶的基因； b)至少一種編碼C18/20延伸酶的基因；和 c)至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因； 其中所述ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑基因中的至少一種基因是超量表達(dá)的。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因 a)至少一種編碼Δ9延伸酶的基因； b)至少一種編碼Δ8去飽和酶的基因；和 c)至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因； 其中所述ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑基因中的至少一種基因是超量表達(dá)的。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組生產(chǎn)宿主還包含額外的途徑成分，包括但不限于至少一種編碼Δ12去飽和酶的基因；至少一種編碼Δ9去飽和酶的基因；至少一種編碼C16/18延伸酶的基因；至少一種編碼C14/16延伸酶的基因；和至少一種編碼?；D(zhuǎn)移酶的基因。
在一種特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因 a)至少一種編碼Δ6去飽和酶的基因；和 b)至少一種編碼C18/20延伸酶的基因；和 c)至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因；和 d)至少一種編碼Δ12去飽和酶的基因； 其中該背景耶氏酵母種不含任何編碼蘋果酸異丙酯脫氫酶(Leu2-)的天然基因；并且 其中所述ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑基因中的至少一種基因是超量表達(dá)的。
在另一種特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因 a)至少一種編碼Δ9延伸酶的基因；和 b)至少一種編碼Δ8去飽和酶的基因；和 c)至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因；和 d)至少一種編碼Δ12去飽和酶的基因；和 e)至少一種編碼C16/18延伸酶的基因； 其中該背景耶氏酵母種不含任何編碼酵母氨酸脫氫酶(Lys5-)的天然基因；并且 其中所述ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑基因中的至少一種基因是超量表達(dá)的。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)包含花生四烯酸的微生物油的方法，包括 a)培養(yǎng)權(quán)利要求1或2的生產(chǎn)宿主，其中生產(chǎn)了包含花生四烯酸的微生物油；和 b)任選回收步驟(a)的微生物油。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了食品，其中包含有效量的通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的微生物油。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了選自下組的產(chǎn)品醫(yī)學(xué)食物、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物、嬰兒配方和藥物，其中包含有效量的通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的微生物油。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了動(dòng)物飼料，其中包含有效量的通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的微生物油。
本發(fā)明還提供了提供制備補(bǔ)充了花生四烯酸的產(chǎn)品、食品或飼料的方法，包括將本發(fā)明的方法生產(chǎn)的微生物油與產(chǎn)品、食品或飼料混合。
在另一種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了提供富含花生四烯酸(ARA)的人、動(dòng)物或水產(chǎn)養(yǎng)殖生物飲食補(bǔ)充物的方法，包括提供通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的含花生四烯酸的微生物油，該微生物油是可被人或動(dòng)物消耗或使用的形式。
生物保藏
以下生物材料保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，具有以下名稱、保藏號(hào)和保藏日。
生物材料 保藏號(hào) 保藏日
質(zhì)粒pY89-5 ATCC PTA-6048 2004年6月4日
解脂耶氏酵母Y2047 ATCC PTA-___ 附圖簡(jiǎn)述和序列說(shuō)明 圖1表示ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑。
圖2是含油酵母中脂質(zhì)積累的生化機(jī)理的示意圖。
圖3是描述多種酰基轉(zhuǎn)移酶在含油酵母中的脂質(zhì)積累中的作用的示意圖。
圖4描繪了產(chǎn)生總脂質(zhì)級(jí)分中的多種脂肪酸(包括ARA)的本發(fā)明的一些解脂耶氏酵母菌株的開(kāi)發(fā)圖。
圖5A提供了pY5-30的質(zhì)粒圖。圖5B說(shuō)明了通過(guò)組化染色確定的解脂耶氏酵母ATCC #76982菌株中TEF、GPD、GPM、FBA和FBAIN的相對(duì)啟動(dòng)子活性。圖5C說(shuō)明了通過(guò)組化染色確定的、多種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的解脂耶氏酵母中YAT1、TEF、GPAT和FBAIN的相對(duì)啟動(dòng)子活性。
圖6A是比較解脂耶氏酵母ATCC #76982菌株中GPD、GPM、FBA和FBAIN的啟動(dòng)子活性的圖，所述活性是熒光分析確定的。圖6B圖示概括了實(shí)時(shí)PCR相對(duì)定量的結(jié)果，其中將解脂耶氏酵母ATCC#76982菌株(即表達(dá)GPD::GUS、GPDIN::GUS、FBA::GUS或FBAIN::GUS嵌合基因)中的GUS mRNA定量到表達(dá)pY5-30(即嵌合TEF::GUS基因)的解脂耶氏酵母菌株的mRNA水平。
圖7提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pY57.Yl.AHAS.w4971；(B)pKUNF12T6E；(C)pDMW232；和(D)pDMW271。
圖8提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pKUNT2；(B)pZUF17；(C)pDMW237；(D)pDMW240；和(E)酵母表達(dá)載體pY89-5。
圖9顯示了纖細(xì)眼蟲細(xì)胞提取物的脂質(zhì)譜的色譜圖。
圖10顯示了多種纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶多肽序列的比對(duì)。采用的比對(duì)方法相應(yīng)于“Clustal V比對(duì)法”。
圖11提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pKUNFmKF2；(B)pDMW277；(C)pZF5T-PPC；(D)pDMW287F；和(E)pDMW297。
圖12提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pZP2C16M899；(B)pDMW314；(C)pDM322；和(D)pZKL5598。
圖13提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pZP3L37；(B)pY37/F15；(C)pKO2UF2PE；和(D)pZKUT16。
圖14提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pKO2UM25E；(B)pZKUGPI5S；(C)pDMW302T16；和(D)pZKUGPE1S。
圖15提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pKO2UM26E；(B)pZUF-Mod-1；(C)pMDAGAT1-17；和(D)pMGPAT-17。
圖16圖示了SEQ ID NOs97，98，99，100，101，102，103，104，105，106和107之間的關(guān)系，其中的每一個(gè)序列都與高山被孢霉中的甘油-3-磷酸o-?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)相關(guān)。
圖17圖示了SEQ ID NOs53，54，55，56，57，58，59和60之間的關(guān)系，其中的每一個(gè)序列都與高山被孢霉中的C16/18脂肪酸延伸酶(ELO3)相關(guān)。
圖18提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pZUF6S；(B)pZUF6S-E3WT；(C)pZKUGPYE1-N；和(D)pZKUGPYE2。
圖19提供了以下質(zhì)粒的質(zhì)粒圖(A)pZKUGPYE1；(B)pZUF6FYE1；(C)pZP217+Ura；(D)pY20；和(E)pLV13。
通過(guò)以下的詳細(xì)說(shuō)明和所附的序列說(shuō)明能夠更全面地理解本發(fā)明，這些內(nèi)容構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。
以下序列符合37 C.F.R.§1.821-1.825的規(guī)定(“Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or AminoAcid Sequence Disclosures-the Sequence Rules”)，并且，符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(Rules 5.2 and 49.5(a-bis)，and Section 208 and Annex Cof the Administrative Instructions)。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式符合37 C.F.R.§1.822的規(guī)定。
SEQ ID NOs1-112，158-168，209，252，255和357-364是編碼表1中所列的啟動(dòng)子、基因或蛋白(或其片段)的ORFs。
表1 基因和蛋白序列號(hào)的概括 SEQ ID NOs113-157是表2中指出的質(zhì)粒。
表2 質(zhì)粒序列號(hào)的概括 SEQ ID NO356相應(yīng)于在耶氏酵母種中優(yōu)化表達(dá)的基因的密碼子優(yōu)化的翻譯起始位點(diǎn)。
SEQ ID NOs169-182分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增解脂耶氏酵母啟動(dòng)子區(qū)的引物YL211，YL212，YL376，YL377，YL203，YL204，GPAT-5-1，GPAT-5-2，ODMW314，YL341，ODMW320，ODMW341，27203-F和27203-R。
SEQ ID NOs183-186分別是用于實(shí)時(shí)分析的寡核苷酸YL-URA-16F，YL-URA-78R，GUS-767F和GUS-891R。
SEQ ID NOs187-202相應(yīng)于8對(duì)寡核苷酸，其一起包括球等鞭金藻Δ9延伸酶的完整的密碼子優(yōu)化的編碼區(qū)(即分別是IL3-1A，IL3-1B，IL3-2A，IL3-2B，IL3-3A，IL3-3B，IL3-4A，IL3-4B，IL3-5A，IL3-5B，IL3-6A，IL3-6B，IL3-7A，IL3-7B，IL3-8A和IL3-8B)。
SEQ ID NOs203-206分別相應(yīng)于用于在密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因的合成過(guò)程中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物IL3-1F，IL3-4R，IL3-5F和IL3-8R。
SEQ ID NO207是描述于pT9(1-4)的417bp NcoI/PstI片段，SEQ ID NO208是描述于pT9(5-8)的377bp PstI/Not1片段。
SEQ ID NOs210-235相應(yīng)于13對(duì)寡核苷酸，其一起包括纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶的完整的密碼子優(yōu)化的編碼區(qū)(即分別是D8-1A，D8-1B，D8-2A，D8-2B，D8-3A，D8-3B，D8-4A，D8-4B，D8-5A，D8-5B，D8-6A，D8-6B，D8-7A，D8-7B，D8-8A，D8-8B，D8-9A，D8-9B，D8-10A，D8-10B，D8-11A，D8-11B，D8-12A，D8-12B，D8-13A和D8-13B)。
SEQ ID NOs236-243分別相應(yīng)于用于在密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因的合成過(guò)程中進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物D8-1F，D8-3R，D8-4F，D8-6R，D8-7F，D8-9R，D8-10F和D8-13R。
SEQ ID NO244是描述于pT8(1-3)的309bp Nco/BgIII片段；SEQ ID NO245是描述于pT8(4-6)的321bp BgIII/XhoI片段；SEQID NO246是描述于pT8(7-9)的264bp XhoI/SacI片段；SEQ IDNO247是描述于pT8(10-13)的369bp Sac1/Not1片段。
SEQ ID NOs248和249分別相應(yīng)于在pDMW255中合成D8S-2的過(guò)程中使用的引物ODMW390和ODMW391。
SEQ ID NOs250和251是實(shí)施例7中描述的嵌合D8S-1::XPR和D8S-2::XPR基因。
SEQ ID NOs253和254相應(yīng)于D8S-3的合成過(guò)程中使用的引物ODMW392和ODMW393。
SEQ ID NOs256和257分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶的引物Eg5-1和Eg3-3。
SEQ ID NOs258-261相應(yīng)于用于對(duì)Δ8去飽和酶克隆進(jìn)行測(cè)序的引物T7，M13-28Rev，Eg3-2和Eg5-2。
SEQ ID NO262相應(yīng)于用于擴(kuò)增D8S-3的引物ODMW404。
SEQ ID NO263是包含D8S-3的1272bp嵌合基因。
SEQ ID NOs264和265分別相應(yīng)于用于在克隆的D8S-3基因中建立新的限制酶位點(diǎn)的引物YL521和YL522。
SEQ ID NOs266-279分別相應(yīng)于用于定點(diǎn)誘變反應(yīng)中，以產(chǎn)生D8SF的引物YL525，YL526，YL527，YL528，YL529，YL530，YL531，YL532，YL533，YL534，YL535，YL536，YL537和YL538。
SEQ ID NO280是突變AHAS基因，其包含W497L突變。
SEQ ID NOs281-283分別相應(yīng)于BD-Clontech Creator

cDNA文庫(kù)試劑盒引物SMART IV寡核苷酸，CDSIII/3’PCR引物和5’-PCR引物。
SEQ ID NO284相應(yīng)于用于高山被孢霉cDNA文庫(kù)測(cè)序的M13正向引物。
SEQ ID NOs285-288和290-291分別相應(yīng)于用于克隆高山被孢霉LPAAT2 ORF的引物MLPAT-F，MLPAT-R，LPAT-Re-5-1，LPAT-Re-5-2，LPAT-Re-3-1和LPAT-Re-3-2。
SEQ ID NOs289和292分別相應(yīng)于解脂耶氏酵母LPAAT1 ORF的5’(1129bp)和3’(938bp)區(qū)。
SEQ ID NOs293和294分別相應(yīng)于用于建立pZUF-MOD-1“對(duì)照”質(zhì)粒的引物pzuf-mod1和pzuf-mod2。
SEQ ID NOs295和296分別相應(yīng)于用于克隆高山被孢霉DGAT1ORF的引物MACAT-F1和MACAT-R。
SEQ ID NOs297和298分別相應(yīng)于用于克隆高山被孢霉DGAT2ORF的引物MDGAT-F和MDGAT-R1。
SEQ ID NOs299和300分別相應(yīng)于用于簡(jiǎn)并PCR中，以擴(kuò)增高山被孢霉GPAT的引物MGPAT-N1和MGPAT-NR5。
SEQ ID NOs301-303分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增高山被孢霉GPAT的3’末端的引物MGPAT-5N1，MGPAT-5N2和MGPAT-5N3。
SEQ ID NOs304和305相應(yīng)于用于基因組步移(genome-walking)中的、來(lái)自ClonTech的Universal GenomeWalkerTM試劑盒的Genome Walker銜接子。
SEQ ID NOs306-309分別相應(yīng)于用于基因組步移中的PCR引物::MGPAT-5-1A，Adaptor-1(AP1)，MGPAT-3N1和Nested AdaptorPrimer 2(AP2)。
SEQ ID NOs310和311分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增高山被孢霉GPAT的引物mgpat-cdna-5和mgpat-cdna-R。
SEQ ID NOs312和313分別相應(yīng)于用于基因組步移中，以分離高山被孢霉ELO3的3’末端區(qū)的引物MA Elong 3’1和MA elong 3’2。
SEQ ID NOs314和315分別相應(yīng)于用于基因組步移中，以分離高山被孢霉ELO3的5’末端區(qū)的引物MA Elong 5’1和MA elong 5’2。
SEQ ID NOs316和317分別相應(yīng)于用于從高山被孢霉cDNA擴(kuò)增完整ELO3的引物MA ELONG 5’NcoI 3和MA ELONG 3’NotI 1。
SEQ ID NOs318和319分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增解脂耶氏酵母YE2的編碼區(qū)的引物YL597和YL598。
SEQ ID NOs320-323分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增解脂耶氏酵母YE1的編碼區(qū)的引物YL567，YL568，YL569和YL570。
SEQ ID NOs324和325分別相應(yīng)于用于克隆解脂耶氏酵母YE1的過(guò)程中的定點(diǎn)誘變的引物YL571和YL572。
SEQ ID NOs326和327分別相應(yīng)于用于克隆解脂耶氏酵母CPT1ORF的引物CPT1-5’-NcoI和CPT1-3’-NotI。
SEQ ID NOs328和329分別相應(yīng)于用于克隆啤酒糖酵母ISC1ORF的引物Isc1F和Isc1R。
SEQ ID NOs330和331分別相應(yīng)于用于克隆啤酒糖酵母PCL1ORF的引物Pcl1F和Pcl1R。
SEQ ID NOs332-335分別相應(yīng)于用于解脂耶氏酵母DGAT2基因的靶定破壞的引物P95，P96，P97和P98。
SEQ ID NOs336-338分別相應(yīng)于用于篩選破壞的解脂耶氏酵母DGAT2基因的靶定整合的引物P115，P116和P112。
SEQ ID NOs339-342分別相應(yīng)于用于解脂耶氏酵母PDAT基因的靶定破壞的引物P39，P41，P40和P42。
SEQ ID NOs343-346分別相應(yīng)于用于篩選破壞的解脂耶氏酵母PDAT基因的靶定整合的引物P51，P52，P37和P38。
SEQ ID NOs347和348分別是用于分離解脂耶氏酵母DGAT1的鑒定為P201和P203的簡(jiǎn)并引物。
SEQ ID NOs349-353分別相應(yīng)于用于建立導(dǎo)向盒的引物P214，P215，P216，P217和P219，所述導(dǎo)向盒用于解脂耶氏酵母中推定的DGAT1基因的靶定破壞。
SEQ ID NOs354和355分別相應(yīng)于用于篩選破壞的解脂耶氏酵母DGAT1基因的靶定整合的引物P226和P227。
SEQ ID NOs365-370分別相應(yīng)于用于合成突變的解脂耶氏酵母AHAS基因的引物410，411，412，413，414和415，所述突變基因包含W497L突變。
SEQ ID NOs371和372分別相應(yīng)于用于擴(kuò)增包含Aco3’終止子的NotI/PacI片段的引物YL325和YL326。
SEQ ID NO373相應(yīng)于存在于真菌Δ15和Δ12去飽和酶中的HisBox1基序。
SEQ ID NO374相應(yīng)于表明具有Δ15去飽和酶活性的真菌蛋白的基序，而SEQ ID NO406相應(yīng)于表明具有Δ12去飽和酶活性的真菌蛋白的基序。
發(fā)明詳述 在此全文引入本文引用的所有專利、專利申請(qǐng)和公開(kāi)文獻(xiàn)作為參考。這特別包括了申請(qǐng)人的受讓人的以下共同未決的申請(qǐng) 美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/840478(2004年5月6日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/840579(2004年5月6日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/840325(2004年5月6日提交) 美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/869630(2004年6月16日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/882760(2004年7月1日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/985109(2004年11月10日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/987548(2004年11月12日提交) 美國(guó)專利申請(qǐng)No.60/624812(2004年11月4日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/024545和No.11/024544(2004年12月29日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.60/689031(2005年6月9日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/183664(2005年7月18日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/185301(2005年7月20日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/190750(2005年7月27日提交)， 美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/225354(2005年9月13日提交)，CL2823和CL3027。
根據(jù)本發(fā)明，申請(qǐng)人提供了能夠生產(chǎn)大于10％花生四烯酸(ARA，20:4，ω-6)的解脂耶氏酵母的生產(chǎn)宿主菌株。該特定多不飽和脂肪酸(PUFA)的積累是通過(guò)導(dǎo)入兩個(gè)不同的功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑中的任意一個(gè)而實(shí)現(xiàn)的。第一個(gè)途徑包括將具有Δ6去飽和酶、C18/20延伸酶和Δ5去飽和酶活性的蛋白導(dǎo)入含油酵母以進(jìn)行高水平重組表達(dá)，其中所述ARA油也包括GLA；后一個(gè)途徑包括具有Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶和Δ5去飽和酶活性的蛋白，從而使得能夠生產(chǎn)不含任何GLA的ARA油。因此，本公開(kāi)內(nèi)容證明了可以對(duì)解脂耶氏酵母進(jìn)行工程化，使得能夠商業(yè)生產(chǎn)ARA及其衍生物。也要求保護(hù)生產(chǎn)方法。
本發(fā)明具有多種用途。通過(guò)本文所描述的方法制備的PUFAs，或其衍生物可被用作飲食代用品，或補(bǔ)充物，特別是嬰兒配方，用于靜脈內(nèi)喂飼的患者或用于預(yù)防或治療營(yíng)養(yǎng)不良。另外，可以將純化的PUFAs(或其衍生物)摻入烹飪油、脂肪，或配制的人造奶油中，以便在正常使用時(shí)，受體能接受到所需數(shù)量的飲食補(bǔ)充。還可將PUFAs摻入嬰兒配方，營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物或其他食品中，并且可以用作抗炎劑或降膽固醇劑?？扇芜x將所述組合物用于藥物學(xué)用途(人或獸醫(yī))。在這種場(chǎng)合下，PUFAs通常是口服的，不過(guò)，可以通過(guò)能夠成功地吸收它們的任何途徑施用，例如，腸胃外(例如皮下，肌內(nèi)或靜脈內(nèi))、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)或局部(例如，作為皮膚油膏或洗液)。
給人或動(dòng)物補(bǔ)充通過(guò)重組方法生產(chǎn)的PUFAs，可以得到水平增加的添加的PUFAs，以及它們的代謝產(chǎn)物。例如，用ARA治療，不僅能夠產(chǎn)生水平增加的ARA，而且還能產(chǎn)生ARA的下游產(chǎn)物，如類二十烷酸。復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制，可能需要組合各種PUFAs，或者添加PUFAs的不同的共軛物，以便預(yù)防、控制或克服這樣的機(jī)制，以便在個(gè)體內(nèi)獲得理想水平的特定的PUFAs。
在其它實(shí)施方案中，通過(guò)本文公開(kāi)的方法制備的PUFAs或其衍生物可以用于合成水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料(即干飼料、半濕飼料和濕飼料)，因?yàn)檫@些配方通常需要至少1-2％的營(yíng)養(yǎng)組分是ω-3和/或ω-6 PUFAs。
定義 在本說(shuō)明書中，使用了多種術(shù)語(yǔ)和縮寫。提供了以下定義。
“可讀框“縮寫為ORF。
“聚合酶鏈反應(yīng)”縮寫為PCR。
“美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”縮寫為ATCC。
“多不飽和脂肪酸”縮寫為PUFA(s)。
“二?；视王；D(zhuǎn)移酶”縮寫為DAG AT或DGAT。
“磷脂二?；视王；D(zhuǎn)移酶”縮寫為PDAT。
“甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶”縮寫為GPAT。
“溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶”縮寫為L(zhǎng)PAAT。
“酰基-CoA1-?；苎字Ｄ憠A?；D(zhuǎn)移酶”縮寫為“LPCAT”。
“?；?CoA固醇-酰基轉(zhuǎn)移酶”縮寫為ARE2。
“二酰基甘油”縮寫為DAG。
“三?；视汀笨s寫為TAGs。
“輔酶A”縮寫為CoA。
“磷脂酰膽堿”縮寫為PC。
術(shù)語(yǔ)“串珠鐮孢(Fusarium moniliforme)”與“Fusariumverticillioides”同義。
術(shù)語(yǔ)“食品”是指任何通常適于人類消耗的食物。典型的食品包括但不限于，肉產(chǎn)品、谷物產(chǎn)品、烘烤食品、快餐、乳制品等。
術(shù)語(yǔ)“功能性食品”是指包括可能有益健康的產(chǎn)品的食品，包括任何改良的食品或成分，其可提供超過(guò)它所包含的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的健康益處。功能性食品可以包括諸如谷物、面包和飲料的食品，其可以用維生素、草藥和營(yíng)養(yǎng)品進(jìn)行強(qiáng)化。功能性食品含有提供超過(guò)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的健康益處的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)殖天然存在于食品中或是有意添加的。
此處用到的術(shù)語(yǔ)“醫(yī)學(xué)食品”是指經(jīng)過(guò)配制，以便在醫(yī)生的監(jiān)督下食用或施用的食品，其意欲用于具有獨(dú)特營(yíng)養(yǎng)需要的疾病或狀況的特殊飲食控制，所述食用或施用是基于例如醫(yī)學(xué)評(píng)估確立的公知科學(xué)原理[參見(jiàn)Orphan Drug Act(21 U.S.C.360ee(b)(3))的5(b)部分]。僅僅當(dāng)滿足以下條件時(shí)，食品是“醫(yī)學(xué)食品”(i)它是特殊配制并且加工的產(chǎn)品(與以天然狀態(tài)使用的天然食料不同)，用于通過(guò)口服或通過(guò)胃管進(jìn)行的腸道喂飼對(duì)患者進(jìn)行部分或全面喂飼；(ii)它意欲用于患者的營(yíng)養(yǎng)控制，所述患者由于治療或長(zhǎng)期醫(yī)學(xué)需要，攝取、消化、吸收或代謝常規(guī)食料或某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力受限或受損，或具有其它特殊的醫(yī)學(xué)決定的營(yíng)養(yǎng)需要，所述患者的營(yíng)養(yǎng)控制可以通過(guò)對(duì)單獨(dú)的正常飲食的改變而實(shí)現(xiàn)；(iii)它提供營(yíng)養(yǎng)支持，所述營(yíng)養(yǎng)支持針對(duì)獨(dú)特營(yíng)養(yǎng)需要的控制進(jìn)行了特殊改變，所述獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)需要是通過(guò)醫(yī)學(xué)評(píng)估確定的特定疾病或狀況導(dǎo)致的；(iv)它意欲在醫(yī)學(xué)監(jiān)督下使用；和(v)它僅僅意欲用于接受活躍和進(jìn)行中的醫(yī)學(xué)監(jiān)督的患者，其中所述患者需要反復(fù)的醫(yī)學(xué)監(jiān)督，包括但不限于對(duì)醫(yī)學(xué)食品使用的說(shuō)明。因此，與飲食補(bǔ)充物或常規(guī)食品不同，醫(yī)學(xué)食品意欲用于對(duì)疾病或狀況進(jìn)行特殊的飲食控制，對(duì)所述疾病或狀況建立了獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)需要，所述醫(yī)學(xué)食品可能滿足與給特定疾病或狀況提供獨(dú)特營(yíng)養(yǎng)支持相關(guān)的科學(xué)上有效的要求。通過(guò)醫(yī)學(xué)食品在醫(yī)學(xué)監(jiān)督下使用的要求，醫(yī)學(xué)食品可以與廣泛類別的特定飲食用途的食品(如低變應(yīng)原性食品)和滿足健康要求的食品(如營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物)區(qū)別。
術(shù)語(yǔ)“醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)品”是指本文所定義的醫(yī)學(xué)食品，典型地是指特別設(shè)計(jì)用于特定飲食需要的強(qiáng)化飲料。醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)品通常包含針對(duì)特定醫(yī)學(xué)或營(yíng)養(yǎng)狀況的飲食組分。商購(gòu)的醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)品的實(shí)例包括但不限于

和
本文用到的術(shù)語(yǔ)“藥物”是指一種化合物或物質(zhì)，如果在美國(guó)出售，必須受到聯(lián)邦食品、藥品和化妝品法案的505或505部分的控制。
術(shù)語(yǔ)“嬰兒配方”是指一種食品，它專門設(shè)計(jì)用于經(jīng)過(guò)刺激人類母乳而被人類嬰兒攝取。嬰兒配方的典型商購(gòu)實(shí)例包括但不限于

和
術(shù)語(yǔ)“飲食補(bǔ)充物”是指一種產(chǎn)品，它(i)意欲用于對(duì)飲食進(jìn)行補(bǔ)充，因此不用作常規(guī)食品或作為膳食或飲食的唯一項(xiàng)目；(ii)含有一種或多種飲食成分(包括例如微生物、礦物質(zhì)、草藥或其它植物物質(zhì)、氨基酸、酶和腺體)或其它組成成分；(iii)意欲作為丸劑、膠囊、片劑或液體通過(guò)口服攝?。缓?iv)標(biāo)為飲食補(bǔ)充物。
術(shù)語(yǔ)“臨床狀況”表示人類或動(dòng)物中的狀況，它損害健康和人類或動(dòng)物的狀態(tài)，并且通過(guò)補(bǔ)充PUFAs，特別是w-3和w-6脂肪酸可以糾正。臨床狀況可以是明確記載的疾病狀態(tài)形式，如冠心病或由營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)不良導(dǎo)致的不良健康的一般狀況。
“食物類似物”是制造用于模擬其食品對(duì)應(yīng)物(肉類、奶酪、乳等)的食品樣產(chǎn)品，意欲具有食品對(duì)應(yīng)物的外觀、味道和質(zhì)地。因此，此處用到的術(shù)語(yǔ)“食品”也包括食物類似物。
術(shù)語(yǔ)“水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料”是指用于補(bǔ)充或替代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的天然飼料的制造的或人工的飲食(配制的飼料)。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料是指用于飼養(yǎng)的有鰭魚類和甲殼動(dòng)物(即較低價(jià)值的食品魚物種[如淡水有鰭魚，如鯉魚、羅非魚和鯰魚]和用于奢侈品或壁龕市場(chǎng)的較高價(jià)值的商品物種如蝦、鮭魚、鱒魚、石首魚、淺海石斑魚(seebass)、海鯉(seebream)和石斑魚])的人工配制的飼料。這些配制飼料包含彼此補(bǔ)充的各種比例的一些成分，形成用于水產(chǎn)養(yǎng)殖物種的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品。
術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物飼料”是指意欲專門用于動(dòng)物，包括家養(yǎng)動(dòng)物(寵物、畜牧業(yè)動(dòng)物等)或用于生產(chǎn)食品的動(dòng)物如飼養(yǎng)魚類的飼料。
術(shù)語(yǔ)“飼料營(yíng)養(yǎng)物”是指諸如蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和核酸的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它們可以來(lái)源于酵母生物物質(zhì)，包括本發(fā)明的重組生產(chǎn)宿主。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“生物物質(zhì)”特別是指來(lái)自重組生產(chǎn)宿主的發(fā)酵的、消耗的或使用的酵母細(xì)胞材料，所述宿主以商業(yè)顯著量生產(chǎn)ARA。
術(shù)語(yǔ)＂脂肪酸＂表示具有各種鏈長(zhǎng)的長(zhǎng)鏈脂族酸(鏈烷酸)，從大約C12-C22(不過(guò)已知可以采用更長(zhǎng)和更短鏈長(zhǎng)的酸)。主要的鏈長(zhǎng)為C16至C22。脂肪酸的結(jié)構(gòu)是通過(guò)簡(jiǎn)單的符號(hào)系統(tǒng)＂X:Y＂表示的，其中，X是在特定脂肪酸中的碳(C)原子的總數(shù)，而Y是雙鍵的數(shù)量。關(guān)于“飽和脂肪酸”與“不飽和脂肪酸”、“單不飽和脂肪酸”與“多不飽和脂肪酸”(或“PUFAs”)，以及“ω-6脂肪酸(ω-6或n-6)與“ω-3脂肪酸(ω-3或n-3)的區(qū)別的其它細(xì)節(jié)提供于WO2004/101757。
在下面的表3中示出了用于描述本公開(kāi)內(nèi)容中的PUFAs的命名。在標(biāo)題為＂簡(jiǎn)化符號(hào)＂的欄目中，利用ω-參考系統(tǒng)表示碳原子的編號(hào)，雙鍵的編號(hào)，和最接近ω碳原子的雙鍵的位置，從ω碳原子開(kāi)始計(jì)數(shù)(它是用于這種目的的第1號(hào))。該表的其余部分歸納了ω-3和ω-6脂肪酸的常用名，在說(shuō)明書中將要使用的縮寫，以及每一種化合物的化學(xué)名稱。
表3 多不飽和脂肪酸的命名 術(shù)語(yǔ)“高水平ARA生產(chǎn)”是指生產(chǎn)微生物宿主的總脂質(zhì)的至少約5％的ARA，優(yōu)選總脂質(zhì)的至少約10％的ARA，更優(yōu)選總脂質(zhì)的至少約15％的ARA，更優(yōu)選總脂質(zhì)的至少約20％的ARA，最優(yōu)選總脂質(zhì)的至少約25-30％的ARA。ARA的結(jié)構(gòu)形式是不限的；因此，例如，ARA可以作為游離脂肪酸或以酯化形式，如?；视?、磷脂、硫苷脂的形式存在于總脂質(zhì)中。
術(shù)語(yǔ)“不含任何GLA”是指當(dāng)采用具有最低至大約0.1％的可檢測(cè)水平的裝置通過(guò)GC分析測(cè)量時(shí)，微生物宿主的總脂質(zhì)中缺乏任何可檢測(cè)的GLA。
術(shù)語(yǔ)“必需脂肪酸”表示生物為了生存必須攝入的PUFA，所述生物不能從頭合成所述特定必需脂肪酸。例如，哺乳動(dòng)物不能合成必需脂肪酸亞油酸(18:2，ω-6)。其他必需脂肪酸包括GLA(ω-6)，DGLA(ω-6)，ARA(ω-6)，EPA(ω-3)和DHA(ω-3)。
“微生物油”或“單細(xì)胞油”是由微生物在它們的生命過(guò)程中天然產(chǎn)生的油。這種油可能包括長(zhǎng)鏈PUFAs。術(shù)語(yǔ)“油”表示在25℃下是液體并且通常是多不飽和的脂類。想法，術(shù)語(yǔ)“脂肪”表示脂類物質(zhì)，它在25℃下是固體，并且通常是飽和的。
“脂質(zhì)體”是指脂質(zhì)小滴，其通常由特定蛋白和磷脂單層圍繞。這些細(xì)胞器是大多數(shù)微生物轉(zhuǎn)運(yùn)/儲(chǔ)存中性脂質(zhì)的位點(diǎn)。認(rèn)為脂質(zhì)體來(lái)源于含有TAG生物合成酶的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微結(jié)構(gòu)域，并且，它們的合成和大小似乎由特定的蛋白成分控制。
“中性脂質(zhì)”是指通常作為儲(chǔ)存脂肪和油存在于脂質(zhì)體中的那些脂質(zhì)，如此命名是因?yàn)樵诩?xì)胞pH，這些脂質(zhì)不具有帶電基團(tuán)。通常，它們完全是非極性的，對(duì)水沒(méi)有親和力。中性脂質(zhì)通常是指甘油的脂肪酸一、二和/或三酯，分別也稱作一?；视?、二酰基甘油或TAG(或統(tǒng)稱為?；视?。必須發(fā)生水解反應(yīng)，以便從?；视歪尫胖舅帷?br> 術(shù)語(yǔ)“三?；视汀?、“油”和“TAGs”是指中性脂質(zhì)，包含酯化于甘油分子的三個(gè)脂肪?；?所述術(shù)語(yǔ)在本發(fā)明中可互換使用)。所述油可以包括長(zhǎng)鏈PUFAs、較短的飽和和不飽和脂肪酸，以及較長(zhǎng)鏈的飽和脂肪酸。因此，“油生物合成”通常是指細(xì)胞中TAGs的合成。
術(shù)語(yǔ)“酰基轉(zhuǎn)移酶”是指負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移氨基-?；酝獾幕鶊F(tuán)的酶(EC2.3.1.-)。
術(shù)語(yǔ)“DAG AT”是指二?；视王；D(zhuǎn)移酶(也稱作?；?CoA-二?；视王；D(zhuǎn)移酶或二酰基甘油O-?；D(zhuǎn)移酶)(EC 2.3.1.20)。這種酶負(fù)責(zé)將?；?CoA和1，2-二酰基甘油轉(zhuǎn)化為TAG和CoA(從而包括在TAG生物合成的終末步驟中)。存在兩個(gè)家族的DAG AT酶DGAT1和DGAT2。前一個(gè)家族與?；?CoA膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)基因家族具有同源性，而后一個(gè)家族是不相關(guān)的(Lardizabalet al.，J.Biol.Chem.276(42)38862-38869(2001))。
術(shù)語(yǔ)“PDAT”是指磷脂二?；视王；D(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.158)。這種酶負(fù)責(zé)將?；鶑牧字膕n-2位置轉(zhuǎn)移到1，2-二酰基甘油的sn-3位置，從而得到溶血磷脂和TAG(從而包括在TAG生物合成的終末步驟中)。這種酶與DGAT(EC 2.3.1.20)的差異在于通過(guò)不依賴于?；?CoA的機(jī)制合成TAG。
術(shù)語(yǔ)“ARE2”是指?；?CoA固醇-?；D(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.26；也稱作固醇-酯合酶2)，其催化以下反應(yīng)?；?CoA+固醇＝CoA+固醇酯。
術(shù)語(yǔ)“GPAT”是指由gpat基因編碼的甘油-3-磷酸O-?；D(zhuǎn)移酶(E.C.2.3.1.15)，其將酰基-CoA和sn甘油3-磷酸轉(zhuǎn)化為1-?；?sn-甘油3-磷酸(磷脂生物合成的第一步)。
術(shù)語(yǔ)“LPAAT”是指溶血磷脂酸-?；D(zhuǎn)移酶(EC 2.3.1.51)。該酶負(fù)責(zé)將酰基-CoA基團(tuán)轉(zhuǎn)移到1-?；?sn-甘油3-磷酸(即溶血磷脂酸)上，得到CoA和1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸(磷脂酸)。文獻(xiàn)中也將LPAAT稱作?；?CoA1-?；?sn-甘油-3-磷酸2-O-?；D(zhuǎn)移酶、1-?；?sn-甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶和/或1-?；视土姿狨；D(zhuǎn)移酶(縮寫為AGAT)。
術(shù)語(yǔ)“LPCAT”是指?；?CoA1-?；苎字?膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶。這種酶負(fù)責(zé)在CoA和磷脂酰膽堿(PC)之間交換酰基。因此，它也稱作參與CoA和其它磷脂，包括溶血磷脂酸(LPA)之間的?；粨Q的酶。
“總脂質(zhì)和油級(jí)分中的PUFAs百分比(％)”是指這些級(jí)分中PUFAs相對(duì)于總脂肪酸的百分比。術(shù)語(yǔ)“總脂質(zhì)級(jí)分”或“脂質(zhì)級(jí)分”都指含油生物內(nèi)的所有脂質(zhì)的總和(即中性和極性)，由此包括位于磷脂酰膽堿(PC)級(jí)分、磷脂酰乙醇胺(PE)級(jí)分和三?；视?TAG或油)級(jí)分中的脂質(zhì)。但是，該術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)”和“油”在說(shuō)明書中可以互換使用。
術(shù)語(yǔ)“磷脂酰膽堿”或“PC”是指作為細(xì)胞膜的主要組成部分的磷脂。PC的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以通常描述為包含以下成分膽堿分子、磷酸基團(tuán)和甘油，其中脂肪酰基鏈作為R基團(tuán)連接在甘油分子的sn-1和sn-2位置上。
術(shù)語(yǔ)“PUFA生物合成途徑酶”表示與PUFA的生物合成相關(guān)的以下任何酶(以及編碼所述酶的基因)，包括Δ4去飽和酶、Δ5去飽和酶、Δ6去飽和酶、Δ12去飽和酶、Δ15去飽和酶、Δ17去飽和酶、Δ9去飽和酶、Δ8去飽和酶、Δ9延伸酶、C14/16延伸酶、C16/18延伸酶、C18/20延伸酶和/或C20/22延伸酶。
術(shù)語(yǔ)“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑”表示一組基因，當(dāng)它們?cè)诤线m的條件下表達(dá)時(shí)，編碼能催化ω-3和/或ω-6脂肪酸生產(chǎn)的酶。通常，參與ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的基因編碼某些或所有以下的酶Δ12去飽和酶、Δ6去飽和酶、C18/20延伸酶、C20/22延伸酶、Δ9延伸酶、Δ5去飽和酶、Δ17去飽和酶、Δ15去飽和酶、Δ9去飽和酶、Δ8去飽和酶、Δ9延伸酶和Δ4去飽和酶。在圖1中示出了典型的途徑，它可以經(jīng)各種中間體將油酸轉(zhuǎn)化成DHA，并且證實(shí)了如何由普通來(lái)源生產(chǎn)ω-3和ω-6脂肪酸。該途徑天然分成兩個(gè)部分，其中一個(gè)部分產(chǎn)生ω-3脂肪酸，另一個(gè)部分僅僅產(chǎn)生ω-6脂肪酸。僅僅產(chǎn)生ω-3脂肪酸的部分在此稱作ω-3脂肪酸生物合成途徑，而僅僅產(chǎn)生ω-6脂肪酸的部分在此稱作ω-6脂肪酸生物合成途徑。
在ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的范圍中使用的術(shù)語(yǔ)“功能性”表示途徑中的一些(或所有)基因表達(dá)活性酶，導(dǎo)致體內(nèi)催化或底物轉(zhuǎn)化。應(yīng)該理解，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑”不表示需要前面段落中列出的所有基因，因?yàn)楹芏嘀舅岙a(chǎn)物僅僅需要表達(dá)該途徑的一個(gè)亞組的基因。
術(shù)語(yǔ)“Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑”是指最少包括以下基因的ARA脂肪酸生物合成途徑Δ6去飽和酶、C18/20延伸酶和Δ5去飽和酶。在一種相關(guān)方式中，術(shù)語(yǔ)“Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑”是指最少包括以下基因的ARA脂肪酸生物合成途徑Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶和Δ5去飽和酶。
術(shù)語(yǔ)“去飽和酶”表示能夠?qū)σ环N或多種脂肪酸去飽和，即，導(dǎo)入雙鍵，以便產(chǎn)生脂肪酸或感興趣的前體的多肽。盡管在本說(shuō)明書中ω-參考系統(tǒng)被用于表示特定的脂肪酸，更方便的是，利用Δ-系統(tǒng)從底物的羧基末端開(kāi)始計(jì)數(shù)以表示去飽和酶的活性。本發(fā)明特別感興趣的是1.)Δ8去飽和酶，它使脂肪酸的位于從該分子的羧基末端開(kāi)始計(jì)數(shù)的第8和第9個(gè)碳原子之間去飽和，例如，催化EDA轉(zhuǎn)化成DGLA和/或EtrA轉(zhuǎn)化成ETA；2.)Δ6去飽和酶，它能催化LA轉(zhuǎn)化成GLA和/或ALA轉(zhuǎn)化成STA；3.)Δ5去飽和酶，它能催化DGLA轉(zhuǎn)化成ARA和/或ETA轉(zhuǎn)化成EPA；4.)Δ4去飽和酶，它能催化DPA轉(zhuǎn)化成DHA；5.)Δ12去飽和酶，它能催化油酸轉(zhuǎn)化成LA；6.)Δ15去飽和酶，它能催化LA轉(zhuǎn)化成ALA和/或GLA轉(zhuǎn)化成STA；7.)Δ17去飽和酶，它能催化ARA轉(zhuǎn)化成EPA和/或DGLA轉(zhuǎn)化成ETA；和8)Δ9去飽和酶，它能催化棕櫚酸轉(zhuǎn)化成棕櫚油酸(16:1)和/或硬脂酸轉(zhuǎn)化成油酸(18:1)。
針對(duì)本發(fā)明Δ15去飽和酶提到的術(shù)語(yǔ)“雙功能”表示該多肽具有用油酸和亞油酸作為酶底物的能力?！懊傅孜铩北硎驹摱嚯脑诨钚晕稽c(diǎn)與底物結(jié)合，并且以反應(yīng)性方式作用于該底物。
術(shù)語(yǔ)“延伸酶系統(tǒng)”表示負(fù)責(zé)延伸脂肪酸碳鏈，以便產(chǎn)生比延伸酶作用的脂肪酸底物長(zhǎng)2個(gè)碳原子的脂肪酸的一組四種酶。更具體地，這種延伸過(guò)程是與脂肪酸合酶相關(guān)發(fā)生的，其中，CoA是?；d體(Lassner et al.，The Plant Cell 8281-292(1996))。在第一步中(其是底物特異性和限速的)，丙二酰-CoA與長(zhǎng)鏈酰基-CoA縮合，產(chǎn)生CO2和β-酮?；?CoA(其中，酰基部分延長(zhǎng)了兩個(gè)碳原子)。隨后的反應(yīng)包括還原成β-羥酰基-CoA，脫水形成烯酰基-CoA，并且第二次還原，產(chǎn)生延長(zhǎng)的?；?CoA。由延伸酶催化的反應(yīng)的例子是將GLA轉(zhuǎn)化成DGLA，STA轉(zhuǎn)化成ETA和將EPA轉(zhuǎn)化成DPA。
為了本發(fā)明的目的，催化第一個(gè)縮合反應(yīng)(即丙二酰-CoA轉(zhuǎn)化為β-酮?；?CoA)的酶統(tǒng)稱為“延伸酶”。概言之，延伸酶的底物特異性一定程度是寬范圍的，但是由于鏈長(zhǎng)度和不飽和化的程度和類型而不同。因此，延伸酶可以具有不同的特異性。例如，C14/16延伸酶利用C14底物(如豆蔻酸)，C16/18延伸酶利用C16底物(如棕櫚酸)，C18/20延伸酶利用C18底物(如GLA、STA)，C20/22延伸酶利用C20底物(如EPA)。以相似的方式，Δ9延伸酶能夠催化LA和ALA分別轉(zhuǎn)化為EDA和EtrA。重要的是注意，一些延伸酶具有廣泛特異性，因此，單個(gè)酶可能能夠催化一些延伸酶反應(yīng)(例如，由此既作為C16/18延伸酶，也作為C18/20延伸酶)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，最理想的是經(jīng)驗(yàn)確定脂肪酸延伸酶的特異性，該確定是通過(guò)用脂肪酸延伸酶的基因轉(zhuǎn)化合適的宿主，并且確定其對(duì)宿主的脂肪酸譜的影響。
術(shù)語(yǔ)“高親和力延伸酶”或“EL1S”或“ELO1”是指底物特異性優(yōu)先針對(duì)GLA的C18/20延伸酶(DGLA是延伸酶反應(yīng)的產(chǎn)物[即Δ6延伸酶])。一種這樣的延伸酶描述于WO 00/12720，在此提供為SEQID NOs17和18。但是，申請(qǐng)人已經(jīng)證明了該酶也對(duì)18:2(LA)和18:3(ALA)具有一些活性。因此，SEQ ID NO18顯示出Δ9延伸酶活性(以及其Δ6延伸酶活性)。因此，概括出此處提供為SEQ IDNO18的C18/20延伸酶可以在本發(fā)明中描述的Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑中和Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑中起作用，作為例如球等鞭金藻Δ9延伸酶(SEQ ID NO40)的替代物。
術(shù)語(yǔ)“EL2S”或“ELO2”是指底物特異性優(yōu)先針對(duì)GLA(DGLA是延伸酶反應(yīng)的產(chǎn)物)和/或STA(STA是延伸酶反應(yīng)的底物)的C18/20延伸酶。一種這樣的延伸酶描述于U.S.6,677,145，在此提供為SEQ IDNOs20和21。
術(shù)語(yǔ)“ELO3”是指由elo3基因(SEQ ID NO53)編碼的高山被孢霉C16/18脂肪酸延伸酶(在此提供為SEQ ID NO54)。術(shù)語(yǔ)“YE2”是指由此處提供為SEQ ID NO61的基因編碼的解脂耶氏酵母C16/18脂肪酸延伸酶(在此提供為SEQ ID NO62)?；诖颂巿?bào)道的數(shù)據(jù)，ELO3和YE2都優(yōu)先催化棕櫚酸(16:0)轉(zhuǎn)化為硬脂酸(18:0)。
術(shù)語(yǔ)“YE1”是指由此處提供為SEQ ID NO64的基因編碼的解脂耶氏酵母C14/16脂肪酸延伸酶(此處提供為SEQ ID NO65)。基于此處報(bào)道的數(shù)據(jù)，YE2優(yōu)先催化豆蔻酸(14:0)轉(zhuǎn)化為棕櫚酸(16:0)。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化效率”和“底物轉(zhuǎn)化百分比”表示特定的酶(例如，去飽和酶或延伸酶)可以將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的效率。轉(zhuǎn)化效率是按照以下公式計(jì)算的([產(chǎn)物]/[底物+產(chǎn)物])＊100，其中‘產(chǎn)物’包括中間產(chǎn)物和衍生自中間產(chǎn)物的所有產(chǎn)物。
術(shù)語(yǔ)“含油的”表示傾向于以脂質(zhì)形式儲(chǔ)存它們的能源的生物(Weete，InFungal Lipid Biochemistry，2nd ed.，Plenum，1980)。通常，所述微生物的細(xì)胞油含量遵循S形曲線，其中，脂質(zhì)的濃度增加，直到在晚對(duì)數(shù)期或早期靜止生長(zhǎng)期的最大值，然后在晚期靜止期和死亡期逐漸減少(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ，Microbiol.57419-25(1991))。
術(shù)語(yǔ)“含油酵母”表示被分類為酵母的微生物，它們能夠產(chǎn)生油。通常，含油微生物的細(xì)胞油或三?；视秃孔裱璖形曲線，其中，脂質(zhì)的濃度增加，直到在晚對(duì)數(shù)期或早期靜止生長(zhǎng)期的最大值，然后在晚期靜止期和死亡期逐漸減少(Yongmanitchai and Ward，Appl.Environ.Microbiol.57419-25(1991))。含油微生物積累占干細(xì)胞重量的大約25％以上的油并非是不常見(jiàn)的。含油酵母的例子包括，但不局限于以下屬耶氏酵母屬，假絲酵母屬，紅酵母屬，紅冬孢屬，隱球酵母屬，絲孢酵母屬和油脂酵母屬。
術(shù)語(yǔ)“可發(fā)酵的碳源”表示微生物能夠代謝以便產(chǎn)生能量的碳源。本發(fā)明的典型的碳源包括，但不局限于單糖，寡糖，多糖，鏈烷，脂肪酸，脂肪酸酯，甘油一酯，甘油二酯，甘油三酯，二氧化碳，甲醇，甲醛，甲酸鹽或酯以及含碳的胺。
在本文中，“分離的核酸片段”是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，它任選包括合成的，非天然的或改變了的核酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可能包含一個(gè)或多個(gè)cDNA、基因組DNA或合成DNA的片段。
