專(zhuān)利名稱(chēng)：一株新解脂耶氏酵母及其用于生物轉(zhuǎn)化蓖麻油制備γ-癸內(nèi)酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一株新分離的解脂耶氏酵母及其用于生 物轉(zhuǎn)化蓖麻油生產(chǎn)天然Y-癸內(nèi)酯的方法。
背景技術(shù)：
γ-癸內(nèi)酯(gamma decalactone)，又名丙位癸內(nèi)酯，是一種含有五元內(nèi)酯環(huán)的十 碳化合物。1969年，Y-癸內(nèi)酯被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)認(rèn)為是安全的食品添加劑和 藥物添加劑，F(xiàn)DA編號(hào)為172. 515。FEMA編號(hào)為2360，我國(guó)食品添加劑國(guó)標(biāo)GB2760規(guī)定其 為允許使用的食用香料。、-癸內(nèi)酯帶有水果味、桃子味和典型的椰子香氣，香氣較桃醛輕 飄，并以誘人的桃香和低香氣閾值的特性，在香料工業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用，主要用于配制奶 油、桃子、柑橘和椰子等類(lèi)型的香精。Y -癸內(nèi)酯天然存在于桃子、杏仁、草莓等水果中，具有強(qiáng)烈的果香香氣，稀釋時(shí)有 桃子香氣，在成熟的果實(shí)中，含量為15ppb，其中89%的是(R)-異構(gòu)體，11%的是(S)-異構(gòu) 體。大量研究發(fā)現(xiàn)，右旋R型Y-癸內(nèi)酯和左旋S-型Y-癸內(nèi)酯的香氣特征存在明顯差異 左旋S-型Y-癸內(nèi)酯的香氣為柔和的、甜甜的椰奶味，有明顯酯味特點(diǎn)；右旋R型Y-癸內(nèi) 酯為強(qiáng)烈的、脂甜的水果味，類(lèi)似椰子，焦糖味。光學(xué)純的Y-癸內(nèi)酯味道偏甜，清新，有明 顯的水果甜味，不同對(duì)映體間的香氣強(qiáng)度不一樣，右旋體的香氣較濃。Y-癸內(nèi)酯的制備可以通過(guò)天然提取、化學(xué)合成、生物技術(shù)3種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué) 合成的內(nèi)酯主要為無(wú)旋光的外消旋體，化學(xué)合成法反應(yīng)條件一般較劇烈，對(duì)設(shè)備要求較高， 普遍存在環(huán)保問(wèn)題，且產(chǎn)品不是天然的；天然提取雖然可以得到某一光學(xué)異構(gòu)體占優(yōu)勢(shì)的 產(chǎn)品，但技術(shù)復(fù)雜、成本高，因而產(chǎn)品價(jià)格昂貴。生物技術(shù)法具有產(chǎn)品綠色天然、成本低、反 應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小等突出優(yōu)點(diǎn)，有極好的發(fā)展前景。利用生物技術(shù)生產(chǎn)Y -癸內(nèi)酯普遍采用生物轉(zhuǎn)化方法，所利用的底物主要有羥基 脂肪酸、脂肪酸酯和非羥基脂肪酸。菌種主要采用酵母菌，一般選用耶氏酵母(Yarrowia sp.)，假絲酵母(Candida sp.)，鎖擲孢酵母(Sporidiobolus sp.)等菌株。比如，蓖麻油中 的主要組分蓖麻油酸(12-羥基-9-十八碳烯酸，含量在80%以上)在酵母菌的作用下，經(jīng) 過(guò)多步氧化使碳鏈縮短，生成Y-癸內(nèi)酯的直接前體4-羥基癸酸，再環(huán)化生成γ-癸 內(nèi)酯。由于產(chǎn)物Y-癸內(nèi)酯對(duì)酵母細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)化體系中Y-癸內(nèi)酯達(dá)到一定 的濃度后就會(huì)抑制細(xì)胞的活性，從而限制Y-癸內(nèi)酯濃度的提高；另外，在Y-癸內(nèi)酯生成 后會(huì)繼續(xù)氧化而被降解，導(dǎo)致Y-癸內(nèi)酯的得率比較低。但從自然界篩選Y-癸內(nèi)酉旨 生產(chǎn)菌株是一項(xiàng)十分艱巨的工作，篩選到的野生菌株直接用于生產(chǎn)，對(duì)產(chǎn)物Y-癸內(nèi)酯的 耐受性低，產(chǎn)量和產(chǎn)率也非常低，所以國(guó)際上用生物法生產(chǎn)Y-癸內(nèi)酯的技術(shù)尚未成熟。為 提高Y-癸內(nèi)酯的生物轉(zhuǎn)化率，必須采取的相應(yīng)措施之一就是1、通過(guò)菌種誘變和定向選 育方法進(jìn)行育種，2、通過(guò)基因工程技術(shù)手段對(duì)菌株進(jìn)行基因改造，構(gòu)建高產(chǎn)工程菌株。
雖然基因工程菌研究已經(jīng)比較成熟，但出于對(duì)人類(lèi)和環(huán)境影響的擔(dān)憂(yōu)，在使用之 前必須進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，評(píng)估潛在危險(xiǎn)，確定其安全等級(jí)，制定安全控制方法和措施，并報(bào) 國(guó)家相關(guān)部門(mén)備案審批。具有生物活性的基因工程菌，目前還主要是試驗(yàn)性和小范圍應(yīng)用。 雖然還沒(méi)有研究顯示基因工程菌究竟會(huì)對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生們么有害影響，但已有證據(jù)表明轉(zhuǎn)基因 微生物釋放到土壤中，可能會(huì)改變?cè)形⑸锵到y(tǒng)的平衡，所以墓因工程菌的使用范圍被 嚴(yán)格控制；特別是帶有外源性基因的基因工程菌，在使用中是嚴(yán)格限制的。由于采用墓因工 程技術(shù)構(gòu)建的高產(chǎn)基因工程菌存在有一定的安全使用問(wèn)題，故我們采用第一種菌株選育手 段來(lái)獲得高產(chǎn)的優(yōu)良菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)目前市場(chǎng)對(duì)天然綠色產(chǎn)品的需要，以及生物法生產(chǎn)Y -癸內(nèi) 酯產(chǎn)物濃度低、沒(méi)有好的生產(chǎn)菌株等問(wèn)題，提供一株從土壤中篩選分離，經(jīng)紫外誘變、NTG誘 變、DES誘變和鈷60誘變后，通過(guò)脂肪酶活性平板定向篩選獲得的解脂耶氏酵母，并提供用 此菌株生物轉(zhuǎn)化蓖麻油制備天然Y-癸內(nèi)酯的方法。