氨基酸或核苷酸序列的“主要部分”是包括多肽的一定數(shù)目的氨基酸序列或基因的核苷酸序列的部分，所述數(shù)目足夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)所述序列進(jìn)行的人工評(píng)估，或通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)化的序列比較，以及使用諸如BLAST的算法的鑒定(Basic Local Alignment SearchTool；Altschul，S.F.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1993)而推測(cè)性地鑒定該多肽或基因。一般地，為了推測(cè)性地鑒定一種多肽或核酸序列與已知的蛋白或基因同源，具有10個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸或30個(gè)或更多個(gè)核苷酸的序列是必須的。此外，對(duì)于核苷酸序列，可以將包含20-30個(gè)連續(xù)核苷酸的基因特異性寡核苷酸探針用于基因鑒定(如Southern雜交)和分離(如細(xì)菌菌落或噬菌體斑的原位雜交)的序列依賴性方法中。此外，可以將12-15個(gè)堿基組成的短寡核苷酸用作PCR中的擴(kuò)增引物，以獲得包括引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“主要部分”包括足夠的序列，以便特異性地鑒定和/或分離包括所述序列的核酸片段。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”被用于表示能夠彼此雜交的核苷酸堿基之間的相互關(guān)系。例如，對(duì)于DNA來(lái)說(shuō)，腺嘌呤互補(bǔ)于胸腺嘧啶，而胞嘧啶互補(bǔ)于鳥嘌呤。
“密碼子簡(jiǎn)并性”表示遺傳密碼的性質(zhì)，它允許改變核苷酸序列，而又不影響所編碼的多肽的氨基酸序列。技術(shù)人員在用核苷酸密碼子表示特定氨基酸時(shí)充分理解由特定宿主細(xì)胞所表現(xiàn)出來(lái)的“密碼子偏倚”。因此，在合成用于改善在宿主細(xì)胞中的表達(dá)的基因時(shí)，需要設(shè)計(jì)所述基因，以便它的密碼子選擇的頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子選擇的頻率。
表示DNA序列的“化學(xué)合成的”表示組成核苷酸是在體外組裝的。DNA的人工化學(xué)合成，可以通過(guò)使用業(yè)已建立的方法完成；或可以利用多種商業(yè)化儀器中的一種進(jìn)行自動(dòng)化的化學(xué)合成?！昂铣苫颉笨梢杂晒押塑账峄締挝唤M裝，它們是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法化學(xué)合成的。將這些基本單位連接在一起并且退火，以便形成基因片段，然后酶促組裝，以便構(gòu)建完整的基因。因此，可以對(duì)基因進(jìn)行修飾，以便根據(jù)核苷酸序列的優(yōu)化優(yōu)化基因表達(dá)，以便體現(xiàn)宿主細(xì)胞的密碼子偏倚。如果密碼子選擇偏向宿主優(yōu)選的密碼子，技術(shù)人員可以理解成功的基因表達(dá)的可能性。優(yōu)選密碼子的確定可以根據(jù)對(duì)來(lái)自宿主細(xì)胞的基因的檢查，其中，可以獲得序列信息。
“基因”表示能表達(dá)特定蛋白的核酸片段，其可以表示單獨(dú)的編碼序列，或可以包括位于編碼序列前面(5’非編碼序列)和后面(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列?！疤烊换颉北硎咎烊慌c它自身的調(diào)節(jié)序列一起存在的基因。“嵌合基因”表示不是天然基因的任何基因，包括不是天然一起存在的調(diào)節(jié)和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括來(lái)自不同來(lái)源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或來(lái)自相同的來(lái)源，但是以不同于天然存在的方式排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列?！皟?nèi)源基因”表示存在于生物基因組中的天然位置上的天然基因?！巴庠础被虮硎就ㄟ^(guò)基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入所述宿主生物的基因。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因?！稗D(zhuǎn)基因”是業(yè)已通過(guò)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入所述基因組的基因?！懊艽a子優(yōu)化的基因”是具有經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)以便模擬宿主細(xì)胞的優(yōu)選的密碼子選擇頻率的密碼子選擇頻率的基因。
“編碼序列”表示編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！昂线m的調(diào)節(jié)序列”表示位于編碼序列上游(5’非編碼序列)，序列內(nèi)，或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，并且，它能影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化識(shí)別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
“啟動(dòng)子”表示能夠控制編碼序列或功能性RNA表達(dá)的DNA序列。一般，編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3’。啟動(dòng)子可能完全來(lái)自天然基因，或者包括來(lái)自天然存在的不同啟動(dòng)子的不同元件，或者甚至包括合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，不同的啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)基因在不同的組織或細(xì)胞類型中的表達(dá)，或者在發(fā)育的不同階段的表達(dá)，或者對(duì)不同的環(huán)境或生理學(xué)條件作出反應(yīng)的表達(dá)。能導(dǎo)致基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中在大多數(shù)時(shí)間表達(dá)的啟動(dòng)子通常被稱作“組成型啟動(dòng)子”。還應(yīng)當(dāng)理解的是，由于在大多數(shù)場(chǎng)合下，調(diào)節(jié)序列的確切邊界未能完全確定，不同長(zhǎng)度的DNA片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。
術(shù)語(yǔ)“GPAT啟動(dòng)子”或“GPAT啟動(dòng)子區(qū)”是指在gpat基因編碼的甘油-3-磷酸O-?；D(zhuǎn)移酶(E.C.2.3.1.15)的‘ATG’翻譯起始密碼子前面，并且對(duì)于表達(dá)是必須的5’上游非翻譯區(qū)。合適的解脂耶氏酵母GPAT啟動(dòng)子區(qū)的實(shí)例描述于美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/225354。
術(shù)語(yǔ)“GPD啟動(dòng)子”或“GPD啟動(dòng)子區(qū)”是指在gpd基因編碼的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(E.C.1.2.1.12)的‘ATG’翻譯起始密碼子前面，并且對(duì)于表達(dá)是必須的5’上游非翻譯區(qū)。合適的解脂耶氏酵母GPD啟動(dòng)子區(qū)的實(shí)例描述于WO 2005/003310。
術(shù)語(yǔ)“GPM啟動(dòng)子”或“GPM啟動(dòng)子區(qū)”是指在gpm基因編碼的磷酸甘油變位酶(EC 5.4.2.1)的‘ATG’翻譯起始密碼子前面，并且對(duì)于表達(dá)是必須的5’上游非翻譯區(qū)。合適的解脂耶氏酵母GPM啟動(dòng)子區(qū)的實(shí)例描述于WO 2005/003310。
術(shù)語(yǔ)“FBA啟動(dòng)子”或“FBA啟動(dòng)子區(qū)”是指在fba1基因編碼的果糖-二磷酸醛縮酶(E.C.4.1.2.13)的‘ATG’翻譯起始密碼子前面，并且對(duì)于表達(dá)是必須的5’上游非翻譯區(qū)。合適的解脂耶氏酵母FBA啟動(dòng)子區(qū)的實(shí)例描述于WO 2005/049805。
術(shù)語(yǔ)“FBAIN啟動(dòng)子”或“FBAIN啟動(dòng)子區(qū)”是指在fba1基因的‘ATG’翻譯起始密碼子前面并且對(duì)于表達(dá)是必須的5’上游非翻譯區(qū)，加上具有fba1基因的內(nèi)含子的5’編碼區(qū)的一部分。合適的解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子區(qū)的實(shí)例描述于WO 2005/049805。
術(shù)語(yǔ)“GPDIN啟動(dòng)子”或“GPDIN啟動(dòng)子區(qū)”是指在gpd基因的‘ATG’翻譯起始密碼子前面并且對(duì)于表達(dá)是必須的5’上游非翻譯區(qū)，加上具有g(shù)pd基因的內(nèi)含子的5’編碼區(qū)的一部分。合適的解脂耶氏酵母GPDIN啟動(dòng)子區(qū)的實(shí)例描述于美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/183664。
術(shù)語(yǔ)“YAT1啟動(dòng)子”或“YAT1啟動(dòng)子區(qū)”是指在yat1基因編碼的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶(TC 2.A.49；GenBank獲取號(hào)XM_504457)的‘ATG’翻譯起始密碼子前面，并且對(duì)于表達(dá)是必須的5’上游非翻譯區(qū)。合適的解脂耶氏酵母YAT1啟動(dòng)子區(qū)的實(shí)例描述于美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/185301。
術(shù)語(yǔ)“EXP1啟動(dòng)子”或“EXP1啟動(dòng)子區(qū)”是指在解脂耶氏酵母“YALI0C12034g”基因(GenBank獲取號(hào)XM_501745)編碼的蛋白的‘ATG’翻譯起始密碼子前面，并且對(duì)于表達(dá)是必須的5’上游非翻譯區(qū)?；凇癥ALI0C12034g”與sp|Q12207啤酒糖酵母非經(jīng)典輸出蛋白2(其功能涉及缺乏可切割的信號(hào)序列的蛋白的輸出的新途徑)的顯著同源性，該基因在此命名為exp1基因，其編碼命名為EXP1的蛋白。合適的解脂耶氏酵母EXP1啟動(dòng)子區(qū)的實(shí)例描述為SEQ IDNO364，但不意欲限制其性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，由于EXP1啟動(dòng)子的精確邊界未能完全確定，具有增加或減少的長(zhǎng)度的的DNA片段可能具有相同的啟動(dòng)子活性。
術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子活性”表示對(duì)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄效力的評(píng)估。例如，這可以通過(guò)測(cè)量從啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的mRNA的量而直接測(cè)定(例如通過(guò)Northern印跡或引物延伸法)或通過(guò)測(cè)量從啟動(dòng)子表達(dá)的基因產(chǎn)物的量而檢測(cè)測(cè)定。
“內(nèi)含子”是大多數(shù)真核生物的基因序列(編碼區(qū)、5’非編碼區(qū)或3’非編碼區(qū))中存在的非編碼DNA的序列。它們的完整功能還未知，但是，一些增強(qiáng)子位于內(nèi)含子中(Giacopelli F.et al.，Gene Expr.1195-104(2003))。這些內(nèi)含子序列是轉(zhuǎn)錄的，但是在mRNA翻譯為蛋白之前，從前mRNA轉(zhuǎn)錄物中除去。內(nèi)含子除去的這一過(guò)程是通過(guò)內(nèi)含子的任一側(cè)上的序列(外顯子)的自我剪接發(fā)生的。
術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)子”是指能提高鄰近的真核啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平，從而增加基因轉(zhuǎn)錄的順式調(diào)節(jié)序列。增強(qiáng)子可以作用于超過(guò)數(shù)萬(wàn)堿基的DNA上的啟動(dòng)子，并且可以在它們調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的5’或3’。增強(qiáng)子也可以位于內(nèi)含子中。
術(shù)語(yǔ)“3’非編碼序列”和“轉(zhuǎn)錄終止子”表示位于編碼序列下游的DNA序列。它包括聚腺苷酸化識(shí)別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)的其他序列。聚腺苷酸化信號(hào)通常以影響聚腺苷酸添加在mRNA前體的3’末端為特征。所述3’區(qū)能夠影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性，或翻譯。
“RNA轉(zhuǎn)錄物”表示由RNA聚合酶催化的DNA序列轉(zhuǎn)錄而得到的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是所述DNA序列的完全互補(bǔ)的拷貝時(shí)，它被稱作初級(jí)轉(zhuǎn)錄物，或者它可以是來(lái)自初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，并且被稱作成熟RNA?！靶攀筊NA”或“mRNA”表示沒(méi)有內(nèi)含子，并且能夠由細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA。“cDNA”表示雙鏈DNA，它是互補(bǔ)于mRNA并且由mRNA衍生的?！坝辛x”RNA表示包括mRNA，并能夠由細(xì)胞翻譯成蛋白的RNA轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x”RNA表示互補(bǔ)于靶初級(jí)轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部分的RNA，并且它能抑制靶基因的表達(dá)(U.S.5,107,065；WO 99/28508)。反義RNA的互補(bǔ)性可以是與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，即，在5’非編碼序列、3’非編碼序列或編碼序列處互補(bǔ)的?！肮δ苄訰NA”表示反義RNA、核酶RNA、或不能翻譯，但仍然能影響細(xì)胞加工的其他RNA。
術(shù)語(yǔ)“可操作地連接的”表示核酸序列締合在單個(gè)核酸片段上，以便其中一個(gè)的功能受到另一個(gè)的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(shí)，它就是與該編碼序列可操作地連接的(即，所述編碼序列受所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制)。編碼序列能夠沿有義或反義方向可操作地與調(diào)節(jié)序列連接。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”表示來(lái)自本發(fā)明的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還可以表示mRNA翻譯成多肽。
“成熟”蛋白表示翻譯后加工的多肽；即，業(yè)已除去了存在于初級(jí)翻譯產(chǎn)物中的所有前肽或原肽的蛋白?！扒绑w”蛋白表示mRNA翻譯的初級(jí)產(chǎn)物；即，仍然存在前肽和原肽。前肽和原肽可以是(但不局限于)細(xì)胞內(nèi)定位信號(hào)。
術(shù)語(yǔ)“重組酶”表示進(jìn)行位點(diǎn)特異性重組，以改變DNA結(jié)構(gòu)的酶，包括轉(zhuǎn)座酶、λ整合/切割酶，以及位點(diǎn)特異性重組酶。
“重組酶位點(diǎn)”或“位點(diǎn)特異性重組酶序列”表示一種DNA序列，它能夠被重組酶識(shí)別和結(jié)合。可以理解，其可以是野生型或突變的重組酶位點(diǎn)，只要保持了功能性，并且重組酶仍然可以識(shí)別該位點(diǎn)、結(jié)合于DNA序列，并且催化兩個(gè)相鄰重組酶位點(diǎn)之間的重組。
“轉(zhuǎn)化”表示將核酸分子轉(zhuǎn)入宿主生物，導(dǎo)致了遺傳學(xué)穩(wěn)定的遺傳性。例如，核酸分子可以是能自主復(fù)制的質(zhì)粒；或者它可以整合到宿主生物的基因組中。包括轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物被稱作“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化的”生物。
術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！?，“載體”和“盒”表示染色體外元件，它通常攜帶有不作為細(xì)胞的中心代謝部分的基因，并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA片段形式的。所述元件可以是自主復(fù)制的序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性或環(huán)狀的單或雙鏈DNA或RNA，可以來(lái)自任何來(lái)源，其中，多個(gè)核苷酸序列業(yè)已連接或重組成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能夠?qū)?dòng)子片段和選定的基因產(chǎn)物的DNA序列，以及合適的3’非翻譯序列導(dǎo)入細(xì)胞?！氨磉_(dá)盒”表示包括外源基因，并且除了外源基因之外，還具有能夠增強(qiáng)基因在外源宿主中表達(dá)的元件的特定載體。
術(shù)語(yǔ)“同源重組”表示兩個(gè)DNA分子之間的DNA片段的交換(在交換過(guò)程中)。交換的片段的側(cè)翼是兩個(gè)DNA分子之間的相同核苷酸序列的位點(diǎn)(即“同源區(qū)”)。術(shù)語(yǔ)“同源區(qū)”是指核酸片段上參與同源重組的、彼此具有同源性的核苷酸序列段。當(dāng)這些同源區(qū)的長(zhǎng)度為至少約10bp，優(yōu)選長(zhǎng)度為至少約50bp時(shí)，通常發(fā)生有效同源重組。典型地，意欲用于重組的片段含有至少兩個(gè)同源區(qū)，其中需要靶定的基因破壞或替代。
術(shù)語(yǔ)“序列分析軟件”表示可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計(jì)算機(jī)算法或軟件程序。“序列分析軟件”可以是通過(guò)商業(yè)渠道獲得的或者獨(dú)立開(kāi)發(fā)的。典型的序列分析軟件包括，但不局限于1.)GCG程序組(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；和4.)采用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)Suhai，Sandor.PlenumNew York，NY)。在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)理解的是，在將序列分析軟件用于分析時(shí)，分析的結(jié)果是基于有關(guān)程序的“缺省值”的，除非另有說(shuō)明。在本文中，“缺省值”表示在初次初始化時(shí)最初隨所述軟件加載的任何組的值或參數(shù)。
術(shù)語(yǔ)“保守結(jié)構(gòu)域”或“基序”表示在沿著進(jìn)行比對(duì)的進(jìn)化上相關(guān)的蛋白的序列的特定位置上保守的一組氨基酸。盡管其它位置的氨基酸在同源蛋白之間可以不同，但在特定位置高度保守的氨基酸表明這些氨基酸是蛋白的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性或活性必須的。由于它們是通過(guò)在比對(duì)的蛋白同源物家族的序列中的高保守程度鑒定的，它們可以用作標(biāo)識(shí)物，或“信號(hào)”，來(lái)確定具有新確定的序列的蛋白是否屬于以前鑒定的蛋白家族。表明具有Δ15去飽和酶活性的真菌蛋白的基序提供為SEQ ID NO374，而表明具有Δ12去飽和酶活性的真菌蛋白的基序提供為SEQ ID NO375。
本發(fā)明所使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且描述于以下文獻(xiàn)中Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)(下文稱作“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.and Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring HarborLaboratoryCold Spring Harbor，NY(1984)；和Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience(1987)出版的Ausubel，F(xiàn).M.et al.，Current Protocols in Molecular Biology。
用于生產(chǎn)ARA的優(yōu)選微生物宿主解脂耶氏酵母 在申請(qǐng)人的工作之前(參見(jiàn)Picataggio et al.，WO2004/101757)，以前還沒(méi)有將含油酵母檢驗(yàn)為適于用作PUFAs的生產(chǎn)平臺(tái)的一類微生物。通常鑒定為含油酵母的屬包括但不限于但不局限于耶氏酵母屬、假絲酵母屬、紅酵母屬、紅冬孢屬、隱球酵母屬、絲孢酵母屬和油脂酵母屬。更具體地講，典型的油合成酵母包括類酵母紅冬孢、斯達(dá)氏油脂酵母、產(chǎn)油油脂酵母、拉可夫氏假絲酵母、鐵紅假絲酵母、熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、茁芽絲孢酵母、皮狀絲孢酵母、膠粘紅酵母、禾木科紅酵母和解脂耶氏酵母(以前被劃分為解脂假絲酵母)。
認(rèn)為含油酵母具有一些性質(zhì)，能夠促進(jìn)它們用作ARA的經(jīng)濟(jì)、商業(yè)生產(chǎn)的宿主生物。首先，這些生物定義為天然能夠合成和積累油的那些，其中油可以占細(xì)胞干重的大約25％以上，更優(yōu)選占細(xì)胞干重的大約30％以上，最優(yōu)選占細(xì)胞干重的大約40％以上。其次，已經(jīng)充分開(kāi)發(fā)了培養(yǎng)具有高油含量的含油酵母的技術(shù)(例如，參見(jiàn)EP 0 005277B1；Ratledge，C.，Prog.Ind.Microbiol.16119-206(1982))。這些生物過(guò)去已經(jīng)在商業(yè)上用于多種目的。例如，已經(jīng)將解脂耶氏酵母的多種菌株用于制造和生產(chǎn)以下物質(zhì)異檸檬酸裂解酶(DD259637)；酯酶(SU1454852，WO2001083773，DD279267)；多羥基鏈烷酸(WO2001088144)；檸檬酸(RU2096461，RU2090611，DD285372，DD285370，DD275480，DD227448，PL160027)；赤蘚糖醇(EP770683)；2-氧戊二酸(DD267999)；γ-癸內(nèi)酯(U.S.6,451,565，F(xiàn)R2734843)；γ-十二內(nèi)酯(EP578388)；和丙酮酸(JP09252790)。
在分類為含油酵母的生物中，為了此處的目的，將解脂耶氏酵母選作優(yōu)選的微生物宿主。這種選擇基于以下知識(shí)，即含油菌株能夠?qū)ⅵ?3脂肪酸級(jí)分摻入TAG級(jí)分中，該生物易于進(jìn)行遺傳操作，和以前將該物種作為食品級(jí)檸檬酸的通常認(rèn)識(shí)到的安全(“GRAS”，根據(jù)美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局)來(lái)源。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，根據(jù)針對(duì)具有高脂質(zhì)含量(測(cè)量為干重的百分比)和高體積產(chǎn)率(測(cè)量為g/L h-1)的野生型菌株的鑒定的初步研究，最優(yōu)選的是命名為ATCC#20362、ATCC #8862、ATCC #18944、ATCC #76982和/或LGAM S(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.，and Aggelis G.，Bioresour.Technol.82(1)43-9(2002))。
如WO 2004/101757中的描述，以前通過(guò)導(dǎo)入和表達(dá)編碼ω-3/ω-6生物合成途徑的基因，對(duì)解脂耶氏酵母進(jìn)行基因工程化，以分別生產(chǎn)1.3％ ARA和1.9％ EPA。更具體地，分別轉(zhuǎn)化兩種不同的DNA表達(dá)構(gòu)建體(包含用于合成ARA的Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶和高親和力PUFA C18/20延伸酶或用于合成EPA的Δ6去飽和酶、Δ5去飽和酶、高親和力PUFA C18/20延伸酶和密碼子優(yōu)化的Δ17去飽和酶)，并且整合到編碼乳清苷-5’-磷酸脫羧酶(EC 4.1.1.23)的解脂耶氏酵母染色體URA3基因中。用合適的底物飼養(yǎng)的宿主細(xì)胞的GC分析檢測(cè)到了ARA和EPA的生產(chǎn)。盡管適于證明進(jìn)行基因工程化以生產(chǎn)ω-6和ω-3脂肪酸的含油宿主的能力，但該工作沒(méi)有進(jìn)行復(fù)雜的代謝工程化，所述代謝工程化是合成占總油級(jí)分的5％以上的ARA，或更優(yōu)選占總油級(jí)分的10％以上的ARA，或甚至更優(yōu)選占總油級(jí)分的15-20％以上的ARA，或最優(yōu)選占總油級(jí)分的25-30％以上的ARA所需要的。
在共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)No.60/624812中，進(jìn)行了解脂耶氏酵母中的復(fù)雜的代謝工程化，以便(1)鑒定允許合成和大量積累EPA的優(yōu)選去飽和酶和延伸酶；(2)操作?；D(zhuǎn)移酶的活性，所述?；D(zhuǎn)移酶使得能夠?qū)ⅵ刂舅徂D(zhuǎn)移到存儲(chǔ)脂質(zhì)庫(kù)中；(3)通過(guò)使用強(qiáng)啟動(dòng)子、以多拷貝表達(dá)和/或密碼子優(yōu)化，超量表達(dá)去飽和酶、延伸酶和酰基轉(zhuǎn)移酶；(4)下調(diào)PUFA生物合成中減少EPA的總積累的特定基因的表達(dá)；和(5)操作影響EPA生產(chǎn)的途徑和總體調(diào)節(jié)劑。這導(dǎo)致在解脂耶氏酵母的一個(gè)特定重組菌株中生產(chǎn)了最高達(dá)28％的EPA。
在本申請(qǐng)中，進(jìn)行了類似的復(fù)雜代謝工程化，導(dǎo)致在解脂耶氏酵母的重組菌株中生產(chǎn)了占總油級(jí)分的10-14％的ARA。更具體地，對(duì)菌株Y2034和Y2047進(jìn)行基因工程化，以便利用Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑，并且生產(chǎn)分別包含10％ ARA和11％ ARA的油；對(duì)菌株Y2214進(jìn)行基因工程化，以便利用Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑，從而生產(chǎn)包含12％ ARA并且不含GLA的油。下文將討論代謝工程化的方面，并且將討論發(fā)酵方法，以進(jìn)一步增強(qiáng)該含油酵母中的ARA生產(chǎn)能力。
概述脂肪酸和甘油三酯的微生物生物合成 一般地，含油微生物中的脂質(zhì)積累是反應(yīng)于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在的總體碳氮比而引發(fā)的。導(dǎo)致游離棕櫚酸(16:0)在含油微生物中從頭合成的該過(guò)程詳細(xì)描述于2004/101757。棕櫚酸是長(zhǎng)鏈飽和和不飽和脂肪酸衍生物的前體，其通過(guò)延伸酶和去飽和酶的作用形成。例如，通過(guò)Δ9去飽和酶的作用，棕櫚酸轉(zhuǎn)化為其不飽和衍生物[棕櫚油酸(16:1)]。類似地，棕櫚酸由C16/18脂肪酸延伸酶延伸形成硬脂酸(18:0)，其可以通過(guò)Δ9去飽和酶轉(zhuǎn)化為其不飽和衍生物，從而產(chǎn)生油酸(18:1)。
通過(guò)一系列反應(yīng)形成TAGs(脂肪酸的主要存儲(chǔ)單位)，所述一系列反應(yīng)包括1.)一個(gè)分子的?；?CoA通過(guò)?；D(zhuǎn)移酶酯化為甘油-3-磷酸，以產(chǎn)生溶血磷脂酸；2.)第二個(gè)分子的?；?CoA通過(guò)?；D(zhuǎn)移酶酯化，產(chǎn)生1，2-二?；视土姿?通常鑒定為磷脂酸)；3.)由磷脂酸磷酸酶除去一個(gè)磷酸，產(chǎn)生1，2-二?；视?DAG)；和4.)通過(guò)?；D(zhuǎn)移酶的作用加入第三個(gè)脂肪酸，以形成TAG(圖2)。
可以將廣泛的脂肪酸摻入TAGs，包括飽和和不飽和脂肪酸，以及短鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸?？梢酝ㄟ^(guò)?；D(zhuǎn)移酶摻入TAGs的脂肪酸的一些非限定性實(shí)例包括癸酸(10:0)、月桂酸(12:0)、豆蔻酸(14:0)、棕櫚酸(16:0)、棕桐油酸(16:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、11-十八碳酸烯酸(18:1)、LA、桐酸(18:3)、ALA、GLA、花生酸(20:0)、EDA、EtrA、DGLA、ETA、ARA、EPA、山俞酸(22:0)、DPA、DHA、二十四酸(24:0)、神經(jīng)酸(24:1)、蠟酸(26:0)和褐煤酸(280)脂肪酸。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方案中，最理想的是將EPA摻入TAG。
ARA，即一種ω-3脂肪酸的生物合成 將油酸轉(zhuǎn)化為ARA的代謝過(guò)程包括通過(guò)加入碳原子而進(jìn)行的碳鏈延伸和通過(guò)加入雙鍵使分子去飽和。這需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中存在一系列的去飽和酶和延伸酶。但是，如圖1所示和下文的描述，ARA生產(chǎn)存在兩種替代途徑。
具體地，所有途徑都需要通過(guò)Δ12去飽和酶的作用最初將油酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)A(18:2)，即ω-6脂肪酸的第一個(gè)。然后，利用ARA生物合成的“ω-6 Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑”，PUFAs通過(guò)如下過(guò)程形成(1)通過(guò)Δ6去飽和酶的作用，LA轉(zhuǎn)化為GLA；(2)通過(guò)C18/20延伸酶的作用，GLA轉(zhuǎn)化為DGLA；和(3)通過(guò)Δ5去飽和酶的作用，DGLA轉(zhuǎn)化為ARA。
或者，通過(guò)“ω-6 Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑”，LA通過(guò)Δ9延伸酶的作用轉(zhuǎn)化為EDA。然后，Δ8去飽和酶將EDA轉(zhuǎn)化為DGLA。隨后，如上文所述，DGLA隨后通過(guò)Δ5去飽和酶的作用去飽和，產(chǎn)生ARA。
為了清楚，在下表中概括了這些途徑的每一個(gè)，以及它們的區(qū)別特征 表4 ARA生物合成的替代生物合成途徑 ＊縮寫“D”＝去飽和酶；“ELO”＝延伸酶. 如果需要，可以用ARA作為底物，生產(chǎn)一些其它的PUFAs。例如，通過(guò)Δ17去飽和酶的作用，ARA可以進(jìn)一步去飽和為EPA，隨后通過(guò)C20/22延伸酶和Δ4去飽和酶的作用，轉(zhuǎn)化為DHA。
選擇用于合成ARA的微生物基因 需要導(dǎo)入解脂耶氏酵母以生產(chǎn)ARA的特定功能性將依賴于宿主細(xì)胞(及其天然PUFA譜和/或去飽和酶/延伸酶譜)、底物的可獲得性和需要的終產(chǎn)物。至于天然宿主細(xì)胞，已知解脂耶氏酵母可以天然產(chǎn)生18:2脂肪酸，因此具有天然Δ12去飽和酶(SEQ ID NOs23和24；參見(jiàn)WO 2004/104167)。至于需要的終產(chǎn)物，上文已經(jīng)在如此產(chǎn)生的油的最終脂肪酸譜(即最終的高ARA油組合物中的％GLA)方面描述了與Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑表達(dá)不同的Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑表達(dá)的結(jié)果。
因此，在一些實(shí)施方案中，需要通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑生產(chǎn)ARA。因此，為了進(jìn)行ARA生物合成，最少必須將以下基因?qū)胨拗魃锊⒈磉_(dá)Δ6去飽和酶、C18/20延伸酶和Δ5去飽和酶。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主菌株還包含下組的至少一種Δ9去飽和酶、Δ12去飽和酶、C14/16延伸酶和C16/18延伸酶。
在一種替代的實(shí)施方案中，需要生產(chǎn)ARA，而不共同合成GLA(因此需要表達(dá)Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑)。因此，為了進(jìn)行ARA生物合成，該策略最少必須將以下基因?qū)胨拗魃锊⒈磉_(dá)Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶和Δ5去飽和酶。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主菌株還包含下組的至少一種Δ9去飽和酶、Δ12去飽和酶、C14/16延伸酶和C16/18延伸酶。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠鑒定編碼ARA生物合成所需的每一種酶的多種候選基因。有用的去飽和酶和延伸酶序列可以來(lái)源于任何來(lái)源，如分離自天然來(lái)源(如細(xì)菌、藻類、真菌、植物、動(dòng)物等)，通過(guò)半合成途徑產(chǎn)生或從頭合成。盡管導(dǎo)入宿主中的去飽和酶和延伸酶基因的特定來(lái)源對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的，但用于選擇具有去飽和酶或延伸酶活性的特定多肽的考慮包括1)多肽的底物特異性；2)多肽或其成分是否是限速酶；3.)去飽和酶或延伸酶對(duì)于需要的PUFA的合成是否是必須的；和/或4.)多肽需要的輔因子。表達(dá)的多肽優(yōu)選具有與其在宿主細(xì)胞中的位置的生化環(huán)境相容的參數(shù)。例如，多肽可能必須與宿主細(xì)胞中的其它酶競(jìng)爭(zhēng)底物。因此，在確定特定多肽對(duì)于改變特定宿主細(xì)胞中的PUFA生產(chǎn)的合適性中，可能需要考慮多肽的KM分析和比活性。用于特定宿主細(xì)胞中的多肽是可以在目的宿主細(xì)胞中存在的生化條件下起作用的多肽，但也可以是具有能夠改變需要的PUFA的去飽和酶或延伸酶活性的任何多肽。
在其它實(shí)施方案中，考慮每種特定去飽和酶和/或延伸酶的轉(zhuǎn)化效率也是有用的。更具體地，由于每種酶很少以100％的效率將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的未純化油的最終脂質(zhì)譜將典型是多種PUFAs的混合物，其由需要的ARA和多種上游中間體PUFAs組成(例如，與100％ ARA油不同)。因此，當(dāng)對(duì)ARA的生物合成進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，考慮每種酶的轉(zhuǎn)化效率也是重要的，必須根據(jù)產(chǎn)物的最終需要的脂質(zhì)譜進(jìn)行考慮。
根據(jù)上述每一種考慮，可以根據(jù)公眾可獲得的文獻(xiàn)(如GenBank)、專利文獻(xiàn)和具有生產(chǎn)PUFAs的能力的微生物的實(shí)驗(yàn)分析，鑒定具有合適去飽和酶和延伸酶活性的候選基因。例如，以下GenBank獲取號(hào)表示公眾可獲得的用于ARA生物合成的基因的實(shí)例AY131238，Y055118，AY055117，AF296076，AF007561，L11421，NM_031344，AF465283，AF465281，AF110510，AF465282，AF419296，AB052086，AJ250735，AF126799，AF126798(Δ6去飽和酶)；AF199596，AF226273，AF320509，AB072976，AF489588，AJ510244，AF419297，AF07879，AF067654，AB022097(Δ5去飽和酶)；AAG36933，AF110509，AB020033，AAL13300，AF417244，AF161219，AY332747，AAG36933，AF110509，AB020033，AAL13300，AF417244，AF161219，X86736，AF240777，AB007640，AB075526，AP002063(Δ12去飽和酶)；NP_441622，BAA18302，BAA02924，AAL36934(Δ15去飽和酶)；AF338466，AF438199，E11368，E11367，D83185，U90417，AF085500，AY504633，NM_069854，AF230693(Δ9去飽和酶)；AF390174(Δ9延伸酶)；AF139720(Δ8去飽和酶)；和NP_012339，NP_009963，NP_013476，NP_599209，BAB69888，AF244356，AAF70417，AAF71789，AF390174，AF428243，NP_955826，AF206662，AF268031，AY591335，AY591336，AY591337，AY591338，AY605098，AY605100，AY630573(C14/16，C16/18和C18/20延伸酶)。類似地，專利文獻(xiàn)提供了很多參與PUFA生產(chǎn)的基因的額外DNA序列(和/或關(guān)于上述一些基因和它們的分離方法的細(xì)節(jié))[例如，WO02/077213(Δ9延伸酶)；WO 00/34439和WO 04/057001(Δ8去飽和酶)；U.S.5,968,809(Δ6去飽和酶)；U.S.5,972,664和U.S.6,075,183(Δ5去飽和酶)；WO 94/11516，U.S.5,443,974，WO 03/099216和WO 05/047485(Δ12去飽和酶)；WO 93/11245(Δ15去飽和酶)；WO 91/13972和U.S.5,057,419(Δ9去飽和酶)；U.S.2003/0196217 A1(Δ17去飽和酶)；以及WO 00/12720，U.S.6,403,349，U.S.6,677,145，U.S.2002/0139974A1，U.S.2004/0111763(C14/16，C16/18和C18/20延伸酶)]。在此全文引入這些專利和申請(qǐng)作為參考。
上文的實(shí)例不是限制性的，來(lái)源于不同來(lái)源的許多其它基因也適于導(dǎo)入解脂耶氏酵母，所述其它基因編碼(1)Δ6去飽和酶、C18/20延伸酶和Δ5去飽和酶(和任選的其它編碼Δ9去飽和酶、Δ12去飽和酶、C14/16延伸酶和/或C16/18延伸酶的基因)；或(2)Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶和Δ5去飽和酶(和任選的其它編碼Δ9去飽和酶、Δ12去飽和酶、C14/16延伸酶和/或C16/18延伸酶的基因)。
用于ARA合成的優(yōu)選基因 盡管可以廣泛選自能夠適于在解脂耶氏酵母中表達(dá)的去飽和酶和延伸酶，但是，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，去飽和酶和延伸酶選自以下這些(或其衍生物) 表5 用于在解脂耶氏酵母中進(jìn)行ARA生物合成的優(yōu)選去飽和酶和延伸酶 ＊注煙曲霉基因組項(xiàng)目由Sanger Institute、University of Manchester的合作者和The Institute of Genome Research(TIGR)資助；構(gòu)巢曲霉基因組項(xiàng)目由Center forGenome Research(CGR)，Cambridge，MA資助；M.grisea基因組項(xiàng)目由CGR和International Rice Blast Genome Consortium資助；禾谷鐮孢基因組項(xiàng)目由CGR和theInternational Gibberella zeae Genomics Consortium(IGGR)資助。
申請(qǐng)人:進(jìn)行了關(guān)于多種延伸酶的大量分析，以確定或證實(shí)在解脂耶氏酵母中表達(dá)時(shí)每種酶的底物特異性和/或底物選擇性。例如，盡管兩種解脂耶氏酵母延伸酶的編碼序列都是公眾可獲得的，并且每種蛋白被注釋為推定的長(zhǎng)鏈脂肪?；由烀富蚺c其它脂肪酸延伸酶具有顯著的同源性，但還沒(méi)有確定這些酶的底物特異性?；诖颂庍M(jìn)行的分析，YE1被肯定地確定為優(yōu)先利用C14脂肪酸作為底物制備C16脂肪酸的脂肪酸延伸酶(即C14/16 延伸酶)，YE2確定為優(yōu)先利用C16脂肪酸作為底物制備C18脂肪酸的脂肪酸延伸酶(即C16/18 延伸酶)。相關(guān)地，當(dāng)鑒定出新的高山被孢霉ELO3基因時(shí)，該序列表征為與其它脂肪酸延伸酶同源。但是，需要進(jìn)行脂質(zhì)譜分析，以證實(shí)ELO3作為C16/18延伸酶的特異性 對(duì)于Δ12去飽和酶，申請(qǐng)人得到了出乎意料的發(fā)現(xiàn)，即串珠鐮孢Δ12去飽和酶(由SEQ ID NO27編碼)以比天然解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶更高的效率起作用，在解脂耶氏酵母中生產(chǎn)18:2(參見(jiàn)WO2005/047485)。具體地，確定解脂耶氏酵母中TEF啟動(dòng)子控制下的串珠鐮孢Δ12去飽和酶的表達(dá)，以產(chǎn)生比以前通過(guò)表達(dá)TEF啟動(dòng)子控制下的編碼解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶的嵌合基因可獲得的水平(59％的LA產(chǎn)物積累)更高水平的18:2(68％的LA產(chǎn)物積累)。這相應(yīng)于底物轉(zhuǎn)化百分比的差異(計(jì)算為([18:2+18:3]/[18:1+18:2+18:3])＊100)，分別是85％和74％)。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，相對(duì)于其它已知Δ12去飽和酶，作為對(duì)解脂耶氏酵母的高ARA生產(chǎn)菌株進(jìn)行工程化的一種手段的本發(fā)明的真菌串珠鐮孢Δ12去飽和酶的表達(dá)是優(yōu)選的(但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)期，串珠鐮孢Δ12去飽和酶的活性可以在解脂耶氏酵母中增強(qiáng)，然后進(jìn)行例如密碼子優(yōu)化)。
盡管目前將串珠鐮孢Δ12酶鑒定為優(yōu)選的Δ12去飽和酶，最近已經(jīng)鑒定了五種新的Δ12去飽和酶，它們可能能夠在解脂耶氏酵母中以改進(jìn)的效率起作用。具體地，Saccharomyces kluyveri Δ12去飽和酶(GenBank獲取號(hào)BAD08375)描述于Watanabe et al.(Biosci.Biotech.Biocheml.68(3)721-727(2004))，而來(lái)自高山被孢霉的Δ12去飽和酶(GenBank獲取號(hào)AB182163)描述于Sakuradani et al.(Eur.J.Biochem.261(3)812-820(1999))。由于隨后用這兩種序列鑒定S.Kluyveri和高山被孢霉Δ15去飽和酶(分別是GenBank獲取號(hào)BAD11952和AB182163)，這兩對(duì)蛋白提供了與串珠鐮孢、構(gòu)巢曲霉、Magnaporthe grisea、粗糙鏈孢霉和禾谷鐮孢的Δ12和Δ15去飽和酶相似的密切相關(guān)的真菌Δ12和Δ15去飽和酶的額外實(shí)例(參見(jiàn)WO 2005/047480和WO 2005/047485)。這一發(fā)現(xiàn)提供了額外的支持，證明申請(qǐng)人以前的假設(shè)，即，“成對(duì)的”真菌Δ12去飽和酶樣序列很可能包含一種具有Δ15去飽和酶活性的蛋白和一種具有Δ12去飽和酶活性的蛋白。因此，本文中在乳克魯維氏酵母、白色假絲酵母、漢遜氏德巴利氏酵母CBS767和煙曲霉中鑒定了相似的“成對(duì)的”Δ12去飽和酶樣蛋白；并且，如預(yù)測(cè)的，比對(duì)的每對(duì)蛋白中的一個(gè)成員與以前鑒定的S.kluyveri Δ12去飽和酶(即乳克魯維氏酵母gnl|GLV|KLLA0B00473g ORF，白色假絲酵母GenBank獲取號(hào)EAK94955和漢遜氏德巴利氏酵母CBS767 GenBank獲取號(hào)CAG90237)關(guān)系更密切，而另一個(gè)成員與S.kluyveri Δ15去飽和酶(乳克魯維氏酵母GenBank獲取號(hào)XM_451551，漢遜氏德巴利氏酵母CBS767 GenBank獲取號(hào)CAG88182，白色假絲酵母GenBank獲取號(hào)EAL03493)關(guān)系更密切。因此，基于這一分析，申請(qǐng)人鑒定了在此表示為SEQ ID Nos358、359、361、362和363的去飽和酶為推定的真菌Δ12去飽和酶，它們?cè)诮庵辖湍钢械某勘磉_(dá)可以用于增加ω-6脂肪酸的生產(chǎn)。
在額外的實(shí)施方案中，申請(qǐng)人鑒定了容易區(qū)分具有Δ15去飽和酶活性與Δ12去飽和酶活性的真菌序列的手段。具體地，當(dāng)分析包含Δ12去飽和酶(即Mad12，Skd12，Nc d12，F(xiàn)m d12，Mg d12，An d12，F(xiàn)g d12，Dhd12p，Kld12p，Cad12p，Afd12p，Mad15，Skd15，Nc d15，F(xiàn)m d15，Mg d15，An d15，F(xiàn)g d15，Dhd15p，Kld15p，Cad15p和Afd15p(參見(jiàn)上文的表))以及Δ15去飽和酶(即來(lái)自串珠鐮孢、構(gòu)巢曲霉、Magnaporthe grisea、粗糙鏈孢霉、禾谷鐮孢、高山被孢霉、乳克魯維氏酵母、白色假絲酵母、Saccharomyces kluyveri、漢遜氏德巴利氏酵母CBS767和煙曲霉)的氨基酸序列比對(duì)時(shí)，很明顯的是所有真菌Δ15或Δ12去飽和酶分別在相應(yīng)于串珠鐮孢Δ15去飽和酶(WO2005/047479中的SEQ ID NO2)的102位并且與高度保守的His Box1(“HECGH”；SEQ ID NO373)僅僅間隔三個(gè)氨基酸殘基的位置含有Ile或Val氨基酸殘基(表6)。
表6 在真菌Δ12和Δ15去飽和酶的保守His Box 1附近的氨基酸比對(duì)
申請(qǐng)人:概括出此位置的Ile和Val分別是真菌去飽和酶中Δ15和Δ12去飽和酶特異性的決定簇。更具體地，申請(qǐng)人認(rèn)為在相應(yīng)殘基具有Ile(即，或基序IXXHECGH[SEQ ID NO374])的任何真菌Δ12去飽和酶樣蛋白將是Δ15去飽和酶，在相應(yīng)殘基具有Val(即，或基序VXXHECGH[SEQ ID NO375])的任何真菌Δ12去飽和酶樣蛋白將是Δ12去飽和酶。因此，這一單個(gè)的亮氨酸/纈氨酸將是未來(lái)鑒定和注釋真菌去飽和酶時(shí)考慮的重要?dú)埢?。此外，申?qǐng)人認(rèn)為在編碼真菌Δ12去飽和酶樣蛋白(如WO 2005/047479中描述為SEQ ID NO2的串珠鐮孢去飽和酶)的基因中，在此位置導(dǎo)致Ile改變?yōu)閂al的突變將改變酶特異性，例如對(duì)Δ12去飽和的特異性；并且，相反，在此位置的導(dǎo)致Val改變?yōu)镮le的突變將改變酶特異性，例如對(duì)Δ15去飽和的特異性。
當(dāng)然，在本發(fā)明的替代實(shí)施方案中，也可以用與SEQ ID NOs2，5，7，9，12，18，21，24，26，28，30-32，34，36，38，40，45，51，54，62，65，358，359和361-363編碼的去飽和酶和延伸酶基本相同的其它DNAs在解脂耶氏酵母中生產(chǎn)ARA?！盎鞠嗤北硎疽詢?yōu)選性增加的順序與選定的多肽或編碼氨基酸序列的核酸序列表現(xiàn)出至少80％、90％或95％同源性的氨基酸序列或核酸序列。對(duì)于多肽，比較序列的長(zhǎng)度通常是至少16個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸，或最優(yōu)選35個(gè)氨基酸。對(duì)于核酸，比較序列的長(zhǎng)度通常是至少50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少75個(gè)核苷酸，最優(yōu)選110個(gè)核苷酸。
同源性典型地是用序列分析軟件測(cè)量的，其中術(shù)語(yǔ)“序列分析軟件”表示可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何計(jì)算機(jī)算法或軟件程序。“序列分析軟件”可以是通過(guò)商業(yè)渠道獲得的或者獨(dú)立開(kāi)發(fā)的。典型的序列分析軟件包括，但不局限于1.)GCG程序組(WisconsinPackage Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP，BLASTN，BLASTX(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)；和4.)采用了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date 1992，111-20.Editor(s)Suhai，Sandor.PlenumNew York，NY)。在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)理解的是，在將序列分析軟件用于分析時(shí)，分析的結(jié)果是基于有關(guān)程序的“缺省值”的，除非另有說(shuō)明。在本文中，“缺省值”表示在初次初始化時(shí)最初隨所述軟件加載的任何組的值或參數(shù)。一般地，所述計(jì)算機(jī)軟件通過(guò)給多個(gè)取代、缺失和其它修飾賦予同源性程度而匹配相似的序列。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用了編碼與SEQ ID NOs2、9、12、18、21、40、45和51描述的序列基本相同的去飽和酶和延伸酶的密碼子優(yōu)化的基因。具體地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以通過(guò)增加編碼的mRNAs的翻譯效率，增加異源基因的表達(dá)，所述翻譯效率的增加是通過(guò)用選擇的宿主微生物中進(jìn)行最優(yōu)基因表達(dá)的密碼子替代天然基因中的密碼子而實(shí)現(xiàn)的。因此，修飾要在外源宿主中表達(dá)的編碼特定多肽的密碼子的一部分通常是有用的，這樣，修飾的多肽利用替代宿主優(yōu)選的密碼子，并且，宿主優(yōu)選的密碼子的利用可以顯著增強(qiáng)編碼多肽的外源基因的表達(dá)。
一般地，通過(guò)檢驗(yàn)蛋白(優(yōu)選以最大量表達(dá)的那些)中的密碼子選擇和確定哪些以最高的頻率使用，可以在特定感興趣的宿主物種中確定宿主優(yōu)選的密碼子。然后，可以用宿主物種中優(yōu)選的密碼子全部或部分地合成感興趣的多肽(如去飽和酶、延伸酶、?；D(zhuǎn)移酶)的編碼序列。也可以合成DNA的全部(或部分)，以除去轉(zhuǎn)錄的mRNA中存在的任何二級(jí)結(jié)構(gòu)去穩(wěn)定序列或區(qū)域。也可以合成DNA的全部(或部分)，以將堿基組成改變成在需要的宿主細(xì)胞中更優(yōu)選的組成。
此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)翻譯起始密碼子‘ATG’附近的核苷酸序列影響酵母細(xì)胞中的表達(dá)。如果需要的多肽在酵母中的表達(dá)不良，可以修飾外源基因的核苷酸序列，以引入有效的酵母翻譯起始序列，獲得最優(yōu)的基因表達(dá)。為了在酵母中表達(dá)，可以通過(guò)對(duì)效率不佳地表達(dá)的基因的定點(diǎn)誘變而實(shí)現(xiàn)，所述誘變是通過(guò)將其與內(nèi)源酵母基因，優(yōu)選高表達(dá)的基因符合讀框地融合而實(shí)現(xiàn)的?；蛘?，如此處對(duì)于解脂耶氏酵母所證明的，可以確定宿主中的共有翻譯起始序列，并且將該序列工程化為異源序列，以便它們?cè)诟信d趣的宿主中最優(yōu)表達(dá)。
在本發(fā)明中，表5的一些去飽和酶和延伸酶基因?yàn)樵诮庵辖湍钢斜磉_(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，該優(yōu)化是基于上文描述的宿主優(yōu)先性。這可能是通過(guò)首先確定解脂耶氏酵母密碼子選擇譜(參見(jiàn)WO04/101757)并且鑒定優(yōu)選的密碼子。然后，為了進(jìn)一步優(yōu)化解脂耶氏酵母中的基因表達(dá)，確定‘ATG’起始密碼子附近的共有序列(即‘MAMMATGNHS’(SEQ ID NO356)，其中使用的核酸簡(jiǎn)并密碼如下M＝A/C；S＝C/G；H＝A/C/T；和N＝A/C/G/T)。下文的表7比較了在解脂耶氏酵母中表達(dá)時(shí)天然和密碼子優(yōu)化的基因的活性，并且提供了關(guān)于每種密碼子優(yōu)化的基因的細(xì)節(jié)。％ Sub.Conv.是“底物轉(zhuǎn)化百分比”的縮寫，Codon-Opt.是“密碼子優(yōu)化的”的縮寫。
表7 對(duì)于在解脂耶氏酵母中進(jìn)行ARA生物合成最優(yōu)選的密碼子優(yōu)化的去飽和酶和延伸酶 在本發(fā)明的額外的替代方案中，盡管其它一些DNAs不是與SEQID NOs3、10、13、16、19、22、41、48和52所示的優(yōu)選去飽和酶和延伸酶基本相同，也可以用于此處的目的。例如，可以用于根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)導(dǎo)入解脂耶氏酵母中的編碼Δ6去飽和酶多肽的DNA序列可以獲自具有生產(chǎn)GLA或STA的能力的微生物。所述微生物包括例如屬于以下屬的微生物被孢霉屬、耳霉屬、腐霉屬、疫霉屬、青霉屬、紫球藻屬、Coidosporium、毛霉屬、鐮孢屬、曲霉屬、紅酵母屬和蟲霉屬。在紫球藻屬中，特別感興趣的是P.Cruentum。在被孢霉屬中，特別感興趣的是長(zhǎng)形被孢霉、微小被孢霉、喜濕被孢霉、拉曼被孢霉angulispora變種和高山被孢霉。在毛霉屬中，特別感興趣的是卷枝毛霉和爪哇毛霉。
或者，例如，一種相關(guān)的去飽和酶不是與高山被孢霉Δ6去飽和酶基本相同，但可以在距離分子的羧基末端的第6個(gè)碳的位置對(duì)脂肪酸分子去飽和，該去飽和酶也可以用于本發(fā)明中作為Δ6去飽和酶，認(rèn)為該去飽和酶仍然可以有效將LA轉(zhuǎn)化為GLA和/或?qū)LA轉(zhuǎn)化為STA。因此，通過(guò)與此處公開(kāi)的去飽和酶和延伸酶起基本相同的作用的能力，可以鑒定(或制備)相關(guān)的去飽和酶和延伸酶。
如上文所提示的，在另一實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備具有適于此處目的的Δ12去飽和酶和Δ6去飽和酶活性的融合蛋白。通過(guò)將Δ12去飽和酶和Δ6去飽和酶與連接的接頭融合在一起，這是可能的。Δ12去飽和酶或Δ6去飽和酶可以位于融合蛋白的N末端部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易了解設(shè)計(jì)和合成合適的接頭分子的方法，例如，接頭可以是一段丙氨酸或賴氨酸，并且不影響融合酶的活性。
最后，本領(lǐng)域公知，文獻(xiàn)中充分記載了合成序列和將序列連接在一起的方法。因此，可以用體外誘變和選擇、定點(diǎn)誘變、化學(xué)誘變、“基因改組”方法或其它方法，獲得天然存在的去飽和酶和/或延伸酶基因的突變。這使得能夠在體內(nèi)生產(chǎn)分別具有去飽和酶或延伸酶活性的多肽，其具有在宿主細(xì)胞中起作用的理想的物理和動(dòng)力學(xué)參數(shù)(如更長(zhǎng)的半衰期或生產(chǎn)需要的PUFA的更高速度)。
總之，盡管提出了編碼適于在解脂耶氏酵母中生產(chǎn)ARA的PUFA生物合成途徑酶的優(yōu)選去飽和酶和延伸酶基因的序列，這些基因不意欲限制本發(fā)明?？梢詮亩喾N來(lái)源(如具有合適去飽和酶或延伸酶活性的野生型、密碼子優(yōu)化的、合成的和/或突變的酶)分離適于此處目的的許多其它編碼PUFA生物合成途徑酶的基因。這些替代去飽和酶的特征可以在于以下能力1.)在從分子的羧基末端開(kāi)始計(jì)數(shù)的第8和9個(gè)碳原子之間對(duì)脂肪酸去飽和，并且催化EDA轉(zhuǎn)化為DGLA(Δ8去飽和酶)；2.)催化LA轉(zhuǎn)化為GLA(Δ6去飽和酶)；3.)催化DGLA轉(zhuǎn)化為ARA(Δ5去飽和酶)；4.)催化油酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)A(Δ12去飽和酶)；和/或5.)催化棕櫚酸轉(zhuǎn)化為棕櫚油酸和/或硬脂酸轉(zhuǎn)化為油酸(Δ9去飽和酶)。以相似的方式，用于此處目的的合適延伸酶不限于來(lái)自特定來(lái)源的那些。相反，具有適于此處目的的用途的酶的特征在于它們將脂肪酸碳鏈相對(duì)于延伸酶作用的底物延長(zhǎng)2個(gè)碳，從而生產(chǎn)單或多不飽和脂肪酸的能力。更特別地，這些酶的特征在于以下能力1.)將LA延伸為EDA(Δ9延伸酶)；2.)延伸C18底物，以生產(chǎn)C20產(chǎn)物(C18/20延伸酶)；3.)延伸C14底物，以生產(chǎn)C16產(chǎn)物(C14/16延伸酶)；和/或4.)延伸C16底物，以生產(chǎn)C18產(chǎn)物(C16/18延伸酶)。重要的是注意一些延伸酶能夠催化一些延伸酶反應(yīng)，作為廣泛底物特異性的結(jié)果。
?；D(zhuǎn)移酶及其在TAG生物合成的終末步驟中的作用 ?；D(zhuǎn)移酶密切參與TAGs的生物合成。關(guān)于酵母中的TAG生物合成，包括參與的基因的細(xì)節(jié)和導(dǎo)致TAG合成的代謝中間體的兩篇全面的短綜述是D.Sorger and G.Daum，Appl.Microbiol.Biotechnol.61289-299(2003)；和H.Müllner and G.Daum，ActaBiochimica Polonica，51(2)323-347(2004)。盡管這些綜述的作者明確概括了真核動(dòng)物?；D(zhuǎn)移酶基因家族的不同種類(下文)，但他們也承認(rèn)TAG合成的調(diào)節(jié)方面和脂質(zhì)顆粒中中性脂質(zhì)的形成仍然還不清楚。
已經(jīng)鑒定了四種真核動(dòng)物?；D(zhuǎn)移酶基因家族，它們參與?；?CoA依賴性或非依賴性酯化反應(yīng)，導(dǎo)致中性脂質(zhì)合成 (1)?；?CoA:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)家族，EC 2.3.1.26(通常稱作固醇?；D(zhuǎn)移酶)。這個(gè)基因家族包括負(fù)責(zé)將?；?CoA和固醇轉(zhuǎn)化為CoA和固醇酯的酶。這個(gè)家族也包括參與TAG生物合成的終末步驟的DGAT1。
(2)卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)家族，EC 2.3.1.43。這個(gè)基因家族負(fù)責(zé)將磷脂酰膽堿和固醇轉(zhuǎn)化為固醇酯和1-?；视土姿崮憠A。這個(gè)家族也包括參與將?；鶑牧字膕n-2位置轉(zhuǎn)移到1，2-二酰基甘油的sn-3位置，導(dǎo)致TAG生物合成的磷脂二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)。
(3)二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DAG AT)家族，EC 2.3.1.20。這個(gè)基因家族(包括DGAT2)參與TAG生物合成的終末步驟。
(4)甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶和酰基-CoA溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT/LPAAT)家族。GPAT(E.C.2.3.1.15)蛋白負(fù)責(zé)TAG生物合成的第一步，而LPAAT(E.C.2.3.1.51)參與TAG生物合成的第二步。這個(gè)家族也包括催化磷脂和CoA之間的酰基交換的溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶(LPCAT)。
這4個(gè)?；D(zhuǎn)移酶基因家族一起代表用于中性脂質(zhì)形成的重疊生物合成系統(tǒng)，并且似乎是差異調(diào)節(jié)、可變定位和不同底物特異性的結(jié)果(H.Müllner and G.Daum，supra)。在此將基于它們對(duì)解脂耶氏酵母中的代謝工程化的重要性對(duì)這4個(gè)基因家族進(jìn)行討論，以使得能夠合成高于10-30％的ARA。
多種酰基轉(zhuǎn)移酶的功能性 圖4中概括了解脂耶氏酵母中很多所述?；D(zhuǎn)移酶之間的相互作用。最初注意TAG生物合成的直接機(jī)理，該過(guò)程的第一步是一個(gè)分子的?；?CoA經(jīng)GPAT酯化為sn-甘油-3-磷酸，以生產(chǎn)溶血磷脂酸(LPA)(CoA作為副產(chǎn)物)。然后，通過(guò)第二個(gè)分子的酰基-CoA的酯化，溶血磷脂酸轉(zhuǎn)化為磷脂酸(PA)(CoA作為副產(chǎn)物)，該反應(yīng)是LPAAT催化的。然后，磷脂酸磷脂酶負(fù)責(zé)從磷脂酸除去磷酸基團(tuán)，產(chǎn)生1，2-二酰基甘油(DAG)。隨后，通過(guò)DAG AT(如DGAT1、DGAT2或PDAT)將第三個(gè)脂肪酸加入DAG的sn-3位置，形成TAG。
以前，認(rèn)為DGAT1是唯一專門參與TAG合成的酶，催化負(fù)責(zé)將酰基-CoA和DAG轉(zhuǎn)為為TAG和CoA的反應(yīng)，其中?；?CoA基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DAG，形成TAG。已知DGAT1與ACATs同源；但是，最近的研究鑒定了新的DAG AT酶家族，它們與ACAT基因家族無(wú)關(guān)。因此，現(xiàn)在的命名區(qū)分了與ACAT基因家族相關(guān)的DAG AT酶(DGAT1家族)和不相關(guān)的DAG AT酶(DGAT2家族)(Lardizabalet al.，J.Biol.Chem.276(42)38862-38869(2001))。在真核生物的所有主要門(真菌、植物、動(dòng)物和基礎(chǔ)真核生物)中鑒定了DGAT2家族的成員。
最近，Dahlqvist等人(Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)976487-6492(2000))和Oelkers等人(J.Biol.Chem.27515609-15612(2000))發(fā)現(xiàn)了在不存在?；?CoA的條件下，通過(guò)?；?CoA非依賴性機(jī)理，也可以發(fā)生TAG合成。具體地，PDAT除去磷脂酰膽堿底物sn-2位置的?；D(zhuǎn)移到DAG，以生產(chǎn)TAG。該酶與LCAT家族結(jié)構(gòu)上相關(guān)；盡管PDAT的功能不像DGAT2那樣充分表征，已經(jīng)推測(cè)PDAT在從一些油籽植物中的磷脂除去“不常見(jiàn)”脂肪酸中起主要作用(Banas，A.et al.，Biochem.Soc.Trans.28(6)703-705(2000))。
對(duì)于啤酒糖酵母中的TAG合成，描述了三種途徑(Sandager，L.et al.，J.Biol.Chem.277(8)6478-6482(2002))。首先，主要通過(guò)DGAT2活性(由DGA1基因編碼)，從DAG和酰基-CoAs合成TAGs。但是，更近年來(lái)，也鑒定了PDAT(由LRO1基因編碼)。最后，已知兩種?；?CoA:固醇-?；D(zhuǎn)移酶(由ARE1和ARE2基因編碼)利用?；?CoAs和固醇生產(chǎn)固醇酯(和低量TAGs；參見(jiàn)Sandager et al.，Biochem.Soc.Trans.28(6)700-702(2000))。PDAT和DGAT2一起負(fù)責(zé)啤酒糖酵母中的大約95％的油生物合成。
基于一些公眾可得到的編碼DGAT1s、DGAT2s、PDATs和ARE2s的序列(參見(jiàn)下文)，申請(qǐng)人在解脂耶氏酵母中分離和表征了編碼DGAT1(SEQ ID NO81)、DGAT2(SEQ ID NOs89、91和93[其中SEQ ID NO89含有至少兩個(gè)額外的嵌套ORFs，如SEQ ID NOs91和93中提供的；SEQ ID NO93編碼的ORF與其它已知DGAT酶具有高度的相似程度，SEQ ID NO93中的破壞消除了天然基因的DGAT功能，從而證明了SEQ ID NO94的多肽具有DGAT功能])、PDAT(SEQ ID NO76)和ARE2(SEQ ID NO78)的基因。但是，與在啤酒糖酵母中開(kāi)發(fā)的模型(其中PDAT和DGAT2負(fù)責(zé)大約95％的油生物合成)相反，發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母的PDAT、DGAT2和DGAT1負(fù)責(zé)最高達(dá)大約95％的油生物合成(而ARE2可能額外是油生物合成的次要決定因素)。
功能對(duì)于解脂耶氏酵母的TAG級(jí)分中的ARA聚集重要的最后一種酰基轉(zhuǎn)移酶是LPCAT。如圖4所示，該酶(EC 2.3.1.23)被假定為負(fù)責(zé)sn-磷脂酰膽堿的sn-2位置上的雙向?；粨Q，以增強(qiáng)ω-6和ω-3PUFA生物合成。這種假定基于以下研究(1)Stymne S.and A.K.Stobart(Biochem J.223(2)305-14(1984))，他們假定LPCAT影響酰基-CoA集合和磷脂酰膽堿(PC)集合之間的交換；(2)Domergue，F(xiàn).et al.(J.Bio.Chem 27835115(2003))，它們提示PC的sn-2位置上GLA的積累和不能在酵母中有效合成ARA，是參與?；?CoA集合中發(fā)生的PUFA生物合成的延伸步驟的結(jié)果，而Δ5和Δ6去飽和步驟主要發(fā)生在PC的sn-2位置；(3)Abbadi，A.et al.(The Plant Cell，162734-2748(2004))，他們基于對(duì)轉(zhuǎn)基因油籽植物中PUFA積累的約束的分析，提示LPCAT在Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑的成功重建中起關(guān)鍵作用；和(4)WO 2004/076617 A2(Renz，A.et al.)，他們提供了編碼來(lái)自秀麗新桿線蟲的LPCAT(T06E8.1)的基因，該LPCAT顯著改進(jìn)了啤酒糖酵母中遺傳學(xué)導(dǎo)入的Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑中的延伸效率。本發(fā)明人概括出LPCAT使得能夠在磷脂和?；?CoA集合之間有效和連續(xù)交換新合成的脂肪酸，因?yàn)槿ワ柡兔复呋|(zhì)偶聯(lián)的脂肪酸(sn-2酰基PC)中雙鍵的導(dǎo)入，而延伸酶專門催化CoA酯化的脂肪酸(?；?CoAs)的延伸。
用于ARA合成的異源酰基轉(zhuǎn)移酶基因的選擇 由于解脂耶氏酵母中天然生產(chǎn)的PUFAs限于18:2脂肪酸(較不常見(jiàn)的是18:3脂肪酸)，很可能宿主生物中編碼GPAT、LPAAT(即LPAAT1或LPAAT2)、DGAT1、DGAT2、PDAT和LPCAT的天然基因難以有效合成包含18:3和更長(zhǎng)(如ARA)的脂肪酸的TAGs。因此，在某些情況下，異源(或“外源”)?；D(zhuǎn)移酶比天然酶優(yōu)選。
在多種生物中鑒定了許多?；D(zhuǎn)移酶基因，并且公開(kāi)于公共和專利文獻(xiàn)中。例如，以下GenBank獲取號(hào)表示公眾可得到的、用于脂質(zhì)生物合成中的酰基轉(zhuǎn)移酶基因CQ891256，AY441057，AY360170，AY318749，AY093169，AJ422054，AJ311354，AF251795，Y00771，M77003(GPATs)；Q93841，Q22267，Q99943，O15120，Q9NRZ7，Q9NRZ5，Q9NUQ2，O35083，Q9D1E8，Q924S1，Q59188，Q42670，P26647，P44848，Q9ZJN8，O25903Q42868，Q42870，P26974，P33333，Q9XFW4，CQ891252，CQ891250，CQ891260，CQ891258，CQ891248，CQ891245，CQ891241，CQ891238，CQ891254，CQ891235(LPAATs)；AY445635，BC003717，NM_010046，NM_053437，NM_174693，AY116586，AY327327，AY327326，AF298815和AF164434(DGAT1s)；以及NC_001147[基因座NP_014888]，NM_012079，NM_127503，AF051849，AJ238008，NM_026384，NM_010046，AB057816，AY093657，AB062762，AF221132，AF391089，AF391090，AF129003，AF251794 and AF164434(DGAT2s)；P40345，O94680，NP_596330，NP_190069和AB006704[gi2351069](PDATs)。類似地，專利文獻(xiàn)提供了很多參與TAG生產(chǎn)的基因的額外DNA序列(和/或關(guān)于上文的一些基因及其分離方法的細(xì)節(jié))[例如U.S.5,210,189，WO 2003/025165(GPATs)；EP1144649 A2，EP1131438，U.S.5,968,791，U.S.6,093,568，WO 2000/049156和WO 2004/087902(LPAATs)；U.S.6,100,077，U.S.6,552,250，U.S.6,344,548，US2004/0088759A1和US 20040078836A1(DGAT1s)；US 2003/124126，WO 2001/034814，US 2003/115632，US 2003/0028923和US2004/0107459(DGAT2s)；WO 2000/060095(PDATs)；以及WO2004/076617 A2(LPCATs)。
上文的實(shí)例不是限制性的，來(lái)源于不同來(lái)源的許多其它編碼DGAT1、DGAT2、PDAT、GPAT、LPCAT和LPAAT的基因也適于導(dǎo)入解脂耶氏酵母中。例如，申請(qǐng)人從高山被孢霉(SEQ ID NOs83和84)、粗糙鏈孢霉(SEQ ID NO85)、玉蜀黍赤霉PH-1(SEQID NO86)、Magnaporthe grisea(SEQ ID NO87)以及構(gòu)巢曲霉(SEQ ID NO88)鑒定了新的DGAT1；并且從高山被孢霉鑒定了新的DGAT2(SEQ ID NOs95和96)、GPAT(SEQ ID NOs97和98)、LPAAT1(SEQ ID NOs67和68)以及LPAAT2(SEQ IDNOs69和70)。
用于ARA合成的優(yōu)選?；D(zhuǎn)移酶基因 盡管可以適于在解脂耶氏酵母中表達(dá)的?；D(zhuǎn)移酶有廣泛的選擇，但是，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，DGAT1、DGAT2、PDAT、GPAT、LPAAT和LPCAT選自生產(chǎn)大量較長(zhǎng)鏈ω-6(如ARA)和/或ω-3(如EPA、DHA)PUFAs的生物。因此，特別優(yōu)選的是以下酶(或其衍生物) 表8 用于在解脂耶氏酵母的高ARA生產(chǎn)菌株中表達(dá)的優(yōu)選異源?；D(zhuǎn)移酶 盡管不意欲限制本發(fā)明，選擇高山被孢霉作為異源酰基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)選來(lái)源，因?yàn)樵撎烊簧锬軌蚝铣蓾舛雀哂诳傊舅?TFAs)的50％的ARA。以相似的方式，秀麗新桿線蟲能夠生產(chǎn)最高達(dá)其TFAs的20-30％的EPA。
當(dāng)然，在本發(fā)明的替代實(shí)施方案中，也可以將與SEQ ID NOs67，68，69，70，80，83，84，95，96，97和98編碼的?；D(zhuǎn)移酶基本相同的其它DNAs用于在解脂耶氏酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，以促進(jìn)TAG級(jí)分中ARA的生產(chǎn)和積累。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用了編碼與SEQ ID NOs67-70，80，83，84和95-98基本相同的?；D(zhuǎn)移酶的密碼子優(yōu)化的基因。
用于表達(dá)外源基因的通用表達(dá)系統(tǒng)、盒、載體和轉(zhuǎn)化 含有指導(dǎo)外源蛋白的高水平表達(dá)的調(diào)節(jié)序列，如導(dǎo)致高水平生產(chǎn)ARA的調(diào)節(jié)序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。上述任何載體都可以用于構(gòu)建編碼優(yōu)選的去飽和酶、延伸酶和?；D(zhuǎn)移酶的嵌合基因。然后可以用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化方法將這些嵌合基因?qū)虢庵辖湍钢?，以提供編碼的酶的高水平表達(dá)。
用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的載體或DNA盒是本領(lǐng)域公知的。構(gòu)建體中存在的序列的特定選擇依賴于需要的表達(dá)產(chǎn)物、宿主細(xì)胞的性質(zhì)和提出的分離轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法。但是，典型地，載體或盒含有指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標(biāo)記和使得能夠進(jìn)行自主復(fù)制和染色體整合的序列。合適的載體包含控制轉(zhuǎn)錄起始的基因的5’的區(qū)域(如啟動(dòng)子)和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3’的區(qū)域(如終止子)。當(dāng)兩個(gè)控制區(qū)都來(lái)自轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的基因時(shí)是最優(yōu)選的，但是，應(yīng)該理解，所述控制區(qū)不一定必須來(lái)自選作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因。
當(dāng)從分開(kāi)的復(fù)制載體表達(dá)兩種或更多種基因時(shí)，理想的是每種載體具有不同的選擇方法，并且應(yīng)該缺乏與其它構(gòu)建體的同源性，以維持穩(wěn)定的表達(dá)并且防止構(gòu)建體之間元件的重新分配。調(diào)節(jié)區(qū)的明智選擇、選擇方法和導(dǎo)入的構(gòu)建體的增殖方法可以實(shí)驗(yàn)確定，由此以必須的水平表達(dá)所有導(dǎo)入的基因，并且提供需要的產(chǎn)物的合成。
可以通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將包含感興趣的基因的構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。這些技術(shù)包括轉(zhuǎn)化(如醋酸鋰轉(zhuǎn)化[Methods in Enzymology，194186-187(1991)])、原生質(zhì)體融合、bolistic impact、電穿孔、微注射或任何其它將感興趣的基因?qū)胨拗骷?xì)胞的方法。適用于解脂耶氏酵母的更特別的教導(dǎo)包括美國(guó)專利No.4,880,741和No.5,071,764以及Chen，D.C.et al.(Appl Microbiol Biotechnol.48(2)232-235(1997))。
為了方便起見(jiàn)，業(yè)已通過(guò)任何方法操作以攝入DNA序列(例如，表達(dá)盒)的宿主細(xì)胞在本文中被稱作“轉(zhuǎn)化的”或“重組的”。轉(zhuǎn)化的宿主具有至少一個(gè)拷貝的表達(dá)構(gòu)建體，并且可以具有兩個(gè)或兩個(gè)以上拷貝，這取決于所述基因是整合在所述基因組上、擴(kuò)增的、或者存在于具有多個(gè)拷貝的染色體外元件上。可以通過(guò)多種選擇技術(shù)鑒定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，如WO 2004/101757和WO 2005/003310中的描述。
此處使用的優(yōu)選選擇方法是對(duì)卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性以及在缺少尿嘧啶、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸或組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力。在替代的實(shí)施方案中，為了選擇酵母Ura-轉(zhuǎn)化體，使用5’-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”)。該化合物對(duì)具有起作用的編碼乳清苷5’-一磷酸脫羧酶(OMP脫羧酶)的URA3基因的酵母細(xì)胞具有毒性；因此，基于該毒性，5-FOA對(duì)于Ura-突變酵母株的選擇和鑒定特別有用(Bartel，P.L.and Fields，S.，Yeast 2-Hybrid System，Oxford UniversityNew York，v.7，pp109-147，1997)。
此處用到的一種替代的優(yōu)選選擇方法依賴于解脂耶氏酵母的顯性、非抗生素標(biāo)記，該標(biāo)記基于磺酰脲抗性。該技術(shù)通常也適用于其它可能是單倍、二倍、非整倍或雜合的工業(yè)酵母株。預(yù)計(jì)它克服了對(duì)于開(kāi)發(fā)工業(yè)酵母株的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的兩個(gè)主要限制，這兩個(gè)限制是(1)幾乎不存在天然營(yíng)養(yǎng)缺陷株，并且由于這些株的倍性阻礙了自發(fā)或誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變體的分離；和(2)抗生素抗性標(biāo)記的利用可能限制了菌株的商業(yè)用途，這是因?yàn)閷?duì)攜帶抗生素抗性基因的遺傳修飾的生物的釋放的限制。盡管Puig等人(J.Agric.Food Chem.461689-1693(1998))開(kāi)發(fā)了基于靶菌株的基因工程的、克服這些限制的方法以使其對(duì)于尿苷是營(yíng)養(yǎng)缺陷的，并且隨后利用了URA3標(biāo)記以誘導(dǎo)感興趣的形狀，但該策略仍然被認(rèn)為對(duì)于常規(guī)工作來(lái)說(shuō)過(guò)于費(fèi)力。
此處公開(kāi)的用于轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的新的磺酰脲抗性選擇標(biāo)記不僅僅依賴于外源基因，也依賴于突變的天然基因。因此，它不需要營(yíng)養(yǎng)缺陷，也不導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)缺陷，并且允許轉(zhuǎn)化野生型菌株。更具體地，標(biāo)記基因(SEQ ID NO280)是一種天然的乙酰羥酸合酶(AHAS或乙酰乳酸合酶；E.C.4.1.3.18)，其具有賦予磺酰脲除草劑抗性的單個(gè)氨基酸改變(W497L)。AHAS是支鏈氨基酸的生物合成途徑中的第一種常見(jiàn)酶，它是磺酰脲和咪唑烷酮除草劑的靶。在啤酒糖酵母中報(bào)道了W497L突變(Falco，S.C.，et al.，Dev.Ind.Microbiol.30187-194(1989)；Duggleby，R.G.，et.al.Eur.J.Biochem.2702895(2003))。初步的測(cè)試確定了耶氏酵母細(xì)胞對(duì)于除草劑不是天然具有抗性的，這是因?yàn)?.)對(duì)除草劑的攝取不良或不攝??；2.)存在天然的除草劑抗性形式的AHAS；和/或3.)利用了除草劑滅活機(jī)制。因此，這使得能夠合成和利用突變的AHAS基因(SEQ ID NO280)作為選擇轉(zhuǎn)化體的手段。
一種再循環(huán)選擇標(biāo)記的額外方法依賴于位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)。簡(jiǎn)言之，該位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)由兩個(gè)元件組成(1)具有特征性DNA序列[如LoxP]的重組位點(diǎn)；和(2)當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)重組位點(diǎn)在相同DNA分子[如Cre]上以特定間隔按相同方向定位時(shí)特異性結(jié)合于DNA序列并且催化DNA序列之間的重組(即切割)的重組酶。該方法具有作為選擇工具的用途，因?yàn)樗梢浴霸傺h(huán)”一對(duì)優(yōu)選的選擇標(biāo)記，用于它們?cè)诙啻芜B續(xù)轉(zhuǎn)化中的用途。
更具體地，建立了整合構(gòu)建體，其包含需要插入宿主基因組的靶基因(如去飽和酶、延伸酶、?；D(zhuǎn)移酶)以及側(cè)翼于重組位點(diǎn)的第一選擇標(biāo)記(如Ura3、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶[HPT])。在轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化和選擇后，通過(guò)導(dǎo)入攜帶第二選擇標(biāo)記(如磺酰脲抗性[AHAS])和適于識(shí)別導(dǎo)入基因組中的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的重組酶的復(fù)制質(zhì)粒，從染色體切下第一選擇標(biāo)記。選擇攜帶第二標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體和證明第一選擇標(biāo)記從宿主基因組切下后，在無(wú)選擇的條件下從宿主收獲復(fù)制的質(zhì)粒。這產(chǎn)生了既不存在第一標(biāo)記也不存在第二標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體，因此，經(jīng)過(guò)消除的菌株可以用于另一輪轉(zhuǎn)化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到，該方法不限于用于本發(fā)明的特定選擇標(biāo)記或位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。
外源基因在解脂耶氏酵母中的超量表達(dá) 正如技術(shù)人員所了解的，僅僅將基因(如去飽和酶)插入克隆載體，不能確保它能夠在需要的水平上成功地表達(dá)。可能需要操縱多種不同的遺傳元件，這些遺傳元件控制轉(zhuǎn)錄，翻譯，蛋白穩(wěn)定性，含氧極限，以及從宿主細(xì)胞的分泌。更具體地講，可以通過(guò)改變以下方面控制基因表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和終止子序列的性質(zhì)；克隆基因的拷貝數(shù)量；基因是質(zhì)粒攜帶的或者是整合到宿主細(xì)胞的基因組上；合成的外源蛋白的最終細(xì)胞定位；宿主生物的翻譯效率；克隆的基因蛋白在宿主細(xì)胞中的內(nèi)在穩(wěn)定性；和克隆的基因內(nèi)的密碼子選擇，這樣它的頻率接近宿主細(xì)胞的優(yōu)選密碼子使用頻率。下文將討論這些超量表達(dá)方法中的一些，并且用于本發(fā)明中作為在解脂耶氏酵母中超量表達(dá)例如去飽和酶、延伸酶和酰基轉(zhuǎn)移酶的手段。
通過(guò)使用較強(qiáng)的啟動(dòng)子(如調(diào)節(jié)型或組成型)導(dǎo)致表達(dá)增加、通過(guò)從mRNA或編碼的蛋白除去/缺失去穩(wěn)定序列、或通過(guò)給mRNA增加穩(wěn)定序列(U.S.4,910,141)，可以在轉(zhuǎn)錄水平增加需要的基因的表達(dá)。
可用于在需要的宿主細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)去飽和酶、延伸酶和?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動(dòng)子是多種多樣的，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。實(shí)際上，能夠指導(dǎo)這些基因在解脂耶氏酵母中表達(dá)的任何啟動(dòng)子都適合本發(fā)明。在宿主細(xì)胞中的表達(dá)能夠以瞬時(shí)或穩(wěn)定的方式進(jìn)行。瞬時(shí)表達(dá)可以通過(guò)誘導(dǎo)可操作地連接在感興趣的基因上的可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的活性而實(shí)現(xiàn)；或者穩(wěn)定表達(dá)可以通過(guò)使用可操作地與感興趣的基因連接的組成型啟動(dòng)子而實(shí)現(xiàn)。例如，當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母時(shí)，提供能夠在酵母細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯區(qū)，特別是來(lái)自宿主物種的那些。例如，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)區(qū)可以從以下渠道獲得1.)糖酵解途徑中的基因，如醇脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油變位酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、磷酸甘油酸激酶、甘油-3-磷酸O-?；D(zhuǎn)移酶等；或2.)可調(diào)節(jié)的基因，如酸性磷酸酶、乳糖酶、金屬硫蛋白、葡糖淀粉酶、翻譯延伸因子EF1-α(TEF)蛋白(U.S.6,265,185)、核糖體蛋白S7(U.S.6,265,185)等?？梢允褂枚喾N調(diào)節(jié)序列中的任意一種，這取決于是需要組成型轉(zhuǎn)錄還是誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄、啟動(dòng)子在表達(dá)感興趣的ORF方面的效率、構(gòu)建的方便性等。上面提供的實(shí)例不意欲限制本發(fā)明。
本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，可以用多種方法比較多種啟動(dòng)子的活性。這種類型的比較可以用于促進(jìn)確定用于將來(lái)的應(yīng)用中的每種啟動(dòng)子的強(qiáng)度，其中一組啟動(dòng)子對(duì)于構(gòu)建用于生產(chǎn)ω-6和ω-3脂肪酸的嵌合基因是必要的。因此，可能有用的是基于報(bào)道基因表達(dá)(即編碼β-葡萄醛酸酶(GUS)的大腸桿菌基因)而對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行間接定量的方法。在替代的實(shí)施方案中，有時(shí)用更定量性的方法對(duì)啟動(dòng)子活性進(jìn)行定量可能是有用的。一種合適的方法是使用實(shí)時(shí)PCR(對(duì)于實(shí)時(shí)PCR應(yīng)用的一般綜述，參見(jiàn)Ginzinger，D.J.，Experimental Hematology，30503-512(2002))。實(shí)時(shí)PCR基于熒光報(bào)道分子的檢測(cè)和定量。信號(hào)的增加與反應(yīng)中PCR產(chǎn)物的量成正比。通過(guò)記錄每個(gè)循環(huán)的熒光發(fā)射量，可以在指數(shù)期監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)，其中PCR產(chǎn)物量的第一次顯著增加與靶模板的起始量相關(guān)。存在兩種用于定量檢測(cè)擴(kuò)增子的通用方法(1)使用熒光探針；或(2)使用DNA結(jié)合劑(如SYBR-green I、溴化乙錠)。對(duì)于相對(duì)基因表達(dá)比較，有必要使用內(nèi)源對(duì)照作為內(nèi)部參照(如染色體編碼的16S rRNA基因)，從而對(duì)加入每個(gè)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中的總DNA量的差異進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。用于實(shí)時(shí)PCR的具體方法在本領(lǐng)域有充分記載。參見(jiàn)例如the Real Time PCR SpecialIssue(Methods，25(4)383-481(2001))。
在實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)后，用記錄的熒光強(qiáng)度對(duì)模板的量進(jìn)行定量，這是通過(guò)采用1.)絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物方法(其中使用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物，如體外翻譯的RNA(cRNA))；2.)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物方法(其中在每一輪的測(cè)定設(shè)計(jì)中都包括已知量的靶核酸)；或3.)用于對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量的比較性CT法(ΔΔCT)(其中將靶序列的相對(duì)量與選擇的任何參照值進(jìn)行比較，結(jié)果相對(duì)于參照值給出)。比較性CT法需要確定靶和標(biāo)準(zhǔn)化物的CT值之間的差異(ΔCT)，其中ΔCT＝CT(靶)-CT(標(biāo)準(zhǔn)化物)。對(duì)要定量的每個(gè)樣品計(jì)算該值，并且必須選擇一種樣品作為進(jìn)行每次比較的參照。比較性ΔΔCT計(jì)算包括發(fā)現(xiàn)每個(gè)樣品的ΔCT和基線的ΔCT之間的差異，然后根據(jù)公式2-ΔΔCT將這些值轉(zhuǎn)化為絕對(duì)值。
盡管可以適于在解脂耶氏酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子有廣泛選擇，但是，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，啟動(dòng)子選自表9所示的那些(或其衍生物)。
表9 優(yōu)選用于在解脂耶氏酵母中超量表達(dá)的天然啟動(dòng)子 ＊位置是相對(duì)于天然基因，其中‘ATG’翻譯起始密碼子的‘A’位置表示為+1。
＊＊＊FBAINm啟動(dòng)子是修飾形式的FBAIN啟動(dòng)子，其中FBAINm在ATG翻譯起始密碼子和FBAIN啟動(dòng)子的內(nèi)含子之間具有52bp缺失(從而僅僅包括N-末端的22個(gè)氨基酸)并且具有內(nèi)含子后的新的翻譯共有序列基序。此外，盡管當(dāng)與要表達(dá)的基因的編碼區(qū)融合時(shí)FBAIN啟動(dòng)子產(chǎn)生融合蛋白，但FBAINm啟動(dòng)子不產(chǎn)生這樣的融合蛋白。
GPM的活性大約與TEF相同，而GPD、FBA、FBAIN、FBAINm、GPDIN、GPAT、YAT1和EXP1的活性都大于TEF(活性是在標(biāo)題為“活性等級(jí)”的列中以相對(duì)方式定量的，其中“1”相應(yīng)于具有最低活性的啟動(dòng)子，而“7”相應(yīng)于具有最高活性的啟動(dòng)子)。這種定量是基于比較性研究，其中將每種啟動(dòng)子用于建立嵌合基因，該嵌合基因具有編碼作為報(bào)道分子的β-葡萄醛酸酶(GUS)的大腸桿菌基因(Jefferson，R.A.Nature.14；342837-838(1989))和耶氏酵母Xpr基因的3’區(qū)的約100bp。通過(guò)組織化學(xué)和/或熒光測(cè)量分析(Jefferson，R.A.Plant Mol.Biol.Reporter 5387-405(1987))和/或采用實(shí)時(shí)PCR，測(cè)量每個(gè)表達(dá)的構(gòu)建體中的GUS活性。
YAT1啟動(dòng)子是獨(dú)特的，因?yàn)樯暾?qǐng)人將其表征為在耶氏酵母中鑒定的第一種在含油條件(即氮限制)下可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。具體地，盡管YAT1啟動(dòng)子在含氮(如最多約0.5％硫酸銨)的培養(yǎng)基中有活性，但當(dāng)宿主細(xì)胞在氮限制條件下(如在含有非常低水平的銨或缺乏銨的培養(yǎng)基中)生長(zhǎng)時(shí)，啟動(dòng)子的活性增加。因此，優(yōu)選的培養(yǎng)基將是含有少于約0.1％硫酸銨或其它合適的銨鹽的培養(yǎng)基。在一種更優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)宿主細(xì)胞在具有高碳氮比(即C:N)的培養(yǎng)基，如含有大約8-12％葡萄糖和大約0.1％或更少硫酸銨的高葡萄糖培養(yǎng)基(HGM)中生長(zhǎng)時(shí)，YAT1啟動(dòng)子被誘導(dǎo)。這些條件也足夠誘導(dǎo)那些含油酵母(如解脂耶氏酵母)中的含油性?；诩?xì)胞提取物的GUS活性，當(dāng)細(xì)胞從基本培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到HGM中并生長(zhǎng)24小時(shí)后，YAT1啟動(dòng)子的活性增加約73倍；在HGM中生長(zhǎng)120小時(shí)后，活性某種程度降低，當(dāng)仍然比含氮的基本培養(yǎng)基中的活性高25倍(實(shí)施例1)。
當(dāng)然，在本發(fā)明的替代實(shí)施方案中，其它衍生自上文表9中描述的啟動(dòng)子區(qū)的其它啟動(dòng)子也可以用于在解脂耶氏酵母中異源表達(dá)，以促進(jìn)TAG級(jí)分中ARA的生產(chǎn)和積累。具體地，上文描述的任何啟動(dòng)子的長(zhǎng)度的改變可以導(dǎo)致具有相同活性的突變啟動(dòng)子，因?yàn)檫€沒(méi)有完全確定這些調(diào)節(jié)序列的精確邊界。在替代實(shí)施方案中，位于FBAIN和GPDIN啟動(dòng)子的內(nèi)含子內(nèi)的增強(qiáng)子可以用于建立嵌合啟動(dòng)子，其相對(duì)于天然耶氏酵母啟動(dòng)子具有增加的活性(例如，當(dāng)驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)道基因與耶氏酵母Xpr基因的3’區(qū)的約100bp一起表達(dá)時(shí)，嵌合GPM::FBAIN和GPM::GPDIN啟動(dòng)子(SEQ ID NOs182和183)相對(duì)于單獨(dú)的GPM啟動(dòng)子具有增加的活性)。
終止區(qū)可源于基因的3’區(qū)(起始區(qū)是從該區(qū)獲得的)或者從不同的基因獲得。大量終止區(qū)是已知的，并且能在多種宿主(當(dāng)在與產(chǎn)生它們的相同和不同的屬和種中使用時(shí))中發(fā)揮令人滿意的作用。終止區(qū)通常在更大程度上是根據(jù)方便性選擇的，而不是因?yàn)槿魏翁厥馓匦?。?yōu)選的是，終止區(qū)源于酵母基因，特別是糖酵母屬、裂殖酵母屬、假絲酵母屬、耶氏酵母屬或克魯維酵母屬。同樣已知編碼γ-干擾素和α-2干擾素的哺乳動(dòng)物基因的3’-區(qū)在酵母中起作用。終止控制區(qū)還可以來(lái)自優(yōu)選宿主天然具有的各種基因。終止位點(diǎn)可以任選是必需的；不過(guò)，如果具有，則是最優(yōu)選的。盡管不意欲限制，本發(fā)明公開(kāi)中使用的終止區(qū)包括解脂耶氏酵母胞外蛋白酶的3’區(qū)的約100bp(XPR；GenBank獲取號(hào)M17741)；?；?coA氧化酶(Aco3GenBank獲取號(hào)AJ001301和No.CAA04661；Pox3GenBank獲取號(hào)XP_503244)終止子；Pex20(GenBank獲取號(hào)AF054613)終止子；Pex16(GenBank獲取號(hào)U75433)終止子；Lip1(GenBank獲取號(hào)Z50020)終止子；Lip2(GenBank獲取號(hào)AJ012632)終止子；和3-氧?；?coA硫解酶(OCT；GenBank獲取號(hào)X69988)終止子。
可以將上文描述的額外拷貝(即一個(gè)拷貝以上)的去飽和酶、延伸酶和/或酰基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)虢庵辖湍?，從而增加ARA生產(chǎn)和積累。具體地，可以在單個(gè)表達(dá)構(gòu)建體中克隆額外拷貝的基因；和/或可以通過(guò)增加質(zhì)?？截悢?shù)或通過(guò)將克隆的基因多次整合到基因組中將額外拷貝的克隆的基因?qū)胨拗骷?xì)胞(參見(jiàn)下文)。例如，在一種實(shí)施方案中，對(duì)解脂耶氏酵母的菌株(即菌株Y2214)進(jìn)行工程化，以通過(guò)將嵌合基因?qū)牒驼系揭辖湍富蚪M中而生產(chǎn)大于14％的ARA，所述嵌合基因包含5個(gè)拷貝的Δ9延伸酶、3個(gè)拷貝的Δ8去飽和酶、4個(gè)拷貝的Δ5去飽和酶、1個(gè)拷貝的Δ12去飽和酶和1個(gè)拷貝的C16/18延伸酶。類似地，在一種替代實(shí)施方案中，對(duì)解脂耶氏酵母的Y2047株進(jìn)行工程化，以通過(guò)將嵌合基因?qū)牒驼系揭辖湍富蚪M中而生產(chǎn)大于11％的ARA，所述嵌合基因包含1個(gè)拷貝的Δ6去飽和酶、2個(gè)拷貝的C18/20延伸酶、3個(gè)拷貝的Δ5去飽和酶和1個(gè)拷貝的Δ12去飽和酶。
一般地，一旦獲得了適合在含油酵母中表達(dá)的DNA(如包含啟動(dòng)子、ORF和終止子的嵌合基因)，將它放入能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的質(zhì)粒載體上，或者將它直接整合到宿主細(xì)胞的基因組中。表達(dá)盒的整合可以在宿主基因組中隨機(jī)地進(jìn)行，或者可以通過(guò)使用含有與宿主基因組具有足夠同源性以靶定宿主基因座內(nèi)的重組的區(qū)域的構(gòu)建體靶定。盡管本發(fā)明不完全基于此，當(dāng)所述構(gòu)建體被靶定于內(nèi)源基因座時(shí)，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)區(qū)的全部或某些可以通過(guò)內(nèi)源基因座提供。
在本發(fā)明中，在解脂耶氏酵母中表達(dá)基因的優(yōu)選方法是通過(guò)將線性DNA整合到宿主的基因組中；并且，當(dāng)需要基因的高水平表達(dá)時(shí)，整合到基因組中的多個(gè)位置是特別有用的。為此，需要鑒定基因組中以多個(gè)拷貝存在的序列。
Schmid-Berger等(J.Bact.176(9)2477-2482(1994))發(fā)現(xiàn)了解脂耶氏酵母中的第一個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子樣元件Ylt1。該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的特征在于存在長(zhǎng)的末端重復(fù)序列(LTRs；每一個(gè)的長(zhǎng)度是大約700bp)，其稱作ζ區(qū)。Ylt1和單獨(dú)的ζ元件分別以至少35個(gè)拷貝/基因組和50-60個(gè)拷貝/基因組，以分散的方式存在于基因組中；確定這兩個(gè)元件都作為同源重組位點(diǎn)起作用。此外，Juretzek等(Yeast1897-113(2001))的研究證明了通過(guò)將質(zhì)粒靶定到酵母基因組的重復(fù)區(qū)中(用兩端都具有LTR ζ區(qū)的線性DNA)，與用低拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體獲得的表達(dá)相比，可以顯著增加基因表達(dá)。因此，定位于ζ的整合作為確保將多個(gè)質(zhì)粒DNA整合到解脂耶氏酵母中的手段是理想的，從而允許高水平基因表達(dá)。然而，不幸的是，并不是解脂耶氏酵母的所有菌株都具有ζ區(qū)(如鑒定為ATCC #20362的菌株)。當(dāng)菌株缺乏所述區(qū)域時(shí)，也可以將包含表達(dá)盒的質(zhì)粒DNA整合到替代的基因座中，以達(dá)到表達(dá)盒的需要的拷貝數(shù)。例如，優(yōu)選的替代基因座包括Ura3基因座(GenBank獲取號(hào)AJ306421)、Leu2基因座(GenBank獲取號(hào)AF260230)、Lys5基因(GenBank獲取號(hào)M34929)、Aco2基因座(GenBank獲取號(hào)AJ001300)、Pox3基因座(Pox3GenBank獲取號(hào)XP_503244；或Aco3GenBank獲取號(hào)AJ001301)、Δ12去飽和酶基因基因座(SEQ ID NO23)、Lip1基因座(GenBank獲取號(hào)Z50020)和/或Lip2基因座(GenBank獲取號(hào)AJ012632)。
有利的是，Ura3基因可以與5-FOA選擇組合，重復(fù)使用(參見(jiàn)上文)。更具體地，可以首先敲除天然Ura3基因，生產(chǎn)具有Ura表型的菌株，其中選擇是基于5-FOA抗性發(fā)生的。然后，可以將一簇多個(gè)嵌合基因和新的Ura3基因整合到耶氏酵母基因組的不同基因座中，從而產(chǎn)生具有Ura+表型的新菌株。當(dāng)敲除導(dǎo)入的Ura3基因時(shí)，隨后的整合將產(chǎn)生新的Ura3-菌株(再次用5-FOA選擇進(jìn)行鑒定)。這樣，可以將Ura3基因(與5-FOA選擇組合)用作多輪轉(zhuǎn)化中的選擇標(biāo)記，從而容易地使基因修飾以容易的方式整合到耶氏酵母基因組中。
對(duì)于一些應(yīng)用，將本發(fā)明的蛋白導(dǎo)向于不同的細(xì)胞腔室(如?；?CoA集合與磷脂酰膽堿集合)將是有用的。為了此處描述的目的，ARA可以以游離脂肪酸或酯化形式如?；视?、磷脂、硫脂或糖脂形式存在。預(yù)計(jì)可以將上文描述的編碼允許ARA生物合成的多肽的嵌合基因進(jìn)一步工程化，以包括合適的細(xì)胞內(nèi)靶定序列。
Juretzek等(Yeast，1897-113(2001))注意到解脂耶氏酵母中整合的質(zhì)?？截悢?shù)的穩(wěn)定性依賴于各個(gè)轉(zhuǎn)化體，即受體株和使用的靶定平臺(tái)。因此，技術(shù)人員將理解，必須篩選多個(gè)轉(zhuǎn)化體，以獲得展示需要的表達(dá)水平和模式的菌株。所述篩選可以通過(guò)DNA印跡的Southern分析(Southern，J.Mol.Biol.98503(1975))、mRNA表達(dá)的Northern分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)133-145(1993))、蛋白表達(dá)的Western分析、表型分析或PUFA產(chǎn)物的GC分析實(shí)現(xiàn)。
總之，可以將上文描述的每一種方法用于增加解脂耶氏酵母中特定基因產(chǎn)物(如去飽和酶、延伸酶、酰基轉(zhuǎn)移酶)的表達(dá)；并且，生物技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地選擇允許ARA的高水平生產(chǎn)的合適方法組合。
用于增加ARA生產(chǎn)的途徑工程化 盡管上文描述的方法可以用于上調(diào)各個(gè)異源基因的表達(dá)，但增加解脂耶氏酵母中的ARA生產(chǎn)的挑戰(zhàn)更復(fù)雜，并且可能需要多個(gè)代謝途徑的協(xié)調(diào)操作。首先將解決PUFA生物合成途徑的操作，然后是TAG生物合成途徑和TAG降解途徑的理想操作。
如上文描述的，生產(chǎn)占總油級(jí)分的5％以上的ARA，或更優(yōu)選占總油級(jí)分的10％以上的ARA，或甚至更優(yōu)選占總油級(jí)分的15-20％以上的ARA，或最優(yōu)選占總油級(jí)分的25-30％以上的ARA的解脂耶氏酵母株的構(gòu)建至少需要以下用于表達(dá)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑的基因Δ6去飽和酶、C18/20延伸酶和Δ5去飽和酶；或至少需要以下用于表達(dá)Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑的基因Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶和Δ5去飽和酶。但是，在任意一種實(shí)施方案中，可能需要在宿主菌株中額外包括Δ9去飽和酶、Δ12去飽和酶、C14/16延伸酶和/或C16/18延伸酶。
在一些情況下，用串珠鐮孢Δ12去飽和酶代替天然解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶可能證明是有利的，因?yàn)榇殓犳擀?2去飽和酶增加底物轉(zhuǎn)化百分比(WO 2005/047485)。更具體地，盡管這兩種Δ12去飽和酶都催化油酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)A，這兩種酶的總體特異性不同(從而影響酶的底物轉(zhuǎn)化百分比)。申請(qǐng)人確定了串珠鐮孢Δ12去飽和酶比解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶具有更高的將LA加載到磷脂酰膽堿底物的sn-2位置上的能力(從而促進(jìn)隨后通過(guò)Δ6去飽和酶進(jìn)行的反應(yīng))?；诖?，串珠鐮孢Δ12去飽和酶的超量表達(dá)和解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶敲除的組合可能導(dǎo)致產(chǎn)物增加，用于隨后轉(zhuǎn)化為ARA。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)宿主基因組的天然DAG ATs活性可能是有用的，從而使得能夠操縱解脂耶氏酵母宿主中脂質(zhì)和油中PUFAs的百分比。具體地，由于預(yù)計(jì)油合成競(jìng)爭(zhēng)含油性的多不飽和化，可能減少或滅活生物的一種或多種酰基轉(zhuǎn)移酶(如PDAT和/或DGAT1和/或DGAT2)的活性，從而減少油生物合成的總體速度，而同時(shí)增加摻入脂質(zhì)和油級(jí)分中的PUFAs百分比(相對(duì)于總脂肪酸)。這是由于允許多不飽和化更有效性進(jìn)行；或者，也就是說(shuō)，通過(guò)下調(diào)特定DAG ATs的活性，油生物合成和多不飽和化之間的底物競(jìng)爭(zhēng)減少，有利于含油性的多不飽和化。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將具有闡釋下調(diào)的最優(yōu)水平所必須的技術(shù)和獲得所述抑制需要的方法。例如，在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，可能需要操縱單個(gè)DAG AT的活性(如建立DGAT1敲除，而不改變PDAT和DGAT2的活性)。在替代實(shí)施方案中，含油生物包含總共“n”種天然DAGATs，修飾總共“n-1”種?；D(zhuǎn)移酶的活性，導(dǎo)致油生物合成的速度降低，而剩余的酰基轉(zhuǎn)移酶保留其野生型活性。在一些情況下，可能需要操縱一些優(yōu)選的含油生物中的所有天然DAG ATs的活性，從而在多不飽和化速度方面實(shí)現(xiàn)油生物合成的最優(yōu)速度。
以相似的方式，申請(qǐng)人假定異源酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與相應(yīng)的天然解脂耶氏酵母?；D(zhuǎn)移酶的敲除的組合能夠顯著增加宿主細(xì)胞中生產(chǎn)的總ARA。具體地，如上文所提示的，對(duì)C20和更高級(jí)的脂肪酸具有特異性的異源GPAT、LPAAT、DGAT1、DGAT2、PDAT和LPCAT?；D(zhuǎn)移酶比天然酶優(yōu)選，因?yàn)榻庵辖湍钢刑烊簧a(chǎn)的PUFAs限于18:2脂肪酸，并且天然酶可能不能有效催化與更長(zhǎng)鏈脂肪酸的反應(yīng)。基于該結(jié)論，申請(qǐng)人鑒定了編碼高山被孢霉中的GPAT、LPAAT、DGAT1和DGAT2的基因，并且在生產(chǎn)EPA的工程化耶氏酵母宿主中表達(dá)了這些基因，導(dǎo)致PUFA生物合成的增加(本文的實(shí)施例14-17)。隨后，減少或敲除了解脂耶氏酵母中一些天然酰基轉(zhuǎn)移酶(如DGAT1和DGAT2)的活性，作為減少天然和異源酰基轉(zhuǎn)移酶之間的底物競(jìng)爭(zhēng)的手段。在生產(chǎn)ARA的工程化耶氏酵母宿主中可以預(yù)期相似的結(jié)果。
也必須考慮途徑的操縱和影響ARA生產(chǎn)的總體調(diào)節(jié)劑。例如，通過(guò)增加長(zhǎng)鏈飽和和不飽和脂肪酸如棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)的前體的可獲得性而增加碳流入PUFA生物合成途徑是有用的。前者的合成依賴于C14/16延伸酶的活性，而后者的合成依賴于C16/18延伸酶的活性。因此，天然解脂耶氏酵母C14/16延伸酶(SEQ ID NOs64和65)的超量表達(dá)顯著增加了16:0和16:1脂肪酸的生產(chǎn)(相對(duì)于對(duì)照菌株增加22％)；類似地，天然解脂耶氏酵母C16/18延伸酶(SEQ IDNOs61和62)的超量表達(dá)增加了18:0、18:1、18:2和18:3脂肪酸的生產(chǎn)(相對(duì)于對(duì)照菌株增加18％)并減少了C16脂肪酸的積累(相對(duì)于對(duì)照菌株減少22％)。當(dāng)然，如此處證明和Inagaki，K.等(Biosci.Biotech.Biochem.66(3)613-621(2002))的研究證明的，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，共表達(dá)異源C16/18延伸酶(如來(lái)自褐家鼠[GenBank獲取號(hào)AB071986；此處是SEQ ID NOs50和51]和/或來(lái)自高山被孢霉[SEQ ID NO53和54)可能是有用的。因此，盡管必須最小操縱解脂耶氏酵母宿主菌株表達(dá)Δ6去飽和酶、C18/20延伸酶和Δ5去飽和酶；或Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶和Δ5去飽和酶用于ARA的生物合成，但在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主菌株額外包括以下至少一種Δ9去飽和酶、Δ12去飽和酶、C14/16延伸酶和/或C16/18延伸酶。