本發(fā)明涉及的酵母名為Yarrowia lipolytica YG，已于2009年8月6日保藏于中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為CCTCC M 209168。上述Yarrowia lipolytica YG CCTCC M 209168菌株的生理生化特征如表1所示。表1 菌株 Yarrowia lipolytica YG CCTCC M 209168 的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一株解脂耶氏酵母，其特征在于該解脂耶氏酵母的菌株名為Yarrowia IipolyticaYG,已于2009年8月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號(hào)為 CCTCCM 209168。該 yarrowia lipolytica YG CCTCC M 209168 菌株的特征是形態(tài)為紡錘 形或圓柱形或梨形，有些母體長(zhǎng)有芽細(xì)胞，連成菌絲；直徑30 100微米，菌落起皺、干乳酪 狀，顏色為乳白色或乳黃色；可利用甘醇、甘露糖、琥珀酸、賴(lài)氨酸，不能利用乳糖和纖維二 糖，可分解脂肪和尿素，不能利用硝酸鹽，可在含質(zhì)量百分比為10%的NaCl培養(yǎng)基上生長(zhǎng)， 所述Yarrowia lipolytica YG CCTCC M209168菌株的18S rDNA序列與其它多株解脂耶氏 酵母的18S rDNA序列有99%的相似性。
2.用權(quán)利要求1所述的解脂耶氏酵母生物轉(zhuǎn)化蓖麻油制備Y-癸內(nèi)酯的方法，其特征 在于該方法的步驟如下(1)斜面培養(yǎng)將yarrowialipolytica YG CCTCC M 209168接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 上，在條件下靜置培養(yǎng)21 36小時(shí)；(2)制備種子培養(yǎng)液用步驟(1)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到液體種子培養(yǎng)基中，在條件下，150 200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)21 M小時(shí)，制得成熟的種子培養(yǎng)液；(3)生物轉(zhuǎn)化使用步驟( 所得的種子培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在20 35°C條 件下，100 200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩轉(zhuǎn)化18 72小時(shí)，得到、-癸內(nèi)酯轉(zhuǎn)化液。
3.如權(quán)利要求2所述的用解脂耶氏酵母生物轉(zhuǎn)化蓖麻油制備Y-癸內(nèi)酯的方法，其特 征在于步驟(1)斜面培養(yǎng)中所述營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方為葡萄糖10克/升，鈉鹽5克/ 升，蛋白胨10克/升，牛肉膏5克/升，瓊脂20克/升，pH7. 0。
4.如權(quán)利要求2所述的用解脂耶氏酵母生物轉(zhuǎn)化蓖麻油制備Y-癸內(nèi)酯的方法，其特 征在于步驟( 制備種子培養(yǎng)液中所述液體種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖15克/升，蛋白胨 5克/升，酵母粉2.5克/升，硫酸鎂2.4克/升，鈉鹽1.2克/升，鉀鹽0.5克/升，pH6. 5。
5.如權(quán)利要求2所述的用解脂耶氏酵母生物轉(zhuǎn)化蓖麻油制備Y-癸內(nèi)酯的方法，其特 征在于步驟(3)生物轉(zhuǎn)化中所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖0 50克/升，蓖麻油10 100克/升，玉米漿0 100克/升，酵母粉0 20克/升，蛋白胨0 30克/升，鉀鹽 0. 2 10克/升，鈉鹽1 20克/升，硫酸鎂0 5克/升，乳化劑吐溫-800 10克/ 升，pH5 9。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一株生物轉(zhuǎn)化蓖麻油制備γ-癸內(nèi)酯的解脂耶氏酵母，名為Yarrowialipolytica YG，已于2009年8月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC M 209168；該菌株是從土壤中分離，經(jīng)紫外、NTG、DES和鈷60誘變后，通過(guò)脂肪酶活性平板定向篩選獲得，菌株形態(tài)為紡錘形或圓柱形，有些母體長(zhǎng)有芽細(xì)胞，連成菌絲，直徑30～100微米，菌落起皺、干乳酪狀，顏色為乳白色或乳黃色；該菌株具有典型的解脂耶氏酵母生理生化特征；該菌株的18S rDNA序列與其它多株解脂耶氏酵母的18S rDNA序列有99％的相似性?？梢岳迷摼赀M(jìn)行生物轉(zhuǎn)化蓖麻油生產(chǎn)天然γ-癸內(nèi)酯。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)γ-癸內(nèi)酯具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)品綠色天然、成本較低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102080053SQ20091019953
公開(kāi)日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2009年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月27日
發(fā)明者張兆斌, 李元芳, 杜毅, 許平, 陳洪, 魏中浩 申請(qǐng)人:愛(ài)普香料集團(tuán)股份有限公司