在另一種優(yōu)選實(shí)施方案中，在本發(fā)明的解脂耶氏酵母中修飾影響脂肪酸降解和TAG降解的途徑，使在細(xì)胞中的?；?CoA集合或TAG級(jí)分中積累的ARA的降解最少。這些途徑分別由?；?CoA氧化酶和脂肪酶基因代表。更具體地，酰基-CoA氧化酶(EC 1.3.3.6)催化過(guò)氧化物酶體β-氧化反應(yīng)，其中每個(gè)循環(huán)的降解都產(chǎn)生酰基-CoA分子和比脂肪酸底物短兩個(gè)碳原子的脂肪酸。解脂耶氏酵母中存在5種?；?CoA氧化酶同工酶，由POX1、POX2、POX3、POX4和POX5基因(也稱作Aco1、Aco2、Aco3、Aco4和Aco5基因)編碼，所述基因分別相應(yīng)于GenBank獲取號(hào)AJ001299-AJ001303(也參見(jiàn)相應(yīng)的GenBank獲取號(hào)XP_504703、XP_505264、XP_503244、XP_504475和XP_502199)。每種同工酶具有不同的底物特異性；例如，POX3基因編碼對(duì)短鏈脂肪酸具有活性的?；?CoA氧化酶，而POX2基因編碼對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸具有活性的酰基-CoA氧化酶(Wang H.J.，et al.J.Bacteriol.，1815140-5148(1999))。認(rèn)為任何上述基因的活性都可以被減少或消除，從而以對(duì)此處的目的有利的方式修飾本發(fā)明的宿主細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶體β-氧化。最后，為了避免混淆，申請(qǐng)人將上文描述的?；?CoA氧化酶稱作POX基因，但根據(jù)一些公開(kāi)文獻(xiàn)，該術(shù)語(yǔ)可以與Aco基因命名互換使用。
類似地，已經(jīng)在解脂耶氏酵母中檢測(cè)到了一些脂肪酶(EC3.1.1.3)，包括細(xì)胞內(nèi)、膜結(jié)合的和細(xì)胞外酶(Choupina，A.，et al.Curr.Genet.35297(1999)；Pignede，G.，et al.J.Bacteriol.1822802-2810(2000))。例如，Lip1(GenBank獲取號(hào)Z50020)和Lip3(GenBank獲取號(hào)AJ249751)是細(xì)胞內(nèi)或膜結(jié)合的，而Lip2(GenBank獲取號(hào)AJ012632)編碼細(xì)胞外脂肪酶。這些脂肪酶中的每一種都是破壞的靶，因?yàn)檫@些酶催化反應(yīng)，所述反應(yīng)中TAG和水直接降解為DAG和脂肪酸陰離子。
在其它替代實(shí)施方案中，可以在解脂耶氏酵母的優(yōu)選宿主菌株中操縱一些脂肪酶的活性。磷脂酶在膜脂質(zhì)的生物合成和降解中起關(guān)鍵作用。更具體地，術(shù)語(yǔ)“磷脂酶”是指具有水解甘油磷脂中的一個(gè)或多個(gè)酯鍵的能力的一組異源酶。盡管所有的磷脂酶都靶定磷脂作為底物，每一種酶都具有切割特定酯鍵的能力。因此，磷脂酶命名區(qū)分了各個(gè)磷脂酶，并且表明了磷脂分子中靶定的特定鍵。例如，磷脂酶A1(PLA1)水解甘油部分sn-1位置上的脂肪?；ユI，而磷脂酶A2(PLA2)除去該分子sn-2位置上的脂肪酸。PLA1(EC 3.1.1.32)和PLA2(EC 3.1.1.4)的作用分別導(dǎo)致游離脂肪酸和2-酰基溶血磷脂或1-?；苎字姆e累。磷脂酶C(PLC)(EC 3.1.4.3)水解磷脂主鏈中的磷酸二酯鍵，并且依賴于涉及的特定磷脂種類，即，磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺等(如PLC1負(fù)責(zé)以下反應(yīng)1-磷脂酰-1D-肌醇4，5-二磷酸+H2O＝1D-肌醇1，4，5-三磷酸+DAG；ISC1編碼肌醇鞘磷脂特異性磷脂酶C[Sawai，H.，et al.J.Biol.Chem.275，39793-39798(2000)])。磷脂酶D(PLD)(EC 3.1.4.4)切割第二個(gè)磷酸二酯鍵，產(chǎn)生磷脂酸和膽堿或乙醇胺，再次依賴于涉及的磷脂類型。磷脂酶B(PLB)具有除去sn-1和sn-2脂肪酸的能力，并且在具有水解酶(其中該酶從磷脂[PLB活性]和溶血磷脂[溶血磷脂酶活性]切割脂肪酸，以釋放脂肪酸)和溶血磷脂酶-轉(zhuǎn)酰基酶(其中該酶能夠通過(guò)將游離脂肪酸轉(zhuǎn)移到溶血磷脂上而產(chǎn)生磷脂)活性方面是獨(dú)特的。超量表達(dá)一種或多種所述磷脂酶可能是有用的，以增加在轉(zhuǎn)化的耶氏酵母宿主細(xì)胞的總油級(jí)分中積累的ARA濃度。假定觀察到該影響，因?yàn)榱字笇Ⅴ；鶑腜C釋放到CoA集合中，以延伸或摻入到甘油三酯中。
在另一種替代實(shí)施方案中，也可以在解脂耶氏酵母的優(yōu)選宿主菌株中操縱CDP-膽堿途徑中負(fù)責(zé)磷脂酰膽堿(PC)生物合成的酶，作為增加總ARA生物合成的手段。通過(guò)編碼二?；视湍憠A磷酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.7.8.2)的解脂耶氏酵母CPT1基因的超量表達(dá)證明了該技術(shù)的用途，從而導(dǎo)致工程化的解脂耶氏酵母菌株的EPA生物合成增加。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉PC生物合成途徑，并且了解其它合適的候選酶。
盡管操縱諸如上文描述的生物化學(xué)途徑的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，下文將簡(jiǎn)述用于減少或消除天然基因活性的一些技術(shù)的綜述。這些技術(shù)可以用于下調(diào)上文描述的天然解脂耶氏酵母Δ12去飽和酶、GPAT、LPAAT、DGAT1、DGAT2、PDAT、LPCAT、?；?CoA氧化酶2(Aco2或Pox2)、?；?CoA氧化酶3(Aco3或Pox3)和/或脂肪酶基因的表達(dá)。
盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定用于減少或消除天然基因活性的最合適的技術(shù)，但一般地，可以通過(guò)例如以下方法減少或消除特定基因的內(nèi)源活性1.)通過(guò)插入、取代和/或缺失靶基因的全部或部分而破壞基因；2.)提供用于將反義序列轉(zhuǎn)錄為基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的盒；3.)使用天然具有很少或不具有[或經(jīng)過(guò)突變而具有很少或不具有]特定基因的活性的宿主細(xì)胞；4.)超量表達(dá)誘變的遺傳亞單位(hereosubunit)(即，在包含兩個(gè)或多個(gè)遺傳亞單位的酶中)，從而由于“顯性失活作用”減少酶活性；和5.)采用iRNA技術(shù)。在某些情況下，也可以通過(guò)利用特定抑制劑(如去飽和酶抑制劑，如U.S.4,778,630中描述的那些)實(shí)現(xiàn)不需要的基因途徑的抑制。
為了進(jìn)行基因破壞，將外源DNA片段(通常是選擇標(biāo)記基因，但任選是在表達(dá)時(shí)賦予需要的表型的嵌合基因或嵌合基因簇)插入要破壞的結(jié)構(gòu)基因，以便破壞它的編碼序列，并因此功能性滅活所述基因。將所述破壞盒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，導(dǎo)致了非通過(guò)同源重組用無(wú)功能的破壞的基因替代功能性天然基因(例如，參見(jiàn)Hamilton et al.J.Bacteriol.1714617-4622(1989)；Balbas et al.Gene 136211-213(1993)；Gueldener et al.Nucleic Acids Res.242519-2524(1996)；和Smith et al.Methods Mol.Cell.Biol.5270-277(1996))。
當(dāng)靶基因的序列已知時(shí)，反義技術(shù)是下調(diào)基因的另一種方法。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，克隆來(lái)自所需基因的核酸片段，并且可操作地與啟動(dòng)子連接，以便RNA的反義鏈能夠轉(zhuǎn)錄。然后將該構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并且生產(chǎn)RNA的反義鏈。反義RNA能通過(guò)阻止編碼感興趣的蛋白的mRNA的積累，抑制基因表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，特殊考慮與使用反義技術(shù)相關(guān)，以便減少特定基因的表達(dá)。例如，反義基因的適當(dāng)水平的表達(dá)可能需要使用不同的嵌合基因，其中采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的不同的調(diào)節(jié)元件。
盡管當(dāng)序列已知時(shí)，靶定的基因破壞和反義技術(shù)提供了下調(diào)基因的有效方法，業(yè)已開(kāi)發(fā)了不是基于序列的其他特異性更低的方法(例如通過(guò)UV輻射/化學(xué)試劑進(jìn)行誘變，或使用可轉(zhuǎn)座元件/轉(zhuǎn)座子；參見(jiàn)WO 04/101757)。
在替代的實(shí)施方案中，可以通過(guò)操縱控制蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)序列減少特定基因的內(nèi)源活性。如本領(lǐng)域公知的，與編碼序列相關(guān)的調(diào)節(jié)序列包括轉(zhuǎn)錄和翻譯“控制”核苷酸序列，其位于編碼序列上游(5’非編碼序列)、序列內(nèi)、或下游(3’非編碼序列)，并且，影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或翻譯。因此，特定基因的調(diào)節(jié)序列的操縱可以表示基因啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、起始控制區(qū)、聚腺苷酸化識(shí)別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的操縱。因此，例如，可以去除或破壞DAG AT的啟動(dòng)子，以下調(diào)DAG AT的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)和油生物合成的速度降低?；蛘撸梢杂脝?dòng)子活性比天然啟動(dòng)子低的異源啟動(dòng)子取代驅(qū)動(dòng)DAG AT表達(dá)的天然啟動(dòng)子。用于操縱調(diào)節(jié)序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
總之，采用此處提供的教導(dǎo)，轉(zhuǎn)化的含油微生物宿主將生產(chǎn)占微生物宿主的總脂質(zhì)的至少約5％的ARA，優(yōu)選占總脂質(zhì)的至少約10％的ARA，更優(yōu)選占總脂質(zhì)的至少約15％的ARA，更優(yōu)選占總脂質(zhì)的至少約20％的ARA，最優(yōu)選占總脂質(zhì)的至少約25-30％的ARA。
用于生產(chǎn)ARA的發(fā)酵過(guò)程 轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞是在優(yōu)化嵌合基因(如編碼去飽和酶、延伸酶、?；D(zhuǎn)移酶等)的表達(dá)，并且產(chǎn)生最大和最經(jīng)濟(jì)的ARA產(chǎn)率的條件下生長(zhǎng)的。一般，可以優(yōu)化的培養(yǎng)基條件包括碳源的類型和用量、氮源的類型和用量、碳氮比、氧水平、生長(zhǎng)溫度、pH、生物量生產(chǎn)期的長(zhǎng)度、油積累期的長(zhǎng)度，以及細(xì)胞收獲時(shí)間。解脂耶氏酵母在復(fù)雜培養(yǎng)基(例如，酵母提取物-蛋白胨-右旋糖培養(yǎng)液(YPD))或缺少生長(zhǎng)所必需的成分，以便強(qiáng)制選擇需要的表達(dá)盒的限定基本培養(yǎng)基)(例如，Yeast Nitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))中生長(zhǎng)。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須包括合適的碳源。合適的碳源包括，但不局限于單糖(例如，葡萄糖、果糖)、二糖(例如，乳糖、蔗糖)、寡糖、多糖(例如，淀粉、纖維素或它們的混合物)、糖醇(例如，甘油)或可更新飼料(例如，干酪乳清滲透物、玉米漿、甜菜糖漿、大麥芽)的混合物。另外，碳源可以包括鏈烷、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂，和脂肪酸的各種商業(yè)來(lái)源，包括植物油(例如，大豆油)和動(dòng)物脂肪。另外，碳源可以包括一碳源(例如，二氧化碳、甲醇、甲醛、甲酸和含碳的胺)，業(yè)已證實(shí)了其轉(zhuǎn)化成關(guān)鍵生物化學(xué)中間體的代謝轉(zhuǎn)化。因此，預(yù)計(jì)，用于本發(fā)明的碳源包括可以包括多種含碳的來(lái)源。盡管上述所有碳源及其混合物預(yù)計(jì)都適合本發(fā)明，優(yōu)選的碳源是糖和/或脂肪酸。最優(yōu)選的是葡萄糖和/或含有10-22個(gè)碳的脂肪酸。
氮可以由無(wú)機(jī)(例如，(NH4)2SO4)或有機(jī)來(lái)源(例如，尿素或谷氨酸)提供。除了合適的碳和氮源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基必須還包括合適的礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液、維生素，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合含油酵母生長(zhǎng)，并且促進(jìn)ARA生產(chǎn)所需要的酶途徑的其他成分。特別關(guān)注若干金屬離子(例如，Mn+2、Co+2、Zn+2、Mg+2)，它們能促進(jìn)脂質(zhì)和PUFAs的合成(Nakahara，T.et al.，Ind.Appl.SingleCell Oils，D.J.Kyle and R.Colin，eds.pp 61-97(1992))。
本發(fā)明的優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是常見(jiàn)的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，如YeastNitrogen Base(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。其他確定的或合成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基也可以使用，并且適合特定解脂耶氏酵母生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。用于發(fā)酵的合適的pH范圍通常為大約pH 4.0-pH 8.0，其中pH 5.5-pH 7.0是起始生長(zhǎng)條件的優(yōu)選范圍。發(fā)酵可以在需氧或厭氧條件下進(jìn)行，其中，微需氧條件是優(yōu)選的。
通常，高水平PUFAs在含油酵母細(xì)胞中的積累，需要兩個(gè)階段的過(guò)程，因?yàn)樵谥镜纳L(zhǎng)和合成/儲(chǔ)存之間的代謝狀態(tài)必須是“平衡的”。因此，最優(yōu)選的是，需要兩個(gè)階段的發(fā)酵過(guò)程在解脂耶氏酵母中生產(chǎn)ARA。該方法描述于WO 2004/101757，在生長(zhǎng)過(guò)程中具有多個(gè)合適的發(fā)酵過(guò)程設(shè)計(jì)(即分批、補(bǔ)料分批和連續(xù))和考慮。
ARA的純化和加工 PUFAs，包括ARA，可以作為游離脂肪酸形式出現(xiàn)在宿主微生物中，或者以諸如?；视?、磷脂、硫脂或糖脂的脂化形式出現(xiàn)在宿主微生物中，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域所熟知的多種方法從宿主細(xì)胞中提取。酵母脂質(zhì)的提取技術(shù)、品質(zhì)分析和可接受性標(biāo)準(zhǔn)的一篇綜述是Z.Jacobs(Critical Reviews in Biotechnology 12(5/6)463-491(1992))。有關(guān)下游加工的簡(jiǎn)單綜述還可以參見(jiàn)A.Singh和O.Ward(Adv.Appl.Microbiol.45271-312(1997))。
一般地，純化ARA和其它PUFAs的方法可以包括用有機(jī)溶劑萃取、超聲波處理、超臨界流體萃取(例如，使用二氧化碳)、皂化和物理方法，如壓力，或它們的組合。其它細(xì)節(jié)可參考WO 2004/101757的教導(dǎo)。
可以氫化含有已經(jīng)精制和/或純化的ARA的油，從而得到具有多種熔解特性和質(zhì)地的脂肪。很多經(jīng)過(guò)加工的脂肪，包括糊、甜食脂肪、硬質(zhì)脂肪、人造黃油、烘烤起酥等，需要室溫下的各種程度的固化，并且僅僅可以通過(guò)改變?cè)嫌偷奈锢硖匦远苽?。這最常見(jiàn)是通過(guò)催化氫化實(shí)現(xiàn)的。
氫化是一種化學(xué)反應(yīng)，其中在諸如鎳的催化劑輔助下將氫加入不飽和脂肪酸雙鍵。氫化具有兩個(gè)主要作用。首先，由于不飽和脂肪酸含量的減少，油的氧化穩(wěn)定性增加。其次，油的物理性質(zhì)改變，這是因?yàn)橹舅嵝揎椩黾恿巳埸c(diǎn)，在室溫下得到半液體或固體脂肪。
存在許多影響氫化反應(yīng)的變量，其隨后改變終產(chǎn)物的組成。包括壓力、溫度、催化劑類型和濃度、攪拌和反應(yīng)器設(shè)計(jì)的操作條件是可以控制的較重要的參數(shù)中的一些。選擇性氫化條件可以相對(duì)于較不飽和的脂肪酸而言優(yōu)先用于氫化更飽和的脂肪酸。通常用非常輕的或刷洗氫化來(lái)增加液體油的穩(wěn)定性。進(jìn)一步的氫化將液體油轉(zhuǎn)化為物理固體的脂肪。氫化的程度依賴于針對(duì)特定終產(chǎn)物設(shè)計(jì)的所需性能和熔解特征。用于制備烘烤產(chǎn)品的液體起酥、用于商業(yè)煎炸和烘烤操作的固體脂肪和起酥，以及用于制造人造黃油的堿原料是通過(guò)氫化得到的多種可能的油和脂肪產(chǎn)品中的一些。氫化和氫化產(chǎn)物的更詳細(xì)描述可以參見(jiàn)Patterson，H.B.W.，Hydrogenation of Fats and OilsTheory andPractice.The American Oil Chemists’Society，1994。
用于食料中的生產(chǎn)ARA的解脂耶氏酵母菌株 目前的市場(chǎng)需要大量摻入ω-3和/或ω-6脂肪酸(特別是ARA、EPA和DHA)的食品和飼料產(chǎn)品。考慮本發(fā)明的包含ARA的酵母微生物油將在食品和飼料產(chǎn)品中起作用，賦予本發(fā)明的制劑的健康益處。
由此處描述的酵母宿主生產(chǎn)的含ω-3和/或ω-6脂肪酸的微生物油將適用于多種食品和飼料產(chǎn)品中，包括但不限于食物類似物、肉類產(chǎn)品、谷物產(chǎn)品、烘烤食品、快餐和乳制品。此外，本發(fā)明的微生物油可以用于制劑中，在包括醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)品、飲食補(bǔ)充物、嬰兒配方和藥品的醫(yī)學(xué)食品中賦予健康益處。食品加工和食品制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解微生物油的量和組成如何添加到食物或食品中。所述量在此稱作“有效”量，并且依賴于食品或飼料產(chǎn)品、該產(chǎn)品意欲補(bǔ)充的飲食或該醫(yī)學(xué)食品或醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)品意欲矯正或治療的醫(yī)學(xué)狀況。
可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備食物類似物?？梢蕴岬降氖侨忸愃莆?、苷酪類似物、乳類似物等。從大豆制備的肉類似物含大豆蛋白或豆腐和其它混合在一起的成分，以模擬各種肉類。這些肉替代品以冷凍、罐裝或干燥食品出售。通常，它們可以以它們所替代的食品相同的方式使用。肉類似物的實(shí)例包括但不限于火腿類似物、香腸類似物、咸肉類似物等。
根據(jù)功能和組成特征，可以將食物類似物分類為模擬物或替代物。例如，模擬干酪僅僅需要模擬其設(shè)計(jì)用于替代的干酪。然而，只有當(dāng)一種產(chǎn)品在營(yíng)養(yǎng)上等同于它所要替代的干酪和滿足該干酪的最小組成需要，才能將其稱作替代干酪。因此，替代干酪通常比模擬干酪具有更高的蛋白水平，并且可以用維生素和礦物質(zhì)進(jìn)行強(qiáng)化。
乳類似物和非乳制食品包括但不限于模擬乳和非乳制甜點(diǎn)(如從大豆和/或大豆蛋白產(chǎn)品制備的那些)。
肉產(chǎn)品包括廣泛的產(chǎn)品。在美國(guó)，“肉”包括從牛、狗和羊生產(chǎn)的“紅肉”。除了紅肉外，還有禽類，包括雞、火雞、鵝、珍珠雞、鴨，以及魚類和甲殼類動(dòng)物。存在各種類型的調(diào)味和加工的肉類產(chǎn)品新鮮的、熟化和煎炸的、以及熟化和蒸煮的。香腸和熱狗是加工的肉產(chǎn)品的實(shí)例。因此，此處用到的“肉產(chǎn)品”包括但不限于加工的肉產(chǎn)品。
谷物食品是來(lái)源于谷物加工的食品。谷物包括來(lái)自產(chǎn)生可食用谷物(籽粒)的草本科植物的任何植物。最常見(jiàn)的谷物是大麥、玉米、小米、燕麥、奎藜、稻、黑麥、高粱、黑小麥、小麥和野生稻。谷物食品的實(shí)例包括但不限于全谷、全谷粗粉、粗谷粉、面粉、麩、胚芽、早餐谷物、寄出食品、意大利面食等。
烘烤食品包括上文描述的任何谷物食品，并且以能夠烘烤，即通過(guò)熱干燥或硬化的方式烘烤或加工過(guò)。烘烤食品的實(shí)例包括但不限于面包、蛋糕、炸面圈、面包條、意大利面食、面包屑、烘烤的快餐、小餅干、小薄脆餅干、小甜餅和小脆餅干。如上文提到的，本發(fā)明的油可以用作一種成分。
快餐食品包括上文或下文描述的任何食品。
煎炸食品包括經(jīng)過(guò)煎炸的上文或下文描述的任何食品。
飲料可以是液體或干粉形式。
例如，可以提到的是非碳酸飲料；果汁、新鮮的、冷凍的、罐裝的或濃縮飲料；調(diào)味的或普通的乳飲料等。成人和嬰兒營(yíng)養(yǎng)配方是本領(lǐng)域公知的并且可以商購(gòu)(如來(lái)自Ross Products Division，AbbottLaboratories的

和

)。嬰兒配方是給嬰兒或幼兒喂食的液體或重配粉末。它們作為母乳的替代品。嬰兒配方在嬰兒飲食中起作特殊作用，因?yàn)樗鼈兺ǔＪ菋雰籂I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的唯一來(lái)源；并且盡管母乳喂養(yǎng)是嬰兒的最佳營(yíng)養(yǎng)，但嬰兒配方足夠接近，因此嬰兒不僅存活，還茁壯成長(zhǎng)。嬰兒配方正在變得越來(lái)越接近于母乳。
乳制品是來(lái)源于乳的產(chǎn)品。乳類似物或非乳制品來(lái)源于除乳以外的來(lái)源，例如，上文討論的大豆乳。這些產(chǎn)品包括但不限于全乳、脫脂乳、發(fā)酵乳產(chǎn)品如酸奶酪或酸奶、乳酪、黃油、煉乳、脫水乳、調(diào)咖啡用白油、咖啡伴侶、冰激凌、干酪等。
可以摻入本發(fā)明的含ARA的油的其它食品包括，例如口香糖、糖果和糖霜、明膠和布丁、硬糖和軟糖、果醬和果凍、白砂糖、糖替代品、甜調(diào)料、糕點(diǎn)裝飾物和糖漿，以及干粉混合物。
健康食品和藥品 健康食品是賦予健康益處的任何食品，包括功能性食品、醫(yī)學(xué)食品、醫(yī)學(xué)營(yíng)養(yǎng)品和飲食補(bǔ)充物。此外，本發(fā)明的微生物油可以用于標(biāo)準(zhǔn)藥物組合物中。包含ARA的本發(fā)明的工程化的解脂耶氏酵母菌株或由其制備的微生物油可以容易地?fù)饺肷鲜鋈魏问称分?，從而生產(chǎn)例如功能性或醫(yī)學(xué)食品。例如，包含ARA的更濃縮的制劑包括膠囊、粉末、片劑、軟凝膠、凝膠帽、液體濃縮物和乳狀液，它們可以用作人或人以外的其它動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。
用于飲食補(bǔ)充物中 更濃縮的含ARA的制劑包括膠囊、粉末、片劑、軟凝膠、凝膠帽、液體濃縮物和乳狀液，它們可以用作人或人以外的其它動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。特別地，本發(fā)明的ARA油特別適于摻入飲食補(bǔ)充物，如嬰兒配方或嬰兒食物。
嬰兒配方是給嬰兒或幼兒喂食的液體或重配粉末。此處將“嬰兒配方”定義為腸道營(yíng)養(yǎng)品，其可以在哺乳期嬰兒中代替母乳，并且通常包含與在水溶液中與所需百分比的碳水化合物和蛋白混合的所需百分比的脂肪(例如參見(jiàn)U.S.4,670,285)。基于世界范圍的組成研究以及專家組規(guī)定的水平，平均母乳典型地含約0.20％-0.40％的總脂肪酸(假定大約50％的熱卡來(lái)自脂肪)；并且，DHA與ARA的比例通常是大約1:1-1:2(參見(jiàn)例如Enfamil LIPILTM[Mead Johnson & Company]和Similac AdvanceTM[Ross Products Division，Abbott Laboratories]的配方)。嬰兒配方在嬰兒飲食中起作特殊作用，因?yàn)樗鼈兺ǔＪ菋雰籂I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的唯一來(lái)源；并且盡管母乳喂養(yǎng)是嬰兒的最佳營(yíng)養(yǎng)，但嬰兒配方足夠接近，因此嬰兒不僅存活，還茁壯成長(zhǎng)。
用于動(dòng)物飼料中 動(dòng)物飼料在此一般定義為意欲用作除人之外的動(dòng)物的飼料或混合于飼料中的產(chǎn)品。并且，如上文提到的，本發(fā)明的包含ARA的油可以用作各種動(dòng)物飼料中的成分。
更具體地，盡管不進(jìn)行限制，預(yù)計(jì)本發(fā)明的油可以用于寵物食品中、反芻動(dòng)物和禽類動(dòng)物食品中以及水產(chǎn)養(yǎng)殖食品中。寵物食品是意欲喂飼寵物[如狗、貓、鳥類、爬行動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物]的產(chǎn)品；這些產(chǎn)品包括上文所述的谷物和健康食品，以及肉和肉副產(chǎn)品、大豆蛋白產(chǎn)品、草和干草產(chǎn)品(如紫花苜蓿、梯牧草、燕麥或雀麥草、蔬菜)。反芻動(dòng)物和禽類動(dòng)物食品是意欲喂飼給例如火雞、雞、牛和豬的食品。至于上文所述的寵物食品，這些食品包括谷物和上文列出的健康食品、大豆蛋白產(chǎn)品、肉和肉副產(chǎn)品、以及草和干草產(chǎn)品。水產(chǎn)養(yǎng)殖食品(或“水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料”)是意欲用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)品，所述水產(chǎn)養(yǎng)殖涉及淡水或海水中水生生物和/或動(dòng)物的繁殖、培養(yǎng)和飼養(yǎng)。
認(rèn)為本發(fā)明的生產(chǎn)高濃度ARA、EPA和/或DHA的工程化的解脂耶氏酵母菌株特別可以用于摻入大多數(shù)動(dòng)物飼料配方中。除了提供必要的ω-3和/或ω-6 PUFAs，酵母本身是一種有用的蛋白和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如維生素、礦物質(zhì)、核酸、復(fù)雜碳水化合物等)的來(lái)源，其能夠有利于總體動(dòng)物健康和營(yíng)養(yǎng)，并且增加配方的美味性。因此，認(rèn)為加入包含本發(fā)明的重組生產(chǎn)宿主的酵母生物量，將是動(dòng)物飼料配方中的極佳的額外飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源。更具體地，解脂耶氏酵母(ATCC#20362)具有以下大約的化學(xué)組成(相對(duì)于干細(xì)胞總量的百分比)35％蛋白、40％脂質(zhì)、10％碳水化合物、5％核酸、5％灰分和5％水。此外，在碳水化合物級(jí)分中，β-葡聚糖占大約45.6mg/g，甘露聚糖占大約11.4mg/g，幾丁質(zhì)占大約52.6mg/g(而海藻糖是最少的成分[大約0.7mg/g])。
大量的文獻(xiàn)檢驗(yàn)了β-葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)的免疫調(diào)節(jié)作用。最充分地研究了細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁的主要成分β-葡聚糖刺激非特異性免疫(即“免疫刺激作用”)從而改進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖物種、寵物和畜牧動(dòng)物以及人的健康的方式，類似地，也發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)和甘露聚糖是有用的免疫刺激劑。具體地，使用β-葡聚糖可以獲得免疫應(yīng)答的總體增強(qiáng)，因?yàn)檫@些β-1，3-D-聚葡萄糖分子以非特異性方式刺激白細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞)的產(chǎn)生，從而增加抗多種致病抗原或環(huán)境刺激物的敏感性和防御能力。更具體地，許多研究證明了β-葡聚糖能夠賦予增強(qiáng)的抗病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲感染的保護(hù)作用；當(dāng)與抗生素和疫苗聯(lián)合使用時(shí)，施加佐劑作用；增強(qiáng)傷口愈合；抵抗自由基導(dǎo)致的破壞；增強(qiáng)腫瘤消退；調(diào)節(jié)細(xì)菌內(nèi)毒素的毒性；和增強(qiáng)粘膜免疫(綜述于Raa，J.et al.，Norwegian Beta GlucanResearch，Clinical Applications of Natural Medicine.ImmuneDepressions Dysfunction & Deficiency(1990))。記載了酵母β-葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)在傳統(tǒng)動(dòng)物飼養(yǎng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用的現(xiàn)有文獻(xiàn)的例子包括L.A.White et al.(J.Anim.Sci.802619-2628(2002))，supplementation in weanling pigs；K.S.Swanson et al.(J.Nutr.132980-989(2002))，supplementation in dogs；J.

et al.(Vet.Immunol.Immonopath.8541-50(2002))，whole Saccharomycescerevisiae administered to gilthead seabream；A.Rodríguez et al.(FishShell.Immuno.16241-249(2004))，whole Mucor circinelloidesadministered to gilthead seabream；M.Bagni et al.(Fish Shell.Immuno.18311-325(2005))，supplementation of sea bass with a yeastextract containing β-glucans；J.Raa(InCruz-Suárez，L.E.，Ricque-Marie，D.，Tapia-Salazar，M.，Olvera-Novoa，M.A.yCivera-Cerecedo，R.，(Eds.).Avances en Nutrición Acuícola V.Memorias del V Simposium Internacional de Nutrición Acuícola.19-22Noviembre，2000.Mérida，Yucatán，Mexico)，a review of the use ofimmune-stimulants in fish and shellfish feeds。
基于解脂耶氏酵母的獨(dú)特蛋白:脂質(zhì):碳水化合物組成，以及獨(dú)特的復(fù)雜碳水化合物譜(包括甘露聚糖:β-葡聚糖:幾丁質(zhì)的大約1:4:4.6的比例)，認(rèn)為本發(fā)明的基因工程化的酵母細(xì)胞(或其部分)是動(dòng)物飼料配方的有用添加劑(例如作為完整的[凍干的]酵母細(xì)胞、作為純化的細(xì)胞壁、作為純化的酵母碳水化合物或在多種其它分級(jí)分離形式內(nèi))。
在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)方面，對(duì)各種魚類物種的營(yíng)養(yǎng)需要的了解增加和飼料制造的技術(shù)進(jìn)步，使得制造的或人工飼料(配方飼料)的開(kāi)發(fā)和使用能夠補(bǔ)充或代替水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的天然飼料。但是，一般地，包含在魚類的水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的一般比例包括(以干飼料的百分比表示)32-45％蛋白、4-28％脂肪(其中至少1-2％是ω-3和/或ω-6 PUFAs)、10-30％碳水化合物、1.0-2.5％礦物質(zhì)和1.0-2.5％維生素?？梢匀芜x將大量其它成分加入配方中。這些其它成分包括(1)類胡蘿卜素，特別是用于鮭魚類和觀賞性的“水族館”魚類，以分別增強(qiáng)新鮮感和皮膚顏色；(2)結(jié)合劑，給飼料團(tuán)提供穩(wěn)定性，并且減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)泄露到水中(如牛心、淀粉、纖維素、果膠、明膠、阿拉伯樹(shù)膠、洋槐豆、瓊脂、鹿角菜膠和其它藻酸鹽)；(3)防腐劑，如抗微生物劑和抗氧化劑，以延長(zhǎng)魚飼料的保質(zhì)期，并且減少脂肪的腐臭(如維生素E、丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、乙氧基喹、和丙酸、苯甲酸或山梨酸的鈉鹽和鉀鹽)；(4)化學(xué)引誘物和調(diào)味劑，以增強(qiáng)飼料的美味性及其攝食；和(5)其它飼料。所述其它飼料可以包括諸如纖維和灰分的材料(分別用作填料以及鈣和磷的來(lái)源)和植物物質(zhì)和/或魚或魷魚食物(如活的、冷凍的或干燥的藻類、海蝦、輪蟲或其它浮游動(dòng)物)，以增強(qiáng)飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值并增加魚類對(duì)它的接受性。Nutrient Requirements of Fish(National ResearchCouncil，National AcademyWashington D.C.，1993)提供了魚類的必須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和各種成分的營(yíng)養(yǎng)含量的詳細(xì)描述。
制造水產(chǎn)養(yǎng)殖配方需要考慮大量因素，因?yàn)橥暾娘暳媳仨毷菭I(yíng)養(yǎng)平衡的、美味的、在水中穩(wěn)定的，并且具有合適的大小和質(zhì)地。關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料的營(yíng)養(yǎng)組成，可以參考Handbook on Ingredients forAquaculture Feeds(Hertrampf，J.W.and F.Piedad-Pascual.KluwerAcademicDordrecht，The Netherlands，2000)和Standard Methodsfor the Nutrition and Feeding of Farmed Fish and Shrimp(Tacon，A.G.J.Argent LaboratoriesRedmond，1990)。一般地，飼料配制為干的(即最終水含量是6-10％)、半濕的(即水含量是35-40％)或濕的(即水含量是50-70％)。干飼料包括以下這些干成分的簡(jiǎn)單疏松的混合物(即“漿”或“粗粉”)；壓實(shí)的小團(tuán)、碎屑或顆粒；以及薄片。根據(jù)魚類的飼養(yǎng)需要，可以制備沉入水中或漂浮的小團(tuán)。半濕和濕飼料是從單個(gè)或混合的成分(如無(wú)價(jià)值的魚類或煮熟的豆類)制備，并且可以成形為餅狀或球狀。
認(rèn)為本發(fā)明的生產(chǎn)高濃度ARA的工程化的解脂耶氏酵母菌株特別可以用于包括在大多數(shù)水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中。除了提供必要的ω-6PUFAs，酵母自身是可以增加配方的美味性的有用蛋白來(lái)源。在替代的實(shí)施方案中，由本發(fā)明的解脂耶氏酵母菌株生產(chǎn)的油可以在從細(xì)胞團(tuán)提取和純化后，直接加入水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料配方中。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述 本發(fā)明證明了占含油酵母解脂耶氏酵母的總脂質(zhì)比例的最多10-14％的ARA的合成。如圖4所示，通過(guò)將多個(gè)基因整合到野生型ATCC#20362解脂耶氏酵母中，建立了許多解脂耶氏酵母菌株，其中每種轉(zhuǎn)化菌株都能夠生產(chǎn)不同量的PUFAs(包括ARA)。菌株Y2034和Y2047(表達(dá)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑)和菌株Y2214(表達(dá)Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑)的完整脂質(zhì)譜示于下表10。脂肪酸鑒定為16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA和ARA；并且每一種所述脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比?！爸|(zhì)％ dcw”表示通過(guò)細(xì)胞干重測(cè)量的細(xì)胞中脂質(zhì)的百分比。
表10 解脂耶氏酵母菌株Y2034、Y2047和Y2214的脂質(zhì)譜
下文描述了菌株Y2047中包含的基因修飾的更詳細(xì)概括(其中完整的細(xì)節(jié)提供于實(shí)施例中) (1)1個(gè)拷貝的串珠鐮孢Δ12去飽和酶的表達(dá)，在FBA::F.Δ12::LIP2嵌合基因中； (2)來(lái)源于高山被孢霉Δ6去飽和酶的1個(gè)拷貝的合成Δ6去飽和酶基因(為在解脂耶氏酵母中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)的表達(dá)，在FBAIN::Δ6S::LIP1嵌合基因中； (3)來(lái)源于人Δ5去飽和酶的1個(gè)拷貝的合成Δ5去飽和酶基因(為在解脂耶氏酵母中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)的表達(dá)，在TEF::H.D5S::PEX16嵌合基因中； (4)來(lái)源于高山被孢霉高親和力C18/20延伸酶的1個(gè)拷貝的合成的高親和力C18/20延伸酶基因(為在解脂耶氏酵母中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)的表達(dá)，在FBAIN::EL1S::PEX20嵌合基因中； (5)來(lái)源于金黃色破囊壺菌C18/20延伸酶的1個(gè)拷貝的合成C18/20延伸酶基因(為在解脂耶氏酵母中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)的表達(dá)，在TEF::EL2S::XPR嵌合基因中； (6)編碼編碼蘋果酸異丙酯脫氫酶的天然解脂耶氏酵母Leu2基因的破壞。
相似地，下文描述了菌株Y2214內(nèi)包含的基因修飾的更詳細(xì)概括(其中完整的細(xì)節(jié)提供于實(shí)施例中) (1)來(lái)源于球等鞭金藻Δ9延伸酶基因的5個(gè)拷貝的合成Δ9延伸酶基因(為在解脂耶氏酵母中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)的表達(dá)，在GPAT::IgD9e::PEX20、TEF::IgD9e::LIP1和FBAINm::IgD9e::OCT嵌合基因中； (2)來(lái)源于纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶基因的3個(gè)拷貝的合成Δ8去飽和酶基因(為在解脂耶氏酵母中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)的表達(dá)，在FBAIN::D8SF::PEX16和GPD::D8SF::PEX16嵌合基因中； (3)2個(gè)拷貝的高山被孢霉Δ5去飽和酶的表達(dá)，在FBAIN::MAΔ5::PEX20和GPAT::MAΔ5::PEX20嵌合基因中； (4)來(lái)源于球等鞭金藻Δ5去飽和酶的2個(gè)拷貝的合成Δ5去飽和酶基因(為在解脂耶氏酵母中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)的表達(dá)，在YAT1::I.D5S::LIP1和GPM/FBAIN::I.D5S::OCT嵌合基因中； (5)1個(gè)拷貝的串珠鐮孢Δ12去飽和酶的表達(dá)，在FBAIN::F.D12S::PEX20嵌合基因中； (6)來(lái)源于褐家鼠rELO基因的1個(gè)拷貝的合成C16/18延伸酶基因(為在解脂耶氏酵母中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)的表達(dá)，在GPM/FBAintron::rELO2S::OCT嵌合基因中；和 (7)編碼酵母氨酸脫氫酶的天然解脂耶氏酵母Lys5基因的破壞。
盡管申請(qǐng)人分別證明了在這些特定的解脂耶氏酵母重組菌株中生產(chǎn)了11％和14％ ARA，但根據(jù)此處公開(kāi)的本發(fā)明，宿主細(xì)胞中EPA的濃度可以通過(guò)額外的基因修飾顯著增加。此外，基于此處描述的教導(dǎo)和結(jié)果可以預(yù)見(jiàn)到本領(lǐng)域技術(shù)人員采用Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑和/或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑，采用含油酵母作為合成多種ω-3和/或ω-6PUFAs的平臺(tái)建立的可行性和商業(yè)用途。
實(shí)施例 在以下實(shí)施例中進(jìn)一步限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，在這些實(shí)施方案中，盡管指明了是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是，是以說(shuō)明形式提供的。通過(guò)上文的討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特征，并且，在不超出本發(fā)明的構(gòu)思和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和改進(jìn)，以便適應(yīng)各種用途和條件。
一般方法 用于實(shí)施例中的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知的，并且披露于以下文獻(xiàn)中1.)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.andManiatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold SpringHarbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2.)T.J.Silhavy，M.L.Bennan，and L.W.Enq uist，Experiments withGene Fusions；Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY(1984)；和3.)Ausubel，F(xiàn).M.et al.，Current Protocols in MolecularBiology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)出版。
適合微生物培養(yǎng)物維持和生長(zhǎng)的材料和方法為本領(lǐng)域所公知。適合在以下實(shí)施例中使用的技術(shù)可以參見(jiàn)以下文獻(xiàn)Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg and G.Briggs Phillips，Eds)，American Society for MicrobiologyWashington，D.C.(1994))；或參見(jiàn)Thomas D.Brock inBiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology，2nd ed.，Sinauer AssociatesSunderland，MA(1989)。用于生長(zhǎng)和維持微生物細(xì)胞的所有試劑，限制酶和材料都是從Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)獲得的，除非另有說(shuō)明。
大腸桿菌(XL1-Blue)感受態(tài)細(xì)胞是從Stratagene公司(SanDiego，CA)購(gòu)買的。大腸桿菌菌株通常是在37℃下在Luria Bertani(LB)平板上生長(zhǎng)的。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，同上)進(jìn)行一般分子克隆。寡核苷酸是由Sigma-Genosys(Spring，TX)合成的。在50μl總體積中進(jìn)行各個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)，其中包括PCR緩沖液(含10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris-HCl(pH 8.75)、2mM MgSO4、0.1％ Triton X-100)、100μg/mL BSA(終濃度)、每種三磷酸脫氧核糖核苷酸各200μM、每種引物各10pmole和1μl Pfu DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)，除非另有說(shuō)明。用Stratagene’sQuickChangeTM定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行定點(diǎn)誘變。當(dāng)PCR或定點(diǎn)誘變參與亞克隆時(shí)，對(duì)所述構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序，以便證實(shí)沒(méi)有將誤差導(dǎo)入所述序列。將PCR產(chǎn)物克隆到Promega’s pGEM-T-easy載體(Madison，WI)中。
用載體和插入片段特異性引物的組合，采用染料終止子技術(shù)(U.S.5,366,860；EP 272,007)在ABI自動(dòng)測(cè)序儀上產(chǎn)生DNA序列。在測(cè)序儀(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)上進(jìn)行序列編輯。所有序列代表每個(gè)方向覆蓋至少兩次。用DNASTAR軟件(DNA Star，Inc.)完成基因序列的比較?；蛘?，基因序列的操作使用可以從GeneticsComputer Group Inc.(Wisconsin Package Version 9.0，GeneticsComputer Group(GCG)，Madison，WI)獲得的程序組進(jìn)行。使用了所述GCG程序“Pileup”，空位形成缺省值為12，空位延伸缺省值為4。使用了GCG“Gap”或“Bestfit”程序，缺省的空位形成罰分為50，缺省的空位延伸罰分為3。除非另有說(shuō)明，在所有其他場(chǎng)合下，都使用GCG程序的缺省參數(shù)。
進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1993)和Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))檢索，以鑒定與包含在BLAST“nr”數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列(包括所有非冗余的GenBank CDS翻譯、來(lái)源于三維結(jié)構(gòu)Brookhaven Protein數(shù)據(jù)庫(kù)的序列、SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù))具有相似性的分離的序列。按照所有可讀框翻譯序列，并且采用NCBI提供的BLASTX算法(Gish，W.andStates，D.J.Nature Genetics 3266-272(1993))比較與“nr”數(shù)據(jù)庫(kù)中包含的所有公眾可獲得的蛋白序列的相似性。
根據(jù)同一性百分比、相似性百分比和預(yù)期值報(bào)告了BLAST比較的結(jié)果，該結(jié)果概括了與詢問(wèn)序列具有最多相似性的序列。“同一性百分比”定義為在兩種蛋白之間相同的氨基酸的百分比。“相似性百分比”定義為在兩種蛋白之間相同或保守的氨基酸的百分比?！邦A(yù)期值”估計(jì)了匹配的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，該顯著性用特定評(píng)分指出匹配數(shù)目，該評(píng)分是在對(duì)該大小的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索而預(yù)期的，這種預(yù)期完全是隨機(jī)的。
縮寫的含義如下“sec”表示秒，“min”表示分鐘，“h”表示小時(shí)，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩爾濃度，“mM”表示毫摩爾濃度，“M”表示摩爾濃度，“mmol”毫摩爾，“μmole”表示微摩爾，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示納克，“U”表示單位，“bp”表示堿基對(duì)，而“kB”表示千堿基。
解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng) 從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)購(gòu)買解脂耶氏酵母菌株ATCC #20362、#76982和#90812。解脂耶氏酵母菌株在28℃下在YPD瓊脂(1％酵母提取物，2％細(xì)菌用蛋白胨，2％葡萄糖，2％瓊脂)上生長(zhǎng)。或者，“SD”培養(yǎng)基包含含有硫酸銨而不含氨基酸的0.67％的酵母氮基和2％葡萄糖。
根據(jù)Chen，D.C.et al.(Appl.Microbiol Biotechnol.48(2)232-235(1997))的方法進(jìn)行解脂耶氏酵母的轉(zhuǎn)化，除非另外指明。簡(jiǎn)言之，將耶氏酵母劃線到Y(jié)PD平板上，在30℃下生長(zhǎng)大約18小時(shí)。從平板上刮下幾個(gè)大滿環(huán)的細(xì)胞，重懸于1ml轉(zhuǎn)化緩沖液中，該緩沖液含有2.25mL 50％ PEG，平均分子量3350；0.125mL 2M醋酸鋰，pH 6.0；0.125mL 2M DTT；和50μg剪切的鮭魚精子DNA。然后，將大約500ng線性化的質(zhì)粒DNA在100μl重懸的細(xì)胞中溫育，以15分鐘間隔渦旋下在39℃維持1小時(shí)。將細(xì)胞鋪板到選擇培養(yǎng)基板上，在30℃下維持2-3天。
為了選擇轉(zhuǎn)化體，一般使用SD培養(yǎng)基或基本培養(yǎng)基(“MM”)；MM的組成如下不含硫酸銨或氨基酸的0.17％酵母氮基(DIFCOLaboratories，Detroit，MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸，pH 6.1。合適的情況下加入腺嘌呤、亮氨酸、賴氨酸和/或尿嘧啶補(bǔ)充物，達(dá)到0.01％的終濃度(從而得到“MMA”、“MMLe”、“MMLy”和“MMU”選擇培養(yǎng)基，每種都是用20g/L瓊脂制備的)。
或者，在5-氟乳清酸(“FOA”；也稱作5-氟尿嘧啶-6羧酸一水合物)選擇培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體，該培養(yǎng)基包含不含硫酸銨或氨基酸的0.17％酵母氮基(DIFCO Laboratories)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿苷、900mg/L FOA(Zymo ResearchCorp.，Orange，CA)和20g/L瓊脂。
最后，對(duì)于設(shè)計(jì)用于促進(jìn)含油性的條件的“兩階段生長(zhǎng)條件”，按照如下制備高葡萄糖培養(yǎng)基(“HGM”)14g/L KH2PO4、4g/LK2HPO4、2g/L MgSO4·7H2O、80g/L葡萄糖(pH 6.5)。根據(jù)以下方案，在“兩階段生長(zhǎng)條件”下培養(yǎng)菌株首先，30℃下250rpm/min振蕩條件下將三份細(xì)胞在液體MM中生長(zhǎng)48小時(shí)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取上清液。將沉淀的細(xì)胞重懸于HGM中，30℃下250rpm/min振蕩條件下生長(zhǎng)72小時(shí)或96小時(shí)。通過(guò)離心再次收集細(xì)胞，提取上清液。
解脂耶氏酵母的脂肪酸分析 為了進(jìn)行脂肪酸分析，通過(guò)離心收集細(xì)胞，并且按照披露于以下文獻(xiàn)中的方法提取脂質(zhì)Bligh，E.G.& Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.37911-917(1959))。脂肪酸甲酯是通過(guò)脂質(zhì)提取物與甲醇鈉的脂交換反應(yīng)制備的(Roughan，G.，and Nishida I.Arch BiochemBiophys.276(1)38-46(1990))，并且隨后用裝有30-m X 0.25mm(內(nèi)徑)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard 6890GC進(jìn)行分析。烘箱溫度以3.5℃/分鐘的速度從170℃(25分鐘保持時(shí)間)提高到185℃。
為了進(jìn)行直接的堿酯交換，收獲耶氏酵母培養(yǎng)物(3mL)，在蒸餾水中洗滌一次，在Speed-Vac中真空干燥5-10分鐘。將甲醇鈉(100μl，1％)加入樣品，然后渦旋并搖動(dòng)樣品20分鐘。加入3滴1M NaCl和400μl己烷后，渦旋和離心樣品。取出上層，按照上文的描述通過(guò)GC進(jìn)行分析。
實(shí)施例1 鑒定用于在解脂耶氏酵母中高表達(dá)的啟動(dòng)子 進(jìn)行了比較研究，研究TEF、GPD、GPDIN、GPM、GPAT、FBA、FBAIN和YAT1啟動(dòng)子的啟動(dòng)子活性，該研究是通過(guò)合成包含每種啟動(dòng)子和作為報(bào)道基因的編碼葡糖醛酸酶(GUS)的大腸桿菌基因的構(gòu)建體而進(jìn)行的(Jefferson，R.A.Nature.14(342)837-838(1989))。然后，通過(guò)組織化學(xué)和熒光測(cè)定(Jefferson，R.A.Plant Mol.Biol.Reporter 5387-405(1987))和/或通過(guò)使用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行mRNA定量而測(cè)量GUS活性。
構(gòu)建包含嵌合啟動(dòng)子::GUS::XPR基因的質(zhì)粒 質(zhì)粒pY5-30(圖5A；SEQ ID NO113)包含耶氏酵母自主復(fù)制序列(ARS18)；ColE1質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；用于在大腸桿菌中進(jìn)行選擇的氨芐青霉素抗性基因(AmpR)；用于在耶氏酵母中進(jìn)行選擇的耶氏酵母LEU2基因；和嵌合TEF::GUS::XPR基因?；谠撡|(zhì)粒，建立了一系列質(zhì)粒，其中用多種其它天然解脂耶氏酵母啟動(dòng)子代替TEF啟動(dòng)子。
通過(guò)PCR擴(kuò)增推定的啟動(dòng)子區(qū)，擴(kuò)增中采用下表11所示引物和基因組解脂耶氏酵母DNA作為模板，或含有克隆到pGEM-T-easyvector(Promega，Madison，WI)載體中的合適DNA區(qū)的基因組DNA的片段。
表11 包含嵌合啟動(dòng)子::GUS::XPR基因的質(zhì)粒的構(gòu)建 注‘ATG’翻譯起始密碼子的‘A’核苷酸稱作+1 按照一般方法中的描述，在50μl總體積中進(jìn)行GPD、GPDIN、GPM、FBA和FBAIN的各個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。熱循環(huán)儀條件設(shè)置為35個(gè)循環(huán)的95℃下1分鐘、56℃下30秒和72℃下1分鐘，最后，72℃下進(jìn)行最終延伸10分鐘。
用預(yù)先混合的2X PCR溶液(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)的1:1稀釋液，在50μl總體積中進(jìn)行GPAT啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增。最終的組合物含有25mM TAPS(pH 9.3)、50mMKCl、2mM MgCl2、1mM 2-巰基乙醇、每種三磷酸脫氧核糖核苷酸各200μM、每種引物各10pmole、50ng模板和1.25U TaKaRa ExTaqTM DNA聚合酶(Takara Mirus Bio，Madison，WI)。熱循環(huán)儀條件設(shè)置為30個(gè)循環(huán)的94℃下2.5分鐘、55℃下30秒和72℃下2.5分鐘，最后，72℃下進(jìn)行最終延伸6分鐘。
在與上文對(duì)GPAT描述的相似組合物中進(jìn)行YAT1啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增。首先將反應(yīng)混合物加熱到94℃持續(xù)150秒。擴(kuò)增進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94℃下30秒、55℃下30秒和72℃下1分鐘，最后，72℃下進(jìn)行最終延伸7分鐘。
用Qiagen PCR純化試劑盒純化每種PCR產(chǎn)物，然后用限制酶消化(根據(jù)上表，用標(biāo)準(zhǔn)條件)，在1％(w/v)瓊脂糖中進(jìn)行凝膠電泳后純化消化的產(chǎn)物。然后將消化的PCR產(chǎn)物(除來(lái)自YAT1的那些)連接到相似消化的pY5-30載體中。然后將來(lái)自每個(gè)反應(yīng)的連接的DNA用于分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10、大腸桿菌DH10B或大腸桿菌DH5α。在含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB瓊脂上選擇轉(zhuǎn)化體。
YAT1在克隆到pY5-30中之前，需要額外的操作。具體地，用HindIII和SalI消化YAT1 PCR產(chǎn)物后，得到了約600bp的片段；用NcoI和HindIII消化后，得到了約200bp的片段。分離和純化這兩種產(chǎn)物。然后，用SalI和NcoI消化質(zhì)粒pYGPAT-GUS，分離和純化約9.5kB的片段。將三種DNA片段連接在一起，得到pYAT-GUS。
分析來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的質(zhì)粒，證明了預(yù)期的質(zhì)粒的存在。這些質(zhì)粒命名如下pYZGDG(包含GPD::GUS::XPR嵌合基因)，pDMW222(包含GPDIN::GUS::XPR嵌合基因)，pYZGMG(包含GPM::GUS::XPR嵌合基因)，pYGPAT-GUS(包含GPAT::GUS::XPR嵌合基因)，pDMW212(包含F(xiàn)BA::GUS::XPR嵌合基因)，pDMW214(包含F(xiàn)BAIN::GUS::XPR嵌合基因)和pYAT-GUS(包含YAT1::GUS::XPR嵌合基因)。
按照一般方法中的描述，將上述質(zhì)粒，以及額外的質(zhì)粒pY5-30(包含TEF::GUS::XPR嵌合基因)分別轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母中。解脂耶氏酵母宿主是解脂耶氏酵母ATCC #76982或解脂耶氏酵母ATCC#20362，菌株Y2034(下文[實(shí)施例4]，能夠通過(guò)去飽和酶/Δ6延伸酶途徑生產(chǎn)10％ ARA)。將所有轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板到缺乏亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，在30℃下維持2-3天。
通過(guò)GUS表達(dá)的組織化學(xué)分析對(duì)耶氏酵母啟動(dòng)子進(jìn)行的比較分析 使含有質(zhì)粒pY5-30、pYZGDG、pYZGMG、pDMW212和pDMW214的解脂耶氏酵母ATCC #76982菌株30℃下在3mL MM中從單菌落生長(zhǎng)到OD600為約1.0。然后，通過(guò)離心收集100μl細(xì)胞，重懸于100μl組織化學(xué)染色緩沖液中，30℃下溫育。將5mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸(X-Gluc)溶解于50μl二甲基甲酰胺中，然后加入5mL 50mM NaPO4，pH 7.0，以制備染色緩沖液。組織化學(xué)染色的結(jié)果(圖5B)表明，構(gòu)建體pY5-30中的TEF啟動(dòng)子、構(gòu)建體pYZGDG中的GDP啟動(dòng)子、構(gòu)建體pYZGMG中的GPM啟動(dòng)子、構(gòu)建體pDMW212中的FBA啟動(dòng)子、構(gòu)建體pDMW214中的FBAIN啟動(dòng)子都是有活性的。FBA和FBAIN啟動(dòng)子似乎都比其它啟動(dòng)子強(qiáng)得多，F(xiàn)BAIN啟動(dòng)子具有最強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。
在一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，使含有質(zhì)粒pY5-30、pYGPAT-GUS、pYAT-GUS和pDMW214的解脂耶氏酵母Y2034菌株30℃下在5mLSD培養(yǎng)基中從單菌落生長(zhǎng)到OD600為約8.0。然后，通過(guò)離心收集1mL細(xì)胞。離心剩余的培養(yǎng)物，用HGM洗滌兩次，分別重懸于5mL HGM中，在30℃下進(jìn)一步生長(zhǎng)。24和120小時(shí)后，離心約0.25mL的每種培養(yǎng)物，收集細(xì)胞。將細(xì)胞樣品分別重懸于100μl組織化學(xué)染色緩沖液(參見(jiàn)上文)中。在每個(gè)樣品中加入消解酶20T(5μl，1mg/mL；ICN Biomedicals，Costa Mesa，CA)，30℃下溫育混合物。
組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示，當(dāng)在SD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24小時(shí)，構(gòu)建體pYGPAT-GUS中的GPAT啟動(dòng)子是有活性的，構(gòu)建體pYAT-GUS中的YAT1啟動(dòng)子也是有活性的(圖5C，“在SD培養(yǎng)中24hr”)。比較而言，GPAT啟動(dòng)子似乎比TEF啟動(dòng)子強(qiáng)得多，并且相對(duì)于FBAIN啟動(dòng)子的活性減少。同樣，當(dāng)細(xì)胞在SD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24小時(shí)，YAT1啟動(dòng)子似乎比TEF啟動(dòng)子強(qiáng)得多，但比FBAIN啟動(dòng)子和GPAT啟動(dòng)子明顯更弱。然而，更有趣的是，發(fā)現(xiàn)在HGM中生長(zhǎng)24小時(shí)的細(xì)胞中，YAT1啟動(dòng)子比GPAT啟動(dòng)子強(qiáng)，并且與FBAIN啟動(dòng)子相似(圖5C，“在HG培養(yǎng)基中24小時(shí)”)。在HGM中120小時(shí)后依然如此(圖5C，“在HG培養(yǎng)基中120小時(shí)”)。因此，YAT1啟動(dòng)子在HGM中似乎被誘導(dǎo)，HGM是由于氮限制而促進(jìn)含油生長(zhǎng)條件的培養(yǎng)基。
通過(guò)GUS表達(dá)的熒光測(cè)定對(duì)解脂耶氏酵母啟動(dòng)子進(jìn)行的比較分析 通過(guò)熒光測(cè)定相應(yīng)的底物β-葡糖苷酸對(duì)4-甲基傘形酮(4-MU)的生產(chǎn)(Jefferson，R.A.Plant Mol.Biol.Reporter 5387-405(1987))，也測(cè)定了GUS活性。
使含有質(zhì)粒pY5-30、pYZGDG、pYZGMG、pDMW212和pDMW214的解脂耶氏酵母ATCC #76982菌株30℃下在3mL MM中從單菌落生長(zhǎng)到OD600為約1.0(按照上文的描述)。然后，將各3mL培養(yǎng)物加入含有50mL MM的500mL燒瓶中，在振蕩孵育器中30℃下生長(zhǎng)約24小時(shí)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，重懸于Promega細(xì)胞裂解緩沖液中，用BIO 101 Biopulverizer system(Vista，CA)裂解。離心后，除去上清液，放置在冰上。
類似地，將含有質(zhì)粒pY5-30、pYAT-GUS、pYGPAT-GUS和pDMW214構(gòu)建體的解脂耶氏酵母菌株Y2034 30℃下在10mL SD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)，從單菌落生長(zhǎng)到OD600為約5.0。收集每種培養(yǎng)物各2mL，用于按照下文所述進(jìn)行GUS活性測(cè)定，而將每種培養(yǎng)物各5ML轉(zhuǎn)換到HGM中。
具體地，通過(guò)離心收集來(lái)自5mL等分物的細(xì)胞，用5mL HGM洗滌一次，重懸于HGM中。然后，將HGM中的培養(yǎng)物在振蕩孵育器中30℃下生長(zhǎng)24小時(shí)。收集每種HGM培養(yǎng)物各2mL用于GUS活性測(cè)定，而使剩余的培養(yǎng)物再生長(zhǎng)額外的96小時(shí)，然后收集每種培養(yǎng)物的額外的2mL用于測(cè)定。
將每份2mL SD培養(yǎng)基中的培養(yǎng)樣品重懸于1ML 0.5X細(xì)胞培養(yǎng)物裂解試劑(Promega)中。將重懸的細(xì)胞在配備橡膠O形環(huán)的2.0mL螺帽試管中與0.6mL玻璃珠(0.5mm直徑)混合。然后在Biospec minibeadbeater(Bartlesville，OK)中，以最高的設(shè)置將細(xì)胞勻漿90秒。14,000rpm下將勻漿混合物在Eppendof離心管中離心2分鐘，以除去細(xì)胞碎屑和珠子。將上清液用于GUS測(cè)定和蛋白測(cè)定。
為了進(jìn)行每個(gè)熒光測(cè)定，將100μl提取物加入700μlGUS測(cè)定緩沖液(2mM 4-甲基傘形酮基-β-D-葡糖苷酸(“MUG”)，溶于提取緩沖液中)或?qū)?00μl提取物加入800μl GUS測(cè)定緩沖液中。將混合物置于37℃下。然后在0、30和60分鐘的時(shí)間點(diǎn)取出100μl的等分物，加入900μl終止緩沖液(1M Na2CO3)。用CytoFluor Series4000 Fluorescence Multi-Well平板讀數(shù)器(PerSeptive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA)對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行讀數(shù)，所述讀數(shù)器設(shè)置為激發(fā)波長(zhǎng)是360nm，而發(fā)射波長(zhǎng)是455nm。用10μl提取物和200μl BioRadBradford試劑或20μl提取物和980μl BioRad Bradford試劑確定每個(gè)樣品的總蛋白濃度(Bradford，M.M.Anal.Biochem.72248-254(1976))。GUS活性表示為每分鐘每mg蛋白的4-MU納摩爾數(shù)。
設(shè)計(jì)將這些熒光測(cè)定的結(jié)果用于比較解脂耶氏酵母ATCC #76982菌株中的TEF、GPD、GPM、FBA和FBAIN啟動(dòng)子，如圖6A所示。具體地，F(xiàn)BA啟動(dòng)子在解脂耶氏酵母中比GPD強(qiáng)2.2倍。此外，F(xiàn)BAIN啟動(dòng)子的GUS活性比GPD啟動(dòng)子強(qiáng)約6.6倍。
這些設(shè)計(jì)用于比較解脂耶氏酵母菌株Y2034中的TEF、GPAT、YAT1和FBAIN啟動(dòng)子的熒光測(cè)定的結(jié)果如下表所示。
表12 各種生長(zhǎng)條件下TEF、FBAIN、YAT1和GPAT啟動(dòng)子活性的比較
基于上述數(shù)據(jù)(其中對(duì)YAT1啟動(dòng)子活性的定量是基于細(xì)胞提取物的GUS活性)，當(dāng)細(xì)胞從SD培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到HGM中并且生長(zhǎng)24小時(shí)后，YAT1啟動(dòng)子的活性增加約37倍。在HGM中120小時(shí)后，活性一定程度地減少，但仍然比在SD培養(yǎng)基中的活性高25倍。相反，當(dāng)從SD培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到HGM中24小時(shí)后，F(xiàn)BAIN啟動(dòng)子和GPAT啟動(dòng)子的活性分別減少30％和40％。TEF啟動(dòng)子的活性在HGM中24小時(shí)后增加2.3倍。因此，YAT1啟動(dòng)子在含油條件下是可誘導(dǎo)的。
通過(guò)GUS表達(dá)的定量PCR分析對(duì)耶氏酵母啟動(dòng)子進(jìn)行的比較分析 通過(guò)定量PCR分析，確定含有pY5-30、pYZGDG、pDMW222、pDMW212和pDMW214構(gòu)建體的解脂耶氏酵母中TEF、GPD、GPDIN、FBA和FBAIN啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。這要求分離RNA和實(shí)時(shí)RT-PCR。
更具體地，使含有pY5-30、pYZGDG、pDMW222、pDMW212和pDMW214構(gòu)建體的解脂耶氏酵母ATCC #76982菌株在25mLErlenmeyer燒瓶中的6mL MM中30℃下從單菌落生長(zhǎng)16小時(shí)。然后，將每種各6mL的起始培養(yǎng)物加入各個(gè)含有140mL HGM的500mL燒瓶中，30℃下溫育4天。以24小時(shí)的每個(gè)間隔，從每個(gè)燒瓶取出每種培養(yǎng)物各1mL，以測(cè)量光密度，取出27mL，用于進(jìn)行熒光測(cè)定(如上文的描述)，取出兩個(gè)1.5mL的等分物，進(jìn)行RNA分離。對(duì)RNA分離的培養(yǎng)物進(jìn)行離心，產(chǎn)生細(xì)胞沉淀。
根據(jù)改進(jìn)的Qiagen RNeasy mini方案(Qiagen，San Diego，CA)，從耶氏酵母菌株分離RNA。簡(jiǎn)言之，在每個(gè)樣品的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用340μL Qiagen’s緩沖液RLT重懸兩種細(xì)胞沉淀的每一種。將來(lái)自兩個(gè)試管的每一個(gè)試管的緩沖液RLT/細(xì)胞懸浮液混合物在珠子攪拌試管(Bio101，San Diego，CA)中混合。將0.5mL玻璃珠中的大約500μL加入試管中，通過(guò)在設(shè)置5(BioPulverizer，Bio101 Company，SanDiego，CA)進(jìn)行珠子攪拌2分鐘，破碎細(xì)胞。然后通過(guò)在14,000rpm離心1分鐘而沉淀破碎的細(xì)胞，將350μl上清液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中。將乙醇(350μL 70％)加入每種勻漿的裂解物。輕柔攪拌后，將整個(gè)樣品加入2mL收集管中的Rneasy微型柱。將樣品以10,000rpm離心15秒。將緩沖液RW1(350μL)加入Rneasy微型柱，將柱子以10,000rpm離心15秒，以洗滌細(xì)胞。棄去洗脫液。將Qiagen’s DNase1儲(chǔ)液(10μL)加入70μl緩沖液RDD，輕柔混合。將完整的DNA酶溶液加入Rneasy微型柱，室溫下溫育15分鐘。溫育步驟后，將350μL緩沖液RW1加入微型柱，將柱子以10,000rpm離心15秒。將柱子用700μL緩沖液RW1洗滌兩次。將不含RNA酶的水(50μL)加入柱子。以10,000rpm將柱子離心1分鐘，以洗脫RNA。
采用兩步RT-PCR方案，其中首先將耶氏酵母總RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，然后用實(shí)時(shí)PCR分析cDNA。用Applied Biosystems’HighCapacity cDNA Archive試劑盒(PN#4322171；Foster City，CA)和來(lái)自MediaTech，Inc.(PN# 46-000-Con；Holly Hill，F(xiàn)L)的分子生物級(jí)水進(jìn)行向cDNA的轉(zhuǎn)化。通過(guò)與10μl RT緩沖液、4μl 25XdNTPs、10μl 10X Random Hexamer引物、5μl Multiscribe逆轉(zhuǎn)錄酶和0.005μl RNA酶混合，并且用水將中反應(yīng)體積補(bǔ)充為100μl，將來(lái)自耶氏酵母的總RNA(100ng)轉(zhuǎn)化為cDNA。在熱循環(huán)儀中溫育反應(yīng)，25℃下10分鐘，然后是37℃下2小時(shí)。將cDNA在-20℃儲(chǔ)存，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。
用來(lái)自Applied Biosystems(PN# 4309155)的SYBR Green PCR主混合物進(jìn)行實(shí)時(shí)分析。將逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物(2μl)加入10μl 2X SYBRPCR混合物、0.2μl 100μM針對(duì)URA(即引物YL-URA-16F和YL-URA-78R[SEQ ID NOs198和199])或GUS(即引物GUS-767F和GUS-891R[SEQ ID NO200和201])的正向和反向引物和7.2μl水。使反應(yīng)在95℃下熱循環(huán)10分鐘，然后在ABI 7900 Sequence DetectionSystem儀器中進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃下5秒和60℃下1分鐘。在每個(gè)周期，在60℃延伸過(guò)程中收集實(shí)時(shí)熒光數(shù)據(jù)。
按照用戶手冊(cè)#2“Relative Quantitation of Gene Expression”，Applied Biosystems，2001年10月，用ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)定量。將URA基因用于對(duì)GUS表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。為了證實(shí)將URA用作標(biāo)準(zhǔn)化基因，比較GUS和URA的PCR效率，發(fā)現(xiàn)它們分別是1.04和0.99(其中1.00等于100％效率)。由于PCR效率都接近于100％，證實(shí)了將URA作為GUS表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)化物，以及將ΔΔCT方法用于表達(dá)定量。標(biāo)準(zhǔn)化的量稱作ΔCT。
將每種不同菌株(即含有pYZGDG、pDMW222、pDMW212和pDMW214構(gòu)建體的解脂耶氏酵母ATCC #76982菌株)中的GUSmRNA定量到含有pY5-30(TEF::GUS)的菌株的mRNA水平。因此，用含有TEF::GUS的菌株的mRNA水平作為參照樣品，計(jì)算表達(dá)的相對(duì)定量。將GPD::GUS、GPDIN::GUS、FBA::GUS和FBAIN::GUS的標(biāo)準(zhǔn)化的值與TEF::GUS參照的標(biāo)準(zhǔn)化值進(jìn)行比較。這種量稱作ΔΔCT。然后利用公式2-ΔΔCT，將ΔΔCT值轉(zhuǎn)化為絕對(duì)值。這些值表示包含嵌合GPD::GUS、GPDIN::GUS、FBA::GUS和FBAIN::GUS基因的菌株相對(duì)于包含嵌合TEF::GUS基因的菌株中的GUS的mRNA水平的增加倍數(shù)。采用該方法，可以比較TEF啟動(dòng)子的活性與GPD、GPDIN、FBA和FBAIN啟動(dòng)子的活性。
每種GUS嵌合基因的mRNA的相對(duì)定量結(jié)果示于圖6B。更具體地，該測(cè)定顯示，在HGM中24小時(shí)后，F(xiàn)BA和FBAIN啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性分別比TEF啟動(dòng)子強(qiáng)大約3.3和6倍。類似地，GPD和GPDIN啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性分別比TEF啟動(dòng)子強(qiáng)大約2和4.4倍。盡管FBA::GUS、FBAIN::GUS、GPD::GUS和GPDIN::GUS基因融合體的轉(zhuǎn)錄活性在4天的實(shí)驗(yàn)期中減少，F(xiàn)BAIN和GPDIN啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性在實(shí)驗(yàn)的最后一天仍然比TEF啟動(dòng)子強(qiáng)大約3和2.6倍。
實(shí)施例2 鑒定用于增加解脂耶氏酵母中的基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子 基于FBAIN和GPDIN的強(qiáng)啟動(dòng)子活性(其中活性分別大于FBA和GPD啟動(dòng)子的活性)和每個(gè)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的內(nèi)含子的鑒定，進(jìn)行了目前的工作，以確定每個(gè)內(nèi)含子中是否存在增強(qiáng)子。
具體地，制備了由GPM::FBAIN啟動(dòng)子融合體和GPM::GPDIN啟動(dòng)子融合體組成的兩個(gè)嵌合啟動(dòng)子，以驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)道基因的表達(dá)。嵌合啟動(dòng)子(包含“成分1”和“成分2”)描述于下表13。
表13 包含嵌合啟動(dòng)子::GUS::XPR基因內(nèi)的嵌合啟動(dòng)子的質(zhì)粒的構(gòu)建 嵌合啟動(dòng)子的位置使每一種嵌合啟動(dòng)子都驅(qū)動(dòng)質(zhì)粒pDMW224和pDMW225中的GUS報(bào)道基因的表達(dá)。
通過(guò)基于組織化學(xué)測(cè)定(如實(shí)施例1的描述)比較包含pDMW224和pDMW225的解脂耶氏酵母菌株中的GUS活性與包含pY5-30、pYZGDG、pYZGMG和pDMW214構(gòu)建體的解脂耶氏酵母菌株中的GUS活性，將GPM::FBAIN啟動(dòng)子和GPM::GPDIN啟動(dòng)子的活性與TEF、FBAIN、GPDIN和GPM啟動(dòng)子的活性進(jìn)行比較。如上文所確定的，F(xiàn)BAIN啟動(dòng)子是最強(qiáng)的啟動(dòng)子。但是，嵌合GPM::FBAIN啟動(dòng)子和嵌合GPM::GPDIN啟動(dòng)子都比GPM啟動(dòng)子強(qiáng)得多，并且似乎活性與GPDIN啟動(dòng)子相同。因此，證明了在GPDIN和FBAIN啟動(dòng)子中都存在增強(qiáng)子。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地用GPDIN內(nèi)含子或FBAIN內(nèi)含子構(gòu)建相似的嵌合啟動(dòng)子。
實(shí)施例3 磺酰脲選擇 由于缺乏合適的非抗生素選擇轉(zhuǎn)化標(biāo)記，阻礙了耶氏酵母的遺傳改進(jìn)。本實(shí)施例描述了基于磺酰脲抗性開(kāi)發(fā)顯性的、解脂耶氏酵母非抗生素標(biāo)記，其也可以遺傳上用于工業(yè)酵母菌株，這些菌株可以是單倍體、二倍體、非整倍體或雜合的。
理論和最初的敏感性篩選 乙酰羥酸合酶(AHAS)是生物合成支鏈氨基酸的途徑中最常見(jiàn)的酶。它是磺酰脲和咪唑烷酮除草劑的靶。因此，在微生物和植物中都報(bào)道了磺酰脲除草劑抗性。例如，在啤酒糖酵母中，AHAS中的單個(gè)W586L突變賦予對(duì)磺酰脲除草劑的抗性(Falco，S.C.，et al.，Dev.Ind.Microbiol.30187-194(1989)；Duggleby，R.G.，et.al.Eur.J.Biochem.2702895(2003))。
當(dāng)對(duì)野生型AHAS解脂耶氏酵母(GenBank獲取號(hào)XP_501277)和啤酒糖酵母(GenBank獲取號(hào)P07342)酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，啤酒糖酵母酶的586位的Trp氨基酸殘基與解脂耶氏酵母酶的497位的Trp殘基相同。因此，如果野生型細(xì)胞自身對(duì)磺酰脲敏感，則認(rèn)為解脂耶氏酵母酶中的W497L突變可能賦予磺酰脲除草劑抗性。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，確定基本培養(yǎng)基中濃度為100μg/mL的磺酰脲(chlorimuron ethyl)足夠抑制野生型解脂耶氏酵母菌株ATCC #20362和ATCC #90812的生長(zhǎng)。
突變的W497L AHAS基因的合成 在兩步反應(yīng)中從基因組DNA建立包含W497L突變的解脂耶氏酵母AHAS基因(SEQ ID NO280)。首先，用Pfu UltraTM High-FidelityDNA聚合酶(Stratagene，目錄號(hào)600380)和引物410和411[SEQ IDNOs365和366]從基因組DNA擴(kuò)增AHAS基因的5’部分；類似地用引物412和413[SEQ ID NOs367和368]擴(kuò)增基因的3’部分。兩對(duì)引物是重疊的，使得重疊區(qū)含有W497L突變(其中該突變是‘CT’改變?yōu)椤甌G’)。
對(duì)大小正確的5’和3’PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化，并且用作第二輪PCR的模板，其中用引物414和415(SEQ ID NOs369和370)以及來(lái)自兩個(gè)主要PCR反應(yīng)的產(chǎn)物的混合物擴(kuò)增完整的突變基因。這種突變的基因攜帶其自身的天然啟動(dòng)子和終止子序列。凝膠純化具有正確大小的第二輪PCR產(chǎn)物，用酶SalI/BsiWI消化后，通過(guò)框內(nèi)融合技術(shù)克隆到質(zhì)粒pY35[含有嵌合TEF::串珠鐮孢Δ12去飽和酶(Fm2)基因、大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)、細(xì)菌氨芐青霉素抗性基因、耶氏酵母Leu2基因和耶氏酵母自主復(fù)制序列(ARS)；其它細(xì)節(jié)參見(jiàn)WO2005/047485]的載體主鏈中。框內(nèi)融合反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，目錄號(hào)C4040-10)中。在LB/Amp平板上選擇1天后，通過(guò)DNA微量制備分析八(8)個(gè)菌落。通過(guò)限制酶消化，證明7個(gè)克隆是正確的。其中一個(gè)含有磺酰脲抗性基因和LEU基因的克隆命名為“pY57”(或“pY57.Yl.AHAS.w4971”；圖7A)。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰方法用pY57和‘空’LEU轉(zhuǎn)化野生型解脂耶氏酵母菌株ATCC #90812和#20362。也利用了包含‘No-DNA’的轉(zhuǎn)化對(duì)照。將轉(zhuǎn)化體鋪板到MM+磺酰脲(SU；100μg/mL)瓊脂平板上，生長(zhǎng)4天后評(píng)估菌落是否存在。
表14 解脂耶氏酵母中的AHAS選擇
基于上述結(jié)果，AHAS W497L是解脂耶氏酵母ATCC #90812和#20362中的良好非抗生素選擇標(biāo)記。隨后，申請(qǐng)人采用了150μg/mL的磺酰脲濃度。這種新的標(biāo)記對(duì)于轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母是有利的，因?yàn)樗灰蕾囉谕庠椿颍且蕾囉谕蛔兊奶烊换?，并且它不需要營(yíng)養(yǎng)缺陷，也不導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)缺陷。除草劑對(duì)于人和動(dòng)物無(wú)毒。
如果以類似此處所述的方法建立突變的AHAS酶，預(yù)期該選擇方法可以普遍適用于其它工業(yè)酵母菌株，它們可能是單倍體、二倍體、非整倍體或雜合的。
實(shí)施例4 Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約10-11％的ARA的Y2034和Y2047菌株 本實(shí)施例描述了來(lái)源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的Y2034和Y2047菌株的構(gòu)建，所述菌株分別能夠生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約10和11％的ARA(圖4)。這些菌株經(jīng)過(guò)工程化，表達(dá)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑。因此，預(yù)期菌株Y2034和Y2047的完整脂質(zhì)譜表明共合成大約25-29％GLA。
菌株Y2034和Y2047的開(kāi)發(fā)首先需要構(gòu)建菌株M4(生產(chǎn)8％DGLA)。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約8％的DGLA的M4菌株 制備構(gòu)建體pKUNF12T6E(圖7B；SEQ ID NO114)，將4種嵌合基因(包含Δ12去飽和酶、Δ6去飽和酶和兩種C18/20延伸酶)整合到野生型耶氏酵母菌株ATCC #20362的Ura3基因座，從而能夠生產(chǎn)DGLA。pKUNF12T6E質(zhì)粒含有以下成分 表15 質(zhì)粒pKUNF12T6E(SEQ ID NO114)的說(shuō)明 用AscI/SphI消化pKUNF12T6E質(zhì)粒，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板到FOA選擇培養(yǎng)基平板上，在30℃維持2-3天。挑選FOA抗性菌落，劃線到MM和MMU選擇平板上。能夠在MMU平板上生長(zhǎng)但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌落選為Ura-菌株。然后30℃下將Ura-菌株的單菌落接種到液體MMU中，以250rpm/min振蕩2天。
通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示DGLA存在于含有pKUNF12T6E的4種嵌合基因的轉(zhuǎn)化體中，但是不存在于野生型耶氏酵母對(duì)照菌株中。選擇的32個(gè)Ura-菌株中的大多數(shù)產(chǎn)生占總脂質(zhì)的約6％的DGLA。存在兩種產(chǎn)生占總脂質(zhì)的約8％的DGLA的菌株(即菌株M4和13-8)。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約10％的ARA的Y2034和Y2047菌株 制備構(gòu)建體pDMW232(圖7C；SEQ ID NO115)和pDMW271(圖7D；SEQ ID NO116)，分別將兩種Δ5嵌合基因整合到耶氏酵母菌株M4的Leu2基因。質(zhì)粒pDMW232和pDMW271分別含有以下成分，如表16和17的描述 表16 質(zhì)粒pDMW232(SEQ ID NO115)的說(shuō)明 表17 質(zhì)粒pDMW271(SEQ ID NO116)的說(shuō)明 用AscI/SphI消化質(zhì)粒pDMW232和pDMW271，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株M4。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MMLe平板上，在30℃維持2-3天。挑選在MMLe平板上生長(zhǎng)的來(lái)自每次轉(zhuǎn)化的各個(gè)菌落，劃線到MM和MMLe平板上。能夠在MMLe平板上生長(zhǎng)但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌落選為L(zhǎng)eu2-菌株。然后30℃下將Leu2-菌株的單菌落接種到液體MMLe中，以250rpm/min振蕩2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示pDMW232和pDMW271轉(zhuǎn)化體中存在ARA，但親本M4菌株中不存在。具體地，在48個(gè)選擇的具有pDMW232的Leu2-轉(zhuǎn)化體中，34個(gè)菌株生產(chǎn)占工程化的耶氏酵母中的總脂質(zhì)的5％以下的ARA，11個(gè)菌株生產(chǎn)6-8％的ARA，3個(gè)菌株生產(chǎn)約10％的ARA。生產(chǎn)10％ ARA的菌株之一命名為“Y2034”。
同時(shí)，在48個(gè)選擇的具有pDMW271的Leu2-轉(zhuǎn)化體中，35個(gè)菌株生產(chǎn)占工程化的耶氏酵母中的總脂質(zhì)的5％以下的ARA，12個(gè)菌株生產(chǎn)6-8％的ARA，1個(gè)菌株生產(chǎn)約11％的ARA。生產(chǎn)11％ ARA的菌株命名為“Y2047”。
實(shí)施例5 制備具有Ura-基因型并且生產(chǎn)占總脂質(zhì)的45％的LA的中間菌株Y2031 通過(guò)將質(zhì)粒pKUNT2(圖8A)的TEF::Y.Δ12::Pex20嵌合基因整合到野生型耶氏酵母菌株ATCC #20362的Ura3基因座中，制備菌株Y2031，從而產(chǎn)生Ura-基因型。
具體地，質(zhì)粒pKUNT2含有以下成分 表18 質(zhì)粒pKUNT2的說(shuō)明(SEQ ID NO117) 根據(jù)一般方法，用AscI/SphI消化質(zhì)粒pZKUT2，然后用于轉(zhuǎn)化野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板到FOA選擇培養(yǎng)基平板上，在30℃維持2-3天。挑選了FOA抗性菌落，劃線到MM和MMU選擇平板上。能夠在MMU平板上生長(zhǎng)，但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌株選作Ura-菌株。然后30℃下將Ura-菌株的單菌落(5個(gè))單獨(dú)接種到液體MMU中，以250rpm/min振蕩2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard6890GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在兩個(gè)Ura-菌株(即2號(hào)和3號(hào)菌株)中含有約45％LA，而野生型ATCC #20362中含有約20％ LA。2號(hào)轉(zhuǎn)化菌株稱作菌株“Y2031”。
實(shí)施例6 密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因在解脂耶氏酵母中的合成和功能性表達(dá) 對(duì)球等鞭金藻的Δ9延伸酶基因(GenBank獲取號(hào)AF390174)的密碼子選擇進(jìn)行優(yōu)化，以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)，該優(yōu)化的方式類似于WO 2004/101753中的描述。具體地，根據(jù)耶氏酵母密碼子使用模式、ATG翻譯起始密碼子周圍的共有序列和RNA穩(wěn)定性的一般規(guī)則(Guhaniyogi，G.and J.Brewer，Gene 265(1-2)11-23(2001))，基于球等鞭金藻基因的DNA序列(SEQ ID NO39)，設(shè)計(jì)了密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因(SEQ ID NO41)。除了修飾翻譯起始位點(diǎn)，還修飾了792bp編碼區(qū)的126bp，優(yōu)化了123個(gè)密碼子。密碼子優(yōu)化的基因中的修飾都沒(méi)有改變編碼的蛋白的氨基酸序列(GenBank獲取號(hào)AF390174；SEQ ID NO40)。
用于耶氏酵母的密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因的體外合成 按照下文合成了密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因。首先，設(shè)計(jì)了8對(duì)寡核苷酸，以延伸密碼子優(yōu)化的球等鞭金藻Δ9延伸酶基因的編碼區(qū)的全長(zhǎng)(如IL3-1A、IL3-1B、IL3-2A、IL3-2B、IL3-3A、IL3-3B、IL3-4A、IL3-4B、IL3-5A、IL3-5B、IL3-6A、IL3-6B、IL3-7A、IL3-7B、IL3-8A和IL3-8B、相應(yīng)于SEQ ID NOs187-202)。每對(duì)有義(A)和反義(B)寡核苷酸都是互補(bǔ)的，例外的是每個(gè)5’末端的4bp突出端。此外，分別在引物IL3-1F、IL3-4R、IL3-5F和IL3-8R(SEQ IDNOs203-206)中引入了NcoI、PstI、PstI和Not1限制位點(diǎn)，用于隨后進(jìn)行亞克隆。
37℃下在含有50mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MgCl2、10mMDTT、0.5mM亞精胺、0.5mM ATP和10U T4多核苷酸激酶的20μl體積中對(duì)每種寡核苷酸(100ng)進(jìn)行磷酸化?；旌厦繉?duì)有義和反義寡核苷酸，采用以下參數(shù)在熱循環(huán)儀中退火95℃(2min)，85℃(2min)，65℃(15min)，37℃(15min)，24℃(15min)和4℃(15min)。因此，將IL3-1A(SEQ ID NO187)與IL3-1B(SEQID NO188)退火，產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物“IL3-1AB”。類似地，將IL3-2A(SEQ ID NO189)與IL3-2B(SEQ ID NO190)退火，產(chǎn)生雙鏈產(chǎn)物“IL3-2AB”等。
然后將退火的雙鏈寡核苷酸的兩個(gè)獨(dú)立的集合連接到一起，如下所示集合1(包含IL3-1AB、IL3-2AB、IL3-3AB和IL3-4AB)；和集合2(包含IL3-5AB、IL3-6AB、IL3-7AB和IL3-8AB)。在20μl的體積中將每個(gè)退火的寡核苷酸的集合與10U的T4 DNA連接酶混合，16℃下溫育連接反應(yīng)。
然后將每個(gè)連接反應(yīng)的產(chǎn)物用作模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)的DNA片段。具體地，采用連接的“集合1”混合物(即IL3-1AB、IL3-2AB、IL3-3AB和IL3-4AB)作為模板，寡核苷酸IL3-1F和IL3-4R(SEQ IDNOs203和204)作為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因的第一部分。按照一般方法的描述，在50μl總體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照如下方法進(jìn)行擴(kuò)增最初在95℃變性3分鐘，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的以下反應(yīng)95℃ 1分鐘，56℃ 30秒，72℃ 40秒。72℃進(jìn)行最終的延伸循環(huán)10分鐘，然后在4℃終止反應(yīng)。將417bp PCR片段亞克隆到pGEM-T easy載體(Promega)中，得到pT9(1-4)。
采用連接的“集合2”混合物(即IL3-5AB、IL3-6AB、IL3-7AB和IL3-8AB)作為模板，寡核苷酸IL3-5F和IL3-8R(SEQ ID NOs205和206)作為引物，通過(guò)PCR類似地?cái)U(kuò)增密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因的第二部分，克隆到pGEM-T-easy載體中，得到pT9(5-8)。
分別用pT9(1-4)和pT9(5-8)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從氨芐青霉素抗體轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA。純化質(zhì)粒DNA，用合適的限制內(nèi)切酶消化，以釋放pT9(1-4)的417bp NcoI/PstI片段(SEQ ID NO207)和pT9(5-8)的377bp PstI/Not1片段(SEQ ID NO208)。然后混合這兩個(gè)片段，按照方向與Nco1/Not1消化的pZUF17(SEQ IDNO118；圖8B)連接在一起，得到pDMW237(圖8C；SEQ ID NO119)。pDMW237中得到的合成Δ9延伸酶基因(“IgD9e”)的DNA序列與最初針對(duì)耶氏酵母設(shè)計(jì)的密碼子優(yōu)化的基因(即SEQ ID NO41)完全相同。
密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因在解脂耶氏酵母中的表達(dá) 按照一般方法，將構(gòu)建體pDMW237(圖8C)轉(zhuǎn)化到解脂耶氏酵母Y2031菌株中(實(shí)施例4)，pDMW237是一種包含F(xiàn)BAIN::IgD9e::Pex20嵌合基因的自主復(fù)制質(zhì)粒。使具有pDMW237的三種Y2031轉(zhuǎn)化體單獨(dú)在MM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天，通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在具有pDMW237的這些轉(zhuǎn)化體中分別生產(chǎn)了7.1％、7.3％和7.4％ EDA。這些數(shù)據(jù)證明合成的、密碼子優(yōu)化的IgD9e能夠?qū)182轉(zhuǎn)化為EDA。密碼子優(yōu)化的基因的“底物轉(zhuǎn)化百分比”確定為大約13％。
實(shí)施例7 在解脂耶氏酵母中合成密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因 按照與WO 2004/101753和實(shí)施例6(上文)描述的相似方式，對(duì)纖細(xì)眼蟲的Δ8去飽和酶基因(GenBank獲取號(hào)AAD45877)的密碼子選擇進(jìn)行了優(yōu)化，以便在耶氏酵母中表達(dá)。盡管合成了三種不同的密碼子優(yōu)化的基因(即“D8S-1”、“D8S-2”和“D8S-3”)，這些基因都不能將EDA去飽和為DGLA。因此，假定以前公開(kāi)的Δ8去飽和酶序列都不正確，必須按照mRNA分離、cDNA合成和PCR直接從纖細(xì)眼蟲分離Δ8去飽和酶。這得到了兩個(gè)相似的序列，在此鑒定為Eg5(SEQ ID NOs44和45)和Eg12(SEQ ID NOs46和47)。
通過(guò)將基因克隆到啤酒糖酵母酵母表達(dá)載體并進(jìn)行底物補(bǔ)料試驗(yàn)而進(jìn)行每種基因序列的功能分析。盡管Eg5和Eg12都能夠使EDA和EtrA去飽和，分別得到DGLA和ETA，但Eg5相對(duì)于Eg12具有顯著更高的活性。
基于證實(shí)的Eg5的Δ8去飽和酶活性，為在解脂耶氏酵母中表達(dá)而對(duì)序列進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，從而導(dǎo)致合成了合成的功能性的密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶，命名為“D8SF”(SEQ ID NOs48和49)。
密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因的初步體外合成 根據(jù)耶氏酵母密碼子使用模式、“ATG”翻譯起始密碼子周圍的共有序列和RNA穩(wěn)定性的一般規(guī)則(Guhaniyogi，G.and J.Brewer，Gene 265(1-2)11-23(2001))，基于公開(kāi)的纖細(xì)眼蟲的序列(SEQID NOs42和43)，設(shè)計(jì)了密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因(命名為“D8S-1”；SEQ ID NO209)。除了修飾翻譯起始位點(diǎn)，還修飾了1260bp編碼區(qū)的200bp(15.9％)。除了第二個(gè)氨基酸從“K”變?yōu)椤癊”，從而在翻譯起始密碼子周圍添加了NcoI位點(diǎn)，密碼子優(yōu)化的基因中的修飾都沒(méi)有改變編碼的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO43)。
具體地，按照下文合成了密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因。首先，設(shè)計(jì)了13對(duì)寡核苷酸，以延伸密碼子優(yōu)化的纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶基因的編碼區(qū)的全長(zhǎng)(如D8-1A、D8-1B、D8-2A、D8-2B、D8-3A、D8-3B、D8-4A、D8-4B、D8-5A、D8-5B、D8-6A、D8-6B、D8-7A、D8-7B、D8-8A、D8-8B、D8-9A、D8-9B、D8-10A、D8-10B、D8-11A、D8-11B、D8-12A、D8-12B、D8-13A和D8-13B、相應(yīng)于SEQ ID NOs210-235)。每對(duì)有義(A)和反義(B)寡核苷酸都是互補(bǔ)的，例外的是每個(gè)5’末端的4bp突出端。此外，分別在引物D8-1A、D8-3B、D8-7A、D8-9B和D8-13B(SEQ ID NOs210、215、222、227和235)中引入了NcoI、BglII、Xho1、SacI和Not1限制位點(diǎn)，用于隨后進(jìn)行亞克隆。
按照實(shí)施例6的描述對(duì)寡核苷酸(每種100ng)進(jìn)行磷酸化，然后混合每對(duì)有義和反義寡核苷酸，并且退火到一起[如D8-1A(SEQ IDNO210)退火于D8-1B(SEQ ID NO211)，得到雙鏈產(chǎn)物“D8-1AB”和D8-2A，(SEQ ID NO212)退火于D8-2B(SEQ ID NO213)，得到雙鏈產(chǎn)物“D8-2AB”等]。
然后將退火的雙鏈寡核苷酸的4個(gè)獨(dú)立的集合連接到一起，如下所示集合1(包含D8-1AB、D8-2AB和D8-3AB)；集合2(包含D8-4AB、D8-5AB和D8-6AB)；集合3(包含D8-7AB、D8-8AB和D8-9AB)；和集合4(包含D8-10AB、D8-11AB、D8-12AB和D8-13AB)。在20μl的體積中將每個(gè)退火的寡核苷酸的集合與10U的T4 DNA連接酶混合，16℃下溫育連接反應(yīng)。
然后將每個(gè)連接反應(yīng)的產(chǎn)物用作模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增設(shè)計(jì)的DNA片段。具體地，采用連接的“集合1”混合物(即D8-1AB、D8-2AB和D8-3AB)作為模板，寡核苷酸D8-1F和D8-3R(SEQ ID NOs236和237)作為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因的第一部分。按照實(shí)施例6的描述，在50μl總體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將309bp PCR片段亞克隆到pGEM-T easy載體(Promega)中，得到pT8(1-3)。
采用連接的“集合2”混合物(即D8-4AB、D8-5AB和D8-6AB)作為模板，寡核苷酸D8-4F和D8-6R(SEQ ID NOs238和239)作為引物，通過(guò)PCR類似地?cái)U(kuò)增密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因的第二部分，克隆到pGEM-T-easy載體中，得到pT8(4-6)。采用連接的“集合3”混合物(即D8-7AB、D8-8AB和D8-9AB)作為模板，寡核苷酸D8-7F和D8-9R(SEQ ID NOs240和241)作為引物，通過(guò)PCR類似地?cái)U(kuò)增密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因的第三部分，克隆到pGEM-T-easy載體中，得到pT8(7-9)。最后，采用“集合4”連接混合物(即D8-10AB、D8-11AB、D8-12AB和D8-13AB作為模板，寡核苷酸D8-10F和D8-13R(SEQ ID NOs242和243)作為引物，通過(guò)PCR類似地?cái)U(kuò)增密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因的第四部分，克隆到pGEM-T-easy載體中，得到pT8(10-13)。
分別用pT8(1-3)、pT8(4-6)、pT8(7-9)和pT8(10-13)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從氨芐青霉素抗體轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA。純化質(zhì)粒DNA，用合適的限制內(nèi)切酶消化，以釋放pT8(1-3)的309bpNcoI/BglII片段(SEQ ID NO244)、pT8(4-6)的321bp BglII/XhoI片段(SEQ ID NO245)、pT8(7-9)的264bp XhoI/SacI片段(SEQID NO246)和pT8(10-13)的369bp Sac1/Not1片段(SEQ ID NO247)。然后組合這些片段，按照方向與Nco1/Not1消化的pY54PC(SEQID NO120；WO2004/101757)連接在一起，得到pDMW240(圖8D)。這在pDMW240中得到了合成的Δ8去飽和酶基因(“D8S-1”，SEQ IDNO209)。
與公開(kāi)的纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶氨基酸序列(SEQ ID NO43)相比，D8S-1的第二個(gè)氨基酸從‘K’改變?yōu)椤瓻’，以便在翻譯起始密碼子周圍添加NcoI位點(diǎn)。采用pDMW240作為模板以及寡核苷酸ODMW390和ODMW391(SEQ ID NOs248和249)作為引物，通過(guò)體外誘變(Stratagene，San Diego，CA)構(gòu)建了具有公開(kāi)的纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶序列(SEQ ID NO43)的準(zhǔn)確氨基酸序列的另一種形式的合成基因。得到的質(zhì)粒命名為pDMW255。pDMW255中的合成Δ8去飽和酶基因命名為“D8S-2”，其氨基酸序列與SEQ ID NO43中描述的序列完全相同。
非功能性的密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因 按照一般方法中的描述，分別用pDMW240(圖8D)和pDMW255轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株ATCC #76982(Leu-)。含有重組構(gòu)建體的酵母在補(bǔ)加了EDA[20:2(11，14)]的MM中生長(zhǎng)。具體地，使含有pDMW240(含D8S-1)或pDMW255(含D8S-2)的轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母的單菌落30℃下在3mL MM生長(zhǎng)至OD600為約1.0。為了進(jìn)行底物補(bǔ)料，隨后將100μl細(xì)胞30℃下在含有10μg EDA底物的3mL MM中傳代培養(yǎng)約24小時(shí)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
兩種轉(zhuǎn)化體都沒(méi)有從EDA生產(chǎn)DGLA，因此，D8S-1和D8S-2都不是功能性的，并且不能使EDA去飽和。嵌合D8S-1::XPR和D8S-2::XPR基因分別示于SEQ ID NOs250和251。
發(fā)現(xiàn)GenBank中保藏的Δ8去飽和酶(獲取號(hào)AAD45877[SEQ IDNO43])與WO 00/34439或Wallis et al.(Archives of Biochem.Biophys，365307-316(1999))(本文的SEQ ID NO252)描述的Δ8去飽和酶的蛋白序列之間存在3個(gè)氨基酸的差異。具體地，發(fā)現(xiàn)GenBank獲取號(hào)AAD45877缺少3個(gè)氨基酸。采用pDMW255作為模板，ODMW392和ODMW393(SEQ ID NOs253和254)作為引物，通過(guò)體外誘變(Stratagene，San Diego，CA)在合成的D8S-2基因中加入了9bp，由此產(chǎn)生了與WO 00/34439和Wallis et al.(上文)(SEQ ID NO252)中描述的序列相同的蛋白。得到的質(zhì)粒命名為“D8S-3”(SEQ ID NO255)。將pDMW261轉(zhuǎn)化到耶氏酵母中之后，按照上文進(jìn)行了采用EDA的補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。用D8S-3沒(méi)有觀察到EDA去飽和為DGLA。
分離纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶基因 纖細(xì)眼蟲獲自密西根州立大學(xué)(East Lansing，MI)的RichardTriemer博士的實(shí)驗(yàn)室。從10mL活躍生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中將1mL等分物轉(zhuǎn)移到500mL玻璃瓶中的250mL纖細(xì)眼蟲(Eg)培養(yǎng)基中。Eg培養(yǎng)基是通過(guò)在970mL水中混合以下成分而制備的1g醋酸鈉、1g牛肉提取物(目錄號(hào)U126-01，Difco Laboratories，Detroit，MI)、2g

胰蛋白胨(目錄號(hào)0123-17-3，Difco Laboratories)和2g

酵母提取物(目錄號(hào)0127-17-9，Difco Laboratories)。過(guò)濾滅菌后，無(wú)菌加入30mL土壤-水上清液(目錄號(hào)15-3790，CarolinaBiological Supply Company，Burlington，NC)，得到最終的Eg培養(yǎng)基。使纖細(xì)眼蟲培養(yǎng)物在23℃，16小時(shí)光、8小時(shí)暗周期中無(wú)攪拌條件下生長(zhǎng)2周。
2周后，取出10mL培養(yǎng)物進(jìn)行脂質(zhì)分析，并且在1,800xg離心5分鐘。用水洗滌沉淀物一次，重新離心。真空中將得到的沉淀物干燥5分鐘，重懸于100μL三甲基氫氧化锍(TMSH)，振蕩下在室溫中溫育15分鐘。此后，加入0.5mL己烷，振蕩下將管形瓶室溫下溫育15分鐘。分離脂肪酸甲酯(從己烷層注射的5μL)，用裝有Omegawax 320熔融二氧化硅毛細(xì)管柱(目錄號(hào)24152，Supelco Inc.)的Hewlett-Packard 6890氣相色譜進(jìn)行定量。對(duì)烤箱溫度進(jìn)行程序化，在220℃保持2.7分鐘，以20℃/min增加到240℃，然后再保持2.3分鐘。通過(guò)Whatman氫發(fā)生器提供載體氣體。將保留時(shí)間與商購(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)物(目錄號(hào)U-99-A，Nu-Chek Prep，Inc.)的甲酯進(jìn)行比較，得到的色譜圖示于圖9。
通過(guò)1,800xg離心10分鐘，沉淀剩余的2周培養(yǎng)物(240mL)，用水洗滌1次，再次離心。采用RNA STAT-60TM試劑(TEL-TEST，Inc.，F(xiàn)riendswood，TX)，根據(jù)提供的制造商的方案(采用5mL試劑，0.5mL水中的溶解的RNA)提取總RNA。以此方式，從沉淀物獲得了1mg總RNA(2mg/mL)。用mRNA純化試劑盒(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)，按照提供的制造商的方案從1mg總RNA分離mRNA。以此方式，獲得了85μg mRNA。
根據(jù)制造商的方案，采用用于cDNA合成的SuperScriptTM Choice系統(tǒng)(InvitrogenTM Life Technologies，Carlsbad，CA)，用提供的寡聚(dT)引物，從765ng mRNA合成cDNA。將合成的cDNA溶解于20μL水中。
采用下文所述條件，用寡核苷酸引物Eg5-1和Eg3-3(SEQ IDNOs256和257)從cDNA擴(kuò)增纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶。具體地，將cDNA(1μL)與50pmol Eg5-1、50pmol Eg5-1、1μL PCR核苷酸混合物(10mM，Promega，Madison，WI)、5μL 10X PCR緩沖液(Invitrogen)、1.5μL MgCl2(50mM，Invitrogen)、0.5μ Taq聚合酶(Invitrogen)和水混合到50μL。反應(yīng)條件是94℃ 3分鐘，然后是35個(gè)循環(huán)的94℃ 45秒，55℃ 45秒和72℃ 1分鐘。72℃下使PCR終止7分鐘，然后保持在4℃。用5μL通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分析PCR反應(yīng)，觀察到分子量為大約1.3kB的DNA條帶。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離剩余的45μL產(chǎn)物，按照制造商的方案，用ZymocleanTM Gel DNA Recovery試劑盒(Zymo Research，Orange，CA)純化DNA條帶。按照制造商的方案將得到的DNA克隆到

Easy載體(Promega)中。用T7、M13-28Rev、Eg3-2和Eg5-2(分別是SEQ ID NOS258-261)對(duì)多個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。
由此獲得了兩類DNA序列，即Eg5(SEQ ID NO44)和Eg12(SEQ ID NO46)，它們的差別僅僅是幾個(gè)bp。Eg5和Eg12的翻譯得到了差別僅僅是1個(gè)氨基酸的蛋白序列SEQ ID NO45和47。因此，Eg5的DNA和蛋白序列分別示于SEQ ID NO44和SEQ IDNO45；Eg12的DNA和蛋白序列分別示于SEQ ID NO46和SEQ IDNO47。
分離的纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶序列與公開(kāi)的纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶序列的比較 圖10中示出了SEQ ID NO45(Eg5)和SEQ ID NO47(Eg12)中所示蛋白序列與GenBank獲取號(hào)AAD45877的蛋白序列(gi5639724；本文的SEQ ID NO43)以及與Wallis et al.(Archives ofBiochem.Biophys.，365307-316(1999)；WO 00/34439)公開(kāi)的蛋白序列[本文的SEQ ID NO252]的比對(duì)。在所有4個(gè)序列中保守的氨基酸用星號(hào)(＊)表示。程序中用虛線使序列的比對(duì)最大化。推定的細(xì)胞色素b5結(jié)構(gòu)域加下劃線。推定的His盒用粗體表示。同一性百分比計(jì)算發(fā)現(xiàn)Eg5 Δ8去飽和酶蛋白與SEQ ID NO43具有95.5％同一性，與SEQ ID NO252具有96.2％同一性，其中“同一性百分比”定義為兩種蛋白之間相同的氨基酸的百分比。用LASERGENE生物信息學(xué)計(jì)算程序組(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序進(jìn)行序列比對(duì)和同一性百分比計(jì)算。用具有缺省參數(shù)(GAPPENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10)的Clustal比對(duì)法(Higgins and Sharp，CABIOS.5151-153(1989))進(jìn)行序列的多重比對(duì)。采用Clustal方法的逐對(duì)比對(duì)的缺省參數(shù)是KTUPLE1，GAPPENALTY＝3，WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。對(duì)于各種纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶序列之間的差異的更復(fù)雜分析，參見(jiàn)共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)No.11/166993。
在啤酒糖酵母中進(jìn)行的纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶序列的功能分析 酵母附加體質(zhì)粒(YEp)型載體pRS425(Christianson et al.，Gene，110119-22(1992))含有來(lái)自啤酒糖酵母2μ內(nèi)源質(zhì)粒的序列、LEU2選擇標(biāo)記和基于多功能噬菌粒pBluescript II SK+的主鏈的序列。按照與Jia et al.(Physiological Genomics，383-92(2000))中描述的相同方法在pRS425的SacII和SpeI位點(diǎn)之間克隆啤酒糖酵母的強(qiáng)組成型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD)啟動(dòng)子，以制備pGPD-425。將NotI位點(diǎn)導(dǎo)入pGPD-425的BamHI位點(diǎn)(由此產(chǎn)生側(cè)翼于BamHI位點(diǎn)的NotI位點(diǎn))，從而得到質(zhì)粒pY-75。按照上文的描述用NotI消化，從

Easy載體釋放Eg5(SEQ ID NO44)和Eg12(SEQ ID NO46)，并且克隆到pY-75的NotI位點(diǎn)，以分別制備pY89-5(保藏為ATCC #PTA-6048)和pY89-12。以此方式，將Δ8去飽和酶(即Eg5[SEQ ID NO44]和Eg12[SEQ ID NO46])克隆在強(qiáng)啟動(dòng)子后面，以便在啤酒糖酵母中表達(dá)。pY89-5的圖譜示于圖8E。
用標(biāo)準(zhǔn)醋酸鋰轉(zhuǎn)化程序?qū)①|(zhì)粒pY89-5、pY89-12和pY-75轉(zhuǎn)化到啤酒糖酵母BY4741(ATCC #201388)中。在補(bǔ)加了CSM-leu的DOBA培養(yǎng)基(Qbiogene，Carlsbad，CA)上選擇轉(zhuǎn)化體。將來(lái)自每個(gè)平板的轉(zhuǎn)化體接種到2mL補(bǔ)加了CSM-leu的DOB培養(yǎng)基(Qbiogene)上，30℃下生長(zhǎng)1天，此后將0.5mL轉(zhuǎn)移到補(bǔ)加了EDA或EtrA到1mM的相同培養(yǎng)基中。將它們?cè)?0℃，250rpm溫育過(guò)夜，通過(guò)離心獲得沉淀物并且真空下干燥。用50μL TMSH對(duì)沉淀物進(jìn)行酯交換，按照一般方法中的描述通過(guò)GC進(jìn)行分析。分析了pY-75(即克隆75-1和75-2)和pY89-5(即克隆5-6-1和5-6-2)的兩個(gè)克隆，同時(shí)分析了來(lái)自兩個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體的兩組pY89-12的克隆(即克隆12-8-1、12-8-2、12-9-1和12-9-2)。
通過(guò)EDA補(bǔ)料的克隆的GC分析獲得的脂質(zhì)譜示于表19；通過(guò)EtrA補(bǔ)料的克隆的GC分析獲得的脂質(zhì)譜示于表20。脂肪酸鑒定為16:0(棕櫚酸)、16:1(棕櫚油酸)、18:0、18:1(油酸)、20:2[EDA]、20:3(8，11，14)[DGLA]、20:3(11，14，17)[ETrA]和20:4(8，11，14，17)[ETA]；每一種的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表19 超量表達(dá)纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶的轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母的脂質(zhì)分析EDA底物補(bǔ)料 表20 超量表達(dá)纖細(xì)眼蟲Δ8去飽和酶的轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母的脂質(zhì)分析ETrA底物補(bǔ)料 表19和20中的數(shù)據(jù)表明克隆的眼蟲Δ8去飽和酶能夠使EDA和EtrA去飽和。SEQ ID NO47所示序列與SEQ ID NO45所示序列相比具有一個(gè)氨基酸的改變，并且Δ8去飽和酶活性降低。
表30中的克隆75-2產(chǎn)生的小量20:4(8，11，14，17)與20:4(8，11，14，17)的標(biāo)準(zhǔn)相比具有略微不同的保留時(shí)間。這個(gè)峰更有可能是該實(shí)驗(yàn)中野生型酵母產(chǎn)生的小量的不同脂肪酸。
為解脂耶氏酵母進(jìn)行密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶基因的進(jìn)一步修飾 根據(jù)有功能的眼蟲Δ8去飽和酶(SEQ ID NOs44和45)的氨基酸序列校正pDMW261中的合成D8S-3基因的氨基酸序列。采用作為模板的pDMW261并且采用核苷酸ODMW404(SEQ ID NO262)和D8-13R(SEQ ID NO243)，擴(kuò)增了編碼合成的D8S-3去飽和酶基因的DNA片段。用Bio101的Geneclean試劑盒純化得到的片段，隨后用Kpn1和Not1消化(引物ODMW404導(dǎo)入KpnI位點(diǎn)，而引物D8-13R導(dǎo)入NotI位點(diǎn))。將Kpn1/Not1片段(SEQ ID NO263)克隆到Kpn1/Not1消化的pKUNFmKF2(圖11A；SEQ ID NO121)中，得到pDMW277(圖11B)。
將設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增和校正D8S-3基因的5’末端的寡核苷酸YL521和YL522(SEQ ID NOs264和265)用作另一個(gè)PCR中的引物，所述另一個(gè)PCR反應(yīng)中將pDMW277用作模板。引物分別在PCR片段的5’和3’末端導(dǎo)入Nco1位點(diǎn)和BglII位點(diǎn)。用Bio101的GeneClean試劑盒純化318bp PCR產(chǎn)物，隨后用Nco1和BglII消化。將消化的片段和來(lái)自pDMW277的954bp BglII/NotI片段一起用于交換pZF5T-PPC的NcoI/NotI片段(圖11C；SEQ ID NO122)，形成pDMW287。除了校正合成D8S-3基因的5’末端，該克隆反應(yīng)也將合成的Δ8去飽和酶基因置于解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子(SEQ ID NO162)的控制下。
然后在pDMW287上進(jìn)行最后一系列定點(diǎn)誘變反應(yīng)中的第一個(gè)反應(yīng)。設(shè)計(jì)第一組引物YL525和YL526(SEQ ID NOs266和267)，以便將pDMW287中的合成D8S-3基因的氨基酸從F校正到S(50號(hào)位置)。然后，該誘變反應(yīng)得到的質(zhì)粒成為下一次定點(diǎn)誘變反應(yīng)的模板，引物是YL527和YL528(SEQ ID NOs268和269)。這些引物設(shè)計(jì)用于將D8S-3基因的氨基酸從F校正到S(67號(hào)位置)，導(dǎo)致產(chǎn)生質(zhì)粒pDMW287/YL527。
為了完成基因的第二個(gè)四分之一中的序列校正，與基因的第一個(gè)四分之一上的突變同時(shí)進(jìn)行以下反應(yīng)。采用pDMW287作為模板，并且采用寡核苷酸YL529和YL530(SEQ ID NOs270和271)作為引物，進(jìn)行體外誘變反應(yīng)，將合成D8S-3基因的氨基酸從C校正到W(177號(hào)位置)。將該誘變反應(yīng)的產(chǎn)物(即pDMW287/Y529)用作隨后反應(yīng)的模板，該反應(yīng)用引物YL531和YL532(SEQ ID NOs272和273)將氨基酸從P校正為L(zhǎng)(213號(hào)位置)。該反應(yīng)的產(chǎn)物稱作pDMW287/YL529-31。
與基因的第一個(gè)和第二個(gè)四分之一上的突變同時(shí)，類似地在基因的3’末端上進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)隨后的誘變反應(yīng)都采用來(lái)自前一個(gè)反應(yīng)的質(zhì)粒產(chǎn)物。在pDMW287上用引物YL533和YL534(SEQ ID NOs274和275)將氨基酸從C校正為S(244號(hào)位置)，得到pDMW287/YL533。用引物YL535和YL536(SEQ ID NOs276和277)將pDMW287/YL533的合成D8S-3基因中的氨基酸從A校正為T(280號(hào)位置)，形成pDMW287/YL533-5。最后，采用pDMW287/YL533-5作為模板，YL537和YL538(SEQ ID NOs278和279)作為引物，將合成D8S-3基因中333號(hào)位置的氨基酸P校正為S。得到的質(zhì)粒稱作pDMW287/YL533-5-7。
用pDMW287/YL529-31的BglII/XhoI片段和pDMW287/YL533-5-7的XhoI/NotI片段改變pDMW287/YL257的BglII/NotI片段，得到pDMW287F(圖11D)。SEQ ID NO49示出了SEQ ID NO48的核苷酸2-1270編碼的氨基酸序列，其與SEQ ID NO45所示序列基本相同，僅僅是在起始甲硫氨酸后有一個(gè)額外的纈氨酸。
實(shí)施例8 密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶基因和密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶在解脂耶氏酵母中的功能性表達(dá) 本實(shí)施例描述了經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)來(lái)自實(shí)施例6和7的密碼子優(yōu)化的Δ9延伸酶和密碼子優(yōu)化的Δ8去飽和酶的解脂耶氏酵母中的DGLA生物合成。本實(shí)施例從而證實(shí)了兩種基因的活性和解脂耶氏酵母表達(dá)Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑的能力。
具體地，將包含構(gòu)建體pDMW287F(實(shí)施例7)的嵌合FBAIN::D8SF::Pex16基因的ClaI/PacI片段插入pDMW237(實(shí)施例6)的ClaI/PacI位點(diǎn)，得到構(gòu)建體pDMW297(圖11E；SED ID NO123)。
質(zhì)粒pDMW297含有以下成分 表21 質(zhì)粒pDMW297(SEQ ID NO123)的說(shuō)明 然后用構(gòu)建體pDMW297根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2031(實(shí)施例5)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板到MM平板上，在30℃維持2-3天。挑選了總共8個(gè)在MM平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，重新劃線到新的MM平板上。一旦生長(zhǎng)，30℃下將這些菌株單獨(dú)接種到液體MM中，以250rpm/min振蕩2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC進(jìn)行分析顯示在所有分析的轉(zhuǎn)化體中都生產(chǎn)DGLA。1個(gè)菌株生產(chǎn)生產(chǎn)約3.2％，4個(gè)菌株生產(chǎn)4.3-4.5％，2個(gè)菌株生產(chǎn)5.5-5.8％，1個(gè)菌株生產(chǎn)6.4％ DGLA(在此命名為菌株“Y0489”)。菌株Y0489中密碼子優(yōu)化的D8SF基因的“底物轉(zhuǎn)化百分比”是75％。
實(shí)施例9 Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14％的ARA的Y2214菌株 本實(shí)施例描述了來(lái)源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y2214的構(gòu)建，所述菌株能夠生產(chǎn)占總脂質(zhì)的14％的ARA(圖4)。該菌株經(jīng)過(guò)工程化，表達(dá)Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑；因此，預(yù)期菌株Y2214的完整脂質(zhì)譜分析表明最終的含ARA的油中沒(méi)有共合成GLA。
此處菌株Y2214的開(kāi)發(fā)需要構(gòu)建菌株Y2152和Y2153(生產(chǎn)約3.5％ DGLA)、菌株Y2173和Y2175(生產(chǎn)14-16％DGLA)和菌株Y2183和Y2184(生產(chǎn)5％ARA)。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約3.5％的DGLA的菌株Y2152和Y2153 用構(gòu)建體pZP2C16M899(圖12A，SEQ ID NO124)整合含有四種嵌合基因(包括兩種Δ9延伸酶、合成的C16/18脂肪酸延伸酶和Δ8去飽和酶)和含有單個(gè)氨基酸突變的耶氏酵母AHAS基因(乙酰羥酸合酶)的簇。耶氏酵母中的突變的AHAS酶賦予對(duì)磺酰脲的抗性，其用作陽(yáng)性篩選標(biāo)記。質(zhì)粒pZP2C16M899設(shè)計(jì)用于整合到耶氏酵母菌株ATCC #20362的Pox2基因位點(diǎn)中，從而含有以下成分 表22 質(zhì)粒pZP2C16M899(SEQ ID NO124)的說(shuō)明 用SphI/AscI消化質(zhì)粒pZP2C16M899，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化ATCC #20362。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到含有150mg磺酰脲的MM平板上，在30℃維持2-3天。挑選磺酰脲抗性菌落，劃線到磺酰脲選擇平板的MM上。然后30℃下將總共96個(gè)轉(zhuǎn)化體接種到具有磺酰脲的液體MM中，250rpm/min振蕩2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在含有pZP2C16M899的4種嵌合基因的轉(zhuǎn)化體中存在DGLA，但在野生型耶氏酵母對(duì)照菌株中不存在。選擇的96個(gè)菌株中的大多數(shù)生產(chǎn)占總脂質(zhì)的2％以下的DGLA。28個(gè)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的2-2.9％的DGLA。2個(gè)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的3.5％的DGLA。65號(hào)和73號(hào)菌株在此分別稱作菌株“Y2152”和“Y2153”。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14-16％的DGLA的菌株Y2173和Y2175 用構(gòu)建體pDMW314(圖12B，SEQ ID NO125)將含有四種嵌合基因(包括兩種Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶和Δ12去飽和酶)的簇整合到耶氏酵母菌株Y2152和Y2153的Ura3基因位點(diǎn)，從而增強(qiáng)DGLA的生產(chǎn)。質(zhì)粒pDMW314含有以下成分 表23 質(zhì)粒pDMW314(SEQ ID NO125)的說(shuō)明 用AscI/SphI消化質(zhì)粒pDMW314，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株Y2152和Y2153。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪板到FOA選擇培養(yǎng)基平板上，在30℃維持2-3天。挑選FOA抗性菌落，劃線到MM和MMU選擇平板上。能夠在MMU平板上生長(zhǎng)但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌落選為Ura-菌株。然后30℃下將Ura-菌株的單菌落接種到液體MMU中，以250rpm/min振蕩2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示幾乎所有含有pDMW314的4種嵌合基因的轉(zhuǎn)化體的DGLA生產(chǎn)都增加。選擇的具有pDMW314的Y2152的48個(gè)Ura-菌株的大多數(shù)都生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約6-8％的DGLA。一個(gè)菌株(即47號(hào)，在此稱作“Y2173”)生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約13.9％的DGLA。
類似地，選擇的具有pDMW314的Y2153的24個(gè)Ura-菌株中的大多數(shù)生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約6-8％的DGLA。兩個(gè)菌株(即6號(hào)和11號(hào)，在此命名為菌株“Y2175”和“Y2176”)分別生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約16.3％和17.2％的DGLA。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約5％的ARA的菌株Y2183和Y2184 用制備構(gòu)建體pDMW322(圖12C；SEQ ID NO126)將兩種Δ5嵌合基因整合到耶氏酵母Y2173和2175菌株的Leu2基因位點(diǎn)。質(zhì)粒pDMW322含有以下成分 表24 質(zhì)粒pDMW232(SEQ ID NO126)的說(shuō)明 用AscI/SphI消化質(zhì)粒pDMW322，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2173和Y2175。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MMLe平板上，在30℃維持2-3天。挑選在MMLe平板上生長(zhǎng)的各個(gè)菌落，劃線到MM和MMLe平板上。能夠在MMLe平板上生長(zhǎng)但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌落選為L(zhǎng)eu2-菌株。然后30℃下將Leu2-菌株的單菌落接種到液體MMLe中，以250rpm/min振蕩的條件下培養(yǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示pDMW322轉(zhuǎn)化體中存在ARA，但親本Y2173和Y2175菌株中不存在。具體地，在48個(gè)選擇的具有pDMW322的Y2173的Leu2-轉(zhuǎn)化體中，大多數(shù)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的4.4％以下的ARA；但是，有兩個(gè)菌株(即1號(hào)和42號(hào)，在此稱作菌株“Y2181”和“Y2182”)分別生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約4.5％和5.8％的ARA。
平行地，在48個(gè)選擇的具有pDMW322的Y2175的Leu2-轉(zhuǎn)化體中，大多數(shù)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的4.5％以下的ARA。有3個(gè)菌株(即22號(hào)、42號(hào)和47號(hào)，在此稱作菌株“Y2183”、“Y2184”和“Y2185”)分別生產(chǎn)占工程化的耶氏酵母中總脂質(zhì)的約4.9％、4.6％和4.7％的ARA。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14％的ARA的菌株Y2214 用構(gòu)建體pZKSL5598(圖12D，SEQ ID NO127)將含有四種嵌合基因(包括Δ9延伸酶、Δ8去飽和酶和兩種Δ5去飽和酶)的簇整合到耶氏酵母Y2183和Y2185菌株的Lys5基因(GenBank獲取號(hào)M34929)位點(diǎn)，從而增強(qiáng)ARA的生產(chǎn)。質(zhì)粒pZKSL5598含有以下成分 表25 質(zhì)粒pZKSL5598(SEQ ID NO127)的說(shuō)明 用AscI/SphI消化質(zhì)粒pZKSL5598，然后用于根據(jù)一般方法分別轉(zhuǎn)化菌株Y2183和Y2184。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MMLys平板上，在30℃維持2-3天。挑選在MMLys平板上生長(zhǎng)的來(lái)自每次轉(zhuǎn)化的各個(gè)菌落，劃線到MM和MMLys平板上。能夠在MMLys平板上生長(zhǎng)但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌落選為L(zhǎng)ys-菌株。然后30℃下將Lys-菌株的單菌落接種到液體MMLy中，以250rpm/min振蕩2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示pZKSL5598轉(zhuǎn)化體中的ARA生產(chǎn)增加。在48個(gè)選擇的具有pZKSL5598的Y2183的Lys-轉(zhuǎn)化體中，大多數(shù)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的4-9.5％的ARA。3個(gè)菌株(即7號(hào)、12號(hào)和37號(hào)，在此命名為“Y2209”、“Y2210”和“Y2211”)分別生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約9.9％、10.3％和9.6％的ARA。
在48個(gè)選擇的具有pZKSL5598的Y2184的Lys-轉(zhuǎn)化體中，大多數(shù)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的4-11％的ARA。2個(gè)菌株(即3號(hào)和22號(hào)，在此命名為“Y2213”和“Y2214”)分別生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約11.9％和14％的ARA。
實(shí)施例10 制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的14％的EPA的中間菌株2067U 本實(shí)施例描述了來(lái)源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y2067U的構(gòu)建，該菌株能夠生產(chǎn)占總脂質(zhì)的顯著濃度的EPA(圖4)。在這種生產(chǎn)EPA的菌株中，基于TAG含量和/或組成的分析，檢驗(yàn)了高山被孢霉LPAAT2、DGAT1和DGAT2以及解脂耶氏酵母CPT1基因超量表達(dá)的作用，分別如實(shí)施例14、15、16和21的描述(參見(jiàn)下文)。
菌株Y2067U(生產(chǎn)14％ EPA)的開(kāi)發(fā)需要構(gòu)建菌株M4(生產(chǎn)8％DGLA，描述于實(shí)施例4)、菌株Y2034(生產(chǎn)10％ ARA，描述于實(shí)施例4)、菌株E(生產(chǎn)10％ EPA)、菌株EU(生產(chǎn)10％ EPA)和菌株Y2067(生產(chǎn)15％ EPA)。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約10％的EPA的E菌株 制備構(gòu)建體pZP3L37(圖13A；SEQ ID NO128)，將三種合成的Δ17去飽和酶嵌合基因整合到Y(jié)2034菌株的?；?CoA氧化酶3基因，如實(shí)施例4的描述。質(zhì)粒pZP3L37含有以下成分 表26 質(zhì)粒pZP3L37(SEQ ID NO128)的說(shuō)明 用AscI/SphI消化質(zhì)粒pZP3L37，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2034。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM平板上，在30℃維持2-3天。挑選在MM平板上生長(zhǎng)的總共48個(gè)轉(zhuǎn)化體，重新劃線到新的MM平板上。一旦生長(zhǎng)，30℃下將這些菌株單獨(dú)接種到液體MM中，以250rpm/min振蕩的條件下培養(yǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示大多數(shù)具有pZP3L37的轉(zhuǎn)化體中存在EPA，但親本菌株(即Y2034)中不存在。在48個(gè)選擇的具有pZP3L37的轉(zhuǎn)化體中，18個(gè)菌株生產(chǎn)占工程化的耶氏酵母中總脂質(zhì)的2％以下的EPA，14個(gè)菌株生產(chǎn)2-3％的EPA，1個(gè)菌株生產(chǎn)約7％的EPA。
在按照一般方法中的描述用“兩階段生長(zhǎng)條件(即48hrs MM，72 hrs HGM)”培養(yǎng)生產(chǎn)7％ EPA的菌株后，進(jìn)一步分析該菌株。GC分析顯示工程化的菌株在兩階段生長(zhǎng)后生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約10％的EPA。該菌株命名為“E”菌株。
制備具有Ura-表型的生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約10％的EPA的EU菌株 通過(guò)鑒定具有5-FOA抗性的菌株E的突變細(xì)胞，制備了菌株EU(Ura-)。具體地，將1環(huán)的耶氏酵母E菌株細(xì)胞接種到3mL YPD培養(yǎng)基中，30℃下以250rpm振蕩的條件下生長(zhǎng)24小時(shí)。用YPD將培養(yǎng)物稀釋到OD600為0.4，然后再溫育4小時(shí)。將培養(yǎng)物鋪板(100μl/平板)到MM+FOA平板上，30℃下維持2-3天?？偣蔡暨x了16個(gè)FOA抗性菌落，劃線到MM和MM+FOA選擇平板上。從中挑選出10個(gè)在FOA選擇平板上生長(zhǎng)，但是不在MM平板上生長(zhǎng)的菌落，選作可能的Ura-菌株。
將這些菌株之一用作pY37/F15轉(zhuǎn)化的宿主，pY37/F15包含嵌合GPD::串珠鐮孢Δ15::XPR2基因和作為選擇標(biāo)記的Ura3基因(圖13B；SEQ ID NO129)。在MM平板上選擇3天后，數(shù)百個(gè)菌落在平板上生長(zhǎng)，不攜帶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化對(duì)照沒(méi)有菌落生長(zhǎng)。這種5-FOA抗性菌株命名為“EU”。
然后將EU菌株的單菌落接種到額外含有0.1g/L尿苷的液體MMU中，30℃下以250rpm振蕩的條件下生長(zhǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard6890GC進(jìn)行分析。GC分析顯示EU菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約10％的EPA。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約15％的EPA的Y2067菌株 制備質(zhì)粒pKO2UF2PE(圖13C；SEQ ID NO130)，將含有兩種嵌合基因(包括異源Δ12去飽和酶和C18/20延伸酶)和Ura3基因的簇整合到菌株EU的天然耶氏酵母Δ12去飽和酶基因中。質(zhì)粒pKO2UF2PE含有以下成分 表27 質(zhì)粒pKO2UF2PE(SEQ ID NO130)的說(shuō)明 用AscI/SphI消化質(zhì)粒pKO2UF2PE，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株EU(但將菌株EU劃線到Y(jié)PD平板上并且生長(zhǎng)大約36小時(shí)[而不是18小時(shí)]，然后懸浮在轉(zhuǎn)化緩沖液中)。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM平板上，在30℃維持2-3天。挑選在MM平板上生長(zhǎng)的總共72個(gè)轉(zhuǎn)化體，獨(dú)立地重新劃線到新的MM平板上。一旦生長(zhǎng)，30℃下將這些菌株單獨(dú)接種到液體MM中，以250rpm/min振蕩的條件下培養(yǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示幾乎所有的具有pKO2UF2PE的轉(zhuǎn)化體中都存在EPA。更具體地，在72個(gè)選擇的轉(zhuǎn)化體中，17個(gè)菌株生產(chǎn)占工程化的耶氏酵母中總脂質(zhì)的8-9.9％的EPA，27個(gè)菌株生產(chǎn)10-10.9％EPA，16個(gè)菌株生產(chǎn)11-11.9％ EPA，7個(gè)菌株生產(chǎn)12-12.7％ EPA。按照一般方法中的描述，用“兩階段生長(zhǎng)條件(即48hrs MM，72hrsHGM)”進(jìn)一步分析生產(chǎn)12.7％ EPA的菌株。GC分析顯示工程化的菌株在兩階段生長(zhǎng)后生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約15％的EPA。該菌株命名為“Y2067”菌株。
制備具有Ura-表型的生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14％的EPA的Y2067U菌株 為了破壞Y2067菌株中的Ura3基因，制備了構(gòu)建體pZKUT16(圖13D；SEQ ID NO131)，將TEF::rELO2S::Pex20嵌合基因整合到菌株Y2067的Ura3基因中。rELO2S是密碼子優(yōu)化的rELO基因，其編碼將16:0延伸為18:0的大鼠肝酶(即C16/18 延伸酶)。質(zhì)粒pZKUT16含有以下成分 表28 質(zhì)粒pZKUT16(SEQ ID NO131)的說(shuō)明 用SalI/PacI消化質(zhì)粒pZKUT16，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化Y2067菌株。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM+5-FOA選擇平板上，在30℃維持2-3天。
挑選了總共24個(gè)在MM+5-FOA平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，分別重新劃線到MM平板和MM+5-FOA平板上。能夠在MM+5-FOA平板上生長(zhǎng)，但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌株選作Ura-菌株。30℃下將總共10個(gè)Ura-菌株單獨(dú)接種到液體MMU培養(yǎng)基中，在250rpm/min振蕩的條件下生長(zhǎng)1天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在MMU培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1天后，所有具有pZKUT16的轉(zhuǎn)化體中都存在5-7％ EPA。用兩階段生長(zhǎng)條件(即48hrs MM，96hrs HGM)進(jìn)一步分析生產(chǎn)6.2％ EPA的菌株。GC分析顯示工程化的菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14％的EPA。該菌株命名為菌株“Y2067U”。
該菌株相對(duì)于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的最終基因型是Ura3-，Pox3-，Y.Δ12-，F(xiàn)BA::F.Δ12::Lip2，F(xiàn)BAINm::F.Δ12::Pex20，TEF::Δ6S::Lip1，F(xiàn)BAIN::E1S::Pex20，GPAT::E1S::Oct，TEF::E2S::Xpr，F(xiàn)BAIN::Δ5::Pex20，TEF::Δ5::Lip1，F(xiàn)BAIN::Δ17S::Lip2，F(xiàn)BAINm::Δ17S::Pex16，TEF::Δ17S和TEF::rELO2S::Pex20。
實(shí)施例11 本實(shí)施例描述了來(lái)源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株Y2107U1的構(gòu)建，該菌株能夠生產(chǎn)占總脂質(zhì)的顯著濃度的EPA(圖4)。基于TAG含量和/或組成的分析，在這種生產(chǎn)EPA的菌株中檢驗(yàn)高山被孢霉GPAT基因超量表達(dá)的影響，如實(shí)施例17的描述(下文)。
菌株Y2107U1(生產(chǎn)16％ EPA，并且具有Ura-表型)的開(kāi)發(fā)需要構(gòu)建菌株M4(生產(chǎn)8％ DGLA，并且描述于實(shí)施例4)、菌株2047(生產(chǎn)11％ ARA，并且描述于實(shí)施例4)、菌株Y2048(生產(chǎn)11％EPA)、菌株Y2060(生產(chǎn)13％ EPA)、菌株Y2072(生產(chǎn)15％ EPA)、菌株Y2072U1(生產(chǎn)14％ EPA)和菌株Y2089(生產(chǎn)18％ EP)。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約11％的EPA的Y2048菌株 制備構(gòu)建體pZP3L37(圖13A；SEQ ID NO128；實(shí)施例10)，將三種合成的Δ17去飽和酶嵌合基因整合到Y(jié)2047菌株(實(shí)施例4)的?；?CoA氧化酶3基因。具體地，用SphI/AscI消化質(zhì)粒pZP3L37，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2047。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM平板上，在30℃維持2-3天。挑選了總共96個(gè)在MM平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，重新劃線到新的MM平板上。一旦生長(zhǎng)，30℃下將這些菌株單獨(dú)接種到液體MM中，以250rpm/min振蕩的條件下培養(yǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示大多數(shù)具有pZP3L37的轉(zhuǎn)化體中存在EPA，但親本Y2047菌株中不存在。在96個(gè)選擇的具有pZP3L37的轉(zhuǎn)化體中，20個(gè)菌株生產(chǎn)占工程化的耶氏酵母中總脂質(zhì)的2％以下的EPA，23個(gè)菌株生產(chǎn)2-3％的EPA，5個(gè)菌株生產(chǎn)3-4％的EPA，2個(gè)菌株(即71號(hào)菌株和94號(hào)菌株)生產(chǎn)約6％的EPA。
選擇71號(hào)菌株(生產(chǎn)6％ EPA)，通過(guò)以兩階段生長(zhǎng)條件(即48hrs MM，72hrs HGM)培養(yǎng)而進(jìn)一步分析。GC分析顯示71號(hào)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約11％的EPA。該菌株命名為菌株“Y2048”。
制備具有Ura-表型的生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約13％的EPA的Y2060菌株 為了破壞菌株Y2048中的Ura3基因，將構(gòu)建體pZKUT16(圖13D；SEQ ID NO131，參見(jiàn)實(shí)施例10)用于將TEF::rELO2S::Pex20嵌合基因整合到Y(jié)2048菌株的Ura3基因中。具體地，用SalI/PacI消化質(zhì)粒pZKUT16，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2048。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM+5-FOA選擇平板上，在30℃維持2-3天。
挑選了總共40個(gè)在MM+5-FOA平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，分別重新劃線到MM平板和MM+5-FOA平板上。能夠在MM+5-FOA平板上生長(zhǎng)，但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌株選作Ura-菌株。30℃下將這40個(gè)Ura-菌株的每一個(gè)單獨(dú)接種到液體MMU培養(yǎng)基中，在250rpm/min振蕩的條件下生長(zhǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在MMU培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天后，14個(gè)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的5％以下的EPA，9個(gè)菌株生產(chǎn)5-5.9％的EPA，15個(gè)菌株生產(chǎn)6-6.9％的EPA，7個(gè)菌株生產(chǎn)7-8％的EPA。用兩階段生長(zhǎng)條件(即48hrs MM，96hrs HGM)進(jìn)一步分析生產(chǎn)7-8％ EPA的菌株。GC分析顯示所有這些菌株都生產(chǎn)占總脂質(zhì)的10％以上的EPA；其中之一生產(chǎn)約13％的EPA。該菌株命名為菌株“Y2060”。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約15％的EPA的Y2072菌株 用構(gòu)建體pKO2UM25E(圖14A；SEQ ID NO132)將含有三種嵌合基因(包括C18/20延伸酶、Δ12去飽和酶和Δ5去飽和酶)和Ura3基因的簇整合到菌株Y2060的天然耶氏酵母Δ12去飽和酶基因中。質(zhì)粒pKO2UM25E含有以下成分 表29 質(zhì)粒pKO2UM25E(SEQ ID NO132)的說(shuō)明 用SphI/AscI消化質(zhì)粒pKO2UM25E，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2060。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM平板上，在30℃維持2-3天。
挑選了總共63個(gè)在MM平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，重新劃線到新的MM平板上。一旦生長(zhǎng)，30℃下將這些菌株單獨(dú)接種到液體MM中，以250rpm/min振蕩的條件下培養(yǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在MM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天后，幾乎所有的具有pKO2UM25E的轉(zhuǎn)化體中都存在EPA。在63個(gè)選擇的轉(zhuǎn)化體中，26個(gè)菌株生產(chǎn)6-8.9％的EPA，46個(gè)菌株生產(chǎn)9％以上的EPA。選擇生產(chǎn)9％以上的EPA的菌株，用于用兩階段生長(zhǎng)程序(即48hrs MM，96hrs HGM)進(jìn)一步分析。GC分析顯示在兩階段生長(zhǎng)后，46個(gè)選擇的菌株中的45個(gè)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的11-14.5％的EPA，而2號(hào)培養(yǎng)物生產(chǎn)15.1％的EPA。該菌株(即2號(hào))命名為菌株“Y2072”。
制備具有Ura-表型的生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14％的EPA的Y2072U1菌株 建立構(gòu)建體pZKUGPI5S(圖14B；SEQ ID NO133)，用于將GPAT::I.Δ5S::Pex20嵌合基因整合到Y(jié)2072菌株的Ura3基因中。更具體地，質(zhì)粒pZKUGPI5S包含以下成分 表30 質(zhì)粒pZKUGPI5S(SEQ ID NO133)的說(shuō)明 用SalI/PacI消化質(zhì)粒pZKUGPI5S，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2072。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM+5-FOA選擇平板上，在30℃維持3-4天。
挑選了總共24個(gè)在MM+5-FOA平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，分別重新劃線到MM平板和MM+5-FOA平板上。能夠在MM+5-FOA平板上生長(zhǎng)，但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌株選作Ura-菌株。將這24個(gè)Ura-菌株的每一個(gè)單獨(dú)接種到液體MMU培養(yǎng)基中，30℃下在250rpm/min振蕩的條件下生長(zhǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在MMU中生長(zhǎng)2天后，8個(gè)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的7.3-8.9％的EPA，14個(gè)菌株生產(chǎn)9-9.9％的EPA，1個(gè)菌株生產(chǎn)10.5％的EPA(即1號(hào))，1個(gè)菌株生產(chǎn)10.7％的EPA(即23號(hào))。用兩階段生長(zhǎng)條件(即48hrs MM，96hrs HGM)進(jìn)一步分析1號(hào)和23號(hào)菌株。GC分析顯示在兩階段生長(zhǎng)后這兩個(gè)菌株都生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14％的EPA。1號(hào)菌株命名為菌株“Y2072U1”。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約18％的EPA的Y2089菌株 用構(gòu)建體pDMW302T16(圖14C；SEQ ID NO134)將含有四種嵌合基因(包括C16/18 延伸酶、C18/20延伸酶、Δ6去飽和酶和Δ12去飽和酶)和Ura3基因的簇整合到Y(jié)2072U1菌株的耶氏酵母脂肪酶1基因位點(diǎn)中。質(zhì)粒pDMW302T16含有以下成分 表31 質(zhì)粒pDMW302T16(SEQ ID NO134)的說(shuō)明 用SphI/AscI消化質(zhì)粒pDMW302T16，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2072U1。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM平板上，在30℃維持3-4天。挑選了總共48個(gè)在MM平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，重新劃線到新的MM平板上。一旦生長(zhǎng)，將這些菌株單獨(dú)接種到液體MM中，30℃下在250rpm/min振蕩的條件下生長(zhǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在MM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2天后，幾乎所有的具有pDMW302T16的Y2072U1的轉(zhuǎn)化體都生產(chǎn)EPA。在48個(gè)選擇的轉(zhuǎn)化體中，27個(gè)菌株生產(chǎn)10％以下的EPA，14個(gè)菌株生產(chǎn)10-12.9％的EPA，5個(gè)菌株生產(chǎn)13-13.9％的EPA。選擇34號(hào)菌株(生產(chǎn)13.9％EPA)用于用兩階段生長(zhǎng)程序(即48hrs MM，96hrs HGM)進(jìn)一步分析。GC分析顯示34號(hào)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的大約18％的EPA。34號(hào)菌株命名為菌株“Y2089”。
該菌株相對(duì)于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的最終基因型是Pox3-，LIP1-，Y.Δ12-，F(xiàn)BA::F.Δ12::Lip2，TEF::F.Δ12::Pex16，F(xiàn)BAIN::MΔ12::Pex20，TEF::Δ6S::Lip1，F(xiàn)BAIN::Δ6S::Lip1，F(xiàn)BAIN::E1S::Pex20，GPAT::E1S::Oct，GPDIN::E1S::Lip2，TEF::E2S::Xpr，F(xiàn)BAIN::MAΔ5::Pex20，TEF::MAΔ5::Lip1，TEF::HΔ5S::Pex16，TEF::IΔ5S::Pex20，GPAT::IΔ5S::Pex20，F(xiàn)BAIN::Δ17S::Lip2，F(xiàn)BAINm::Δ17S::Pex16，TEF::Δ17S::Pex16和2X TEF::rELO2S::Pex20。
制備具有Ura-表型的生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約16％的EPA的Y2107U1菌株 建立構(gòu)建體pZKUGPE1S(圖14D；SEQ ID NO135)，用于將GPAT::EL1S::Pex20嵌合基因整合到菌株Y2089的Ura3基因中。更具體地，質(zhì)粒pZKUGPE1S包含以下成分 表32 質(zhì)粒pZKUGPE1S(SEQ ID NO135)的說(shuō)明 用SalI/PacI消化質(zhì)粒pZKUGPE1S，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化菌株Y2089。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM+5-FOA選擇平板上，在30℃維持3-4天。
挑選了總共8個(gè)在MM+5-FOA平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，分別重新劃線到MM平板和MM+5-FOA平板上。能夠在MM+5-FOA平板上生長(zhǎng)，但是不能在MM平板上生長(zhǎng)的菌株選作Ura-菌株。將這8個(gè)Ura-菌株的每一個(gè)單獨(dú)接種到液體MMU中，30℃下在250rpm/min振蕩的條件下生長(zhǎng)2天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在MMU中生長(zhǎng)2天后，6個(gè)菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的6.6-8.7％的EPA，2個(gè)菌株生產(chǎn)9.4-10％的EPA(即4號(hào)和5號(hào))。用兩階段生長(zhǎng)條件(即48hrs MM，96hrs HGM)進(jìn)一步分析4號(hào)和5號(hào)菌株。GC分析顯示這兩個(gè)菌株在兩階段生長(zhǎng)后生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約16％的EPA。4號(hào)菌株命名為菌株“Y2107U1”。
實(shí)施例12 制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的9-12％的EPA的中間菌株MU 本實(shí)施例描述了來(lái)源于解脂耶氏酵母ATCC #20362的菌株MU的構(gòu)建，該菌株能夠生產(chǎn)占總脂質(zhì)的顯著濃度的EPA(圖4)。基于TAG含量和/或組成的分析，在這種生產(chǎn)EPA的菌株中檢驗(yàn)多個(gè)天然解脂耶氏酵母?；D(zhuǎn)移酶敲除的影響，如實(shí)施例24的描述(下文)。
菌株MU(生產(chǎn)9-12％ EPA)的開(kāi)發(fā)需要構(gòu)建菌株M4(生產(chǎn)8％DGLA，并且描述于實(shí)施例4)、菌株Y2034(生產(chǎn)10％ ARA，并且描述于實(shí)施例4)、菌株E(生產(chǎn)10％ EPA，并且描述于實(shí)施例10)、菌株EU(生產(chǎn)10％ EPA，并且描述于實(shí)施例10)和菌株M26(生產(chǎn)14％ EPA)。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的14％的EPA的M26菌株 用構(gòu)建體pZKO2UM26E(SEQ ID NO136；圖15A)將含有三種嵌合基因(包括C18/20延伸酶、Δ6去飽和酶和Δ12去飽和酶)和Ura3基因的簇整合到EU菌株(實(shí)施例10)的耶氏酵母Δ12去飽和酶基因位點(diǎn)中。質(zhì)粒pKO2UM26E含有以下成分 表33 質(zhì)粒pKO2UM26E(SEQ ID NO136)的說(shuō)明 用SphI/AscI消化質(zhì)粒pKO2UM26E，然后用于根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化EU菌株(實(shí)施例10)。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞鋪板到MM平板上，在30℃維持2-3天。
挑選了總共48個(gè)在MM平板上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化體，重新劃線到新的MM平板上。一旦生長(zhǎng)，30℃下將這些菌株單獨(dú)接種到液體MM中，以250rpm/min振蕩的條件下生長(zhǎng)1天。通過(guò)離心收集細(xì)胞，提取脂質(zhì)，通過(guò)酯交換制備脂肪酸甲酯，隨后用Hewlett-Packard 6890 GC進(jìn)行分析。
GC分析顯示在MM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1天后，幾乎所有的具有pKO2UM26E的轉(zhuǎn)化體中都存在EPA。在48個(gè)選擇的轉(zhuǎn)化體中，5個(gè)菌株生產(chǎn)占工程化的耶氏酵母中的總脂質(zhì)的4％以下的EPA，23個(gè)菌株生產(chǎn)4-5.9％ EPA，9個(gè)菌株生產(chǎn)6-6.9％ EPA，11個(gè)菌株生產(chǎn)7-8.2％ EPA。選擇生產(chǎn)8.2％ EPA的菌株用于通過(guò)兩階段生長(zhǎng)程序(即48hrs MM，96hrs HGM)進(jìn)一步分析。GC分析顯示工程化的菌株生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14％的EPA。該菌株稱作菌株“M26”。
菌株M26相對(duì)于野生型解脂耶氏酵母ATCC #20362的最終基因型是Pox3-，Y.Δ12-，F(xiàn)BA::F.Δ12::Lip2，F(xiàn)BAIN::MΔ12::Pex20，TEF::Δ6S::Lip1，F(xiàn)BAIN::Δ6B::Pex20，F(xiàn)BAIN::E1S::Pex20，GPAT::E1S::Xpr，TEF::E2S::Xpr，F(xiàn)BAIN::MAΔ5::Pex20，TEF::MAΔ5::Lip1，TEF::H Δ 5S::Pex16，F(xiàn)BAIN::Δ 17S::Lip2，F(xiàn)BAINm::Δ17S::Pex16，TEF::Δ 17S::Pex16和TEF::rELO2S::Pex20。
制備生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約14％的EPA的MU菌株 菌株MU是菌株M26的Ura營(yíng)養(yǎng)缺陷型。該菌株是通過(guò)用PacI和HincII消化過(guò)的5μg質(zhì)粒pZKUM(SEQ ID NO137)轉(zhuǎn)化菌株M26而制備的。用Frozen-EZ酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(Zymo ResearchCorporation，Orange，CA)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)將100μl轉(zhuǎn)化的細(xì)胞混合物在以下培養(yǎng)基中鋪板在瓊脂板上，選擇轉(zhuǎn)化體6.7g/L酵母氮基(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)、20g/右旋糖、50mg/L尿嘧啶和800mg/L FOA。7天后，將出現(xiàn)的小菌落鋪板在MM和MMU瓊脂板上。所有都是URA營(yíng)養(yǎng)缺陷型。菌株之一命名為“MU”。
實(shí)施例13 高山被孢霉基因組DNA和cDNA的制備 本實(shí)施例描述了高山被孢霉(ATCC #16266)的基因組DNA和cDNA的制備。這使得能夠分別按照實(shí)施例14、15、16、17和18的描述分離高山被孢霉LPAAT2、DGAT1、DGAT2、GPAT和ELO3。
制備高山被孢霉基因組DNA 使用QiaPrep Spin微量制備試劑盒(Qiagen，目錄號(hào)627106)，從高山被孢霉(ATCC #16266)分離基因組DNA。刮下在YPD瓊脂平板(2％細(xì)菌用酵母提取物，3％細(xì)菌用肽胨，2％葡萄糖，2％細(xì)菌用瓊脂)上生長(zhǎng)的細(xì)胞，重新懸浮于1.2mL試劑盒緩沖液P1。將重新懸浮的細(xì)胞置于2個(gè)2.0mL螺旋帽試管中，每個(gè)試管裝有0.6mL玻璃珠(0.5mm直徑)。在Biospec(Bartlesville，OK)微珠攪拌機(jī)上，在HOMOGENIZE設(shè)置，勻漿細(xì)胞2min。然后在Eppendorf微量離心機(jī)中在14,000rpm離心試管2min。將上清液(0.75mL)轉(zhuǎn)移至3個(gè)1.5mL微量離心試管。向每個(gè)試管中加入等體積的試劑盒緩沖液P2。通過(guò)反轉(zhuǎn)混合試管3次后，將0.35mL緩沖液N3加入每個(gè)試管。通過(guò)反轉(zhuǎn)混合試管5次，再次混合物內(nèi)容物。在Eppendorf微量離心機(jī)中在14,000rpm離心混合物5min。將每個(gè)試管的上清液轉(zhuǎn)移進(jìn)分開(kāi)的試劑盒離心柱中。然后對(duì)柱子進(jìn)行以下步驟離心(14,000rpm 1min)，用緩沖液PE洗滌一次，離心(14,000rpm 1min)，然后最后離心(14,000rpm 1min)。將緩沖液EB(50μl)加入每個(gè)柱中，靜置1min。然后通過(guò)在14,000rpm離心1min，洗脫基因組DNA。
制備高山被孢霉cDNA根據(jù)制造商的方案，使用BD-Clontech Creator

cDNA文庫(kù)試劑盒(Mississauga，ON，Canada)，制備了高山被孢霉cDNA。具體地，在23℃，將高山被孢霉菌株ATCC #16266在60mL YPD培養(yǎng)基(2％細(xì)菌用酵母提取物，3％細(xì)菌用肽胨，2％葡萄糖)中培養(yǎng)3天。通過(guò)在Beckman GH3.8轉(zhuǎn)子中3750rpm離心10min，沉淀細(xì)胞，并重新懸浮于6X 0.6mL Trizole試劑(Invitrogen)。將重新懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6個(gè)2mL螺旋帽試管中，每個(gè)試管裝有0.6mL 0.5mm玻璃珠。在Biospec(Bartlesville，OK)微珠攪拌機(jī)上，在HOMOGENIZE設(shè)置，勻漿細(xì)胞2min。短時(shí)間離心試管，沉淀珠子。將液體轉(zhuǎn)移至4個(gè)新的1.5mL微量離心試管，向每個(gè)試管中加入0.2mL氯仿/異戊醇(24:1)。用手搖動(dòng)試管1min，靜置3min。然后在4℃，在14,000rpm離心試管10min。將上層轉(zhuǎn)移至4個(gè)新試管。將異丙醇(0.5mL)加入每個(gè)試管中。在室溫溫育試管15min，然后在14,000rpm、4℃離心10min。各用1mL 75％乙醇(由無(wú)RNA酶的水制備)洗滌沉淀，并在空氣中干燥。然后，將總RNA樣品重新溶于500μl水，使用1:50稀釋的RNA樣品，在A260nm測(cè)量RNA的量。得到共計(jì)3.14mg RNA。
根據(jù)制造商的方案，用Qiagen Rneasy總RNA Midi試劑盒進(jìn)一步純化該總RNA樣品。從而，將總RNA樣品稀釋至2mL，并與含有80μl β-巰基乙醇和5.6mL 100％乙醇的8mL緩沖液RLT相混合。將樣品分成4份，裝載4 RNeasy midid柱。然后，在4500Xg離心柱5min。為了洗滌柱，裝載2mL緩沖液RPE，在4500Xg離心柱2min。重復(fù)洗滌步驟1次，例外是，將離心延長(zhǎng)至5min。如下洗脫總RNA向每個(gè)柱中應(yīng)用250μl無(wú)RNA酶的水，等待1min，在4500Xg離心3min。
按照Pharmacia的試劑盒手冊(cè)，從上面的總RNA樣品分離聚A(+)RNA。簡(jiǎn)而言之，使用2個(gè)寡-dT-纖維素柱。各用1mL高鹽緩沖液，洗滌柱2次。將來(lái)自前一步驟的總RNA樣品稀釋至2mL總體積，并調(diào)節(jié)至10mM Tris/HCl，pH 8.0，1mM EDTA。在65℃加熱樣品5min，然后置于冰上。加入樣品緩沖液(0.4mL)，然后在重力進(jìn)料下，將樣品裝載到2個(gè)寡-dT-纖維素柱上。在350Xg離心柱2min，各用0.25mL高鹽緩沖液洗滌2次，每次洗滌后在350Xg離心2min。在相同的離心程序后，再用低鹽緩沖液洗滌柱3次。通過(guò)各用0.25mL預(yù)熱至65℃的洗脫緩沖液洗滌柱4次，洗脫聚(A)+RNA，隨后進(jìn)行相同的離心程序。重復(fù)整個(gè)純化過(guò)程一遍。得到的純化的聚(A)+RNA的濃度為30.4ng/μl。
使用BD-Clontech描述的LD-PCR方法和0.1μg聚A(+)RNA樣品，制備cDNA。更具體地，就第1鏈cDNA合成而言，將3μl聚(A)+RNA樣品與1μl SMART IV寡核苷酸(SEQ ID NO281)和1μl CDSIII/3’PCR引物(SEQ ID NO282)相混合。在72℃加熱混合物2min，在冰上冷卻2min。向試管中加入下述物質(zhì)2μl第1鏈緩沖液，1μl 20mM DTT，1μl 10mM dNTP混合物和1μlPowerscript逆轉(zhuǎn)錄酶。在42℃溫育混合物1小時(shí)，然后在冰上冷卻。
將第1鏈cDNA合成混合物用作PCR反應(yīng)的模板。更具體地，反應(yīng)混合物含有下述物質(zhì)2μl第1鏈cDNA混合物，2μl5’-PCR引物(SEQ ID NO283)，2μl CDSIII/3’-PCR引物(SEQ ID NO282)，80μl水，10μl 10X Advantage 2 PCR緩沖液，2μl 50X dNTP混合物和2μl 50X Advantage 2聚合酶混合物。將熱循環(huán)儀條件設(shè)定為95℃ 20sec，然后是在GenAmp 9600儀器上的14個(gè)95℃ 5sec和68℃ 6min的循環(huán)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色，定量PCR產(chǎn)物。
將75μl上述PCR產(chǎn)物(cDNA)與3μl 20μg/μl蛋白酶K(與試劑盒一起提供)相混合。在45℃溫育混合物20min，然后加入75μl水，用150μl苯酚:氯仿:異戊醇混合物(25:24:1)提取混合物。用150μl氯仿:異戊醇(25:1)進(jìn)一步提取水相。然后，將水相與15μl 3M醋酸鈉，2μl 20μg/μl糖原和400μl 100％乙醇相混合。立即在離心機(jī)中在室溫在14000rpm離心混合物20min。用150μl 80％乙醇洗滌沉淀一次，在空氣中干燥，溶于79μl水。
隨后用SfiI消化溶解的cDNA(將79μl cDNA與10μl 10X SfiI緩沖液，10μl SfiI酶和1μl 100X BSA相混合，在50℃溫育混合物2小時(shí))。加入二甲苯藍(lán)染料(2μl 1％)。然后完全按照制造商的方案，在與試劑盒一起提供的Chroma Spin-400柱上分離混合物。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，分析從柱收集的級(jí)分。合并含有cDNA的前3個(gè)級(jí)分，并用乙醇沉淀cDNA。將沉淀的cDNA重新溶于7μl水，并連接進(jìn)試劑盒-提供的pDNR-LIB。
文庫(kù)測(cè)序 將連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-1 Blue電穿孔感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)。得到估計(jì)共2 x 106菌落。使用M13正向引物(SEQ IDNO284)，通過(guò)Agencourt Bioscience Corporation(Beverly，MA)，進(jìn)行cDNA文庫(kù)的測(cè)序。
實(shí)施例14 高山被孢霉LPAAT2表達(dá)增加PUFAs百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)高山被孢霉LPAAT2(SEQ IDNOs69和70)的解脂耶氏酵母菌株Y2067U(實(shí)施例10)中EPA生物合成和積累的增加。認(rèn)為如果類似地共表達(dá)高山被孢霉LPAAT2(如在菌株Y2034、Y2047和/或Y2214中)，則經(jīng)過(guò)工程化以通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑生產(chǎn)ARA的解脂耶氏酵母宿主菌株能夠證明ARA生物合成和積累的增加。
按照如下方法克隆高山被孢霉LPAAT2 ORF。通過(guò)PCR，用引物MLPAT-F和MLPAT-R(SEQ ID NOs285和286)擴(kuò)增來(lái)自高山被孢霉的cDNA(實(shí)施例13)的LPAAT2 ORF。反應(yīng)混合物含有1μlcDNA、每種引物各1μl、22μl水和25μl ExTaq預(yù)混合2X Taq PCR溶液(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)。按照如下方法進(jìn)行擴(kuò)增最初在94℃變性150sec，然后是30個(gè)循環(huán)的94℃下變性30sec、55℃下退火30sec和72℃下延伸90sec。72℃進(jìn)行最終的延伸循環(huán)10分鐘，然后在4℃終止反應(yīng)。從PCR反應(yīng)獲得了約950bp DNA片段。根據(jù)制造商的方案，用Qiagen(Valencia，CA)PCR純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化。用NcoI和NotI消化純化的PCR產(chǎn)物，克隆到Nco I-Not I切割的pZUF17載體(SEQ ID NO118；圖8B)中，使得基因處于自主復(fù)制的載體中的解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子和PEX20-3’終止子區(qū)控制下，以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)。通過(guò)微量制備DNA的限制分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pMLPAT-17”(SEQ ID NO138)。
為了將高山被孢霉LPAAT2整合到解脂耶氏酵母的基因組中，建立了質(zhì)粒pMLPAT-Int。用引物L(fēng)PAT-Re-5-1和LPAT-Re-5-2(SEQID NOs287和288)擴(kuò)增1129bp DNA片段YLPAT-5’(SEQ ID NO289)，該片段含有解脂耶氏酵母LPAAT1(SEQ ID NO71)的AUG上游緊鄰的解脂耶氏酵母基因組1103bp片段。反應(yīng)混合物含有1μl解脂耶氏酵母基因組DNA、每種引物各1μl、22μl水和25μl ExTaq預(yù)混合2X Taq PCR溶液(TaKaRa)。按照上文進(jìn)行擴(kuò)增。從PCR反應(yīng)獲得了約1130bp DNA片段。根據(jù)制造商的方案，用Qiagen的PCR純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化。用SalI和ClaI消化純化的PCR產(chǎn)物，克隆到SalI-ClaI切割的pBluescript SK(-)載體中，得到質(zhì)?！皃YLPAT-5’”。
然后用引物L(fēng)PAT-Re-3-1和LPAT-Re-3-2(SEQ ID NOs290和291)擴(kuò)增938bp片段YLPAT-3’(SEQ ID NO292)，該片段含有解脂耶氏酵母LPAAT1的終止密碼子后緊鄰的解脂耶氏酵母基因組903bp片段。用ClaI和XhoI消化純化的PCR產(chǎn)物，克隆到ClaI-XhoI消化的pYLPAT-5’中。通過(guò)微量制備分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pYLPAT-5’-3’”。
然后用ClaI和NotI消化pMLPAT-17(SEQ ID NO138)，根據(jù)制造商的方案，用Qiagen QiaexII凝膠純化試劑盒分離含有解脂耶氏酵母Ura3基因的約3.5kb片段、解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子和高山被孢霉LPAAT2基因。將該片段克隆到ClaI-NotI消化的pYLPAT-5’-3’中。通過(guò)微量制備和限制分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體。得到的質(zhì)粒命名為“pMLPAT-Int”(SEQ ID NO139)。
如下制備“對(duì)照”載體pZUF-MOD-1(SEQ ID NO140；圖15B)。首先，用引物pzuf-mod1和pzuf-mod2(SEQ ID NOs293和294)擴(kuò)增252bp“填充”DNA片段。用Qiagen QiaQuick PCR純化試劑盒純化擴(kuò)增的片段，使用標(biāo)準(zhǔn)條件，用NcoI和NotI消化，然后再用QiaQuick PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。將該片段連接進(jìn)類似地消化的NcoI-/NotI-切割的pZUF17載體(SEQ ID NO118；圖8B)，并將得到的連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10細(xì)胞(Invitrogen)。使用Qiagen QiaPrep Spin微量制備試劑盒，從4個(gè)得到的菌落純化質(zhì)粒DNA。用NcoI和NotI消化純化的質(zhì)粒，證實(shí)約250bp片段的存在。得到的質(zhì)粒稱作“pZUF-MOD-1”(SEQ ID NO140)。
根據(jù)一般方法，分別用質(zhì)粒pMLPAT-17、質(zhì)粒pZUF-MOD-1(對(duì)照)和SpeI/XbaI消化的質(zhì)粒pMLPAT-Int轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株Y2067U(來(lái)自實(shí)施例10，生產(chǎn)占總脂質(zhì)的14％的EPA)。使轉(zhuǎn)化體在添加了氨基酸的合成MM中生長(zhǎng)2天，然后在HGM中生長(zhǎng)4天?；贕C分析(如一般方法中所述)，在下表中示出了兩個(gè)含有pZUF-MOD-1的轉(zhuǎn)化體、兩個(gè)含有pMLPAT-17的轉(zhuǎn)化體，和兩個(gè)具有整合到基因組中的pMLPAT-Int的轉(zhuǎn)化體的脂肪酸譜。脂肪酸鑒定為18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ARA、ETA和EPA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表34 經(jīng)過(guò)工程化而超量表達(dá)高山被孢霉LPAAT2的耶氏酵母菌株Y2067U中的脂質(zhì)組成
如上文所證明的，從pMLPAT-17表達(dá)高山被孢霉LPAAT2，使“對(duì)照”菌株中的EPA百分比從約14％增加到15.5-16％。當(dāng)用pMLPAT-Int將高山被孢霉LPAAT2整合到基因組中時(shí)，EPA額外增加到16.6-17.3％。如果天然解脂耶氏酵母LPAAT1(SEQ ID NOs71和72)和/或LPAAT2(SEQ ID NOs74和75)從例如菌株Y2067U+pMLPAT-Int中敲除，可以預(yù)期進(jìn)一步的增加。
實(shí)施例15 高山被孢霉DGAT1表達(dá)增加PUFAs百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)高山被孢霉DGAT1 cDNA(SEQID NO83)的解脂耶氏酵母菌株Y2067U(實(shí)施例10)中EPA生物合成和積累的增加。認(rèn)為如果類似地共表達(dá)高山被孢霉DGAT1(如在菌株Y2034、Y2047和/或Y2214中)，則經(jīng)過(guò)工程化以通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑生產(chǎn)ARA的解脂耶氏酵母宿主菌株能夠證明ARA生物合成和積累的增加。
如下克隆高山被孢霉DGAT1 ORF。首先，為了輔助克隆cDNA，將DGAT1的第2個(gè)密碼子的序列從‘ACA’改變成‘GCA’，導(dǎo)致從蘇氨酸至丙氨酸的氨基酸改變。這通過(guò)用引物MACAT-F1和MACAT-R(SEQ ID NO295和296)擴(kuò)增高山被孢霉DGAT1 ORF的完整編碼區(qū)來(lái)實(shí)現(xiàn)。更具體地，PCR反應(yīng)混合物含有1μl各20μM引物MACAT-F1和MACAT-R溶液，1μl高山被孢霉cDNA(同上，實(shí)施例13)，22μl水和25μl ExTaq預(yù)混合2X Taq PCR溶液(TaKaRaBio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)。如下進(jìn)行擴(kuò)增在94℃初步變性150sec，隨后30個(gè)下述循環(huán)在94℃變性30sec，在55℃退火30sec，在72℃延伸90sec。進(jìn)行在72℃ 10min的最終延伸循環(huán)，然后在4℃終止反應(yīng)。從PCR反應(yīng)得到約1600bp DNA片段。根據(jù)制造商的方案，使用Qiagen的PCR純化試劑盒，進(jìn)行純化。
將高山被孢霉DGAT1 ORF插入Nco I-和Not I-消化的質(zhì)粒pZUF17(SEQ ID NO118；圖8B)，使得ORF克隆在FBAIN啟動(dòng)子和PEX20-3’終止子區(qū)域控制下。但是，由于DGAT1 ORF含有內(nèi)部NcoI位點(diǎn)，克隆必需進(jìn)行2個(gè)分開(kāi)的限制酶消化。首先，用BamHI和Nco I消化約2μg純化的PCR產(chǎn)物。反應(yīng)混合物含有20U每種酶(Promega)和6μl限制緩沖液D，總體積為60μl。在37℃溫育混合物2小時(shí)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離約320bp片段，并使用QiagenQiaex II凝膠純化試劑盒進(jìn)行純化。單獨(dú)地，使用與上面相同的反應(yīng)條件，例外是用Not I替代Nco I，用BamHI和Not I消化約2μg純化的PCR產(chǎn)物，如上分離和純化約1280bp片段。最后，用Nco I和Not I消化約3μg pZUF17，并如上純化，制備約7kB片段。
在三向連接中，將約7kB Nco I/Not I pZUF17片段、約320bp NcoI/BamHI DGAT1片段和約1280bp BamHI/Not I DGAT1片段連接到一起，在室溫溫育過(guò)夜。連接混合物含有100ng 7kB片段以及320bp和1280bp片段各200ng、2μl連接酶緩沖液和2U T4 DNA連接酶(Promega)，總體積為20μl。根據(jù)制造商的方案，將連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)。
將轉(zhuǎn)化的單個(gè)菌落(共12個(gè))用于接種培養(yǎng)物，用于微量制備分析。限制圖譜和測(cè)序證實(shí)，12個(gè)菌落中的5個(gè)菌落攜帶需要的質(zhì)粒，其稱作“pMDGAT1-17”(圖15C；SEQ ID NO141)。
根據(jù)一般方法，分別用pMDGAT1-17和pZUF-MOD-1(上文，實(shí)施例14)轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株Y2067U(來(lái)自實(shí)施例10)。使轉(zhuǎn)化體在添加了氨基酸的合成MM中生長(zhǎng)2天，然后在HGM中生長(zhǎng)4天?；贕C分析(如一般方法中所述)，在下表35中示出了兩個(gè)含有pMDGAT1-17的轉(zhuǎn)化體和兩個(gè)含有pZUF-MOD-1的轉(zhuǎn)化體的脂肪酸譜。脂肪酸鑒定為18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ARA、ETA和EPA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表35 經(jīng)過(guò)工程化而超量表達(dá)高山被孢霉DGAT1的耶氏酵母菌株Y2067U中的脂質(zhì)組成
如上文證明的，從質(zhì)粒pMDGAT1-17表達(dá)高山被孢霉DGAT1，分別使“對(duì)照”菌株中的EPA百分比從約13.3％增加到約14％(“Y2067U+pMDGAT1-17 #1”)和約15.1％(“Y2067U+pMDGAT1-17#2”)。如果天然解脂耶氏酵母DGAT1(SEQ ID NOs81和82)從例如菌株Y2067U+pMDGAT1-17中敲除，可以預(yù)期EPA的進(jìn)一步增加。
實(shí)施例16 高山被孢霉DGAT2增加PUFAs百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)高山被孢霉DGAT2 cDNA(SEQID NO95)的解脂耶氏酵母菌株Y2067U(實(shí)施例10)中EPA生物合成和積累的增加。認(rèn)為如果類似地共表達(dá)高山被孢霉DGAT2(如在菌株Y2034、Y2047和/或Y2214中)，則經(jīng)過(guò)工程化以通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑生產(chǎn)ARA的解脂耶氏酵母宿主菌株能夠證明ARA生物合成和積累的增加。
如下將高山被孢霉DGAT2 ORF克隆到質(zhì)粒pZUF17中。首先，用來(lái)自高山被孢霉cDNA(上文實(shí)施例13)的引物MDGAT-F和MDGAT-R1(SEQ ID NOs297和298)PCR擴(kuò)增ORF。分離預(yù)期的1015bp片段，純化，用Nco I和Not I消化，克隆到Nco I-Not I切割的pZUF17載體(SEQ ID NO118；圖8B)中，使得基因在解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子和PEX20-3’終止子區(qū)域控制下。通過(guò)微量制備DNA的限制分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pMDGAT2-17”(SEQ ID NO142)。
根據(jù)一般方法，分別用pMDGAT2-17和pZUF-MOD-1(上文，實(shí)施例14)轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株Y2067U(來(lái)自實(shí)施例10)。使轉(zhuǎn)化體在添加了氨基酸的合成MM中生長(zhǎng)2天，然后在HGM中生長(zhǎng)4天?；贕C分析(如一般方法中所述)，下文示出了兩個(gè)含有pMDGAT2-17的轉(zhuǎn)化體和兩個(gè)含有pZUF-MOD-1的轉(zhuǎn)化體的脂肪酸譜。脂肪酸鑒定為18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ARA、ETA和EPA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表36 經(jīng)過(guò)工程化而超量表達(dá)高山被孢霉DGAT2的耶氏酵母菌株Y2067U中的脂質(zhì)組成
如上文證明的，從質(zhì)粒pMDGAT2-17表達(dá)高山被孢霉DGAT2，使“對(duì)照”菌株中的EPA百分比從約13.3％增加到約15.25％(“Y2067U+pMDGAT2-17)。如果天然解脂耶氏酵母DGAT2(SEQID NOs89-94)從例如菌株Y2067U+pMDGAT2-17中敲除，可以預(yù)期EPA的進(jìn)一步增加。
實(shí)施例17 高山被孢霉GPAT增加PUFAs百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)高山被孢霉GPAT ORF(SEQ IDNO97)的解脂耶氏酵母菌株Y2107U1(實(shí)施例11)中DGLA生物合成和積累的增加(以及18:1的量減少)。認(rèn)為如果類似地共表達(dá)高山被孢霉GPAT(如在菌株Y2034、Y2047和/或Y2214中)，則經(jīng)過(guò)工程化以通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑生產(chǎn)ARA的解脂耶氏酵母宿主菌株能夠證明ARA生物合成和積累的增加。
基于來(lái)自構(gòu)巢曲霉(GenBank獲取號(hào)EAA62242)和粗糙鏈孢霉(GenBank獲取號(hào)XP_325840)的GPAT的序列，設(shè)計(jì)了以下引物進(jìn)行簡(jiǎn)并PCR MGPAT-N1(SEQ ID NO299)CCNCAYGCNAAYCARTTYGT MGPAT-NR5(SEQ ID NO300)TTCCANGTNGCCATNTCRTC [注用于SEQ ID NOs299和300的核酸簡(jiǎn)并密碼如下 R＝A/G；Y＝C/T；并且N＝A/C/T/G。] 用TaKaRa ExTaq預(yù)混合Taq聚合酶(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，Japan)，在Perkin Elmer GeneAmp 9600 PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增如下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94℃下變性30sec、55℃下退火30sec和72℃下延伸90sec。然后72℃進(jìn)行最終的延伸循環(huán)7分鐘。
獲得了約1.2kB的片段(SEQ ID NO99)。用Qiagen QiaQuickPCR純化試劑盒純化該片段，克隆到

克隆載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中，并且測(cè)序。得到的序列翻譯后基于BLAST程序分析與已知的GPATs具有同源性。
基于1212bp cDNA片段的序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增和基因組步移技術(shù)克隆了高山被孢霉GPAT的5’和3’區(qū)。這使得能夠組裝相應(yīng)于高山被孢霉GPAT(SEQ ID NO100)的-1050bp至+2885bp區(qū)的重疊群。該重疊群包括GPAT的整個(gè)編碼區(qū)和四個(gè)內(nèi)含子(SEQ IDNOs104，105，106和107)。
具體地，將描述于實(shí)施例13(1μl)的高山被孢霉cDNA樣品用作擴(kuò)增GPAT的3’末端的模板。MGPAT-5N1(SEQ ID NO301)和CDSIII/3’(SEQ ID NO282)用作模板。用TaKaRa ExTaq預(yù)混合Taq聚合酶(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，Japan)，在PerkinElmer GeneAmp 9600 PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增如下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94℃下變性30sec、55℃下退火30sec和72℃下延伸90sec。然后72℃進(jìn)行最終的延伸循環(huán)7分鐘。
1:10稀釋PCR產(chǎn)物，將1μl稀釋的PCR產(chǎn)物用作第二輪擴(kuò)增的模板，該第二輪擴(kuò)增采用MGPAT-5N2(SEQ ID NO302)和CDSIII/3’作為引物。條件與上文描述的完全相同。再次將第二輪PCR產(chǎn)物1:10稀釋，將1μl稀釋的PCR產(chǎn)物用作第三輪PCR的模板，該第三輪PCR采用MGPAT-5N3(SEQ ID NO303)和CDSIII/3’作為引物。PCR條件再次相同。
第三輪PCR產(chǎn)生約1kB的片段。用Qiagen QiaQuick PCR純化試劑盒純化該片段，克隆到pCR2.1-TOPO載體中，進(jìn)行序列分析。序列分析結(jié)果表明該965bp片段(SEQ ID NO101)相應(yīng)于GPAT基因的3’末端。
用Clontech Universal GenomeWalkerTM試劑盒獲得一段相應(yīng)于高山被孢霉GPAT的5’末端區(qū)的基因組DNA。簡(jiǎn)言之，用DraI、EcoRV、PvuII或StuI單獨(dú)地消化2.5μg每個(gè)高山被孢霉基因組DNA，使用Qiagen Qiaquick PCR純化試劑盒，純化消化的DNA樣品，并用每種試劑盒緩沖液EB各30μl洗脫，并用如下所示的基因組步移接頭(SEQ ID NO304[上鏈]和305[下鏈])，連接純化的樣品 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3’ 3’-H2N-CCCGACCA-5’ 每種連接反應(yīng)混合物含有1.9μl 25μM基因組步移接頭，1.6μl10X連接緩沖液，0.5μl T4 DNA連接酶和4μl純化的消化的基因組DNA樣品之一。在16℃溫育反應(yīng)混合物過(guò)夜。通過(guò)在70℃溫育5min，終止反應(yīng)。然后，將72μl 10mM TrisHCl，1mM EDTA，pH 7.4緩沖液加入每種連接反應(yīng)混合物。
進(jìn)行了四個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)采用四種連接混合物之一作為模板。PCR反應(yīng)混合物含有1μl連接混合物，0.5μl 20μMMGPAT-5-1A(SEQ ID NO306)，1μl 10μM試劑盒引物AP1(SEQID NO307)，22.5μl μl水和25μl ExTaq預(yù)混合Taq 2X PCR溶液(TaKaRa)。采用以下條件進(jìn)行32輪PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)的94℃變性30sec、55℃退火30sec和72℃延伸180sec。72℃最終延伸7min，隨后在4℃終止反應(yīng)。
分別以1:50稀釋每個(gè)PCR反應(yīng)的產(chǎn)物，用作第二輪PCR的模板。每個(gè)反應(yīng)混合物含有1μl稀釋的PCR產(chǎn)物之一作為模板，0.5μl 20μM MGPAT-3N1(SEQ ID NO308)，21μl 10μM試劑盒引物AP2(SEQ ID NO309)，22.5μl水和25μl of ExTaq預(yù)混合Taq 2X PCR溶液(TaKaRa)。用與上文所述相同的熱循環(huán)條件進(jìn)行32輪PCR反應(yīng)。
從第二輪PCR獲得DNA片段。純化該片段，克隆到pCR2.1-TOPO中并測(cè)序。測(cè)序分析顯示1908bp片段(SEQ ID NO102)是高山被孢霉GPAT基因的5’末端。
類似地，按照上文所述，通過(guò)兩輪基因組步移獲得966 bp片段(SEQ ID NO103)，不同的是采用引物MGPAT-5N1作為基因特異性引物進(jìn)行第一輪PCR，用引物MGPAT-5N2作為基因特異性引物進(jìn)行第二輪。也純化該片段，克隆到pCR2.1-TOPO中并測(cè)序。序列分析顯示它含有GPAT基因的一部分；但是，該片段的長(zhǎng)度不足以延伸基因的任何一個(gè)末端。與3’cDNA序列(SEQ ID NO101)的比較顯示沒(méi)有包括ORF的最后171bp。
組裝來(lái)自高山被孢霉的全長(zhǎng)GPAT序列 從上文描述的最初的部分cDNA片段(SEQ ID NO99)、3’cDNA片段(SEQ ID NO101)、內(nèi)部基因組片段(SEQ ID NO103)和5’基因組片段(SEQ ID NO102)組裝含有完整GPAT基因(包括在GPAT翻譯起始‘ATG’密碼子上游延伸1050個(gè)堿基，并且延伸超過(guò)GPAT終止密碼子22個(gè)堿基的區(qū)域)的3935bp序列(SEQ ID NO100)(圖示于圖16)。該區(qū)域中包括了2151bp GPAT ORF。從‘ATG’到終止密碼子‘TAG’的高山被孢霉GPAT ORF的完整核苷酸序列提供為SEQ ID NO97(相應(yīng)于SEQ ID NO100的堿基1050-2863，排除4個(gè)內(nèi)含子(即內(nèi)含子1[SEQ ID NO104]，相應(yīng)于SEQ ID NO100的堿基1195-1469；內(nèi)含子2[SEQ ID NO105]，相應(yīng)于SEQ IDNO100的堿基1585-1839；內(nèi)含子3[SEQ ID NO106]，相應(yīng)于SEQID NO100的堿基2795-2877和內(nèi)含子4[SEQ ID NO107]，相應(yīng)于SEQ ID NO100的堿基2940-3038)。翻譯的氨基酸序列(SEQ IDNO98)顯示出與許多真菌、植物和動(dòng)物GPATs的同源性。
更具體地，通過(guò)進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment SearchTool；Altschul，S.F.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1993))檢索確定序列同一性。此處描述為SEQ ID NO98的氨基酸片段與推定的玉蜀黍黑粉菌的GPAT(GenBank獲取號(hào)EAK84237)的蛋白序列具有47％同一性和65％相似性，預(yù)期值是1e-152；此外，SEQ IDNO111與煙曲霉的GPAT(GenBank獲取號(hào)EAL20089)具有47％同一性和62％相似性，預(yù)期值是1e-142。
構(gòu)建包含F(xiàn)BAIN::MGPAT::PEX20-3’嵌合基因的質(zhì)粒pMGPAT-17 如下克隆高山被孢霉GPAT ORF。用引物MGPAT-cDNA-5和MGPAT-cDNA-R(SEQ ID NOs310和311)通過(guò)PCR從cDNA擴(kuò)增GPAT ORF。反應(yīng)混合物包含1μl cDNA、每種引物各1μl、22μl水和25μl ExTaq預(yù)混合2X Taq PCR溶液(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)。如下進(jìn)行擴(kuò)增在94℃初步變性150sec，隨后30個(gè)下述循環(huán)在94℃變性30sec，在55℃退火30sec，在72℃延伸90sec。進(jìn)行在72℃ 10min的最終延伸循環(huán)，然后在4℃終止反應(yīng)。從PCR反應(yīng)得到約2.2kB DNA片段。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用Qiagen PCR純化試劑盒純化該片段。
用BamHI和EcoRI消化純化的PCR產(chǎn)物，通過(guò)凝膠瓊脂糖電泳分離約470bp的片段，用Qiagen凝膠純化試劑盒純化。獨(dú)立地，也用EcoRI和NotI切割PCR產(chǎn)物，按照上文分離和純化1.69kB片段。將兩個(gè)片段連接到BamHI和NotI切割的pZUF-MOD-1載體(SEQID NO140；圖15B)中，使得基因處于自主復(fù)制的載體中解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子和PEX20-3’終止子區(qū)的控制下，以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)。通過(guò)微量制備DNA的限制分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pMGPAT-17”(SEQ ID NO143；圖15D)。
分析超量表達(dá)高山被孢霉GPAT的轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母中的脂質(zhì)組成 根據(jù)一般方法，分別用質(zhì)粒pMGPAT-17和pZUF-MOD-1(上文，實(shí)施例14)轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株Y2107U1(來(lái)自實(shí)施例11)。使轉(zhuǎn)化體在添加了氨基酸的合成MM中生長(zhǎng)2天，然后在HGM中生長(zhǎng)4天。基于GC分析(如一般方法中所述)，下文示出了兩個(gè)含有pZUF-MOD-1的轉(zhuǎn)化體和兩個(gè)含有pMGPAT-17的轉(zhuǎn)化體的脂肪酸譜。脂肪酸鑒定為18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ARA、ETA和EPA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表37 經(jīng)過(guò)工程化而超量表達(dá)高山被孢霉GPAT的耶氏酵母菌株Y2107U1中的脂質(zhì)組成
如上文證明的，從pMGPAT-17表達(dá)高山被孢霉GPAT，使“對(duì)照”菌株中的DGLA百分比從約2.5％增加到約6.5％。18:1的水平從約23％減少到約16％。如果天然解脂耶氏酵母GPAT從表達(dá)pMGPAT-17的轉(zhuǎn)化菌株中敲除，可以預(yù)期DGLA(或任何其它下游PUFAs)的進(jìn)一步增加。
實(shí)施例18 高山被孢霉脂肪酸延伸酶“ELO3”增加PUFAs百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)高山被孢霉C16/18脂肪酸延伸酶(“ELO3”；SEQ ID NOs53和54)的解脂耶氏酵母菌株Y2031(實(shí)施例5)中生產(chǎn)35％以上的C18脂肪酸(18:0、18:1、18:2和GLA)和31％以下的C16脂肪酸。認(rèn)為ELO3(其可以任選是密碼子優(yōu)化的，以便增加表達(dá))可以促使碳流入工程化的Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑，作為增加需要的PUFA即ARA的生產(chǎn)的手段。例如，包含該C16/18脂肪酸延伸酶的嵌合基因可以容易地導(dǎo)入例如菌株Y2034、Y2047或Y2214中。
高山被孢霉C16/18脂肪酸延伸酶的序列鑒定 從9,984種高山被孢霉cDNA序列(實(shí)施例13)鑒定編碼一部分高山被孢霉脂肪酸延伸酶的cDNA片段(SEQ ID NO55)。該cDNA片段與許多脂肪酸延伸酶具有顯著同源性，從而鑒定為延伸酶。
根據(jù)同一性百分比、相似性百分比和預(yù)期值報(bào)道了概括與SEQ IDNO55具有最多相似性的序列的BLAST比較的結(jié)果。具體地，SEQID NO55的翻譯的氨基酸序列與來(lái)自白色假絲酵母SC5314的可能的脂肪酸延伸酶(GenBank獲取號(hào)EAL04510.1，其中標(biāo)注為與啤酒糖酵母EUR4、FEN1和ELO1相似的三種可能的脂肪酸延伸酶基因之一)的蛋白序列具有32％同一性和46％相似性，預(yù)期值是4e-13。此外，SEQ ID NO55與來(lái)自啤酒糖酵母的ELO1(GenBank獲取號(hào)NC_001142，X染色體的堿基67849-68781)具有35％同一性和53％相似性。啤酒糖酵母ELO1描述為中等鏈酰基延伸酶，其催化不飽和C12-C16脂肪?；?CoAs在羧基末端延伸為C16-C18脂肪酸。
基于上文報(bào)道的同源性，SEQ ID NO55的解脂耶氏酵母基因產(chǎn)物在此命名為“延伸酶3”或“ELO3”。
分析部分脂肪酸延伸酶cDNA序列(SEQ ID NO55)表明，5’和3’末端都是不完整的。為了獲得缺失的高山被孢霉ELO3的3’區(qū)，采用了Clontech Universal GenomeWalkerTM試劑盒(如實(shí)施例17的描述)。具體地，在第一輪PCR中采用了與上文所述相同的一組四種連接混合物，采用了相同的成分和條件，不同之處是將MA Elong 3’1(SEQ ID NO312)和AP1用作引物(即代替引物MGPAT-5-1A和AP1)。第二輪PCR采用MA Elong 3’2(SEQ ID NO313)和AP2作為引物。從第二輪PCR獲得了1042bp DNA片段(SEQ ID NO56)。純化該片段，克隆到pCR2.1-TOPO中并測(cè)序。序列分析表明該片段含有ELO3的3’末端，包括基因的‘TAA’終止密碼子下游的約640bp。
也采用與用于Clontech 3’-末端RACE(上文)中相同的一組四種連接混合物獲得了高山被孢霉ELO3的5’末端區(qū)。具體地，進(jìn)行了采用與上文所述相同的成分和條件的第一輪PCR，不同之處是將MAElong 5’1(SEQ ID NO314，在5’末端嵌套)和AP1用作引物(即代替引物MA Elong 3’1和AP1)。第二輪PCR采用MA Elong 5’2(SEQID NO315，在5’末端嵌套)和AP2作為引物。獲得了2223bp DNA片段(SEQ ID NO57)。對(duì)其進(jìn)行純化，克隆到pCR2.1-TOPO中并測(cè)序。序列分析顯示它含有ELO3基因的5’區(qū)。
這樣，通過(guò)組合最初的部分cDNA序列(SEQ ID NO55)和通過(guò)基因組步移獲得的5’和3’序列(分別是SEQ ID NOs57和56，圖示于圖17)，獲得了高山被孢霉ELO3(SEQ ID NO53)的完整cDNA序列。這產(chǎn)生了3557bp的序列，在此鑒定為SEQ ID NO58，其包含ELO3的推定的‘ATG’翻譯起始密碼子上游的2091bp；828bpELO3 ORF(即SEQ ID NO53，相應(yīng)于SEQ ID NO58的堿基2092-2919)；和ELO3終止密碼子的下游的638 bp(相應(yīng)于SEQ IDNO58的堿基2920-3557)。
高山被孢霉ELO3的相應(yīng)基因組序列比SEQ ID NO58中提供的cDNA片段長(zhǎng)。具體地，發(fā)現(xiàn)在ORF的318bp處含有ELO3基因的基因組DNA中存在542bp內(nèi)含子(SEQ ID NO59)；因此，在此提供于SEQ ID NO60中的基因組DNA片段是4,099bp(圖17)。
基于BLAST程序分析，翻譯的ELO3蛋白序列(SEQ ID NO54)具有以下同源性與來(lái)自白色假絲酵母SC5314的可能的脂肪酸延伸酶(GenBank獲取號(hào)EAL04510.1)具有37％同一性和51％相似性，預(yù)期值是4e-43。此外，翻譯的ELO3與來(lái)自粗糙鏈孢霉的XP_331368(在此標(biāo)注為“假定蛋白”)的蛋白序列具有33％同一性和44％相似性，預(yù)期值是3e-44。
構(gòu)建包含F(xiàn)BAIN::ELO3::PEX16-3’嵌合基因的質(zhì)粒pZUF6S-E3WT 如下克隆高山被孢霉脂肪酸ELO3 ORF。用引物MA Elong 5’NcoI 3和MA Elong 3’NotI(SEQ ID NOs316和317)通過(guò)PCR從高山被孢霉cDNA(實(shí)施例13)擴(kuò)增ELO3 ORF。反應(yīng)混合物包含1μl cDNA、每種引物各1μl、22μl水和25μl ExTaq預(yù)混合2X TaqPCR溶液(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)。如下進(jìn)行擴(kuò)增在94℃初步變性30sec，隨后32個(gè)下述循環(huán)在94℃變性30sec，在55℃退火30sec，在72℃延伸120sec。進(jìn)行在72℃ 10min的最終延伸循環(huán)，然后在4℃終止反應(yīng)。從PCR反應(yīng)得到約830bp DNA片段。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用Qiagen(Valencia，CA)PCR純化試劑盒純化該片段。將純化的PCR產(chǎn)物分成兩個(gè)等分物，用NcoI和NspI消化一個(gè)等分物，用NspI和NotI消化另一個(gè)等分物。通過(guò)三段連接，將約270bp NcoI-NspI和約560bp NspI-NotI片段克隆到Nco I-Not I切割的pZF5T-PPC載體(圖11C；SEQ ID NO122)中，使得基因處于自主復(fù)制的載體中解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子和PEX16-3’終止子區(qū)(GenBank獲取號(hào)U75433)的控制下，以便在解脂耶氏酵母中表達(dá)。通過(guò)微量制備物分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pZF5T-PPC-E3”(SEQ ID NO144)。
用ClaI和PacI消化質(zhì)粒pZF5T-PPC-E3，用Qiagen凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠純化約2.2kB的條帶(即FBAIN::ELO3::PEX16-3’片段)。將該片段克隆到ClaI-PacI切割的pZUF6S(圖18A；SEQ ID NO145)中，其是一種自主復(fù)制的質(zhì)粒，含有FBAIN啟動(dòng)子和Pex20-3’終止子(即FBAIN::D6S::Pex20嵌合基因)控制下的高山被孢霉Δ6去飽和酶ORF(“D6S”；GenBank獲取號(hào)AF465281)和Ura3基因。通過(guò)微量制備物分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pZUF6S-E3WT”(圖18B；SEQ ID NO146)。
分析超量表達(dá)高山被孢霉ELO3的轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母中的脂質(zhì)組成 根據(jù)一般方法，用質(zhì)粒pZUF6S(對(duì)照，包含F(xiàn)BAIN::D6S::Pex20嵌合基因)和質(zhì)粒pZUF6S-E3WT(包含F(xiàn)BAIN::D6S::Pex20嵌合基因和FBAIN::ELO3::PEX16嵌合基因)轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株Y2031(實(shí)施例53)。使轉(zhuǎn)化體在添加了氨基酸的合成MM中生長(zhǎng)2天，然后在HGM中生長(zhǎng)4天?；贕C分析(如一般方法中所述)，下表38示出了6個(gè)含有pZUF6S的克隆(1-6號(hào)克隆，來(lái)自單次轉(zhuǎn)化)和22個(gè)含有pZUF6S-E3WT的克隆(來(lái)自4次不同的轉(zhuǎn)化[即3、5、6和7號(hào)])的脂肪酸譜。脂肪酸鑒定為16:0(棕櫚酸)、16:1(棕櫚油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)和GLA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表38 經(jīng)過(guò)工程化而超量表達(dá)高山被孢霉ELO3的耶氏酵母菌株Y2031中的脂質(zhì)組成
一些樣品(以粗體和斜體標(biāo)出)偏離預(yù)期讀數(shù)。具體地，Y2031+pZUF6S-E3WT #3-3和Y2031+pZUF6S-E3WT #5-6都不生產(chǎn)GlA。類似地，Y2031+pZUF6S-E3WT #7-1、#7-3和#7-4具有GC誤差，其中GC讀出的16:0和16:1峰是單峰。由于這些變異結(jié)果，表39報(bào)道了對(duì)照和表達(dá)ELO3的轉(zhuǎn)化菌株中的平均脂質(zhì)。具體地，表39示出了表38中的脂肪酸譜的平均值，當(dāng)計(jì)算這些平均值時(shí)，沒(méi)有包括表38中用粗體和斜體表示的有錯(cuò)誤的行?！翱侰16”表示16:0和16:1的平均值的和，而“總C18”表示18:0、18:1、18:2和GLA的平均值的和。
表39 經(jīng)過(guò)工程化而超量表達(dá)高山被孢霉ELO3的耶氏酵母菌株Y2031中的脂質(zhì)組成
基于上面報(bào)道的數(shù)據(jù)，當(dāng)與解脂耶氏酵母菌株Y2031中的高山被孢霉Δ6去飽和酶共表達(dá)時(shí)，相對(duì)于僅僅超量表達(dá)高山被孢霉Δ6去飽和酶的Y2031的對(duì)照菌株，高山被孢霉ELO3的超量表達(dá)導(dǎo)致C18的百分比增加，C16的百分比減少。這表明高山被孢霉ELO3實(shí)際上是C16/18脂肪酸延伸酶。
實(shí)施例19 耶氏酵母C16/18脂肪酸延伸酶“YE2”增加PUFAs百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)解脂耶氏酵母C16/18脂肪酸延伸酶(“YE2”；SEQ ID NO62)的解脂耶氏酵母菌株Y2031(實(shí)施例5)中GLA生物合成和積累的增加。認(rèn)為YE2延伸酶可以促使碳流入工程化的Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑，作為增加需要的PUFA即ARA的生產(chǎn)的手段。例如，包含該C16/18脂肪酸延伸酶的嵌合基因可以容易地導(dǎo)入例如菌株Y2034、Y2047或Y2214中。
解脂耶氏酵母C16/18脂肪酸延伸酶的序列鑒定 采用大鼠Elo2 C16/18脂肪酸延伸酶蛋白序列(GenBank獲取號(hào)AB071986；SEQ ID NO51)作為詢問(wèn)序列，通過(guò)序列比較鑒定了來(lái)自解脂耶氏酵母的新的脂肪酸延伸酶候選物。具體地，用這種rElo2詢問(wèn)序列檢索GenBank和“Yeast project Genolevures”的公共解脂耶氏酵母蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(Center for Bioinformatics，LaBRI，TalenceCedex，F(xiàn)rance)(也參見(jiàn)Dujon，B.et al.，Nature 430(6995)35-44(2004))。這導(dǎo)致鑒定了標(biāo)注為“未命名蛋白產(chǎn)物”的同源序列，即GenBank獲取號(hào)CAG77901(SEQ ID NOs61和62)。該基因命名為YE2。
用BLAST算法(Altschul，S.F.，et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))比較耶氏酵母YE2氨基酸序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)最相似的已知氨基酸序列是來(lái)自白色假絲酵母SC5314的氨基酸序列(SEQ ID NO63，GenBank獲取號(hào)EAL04510)，其標(biāo)注為可能的脂肪酸延伸酶。這種蛋白具有約40％同一性，評(píng)分為236，E值為7e-61。
分離耶氏酵母YE2基因 采用耶氏酵母基因組DNA作為模板，寡核苷酸YL597和YL598(SEQ ID NOs318和319)作為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增YE2基因的編碼區(qū)。按照一般方法的描述，在50μl總體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)。熱循環(huán)儀條件設(shè)定為35個(gè)循環(huán)的95℃ 1min、56℃ 30sec、72℃ 1min，然后72℃下最終延伸10min。純化YE2編碼區(qū)的PCR產(chǎn)物，用NcoI/NotI消化，然后與NcoI/NotI消化的pZKUGPYE1-N(下文實(shí)施例20；也參見(jiàn)圖18C，SEQ ID NO147)連接在一起，得到pZKUGPYE2(圖18D，SEQ ID NO148)。在“ATG”翻譯起始密碼子周圍加入NcoI位點(diǎn)，使YE2的第二個(gè)氨基酸從L改變?yōu)閂。
按照方向?qū)ZKUGPYE2(含有GPAT啟動(dòng)子和YE2編碼區(qū))的ClaI/NotI片段和含有Aco終止子的NotI/PacI片段(通過(guò)用引物YL325和YL326[SEQ ID NOs371和372]對(duì)ACO 3’終止子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用NotI/PacI消化而制備)與ClaI/PacI消化的載體pZUF6S連接在一起，得到pZUF6YE2。隨后將pZKUT16的ClaI/NcoI片段(含有TEF啟動(dòng)子)和pZUF6YE2的NcoI/PacI片段(含有YE2的編碼區(qū)和Aco終止子)按照方向與ClaI/PacI消化的載體pZUF6S連接在一起，得到pZUF6TYE2(SEQ ID NO149)。
分析超量表達(dá)YE2的轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母中的脂質(zhì)組成 分別用質(zhì)粒pZUF6S(圖18A，SEQ ID NO145)和pZUF6TYE2(SEQ ID NO149)轉(zhuǎn)化耶氏酵母菌株Y2031。這兩種質(zhì)粒的成分描述于表40和41。
表40 質(zhì)粒pZUF6S(SEQ ID NO145)的說(shuō)明 表41 質(zhì)粒pZUF6TYE2(SEQ ID NO149)的說(shuō)明 根據(jù)一般方法，用質(zhì)粒pZUF6S(對(duì)照)和質(zhì)粒pZUF6TYE2轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株2031(實(shí)施例5)。轉(zhuǎn)化體在液體MM中生長(zhǎng)2天?；贕C分析(如一般方法的描述)，8個(gè)均含有pZUF6S或pZUF6YE2的菌落的脂肪酸譜示于下表42。脂肪酸鑒定為16:0(棕櫚酸)、16:1(棕櫚油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)和GLA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表42 用pZUF6S和pZUF6TYE2轉(zhuǎn)化的耶氏酵母菌株Y2031中的脂肪酸組成的比較
GC分析顯示在具有pZUF6S的Y2031轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)了占總脂質(zhì)的約27.1％的C16(C16:0和C16:1)和62.2％的C18(C18:0、C18:1、C18:2和GLA)；在具有pZUF6TYE2的Y2031轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)約21.3％的C16和73.6％的C18。因此，在pZUF6TYE2轉(zhuǎn)化體中，C16的總量減少了約21.4％，C18的總量增加了約18％(與具有pZUF6S的轉(zhuǎn)化體相比)。這些數(shù)據(jù)證明了TE2作為C16/18脂肪酸延伸酶起作用，在耶氏酵母中生產(chǎn)C18脂肪酸。此外，相對(duì)于在pZUF6S轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)的GLA，在pZUF6TYE2轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)多大約12.8％的GLA。這些數(shù)據(jù)表明YE2延伸酶能夠促進(jìn)碳流入工程化PUFA途徑，生產(chǎn)更多的終產(chǎn)物(即GLA)。
實(shí)施例20 耶氏酵母C14/16脂肪酸延伸酶“YE1”增加PUFAs百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)解脂耶氏酵母C14/16脂肪酸延伸酶(“YE1”；SEQ ID NO65)的解脂耶氏酵母菌株Y2031(實(shí)施例5)中GLA生物合成和積累的增加。認(rèn)為YE1延伸酶可以促使碳流入工程化的Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑，作為增加需要的PUFA即ARA的生產(chǎn)的手段。具體地，包含該C14/16脂肪酸延伸酶的嵌合基因可以容易地導(dǎo)入例如菌株Y2034、Y2047或Y2214中。
解脂耶氏酵母C14/16脂肪酸延伸酶的序列鑒定 采用大鼠Elo2 C16/18脂肪酸延伸酶蛋白序列(GenBank獲取號(hào)AB071986；SEQ ID NO51)作為詢問(wèn)序列，按照類似于實(shí)施例19的方法鑒定了來(lái)自解脂耶氏酵母的新的脂肪酸延伸酶候選物。這導(dǎo)致鑒定了標(biāo)注為“未命名蛋白產(chǎn)物”的同源序列，即GenBank獲取號(hào)CAG83378(SEQ ID NOs64和65)。該基因命名為“YE1”。
用BLAST算法(Altschul，S.F.，et al.，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))比較耶氏酵母YE1氨基酸序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)最相似的已知序列是來(lái)自粗糙鏈孢霉的FEN1(GenBank獲取號(hào)CAD70918；SEQ ID NO66)，它是一種與YE1具有約60％同一性的可能的脂肪酸延伸酶。
YE1基因的DNA序列(SEQ ID NO64)具有內(nèi)部NcoI位點(diǎn)。為了在YE1基因的“ATG”翻譯起始密碼子周圍摻入耶氏酵母翻譯基序，采用了兩步策略對(duì)耶氏酵母的完整YE1基因進(jìn)行PCR。具體地，采用耶氏酵母基因組DNA作為模板，采用寡核苷酸YL567和YL568(SEQ ID NOs320和321)作為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增YE1的前一半，而用寡核苷酸YL569和YL570(SEQ ID NOs322和323)作為引物類似地?cái)U(kuò)增YE1基因的后一半。按照一般方法的描述，在50μl總體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)。熱循環(huán)儀條件設(shè)定為35個(gè)循環(huán)的95℃ 1min、56℃ 30sec、72℃ 1min，然后72℃下最終延伸10min。純化相應(yīng)于YE1的5’部分的PCR產(chǎn)物，然后用NcoI和SacI消化，得到Y(jié)E1-1片段，同時(shí)純化YE1的3’部分的PCR產(chǎn)物，用SacI和NotI消化，得到Y(jié)E1-2片段。直接將YE1-1和YE1-2片段連接于NcoI/NotI消化的pZKUGPE1S(上文，實(shí)施例11)，得到pZKUGPYE1(圖19A，SEQ ID NO150)。然后用pZKUGPYE1作為模板，寡核苷酸YL571和YL572(SEQ ID NOs324和325)作為引物，通過(guò)定點(diǎn)誘變對(duì)YE1的內(nèi)部NcoI位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到pZKUGPYE1-N(SEQ ID NO147)。序列分析顯示該突變沒(méi)有改變YE1的氨基酸序列。在ATG翻譯起始密碼子周圍加入NcoI位點(diǎn)，使YE1的第二個(gè)氨基酸從S改變?yōu)锳。
將pZF5T-PPC的ClaI/NcoI片段(含有FBAIN啟動(dòng)子)和pZKUGPYE1-N的NcoI/PacI片段(含有YE1的編碼區(qū)和Aco終止子)按照方向與ClaI/PacI消化的載體pZUF6S連接在一起，得到pZUF6FYE1(SEQ ID NO151)。
分析超量表達(dá)YE1的轉(zhuǎn)化的解脂耶氏酵母中的脂質(zhì)組成 將包含解脂耶氏酵母YE1 ORF的嵌合基因克隆到質(zhì)粒pZUF6中，使得可以通過(guò)轉(zhuǎn)化的耶氏酵母菌株中脂肪酸組成的GC分析確定基因超量表達(dá)的作用。具體地，對(duì)照質(zhì)粒pZUF6S(圖18A；SEQ IDNO145；包含F(xiàn)BAIN::D6S::Pex20嵌合基因)的成分描述于實(shí)施例19；而pZUF6FYE1(圖19B；SEQ ID NO151，包含F(xiàn)BAIN::D6S::Pex20嵌合基因和FBAIN::YE1::Aco嵌合基因)的成分描述于下表43。
表43 質(zhì)粒pZUF6FYE1(SEQ ID NO151)的說(shuō)明 轉(zhuǎn)化后，使轉(zhuǎn)化體在添加了氨基酸的合成MM中生長(zhǎng)2天，然后在HGM中生長(zhǎng)4天。基于GC分析(如一般方法中所述)，下表55示出了6個(gè)含有pZUF6S的克隆和5個(gè)含有pZUF6FYE1的克隆的脂肪酸譜。脂肪酸鑒定為16:0(棕櫚酸)、16:1(棕櫚油酸)、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)和GLA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表44 用pZUF6S和pZUF6FYE1轉(zhuǎn)化的耶氏酵母菌株Y2031中的脂肪酸組成的比較
GC分析測(cè)量出在具有pZUF6S的Y2031轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)占總脂質(zhì)的約31.1％的C16(C16:0+C16:1)，而在具有pZUF6FYE1的Y2031轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)約39.6％的C16。與具有pZUF6S的轉(zhuǎn)化體相比，在pZUF6FYE1轉(zhuǎn)化體中的C16總量增加約26.7％。因此，這些數(shù)據(jù)證明YE1作為C14/16脂肪酸延伸酶起作用，在耶氏酵母中生產(chǎn)C16脂肪酸。此外，在pZUF6FYE1轉(zhuǎn)化體中生產(chǎn)的GLA比在pZUF6S轉(zhuǎn)化體中多57％，表明YE1延伸酶能夠促使碳流入工程化的途徑，以生產(chǎn)更多的終產(chǎn)物(即GLA)。
實(shí)施例21 解脂耶氏酵母CPT1超量表達(dá)增加PUFAs的百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而超量表達(dá)解脂耶氏酵母CPT1 cDNA(SEQ ID NO109)的解脂耶氏酵母菌株Y2067U(實(shí)施例10)中EPA生物合成和積累的增加。也增加了導(dǎo)致EPA合成的PUFAs。認(rèn)為如果類似地共表達(dá)解脂耶氏酵母CPT1(如在菌株Y2034、Y2047或Y2214中)，則經(jīng)過(guò)工程化以通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑生產(chǎn)ARA的解脂耶氏酵母宿主菌株能夠證明ARA生物合成和積累的增加。
用以下程序制備解脂耶氏酵母菌株ATCC #20326 cDNA。在30℃，使細(xì)胞在200mL YPD培養(yǎng)基(2％細(xì)菌用酵母提取物，3％細(xì)菌用肽胨，2％葡萄糖)中生長(zhǎng)1天，然后通過(guò)在Beckman GH3.8轉(zhuǎn)子中3750rpm離心10min而沉淀細(xì)胞，并用HGM洗滌兩次。將洗滌的細(xì)胞重懸于200mL HGM中，30℃下再生長(zhǎng)4hrs。然后通過(guò)在4x50mL試管中3750rpm離心10min，收獲細(xì)胞。
用Qiagen Rneasy總RNA Midi試劑盒分離總RNA。為了破碎細(xì)胞，將收獲的細(xì)胞重懸于4X600μl試劑盒緩沖液RLT(按照制造商的規(guī)定，補(bǔ)加了β-巰基乙醇)中，與等體積的0.5mm玻璃珠在4個(gè)2mL螺帽試管中混合。用Biospec微珠攪拌機(jī)在勻漿設(shè)置下將細(xì)胞破碎2min。加入額外的4 x 600μl緩沖液RLT。通過(guò)離心除去玻璃珠和細(xì)胞碎屑，根據(jù)制造商的方案用上清液分離總RNA。
按照制造商的方案，用Qiagen Oligotex mRNA純化試劑盒從上面的總RNA樣品分離聚A(+)RNA。用相同的試劑盒對(duì)分離的聚A(+)RNA再進(jìn)行一輪純化，以確保mRNA樣品的純度。最終的純化的聚(A)+RNA的濃度為30.4ng/μl。
按照實(shí)施例13的描述用BD-Clontech規(guī)定的LD-PCR法和0.1μg聚A(+)RNA樣品制備cDNA，不同之處是用于第一鏈cDNA合成的PCR熱循環(huán)儀條件設(shè)定為95℃ 20sec，然后是20個(gè)循環(huán)的95℃ 5sec和68℃ 6min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。
如下克隆解脂耶氏酵母CPT1 cDNA。用引物CPT1-5’-NcoI和CPT1-3’-NotI(SEQ ID NOs326和327)通過(guò)PCR從解脂耶氏酵母的cDNA擴(kuò)增解脂耶氏酵母ORF。反應(yīng)混合物含有0.5μl cDNA、每種引物各0.5μl、11μl水和12.5μl ExTaq預(yù)混合2X Taq PCR溶液(TaKaRa Bio Inc.，Otsu，Shiga，520-2193，Japan)。按照如下方法進(jìn)行擴(kuò)增最初在94℃變性300sec，然后是30個(gè)循環(huán)的94℃下變性30sec、55℃下退火30sec和72℃下延伸60sec。72℃進(jìn)行最終的延伸循環(huán)10分鐘，然后在4℃終止反應(yīng)。從PCR反應(yīng)獲得了約1190bp DNA片段。根據(jù)制造商的方案，用Qiagen的PCR純化試劑盒對(duì)其進(jìn)行純化。用NcoI和NotI消化純化的PCR產(chǎn)物，克隆到Nco I-NotI切割的pZUF17載體(SEQ ID NO118；圖8B)中，使得基因處于解脂耶氏酵母FBAIN啟動(dòng)子和PEX20-3’終止子區(qū)控制下。通過(guò)微量制備物分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pYCPT1-17”(SEQ ID NO152)。
為了將嵌合FBAIN::CPT1::PEX20基因整合到解脂耶氏酵母的基因組中，通過(guò)用NcoI和NotI消化pYCPT1-17，并且分離含有CPT1ORF的約1190bp片段而建立質(zhì)粒pYCPT1-ZP217。然后將該片段克隆到NcoI和NotI消化的pZP217+Ura(SEQ ID NO153)中。如圖19C所示，質(zhì)粒pZP217+Ura是一種解脂耶氏酵母整合質(zhì)粒，包含嵌合的TEF::合成Δ17去飽和酶(針對(duì)解脂耶氏酵母進(jìn)行了密碼子優(yōu)化)::Pex20-3’基因和用作選擇標(biāo)記的Ura3基因。通過(guò)微量制備物分析證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pYCPT1-ZP217”(SEQ IDNO154)。
根據(jù)一般方法，分別用BssHII/BbuI消化的pYCPT1-ZP217和pZUF-MOD-1(上文實(shí)施例14)轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母菌株Y2067U(來(lái)自實(shí)施例10)。使轉(zhuǎn)化體在添加了氨基酸的合成MM中生長(zhǎng)2天，然后在HGM中生長(zhǎng)4天?；贕C分析(如一般方法中所述)，下表示出了兩個(gè)含有pZUF-MOD-1的轉(zhuǎn)化體和基因組中整合了pYCPT1-ZP217的4個(gè)轉(zhuǎn)化體的脂肪酸譜。脂肪酸鑒定為18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ARA、ETA和EPA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表45 經(jīng)過(guò)工程化而超量表達(dá)解脂耶氏酵母CPT1的耶氏酵母菌株Y2067U中的脂質(zhì)組成
如上所示，通過(guò)基因組整合，強(qiáng)FBAIN啟動(dòng)子控制下的解脂耶氏酵母CPT1的表達(dá)使EPA百分比從“對(duì)照”菌株中的13.4％增加到15.7-16％。此外，也增加了GLA、DGLA和ARA水平。
實(shí)施例22 啤酒糖酵母ISC1增加PUFAs百分比 本實(shí)施例描述經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化而共表達(dá)啤酒糖酵母ISC1基因(SEQ IDNO111)的解脂耶氏酵母菌株M4(實(shí)施例4)中EPA生物合成和積累的增加。認(rèn)為如果類似地共表達(dá)啤酒糖酵母ISC1(如在菌株Y2034、Y2047或Y2214中)，則經(jīng)過(guò)工程化以通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑生產(chǎn)EPA的解脂耶氏酵母宿主菌株能夠證明EPA生物合成和積累的增加。
如下將啤酒糖酵母ISC1ORF克隆到質(zhì)粒pZP217+Ura中。首先，用來(lái)自啤酒糖酵母菌株S288C(Promega，Madison，WI)的基因組DNA以及引物對(duì)Isc1F和Isc1R(SEQ ID NOs328和329)PCR擴(kuò)增ORF。引物Isc1F將擴(kuò)增的ORF中的ISC1的野生型5’序列從‘ATGTACAA’修飾為‘ATGGACAA’，因?yàn)楸匦钃饺隢coI位點(diǎn)從而使ISC1符合讀碼框。按照如下方法進(jìn)行擴(kuò)增最初在94℃變性120sec，然后是35個(gè)循環(huán)的94℃下變性30sec、50℃下退火30sec和68℃下延伸120sec。68℃進(jìn)行最終的延伸循環(huán)10分鐘，然后在4℃終止反應(yīng)。從ISC1的PCR反應(yīng)獲得了1455bp DNA片段，用1％瓊脂糖凝膠(120V，30min)和來(lái)自Invitrogen(Carlsbad，CA)的1kB DNA標(biāo)準(zhǔn)物通過(guò)電泳證實(shí)了PCR產(chǎn)物大小。
根據(jù)制造商的說(shuō)明，用來(lái)自Zymo Research Corporation(Orange，CA)的DNA Clean & Concentrator-5試劑盒純化DNA。然后將ISC1片段分別克隆到NcoI和NotI消化的pZP217+Ura(SEQ IDNO153；圖19C)中。通過(guò)凝膠電泳證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pTEF::ISC1”(SEQ ID NO155)。因此，該質(zhì)粒包含DNA盒，該DNA盒包含3’-POX2、URA3、TEF::ISC1::Pex20和POX2啟動(dòng)子區(qū)。
如下制備“對(duì)照”載體。首先，用來(lái)自啤酒糖酵母菌株S288C的基因組DNA和引物對(duì)Pcl1F和Pcl1R(SEQ ID NOs330和331)PCR擴(kuò)增啤酒糖酵母pcl1 ORF(編碼參與進(jìn)入有絲分裂細(xì)胞周期和調(diào)節(jié)形態(tài)發(fā)生的蛋白)。按照上文的描述進(jìn)行擴(kuò)增。從pcl1的PCR反應(yīng)獲得861bp DNA片段(通過(guò)上文描述的電泳證實(shí))。用DNA Clean &Concentrator-5試劑盒純化DNA，然后用NcoI/NotI消化。然后將片段克隆到相似消化的pZP217+Ura中。通過(guò)凝膠電泳證實(shí)正確的轉(zhuǎn)化體，得到的質(zhì)粒命名為“pTEF::pcl1”。然后用HincII消化質(zhì)粒pTEF::plc1，除去pcl1ORF。重新連接得到的質(zhì)粒，使得用AscI/SphI消化后得到包含3’-POX2、URA3、TEF::Pex20和POX2啟動(dòng)子區(qū)的線性DNA盒。
分別用Asc1/Sph1消化的pTEF::ISC1和“對(duì)照”轉(zhuǎn)化感受態(tài)解脂耶氏酵母菌株M4細(xì)胞(來(lái)自實(shí)施例4)(其中每種質(zhì)粒各5μg進(jìn)行了消化)。用Frozen EZ Yeast Transformation II試劑盒(ZymoResearch)完成轉(zhuǎn)化，在包含不含氨基酸的YNB(6.7g/L；Becton，Dickinson and Co.，Sparks，MD[目錄號(hào)291940])、葡萄糖(20g/L)和瓊脂(20g/L)的平板上選擇轉(zhuǎn)化體。獲得了幾百個(gè)轉(zhuǎn)化的菌落。采用來(lái)自ISC1的5個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體的基因組DNA，通過(guò)PCR證實(shí)了每個(gè)DNA盒整合到解脂耶氏酵母POX2基因座中。
使轉(zhuǎn)化體在不含氨基酸、含有2％葡萄糖的YNB中生長(zhǎng)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，重懸于包含100g/L右旋糖、2g/L MgSO4和50mM pH 6.5的磷酸緩沖液的培養(yǎng)基中，再生長(zhǎng)5天。通過(guò)離心收集來(lái)自0.75mL每種培養(yǎng)物的細(xì)胞，分析它們的脂肪酸組成?；贕C分析(如一般方法中所述)，下文示出了3個(gè)含有“對(duì)照”載體的轉(zhuǎn)化體和5個(gè)含有pTEF::ISC1的轉(zhuǎn)化體的脂肪酸譜。脂肪酸鑒定為16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ARA、ETA和EPA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表46 經(jīng)過(guò)工程化而超量表達(dá)啤酒糖酵母ISC1的耶氏酵母菌株M4中的脂質(zhì)組成
啤酒糖酵母ISC1基因的表達(dá)使EPA的百分比從“對(duì)照”菌株中的9.3％增加到10.7％(“M4+pTEF::ISC1”)，代表增加了14.5％。
實(shí)施例23 制備解脂耶氏酵母?；D(zhuǎn)移酶敲除體 本實(shí)施例描述了建立解脂耶氏酵母的單、雙和三敲除菌株，所述菌株中破壞了PDAT、DGAT2、DGAT1、PDAT和DGAT2、PDAT和DGAT1、DGAT1和DGAT2，或PDAT、DGAT1和DGAT2基因。證實(shí)了每個(gè)敲除菌株中基因的破壞，通過(guò)實(shí)施例24中的總脂質(zhì)的GC分析確定了每個(gè)破壞對(duì)脂肪酸含量和組成的影響。
靶向破壞解脂耶氏酵母DGAT2基因 通過(guò)用稱作質(zhì)粒pY21DGAT2的靶向盒對(duì)內(nèi)源DGAT2基因的同源重組-介導(dǎo)的替換，進(jìn)行解脂耶氏酵母ATCC #90812中的DGAT2基因的靶向破壞。pY21DGAT2源自質(zhì)粒pY20(圖19D；SEQ ID NO156)。具體地，通過(guò)將570bp Hind III/Eco RI片段插入類似地線性化的pY20，制備pY21DGAT2。570bp DNA片段含有(按5’至3’方向)3’同源序列位置+1090至+1464(SEQ ID NO89的編碼序列(ORF))，Bgl II限制位點(diǎn)和5’同源序列位置+906至+1089(SEQ IDNO89所示的編碼序列(ORF))。分別使用兩對(duì)PCR引物P95和P96(SEQ ID NO332和333)和P97和P98(SEQ ID NO334和335)，通過(guò)PCR擴(kuò)增制備片段。
通過(guò)Bgl II限制消化，將pY21DGAT2線性化，并轉(zhuǎn)化進(jìn)對(duì)數(shù)中期解脂耶氏酵母ATCC #90812細(xì)胞，如一般方法中所述。將細(xì)胞鋪板到Y(jié)PD潮霉素選擇平板，并在30℃維持2-3天。
分離14個(gè)解脂耶氏酵母ATCC #90812潮霉素-抗性菌落，通過(guò)PCR篩選靶向破壞。一組PCR引物(P115和P116[分別是SEQ IDNO336和337])用于在同源重組后擴(kuò)增特異性的連接片段。另一對(duì)PCR引物(P115和P112[SEQ ID NO338])用于檢測(cè)天然基因。
ATCC #90812菌株的14個(gè)潮霉素-抗性菌落中的2個(gè)是對(duì)連接片段陽(yáng)性的，且對(duì)天然片段陰性的。因而，在這2個(gè)菌株中證實(shí)了靶向整合，其中之一命名為“S-D2”。
靶向破壞解脂耶氏酵母PDAT基因 通過(guò)用稱作pLV13(圖19E；SEQ ID NO157)的靶向盒對(duì)內(nèi)源PDAT基因的同源重組-介導(dǎo)的替換，進(jìn)行解脂耶氏酵母ATCC#90812中的PDAT基因的靶向破壞。pLV13源自質(zhì)粒pY20(圖19D；SEQ ID NO156)。具體地，通過(guò)將992bp Bam HI/Eco RI片段插入類似地線性化的pLV5，制備pLV13。992bp DNA片段含有(按5’至3’方向)3’同源序列位置+877至+1371(SEQ ID NO76的編碼序列(ORF))，Bgl II限制位點(diǎn)和5’同源序列位置+390至+876(SEQID NO76的編碼序列(ORF))。分別使用PCR引物P39和P41(SEQ ID NO339和340)和P40和P42(SEQ ID NO341和342)，通過(guò)PCR擴(kuò)增制備片段。
通過(guò)Bgl II限制消化，將pLV13線性化，并根據(jù)一般方法轉(zhuǎn)化進(jìn)對(duì)數(shù)中期解脂耶氏酵母ATCC #90812細(xì)胞。將細(xì)胞鋪板到Bio101DOB/CSM-Ura選擇平板，并在30℃維持2-3天。
分離10個(gè)解脂耶氏酵母ATCC #90812菌落，通過(guò)PCR篩選靶向破壞。一組PCR引物(P51和P52[分別是SEQ ID NO343和344])設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增靶向盒。另一組PCR引物(P37和P38[分別是SEQ IDNO345和346])設(shè)計(jì)用于檢測(cè)天然基因。10個(gè)菌株中的10個(gè)都是對(duì)連接片段陽(yáng)性的，且10個(gè)菌株中的3個(gè)是對(duì)天然片段陰性的，因而，在這3個(gè)菌株中證實(shí)了成功的靶向整合。這些菌株之一命名為“S-P”。
解脂耶氏酵母DGAT1基因的靶向破壞 使用簡(jiǎn)并PCR引物P201和P203(分別是SEQ ID NO347和348)和解脂耶氏酵母ATCC #76982基因組DNA作為模板，通過(guò)PCR克隆全長(zhǎng)Yl DGAT1 ORF。需要簡(jiǎn)并引物，因?yàn)椴恢谰幋aYl DGAT1的核苷酸序列。
在RoboCycler Gradient 40 PCR儀中進(jìn)行PCR，按照如下進(jìn)行擴(kuò)增95℃下初步變性1min，然后是30個(gè)循環(huán)的95℃下變性30sec、55℃下退火1min和72℃下延伸1min。72℃進(jìn)行最終的延伸循環(huán)10分鐘，然后在4℃終止反應(yīng)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)期的PCR產(chǎn)物(約1.6kB)，分離，純化，克隆進(jìn)

克隆載體(Invitrogen)，并部分地測(cè)序，以證實(shí)它的身份。
通過(guò)靶向盒對(duì)內(nèi)源DGAT1基因的同源重組-介導(dǎo)的替換，進(jìn)行解脂耶氏酵母ATCC #90812中的推定DGAT1基因的靶向破壞(采用上文對(duì)DGAT2描述的方法)。具體地，將1.6kB分離的Yl DGAT1 ORF(SEQ ID NO81)用作PCR模板分子，構(gòu)建由下述組分組成的YlDGAT1靶向盒5’同源Yl DGAT1序列(用引物P214和P215(SEQID NOs349和350)擴(kuò)增)、耶氏酵母亮氨酸2(Leu2；GenBank獲取號(hào)AAA35244)基因，和3’同源Yl DGAT1序列(用引物P216和P217(SEQ ID NOs351和352)擴(kuò)增)。用Pfu Ultra聚合酶(Stratagene，目錄號(hào)600630)和上文所述熱循環(huán)儀條件擴(kuò)增靶向盒的每個(gè)單獨(dú)部分后，純化每個(gè)片段。將3個(gè)正確大小的、純化的片段混合到一起，作為使用PCR引物P214和P219(SEQ ID NO353)的第二個(gè)PCR反應(yīng)的模板分子，得到Y(jié)l DGAT1破壞盒。
凝膠純化靶向盒，并用于轉(zhuǎn)化對(duì)數(shù)中期野生型解脂耶氏酵母(ATCC #90812)。如一般方法中所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化體鋪板到Bio101 DOB/CSM-Leu選擇平板上，并在30℃維持2-3天。通過(guò)PCR篩選幾種亮氨酸原養(yǎng)型，以證實(shí)靶向的DGAT1破壞。具體地，一組PCR引物(P226和P227[SEQ ID NO354和355])用于擴(kuò)增破壞盒和天然靶基因之間的連接。另一組PCR引物(P214和P217[SEQ IDNO349和352])用于檢測(cè)天然基因。
所有亮氨酸原養(yǎng)型菌落都是對(duì)連接片段陽(yáng)性的，且是對(duì)天然片段陰性的，因而，在這些菌株中證實(shí)了靶向整合，其中之一命名為“S-D1”。
建立含有PDAT和/或DGAT2和/或DGAT1基因破壞的解脂耶氏酵母雙敲除和三敲除菌株 用質(zhì)粒pLV13(含有PDAT破壞)轉(zhuǎn)化解脂耶氏酵母ATCC #90812潮霉素抗性“S-D2”突變體(含有DGAT2破壞)，按照對(duì)單個(gè)PDAT破壞的描述，通過(guò)PCR篩選轉(zhuǎn)化體。證明12個(gè)轉(zhuǎn)化體中的兩個(gè)在DGAT2和PDAT基因中都有破壞。這些菌株之一命名為“S-D2-P”。
類似地，制備了在DGAT1和PDAT(“S-D1-P”)中、在DGAT2和DGAT1(“S-D2-D1”)中具有雙敲除、以及在DGAT2、DGAT1和PDAT中具有三敲除的菌株(“S-D2-D1-P”)。
實(shí)施例24 解脂耶氏酵母?；D(zhuǎn)移酶敲除減少脂質(zhì)含量并增加PUFAs百分比 本實(shí)施例分析了酰基轉(zhuǎn)移酶的單和/或雙和/或三敲除在野生型解脂耶氏酵母和以前經(jīng)過(guò)工程化而生產(chǎn)EPA的解脂耶氏酵母菌株中的影響，這是通過(guò)脂肪酸含量和組成而測(cè)量的。認(rèn)為如果類似地操作宿主的天然?；D(zhuǎn)移酶(如在菌株Y2034、Y2047或Y2214中)，則經(jīng)過(guò)工程化以通過(guò)Δ6去飽和酶/Δ6延伸酶途徑或Δ9延伸酶/Δ8去飽和酶途徑生產(chǎn)ARA的解脂耶氏酵母宿主菌株能夠證明ARA生物合成和積累的增加。
具有?；D(zhuǎn)移酶破壞的解脂耶氏酵母ATCC #90812中的TAG含量減少 首先，比較了野生型和突變的解脂耶氏酵母ATCC #90812中的TAG含量，所述突變的解脂耶氏酵母ATCC #90812含有(1)PDAT、DGAT2和DGAT1中的單個(gè)破壞；(2)PDAT和DGAT2、DGAT1和PDAT，以及DGAT1和DGAT2中的雙破壞；和(3)PDAT、DGAT2和DGAT1的三破壞。
具體地，分別將來(lái)自含有野生型和突變的解脂耶氏酵母ATCC#90812(即S-D1、S-D2、S-P、S-D1-D2、S-D1-P、S-D2-P和S-D1-D2-P)的一環(huán)細(xì)胞接種在3mL YPD培養(yǎng)基中，30℃下在搖床(300rpm)上生長(zhǎng)過(guò)夜。收獲細(xì)胞，在0.9％ NaCl中洗滌一次，重懸于50mLHGM中。然后使細(xì)胞在搖床上生長(zhǎng)48小時(shí)。在水中洗滌細(xì)胞，凍干細(xì)胞沉淀。將二十(20)mg干細(xì)胞量用于通過(guò)GC分析總脂肪酸和TLC(下文)和GC分析后的油級(jí)分。
在下面的5個(gè)步驟中，描述了TLC使用的方法(1)將內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品15:0脂肪酸(10μl 10mg/mL)加入2-3mg干細(xì)胞團(tuán)，然后使用甲醇/氯仿方法提取總脂質(zhì)。(2)使用25-50μl微量吸管，將提取的脂(50μl)印跡到繪在離5 x 20cm硅膠60平板底部約1英寸的光束線上。(3)然后在N2下干燥TLC平板，并插入含有約100mL 80:20:1己烷:乙醚:醋酸溶劑的罐中。(4)分離帶后，將碘蒸汽吹過(guò)平板的一側(cè)，以鑒別帶。這使得能夠使用剃刀刀片刮掉在平板的另一側(cè)上的樣品，用于進(jìn)一步分析。(5)如一般方法中所述，進(jìn)行刮掉的樣品的基礎(chǔ)酯交換和GC分析。
GC結(jié)果示于下表47。將培養(yǎng)物描述為“S”菌株(野生型)，“S-P”(PDAT敲除)，“S-D1”(DGAT1敲除)，“S-D2”(DGAT2敲除)，“S-D1-D2”(DGAT1和DGAT2敲除)，“S-P-D1”(PDAT和DGAT1敲除)，“S-P-D2”(PDAT和DGAT2敲除)和“S-P-D1-D2”(PDAT，DGAT1和DGAT2敲除)。使用的縮寫是“WT”＝野生型；“FAs”＝脂肪酸；“dcw”＝干細(xì)胞重量；并且，“FAs％ dcw，％ WT”＝相對(duì)于野生型中的％的FAs％ dcw，其中“S”菌株是野生型。
表47 在PDAT、DGAT2和DGAT1中具有單個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)破壞的耶氏酵母ATCC #90812菌株的脂含量
表47的結(jié)果表明3種DAG AT對(duì)油生物合成的相對(duì)貢獻(xiàn)。DGAT2的貢獻(xiàn)最大，而PDAT和DGAT1的貢獻(xiàn)相等，但是小于DGAT2。三敲除菌株脂的約3％殘留油含量可能是ARE2(SEQ ID NOs78和79)編碼的解脂耶氏酵母的?；?CoA:甾醇-酰基轉(zhuǎn)移酶的貢獻(xiàn)。
具有破壞的DGAT2基因的菌株EU中的TAG含量減少，EPA百分比增加 檢驗(yàn)野生型解脂耶氏酵母ATCC #90812中的多種?；D(zhuǎn)移酶敲除(上文)的影響后，在EU菌株(即，經(jīng)過(guò)工程化而生產(chǎn)10％ EPA；參見(jiàn)實(shí)施例10)的DGAT2敲除菌株中檢驗(yàn)TAG含量和脂肪酸組成。
具體地，按照實(shí)施例23中對(duì)S菌株(ATCC #90812)的描述，破壞菌株EU中的DGAT2基因。DGAT2破壞的菌株命名為EU-D2。收獲EU和EU-D2菌株，在根據(jù)兩種不同條件生長(zhǎng)后進(jìn)行分析。在下表中稱作“3mL”的條件下，使細(xì)胞在3mL MM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1天，洗滌，然后在3mL HGM中生長(zhǎng)3天。或者，在下表中稱作“51mL”的條件下，使細(xì)胞在51mL MM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1天，洗滌，然后在51mL HGM中生長(zhǎng)3天。在TLC分離后的51mL培養(yǎng)物的提取物(“級(jí)分”)中確定磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和三?；视?TAG或油)的脂肪酸組成。
GC結(jié)果示于下表48。培養(yǎng)物描述為“EU”菌株(野生型)和“EU-D2”菌株(DGAT2敲除)。脂肪酸鑒定為16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ARA、ETA和EPA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。
表48 具有DGAT2破壞的耶氏酵母菌株EU的脂質(zhì)含量和組成
結(jié)果表明DGAT2敲除導(dǎo)致％ EPA(占總脂肪酸的百分比)的加倍和脂質(zhì)含量的減半(表示為％ dcw)。此外，脂含量中觀察到的幾乎所有改變都是由于TAG級(jí)分的改變。菌株EU的51mL培養(yǎng)物中的％ EPA比預(yù)期的少，可能是由于不穩(wěn)定性。
具有破壞的?；D(zhuǎn)移酶基因的解脂耶氏酵母菌株中MU中TAG含量增加，EPA百分比減少 最后，基于菌株EU-D2中單個(gè)DGAT2敲除導(dǎo)致的EPA百分比增加和脂質(zhì)含量減少，在菌株MU(經(jīng)過(guò)工程化而生產(chǎn)14％ EPA，參見(jiàn)實(shí)施例12)的多個(gè)?；D(zhuǎn)移酶敲除菌株中研究了TAG含量和脂肪酸組成。具體地，在菌株MU中，建立了在PDAT、DGAT2和DGAT1中的單個(gè)破壞，和在PDAT和DGAT2中的雙破壞。在4種不同生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)后，比較每個(gè)這樣的菌株的脂含量和組成。
更具體地，使用實(shí)施例23的方法(不同之處是，DGAT1破壞的選擇依賴于URA3基因)，在菌株MU中建立PDAT、DGAT2、DGAT1中的單個(gè)破壞。這會(huì)產(chǎn)生單敲除菌株，分別稱作“MU-D1”(破壞DGAT1)、“MU-D2”(破壞DGAT2)和“MU-P”(破壞PDAT)。通過(guò)PCR證實(shí)各個(gè)敲除菌株。另外，通過(guò)相同方法破壞MU-D2菌株的PDAT基因，并通過(guò)PCR證實(shí)破壞。得到的雙敲除菌株稱作“MU-D2-P”。
分析MU-D1、MU-D2、MU-P和M-D2-P敲除菌株，以確定每個(gè)敲除對(duì)脂含量和組成的影響，如下所述。而且，還使用促進(jìn)含油性的生長(zhǎng)條件，來(lái)確定它們對(duì)總脂含量的影響。因而，共進(jìn)行了4個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)，分別稱作“實(shí)驗(yàn)A”、“實(shí)驗(yàn)B”、“實(shí)驗(yàn)C”和“實(shí)驗(yàn)E”。更具體地，將3環(huán)來(lái)自含有上述每種菌株的平板的細(xì)胞接種進(jìn)MMU[實(shí)驗(yàn)B和C是3mL；實(shí)驗(yàn)A和E是50mL]，并在30℃搖床中生長(zhǎng)24小時(shí)(實(shí)驗(yàn)A，B和C)或48小時(shí)(實(shí)驗(yàn)E)。收獲細(xì)胞，在HGM中洗滌一次，重新懸浮于HGM(實(shí)驗(yàn)A和E是50mL；且實(shí)驗(yàn)B是3mL)或含有尿嘧啶的HGM(“HGMU”)(實(shí)驗(yàn)C是3mL)，并如上培養(yǎng)4天。將一份等分物(1mL)用于根據(jù)一般方法所述的GC脂分析，第二份等分物用于測(cè)定培養(yǎng)物在600nm的OD。收獲實(shí)驗(yàn)A和E的剩余培養(yǎng)物，在水中洗滌一次，凍干，用于干細(xì)胞重量(dcw)測(cè)定。相反地，使用顯示它們的關(guān)系的方程，從它們的OD600，確定實(shí)驗(yàn)B和C的dcw。還測(cè)定了實(shí)驗(yàn)A，B，C和E中的不同菌株各自的脂肪酸組成。
在下面的表49中顯示了結(jié)果。將培養(yǎng)物描述為“MU”菌株(親本EPA生產(chǎn)菌株)，“MU-P”(PDAT敲除)，“MU-D1”(DGAT1敲除)，“MU-D2”(DGAT2敲除)和“MU-D2-P”(DGAT2和PDAT敲除)。使用的縮寫是“WT”＝野生型(即，MU)；“OD”＝光密度；“dcw”＝干細(xì)胞重量；“TFAs”＝總脂肪酸；和，“TFAs％ dcw，％ WT”＝相對(duì)于野生型(“MU”)菌株的TFAs％ dcw。脂肪酸鑒定為16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)、18:2(LA)、GLA、DGLA、ARA、ETA和EPA；每種脂肪酸的組成表示為總脂肪酸的百分比。

數(shù)據(jù)證實(shí)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的脂質(zhì)含量隨生長(zhǎng)條件而變化。而且，每種?；D(zhuǎn)移酶對(duì)脂質(zhì)含量的貢獻(xiàn)也變化。具體地，在實(shí)驗(yàn)B、C和E中，DGAT2對(duì)油生物合成的貢獻(xiàn)大于PDAT或DGAT1。相反地，如實(shí)驗(yàn)A所證實(shí)的，在DGAT2、DGAT1和PDAT中的單敲除會(huì)導(dǎo)致大約相同的脂質(zhì)含量減少(即，分別是減少48％、49％和42％[參見(jiàn)“TFAs％ dcw，％ WT”])。
至于脂肪酸組成，數(shù)據(jù)表明每個(gè)DAG AT基因的敲除導(dǎo)致油含量降低和EPA百分比增加。例如，DGAT2敲除導(dǎo)致大約一半的脂質(zhì)含量以及EPA占脂肪酸的百分比大約加倍(類似于上文菌株EU-D2中觀察到的結(jié)果)。DAGAT2和PDAT都敲除，導(dǎo)致最少的油和最多的EPA百分比。
基于此處報(bào)道的結(jié)果，認(rèn)為天然DGAT2和/或DGAT1和/或PDAT的破壞是顯著降低經(jīng)過(guò)工程化而生產(chǎn)高濃度的PUFAs，包括ARA的解脂耶氏酵母菌株(如在菌株Y2034、Y2047或Y2214中)的PUFAs百分比的有用手段。實(shí)際上，菌株Y2214中天然DGAT2的破壞導(dǎo)致ARA的百分比增加1.7倍(數(shù)據(jù)未示出)。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因
a)至少一種編碼Δ6去飽和酶的基因；
b)至少一種編碼C18/20延伸酶的基因；和
c)至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因。
2.用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因
a)至少一種編碼Δ9延伸酶的基因；
b)至少一種編碼Δ8去飽和酶的基因；和
c)至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因。
3.權(quán)利要求1或2的重組生產(chǎn)宿主，其中該基因集合任選包含至少一種編碼Δ12去飽和酶的基因。
4.權(quán)利要求3的重組生產(chǎn)宿主，其中該背景耶氏酵母種不含任何編碼具有Δ12去飽和酶活性的多肽的天然基因。
5.權(quán)利要求1或2的重組生產(chǎn)宿主，其中所述ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑基因的至少一種基因處于具有選自SEQ ID NOs158-168和364的核酸序列的啟動(dòng)子序列的控制下。
6.權(quán)利要求3的重組生產(chǎn)宿主，其中所述Δ12去飽和酶具有選自SEQ ID NOs24、26、28、30、31、32、34、36、38、358、359、361、362和363的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，其中所述Δ6去飽和酶具有選自SEQ ID NOs2和5的氨基酸序列；并且其中所述C18/20延伸酶具有選自SEQ ID NOs18和21的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求2的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，其中所述Δ9延伸酶具有選自SEQ ID NOs40和18的氨基酸序列，并且其中所述Δ8去飽和酶具有選自SEQ ID NOs45、47和49的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求1或2的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，其中所述Δ5去飽和酶具有選自SEQ ID NOs7、9和12的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1或2的重組生產(chǎn)宿主，其中該基因集合任選包含選自下組的ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑基因
a)至少一種編碼Δ9去飽和酶的基因；
b)至少一種編碼C16/18延伸酶的基因；和
c)至少一種編碼C14/16延伸酶的基因。
11.權(quán)利要求10的重組生產(chǎn)宿主，其中所述C16/18延伸酶具有選自SEQ ID NOs51、54和62的氨基酸序列，并且其中所述C14/16延伸酶具有SEQ ID NO65所示的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求1或2的重組生產(chǎn)宿主，其中該基因集合任選包含至少一種編碼選自下組的?；D(zhuǎn)移酶的基因
(1)二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT1)；
(2)二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT2)；
(3)磷脂二?；视王；D(zhuǎn)移酶(PDAT)；
(4)?；?CoA1-?；苎字Ｄ憠A?；D(zhuǎn)移酶(LPCAT)；
(5)甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)；和
(6)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)。
13.權(quán)利要求12的重組生產(chǎn)宿主，其中所述二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT1)具有選自SEQ ID NOs82和84-88的氨基酸序列；其中所述二?；视王；D(zhuǎn)移酶(DGAT2)具有選自SEQ ID NOs90、92、94和96的氨基酸序列；其中所述磷脂二?；视王；D(zhuǎn)移酶(PDAT)具有SEQ ID NO77所示的氨基酸序列；其中所述甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GPAT)具有SEQ ID NO98所示的氨基酸序列；其中所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)具有選自SEQ ID NOs68、70、72和75的氨基酸序列；并且其中所述?；?CoA1-?；苎字Ｄ憠A酰基轉(zhuǎn)移酶(LPCAT)具有SEQ ID NO80所示的氨基酸序列。
14.用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因
a)至少一種編碼Δ6去飽和酶的基因；
b)至少一種編碼C18/20延伸酶的基因；
c)至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因；
d)至少一種編碼Δ17去飽和酶的基因；和
e)至少一種編碼Δ12去飽和酶的基因；并且
其中所述背景耶氏酵母種不含任何編碼蘋果酸異丙酯脫氫酶(Leu2-)的天然基因。
15.用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因
f)至少一種編碼Δ9延伸酶的基因；
g)至少一種編碼Δ8去飽和酶的基因；
h)至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因；
i)至少一種編碼Δ12去飽和酶的基因；和
j)至少一種編碼C16/18延伸酶的基因；并且
其中所述背景耶氏酵母種不含任何編碼酵母氨酸脫氫酶(Lys5-)的天然基因。
16.用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主細(xì)胞，包括背景耶氏酵母種，其中包含基因集合，所述集合包含ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途徑的以下基因
a)至少一組基因，選自
(1)至少一種編碼Δ6去飽和酶的基因；至少一種編碼C18/20延伸酶的基因；和至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因；
(2)至少一種編碼Δ9延伸酶的基因；至少一種編碼Δ8去飽和酶的基因；和至少一種編碼Δ5去飽和酶的基因；
b)至少一種編碼選自下組的酶的基因
(1)Δ12去飽和酶；
(2)Δ9去飽和酶；
(3)C14/16延伸酶；
(4)C16/18延伸酶；和
c)至少一種編碼選自下組的酶的基因
(i)選自DGAT1、DGAT2和PDAT的二?；视王；D(zhuǎn)移酶；
(ii)?；?CoA1-酰基溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶(LPCAT)；
(iii)甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)；
(iv)溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)；
(v)磷脂酶C；和
(vi)磷脂酶A2；
其中
(1)該背景耶氏酵母種不含任何編碼具有Δ12去飽和酶活性的多肽的天然基因，
(2)該背景耶氏酵母種不含任何編碼選自脂肪酶1(Lip1-)、過(guò)氧化物酶體?；鵆oA氧化酶ACO3(Pox3-)、酰基-CoA氧化酶2(Pox2-)、乳清苷-5’-磷酸脫羧酶(Ura3-)、酵母氨酸脫氫酶(Lys5-)、脂肪酶2(Lip2-)和蘋果酸異丙酯脫氫酶(Leu2-)的酶的天然基因。
17.權(quán)利要求1或2的重組生產(chǎn)宿主，其中該宿主生產(chǎn)的微生物油包含占總脂肪酸的至少約5％的花生四烯酸。
18.權(quán)利要求1或2的重組生產(chǎn)宿主，其中該宿主生產(chǎn)包含花生四烯酸的微生物油，并且該微生物油不含任何γ-亞油酸。
19.生產(chǎn)包含花生四烯酸的微生物油的方法，包括
a)培養(yǎng)權(quán)利要求1或2的宿主，所述宿主中生產(chǎn)包含花生四烯酸的微生物油；和
b)任選回收步驟(a)的微生物油。
20.由權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的微生物油。
21.權(quán)利要求20的微生物油，其中所述油含有至少約5％的花生四烯酸。
22.權(quán)利要求20的混合油，其中所述油包含選自亞油酸、γ-亞麻酸、二十碳二烯酸、二高-γ-亞油酸、花生四烯酸、α-亞麻酸、十八碳四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的脂肪酸。
23.包含有效量的由權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的微生物油的食品。
24.權(quán)利要求23的食品，選自食物類似物、肉類產(chǎn)品、谷物產(chǎn)品、烘烤食品、快餐和乳制品。
25.選自醫(yī)學(xué)食品、飲食補(bǔ)充物、嬰兒配方和藥品的產(chǎn)品，包含有效量的由權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的微生物油。
26.包含有效量的由權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的微生物油的動(dòng)物飼料。
27.權(quán)利要求26的動(dòng)物飼料，其中所述動(dòng)物飼料選自寵物飼料、反芻動(dòng)物飼料、禽類動(dòng)物飼料和水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。
28.包含有效量的微生物油并且任選包含酵母生物物質(zhì)的動(dòng)物飼料，包含權(quán)利要求1或2的重組宿主。
29.權(quán)利要求28的動(dòng)物飼料，其中該酵母生物物質(zhì)包括選自蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和核酸的飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
30.制備補(bǔ)加了花生四烯酸的食品的方法，包括將權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的微生物油與食品組合。
31.制備選自醫(yī)學(xué)食品、飲食補(bǔ)充物、嬰兒配方和藥品的產(chǎn)品的方法，其中該產(chǎn)品補(bǔ)充了花生四烯酸，該方法包括將權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的微生物油與該產(chǎn)品組合。
32.制備補(bǔ)充了花生四烯酸的動(dòng)物飼料的方法，包括將權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的微生物油與動(dòng)物飼料組合。
33.給包含花生四烯酸的動(dòng)物飼料補(bǔ)充飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方法，包括將權(quán)利要求26的動(dòng)物飼料與包含飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的酵母生物物質(zhì)組合。
34.權(quán)利要求33的方法，其中該飼料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)選自蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)和核酸。
35.提供富含花生四烯酸的人、動(dòng)物或水產(chǎn)養(yǎng)殖生物飲食補(bǔ)充物的方法，包括提供權(quán)利要求19的方法生產(chǎn)的含有花生四烯酸的微生物油，該微生物油是可被人或動(dòng)物消耗或使用的形式。
36.用于生產(chǎn)花生四烯酸的重組生產(chǎn)宿主解脂耶氏酵母Y2047，ATCC保藏號(hào)為ATCC______。
全文摘要
描述了能夠生產(chǎn)占總油級(jí)分的10％以上的花生四烯酸(ARA，一種ω-6多不飽和脂肪酸)的含油酵母解脂耶氏酵母的工程化菌株。這些菌株包含多種表達(dá)異源去飽和酶、延伸酶和?；D(zhuǎn)移酶的嵌合基因，任選包含多種天然去飽和酶和?；D(zhuǎn)移酶敲除，從而能夠合成和高度積累ARA。要求保護(hù)生產(chǎn)宿主細(xì)胞和在所述宿主細(xì)胞中生產(chǎn)ARA的方法。
文檔編號(hào)C12N9/10GK101437952SQ200580045910
公開(kāi)日2009年5月20日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月4日
發(fā)明者H·G·達(dá)穆德, P·J·吉利斯, D·J·馬庫(kù)爾, S·K·皮卡塔吉奧, D·M·W·波拉克, J·J·拉希安蒂, 薛志雄, N·S·亞達(dá)夫, 張宏祥, 群 朱 申請(qǐng)人:納幕爾杜邦公司