專(zhuān)利名稱(chēng)：用解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株表達(dá)和分泌異源蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酵母蛋白的分泌技術(shù)。更具體地說(shuō)，涉及重組解脂亞羅威阿酵母(Yarrowia lipolytica)克隆載體，包括為哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)(例如凝乳酶原)和其他多肽的表達(dá)和分泌編碼的異源DNA；涉及表達(dá)載體，包括解脂亞羅威阿酵母基因啟動(dòng)子(例如XPR2或LEU2)、堿性蛋白酶信號(hào)(或前順序)、酶原區(qū)(pro region)、XPR2終止區(qū)，以及由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性或使用其它解脂亞羅威阿酵母基因成分產(chǎn)生的變異體及其功能等同物。此外，本發(fā)明還涉及攜帶所述表達(dá)載體和分泌載體的酵母轉(zhuǎn)化株，它們?cè)诋a(chǎn)生天然功能狀態(tài)的異源蛋白質(zhì)中的應(yīng)用；以及完成上述各項(xiàng)的方法。
穩(wěn)定而又充分地提供對(duì)工業(yè)(例如凝乳酶原、牛生長(zhǎng)激素)或醫(yī)用(例如尿抑胃激素、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、人過(guò)敏毒素C5a)有著重要價(jià)值的各種蛋白質(zhì)或多肽，特別是提供易于獲得的功能態(tài)優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品的原料，這種經(jīng)濟(jì)上的誘惑力，導(dǎo)致許多研究人員把DNA重組技術(shù)應(yīng)用于作為生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)“工廠”的微生物。
由于從重組宿主細(xì)胞特別是大腸桿菌的胞內(nèi)積累中回收具有生物活性的外源或異源(外來(lái)的)蛋白質(zhì)時(shí)遇到一些困難，所以，作為有可能解決困難的方法，廣泛的研究集中在蛋白質(zhì)的分泌上。在大腸桿菌中，異源蛋白質(zhì)往往是以可折射光的包涵體的狀態(tài)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的。該蛋白質(zhì)通常水溶性很低，而且很少有或者沒(méi)有生物活性。從可折射光的包涵體中提取該蛋白質(zhì)通常包括苛刻的化學(xué)處理，這種處理可能花費(fèi)昂貴而回收到的所需的有生物活性的天然蛋白質(zhì)微乎其微或者一無(wú)所獲。此外，為了釋放可折射光的包涵體，需要破壞細(xì)胞，因而所述蛋白被大腸桿菌產(chǎn)生的不良物質(zhì)污染的可能性也隨之加劇。除了大腸桿菌外，其它微生物也能產(chǎn)生不溶性胞內(nèi)狀態(tài)的異源蛋白質(zhì)，例如1982年7月28日公布的英國(guó)專(zhuān)利2,091,271號(hào)，公開(kāi)了用DNA重組技術(shù)對(duì)啤酒酵母進(jìn)行遺傳改造以表達(dá)牛犢凝乳酶。鑒于這些困難，從宿主微生物分泌該種蛋白質(zhì)已轉(zhuǎn)向力圖產(chǎn)生具有天然活性構(gòu)型的蛋白質(zhì)。
一種特定蛋白質(zhì)，包括異源蛋白質(zhì)或多肽，是否可由特定的微生物分泌，看來(lái)似乎決定于蛋白質(zhì)。在大多數(shù)真核細(xì)胞中，有的蛋白質(zhì)合成裝置與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相連，初生多肽鏈氨基端附近的氨基酸順序(稱(chēng)為“信號(hào)順序”)的作用是引導(dǎo)蛋白穿過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。接著在提供活性成熟蛋白質(zhì)的分泌過(guò)程中，經(jīng)蛋白質(zhì)水解切除信號(hào)順序。已經(jīng)做出的某些嘗試，目的是為了在包括枯草桿菌、啤酒酵母的微生物中和培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，用信號(hào)順序建立分泌異源蛋白質(zhì)的方法。然而所述的這些微生物尚未證明是理想的。
枯草桿菌的固有特性，例如分泌許多蛋白質(zhì)，包括易降解分泌的異源蛋白質(zhì)的許多蛋白酶；轉(zhuǎn)化株由于失去異源DNA而造成的不穩(wěn)定性也阻礙了它的發(fā)展。
已經(jīng)成功地對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行了遺傳改造使其表達(dá)和分泌異源蛋白質(zhì)，但是，這些系統(tǒng)都有技術(shù)上的要求，并且費(fèi)用很高，要把大多數(shù)蛋白質(zhì)作為產(chǎn)品進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)仍然是不切實(shí)際的。
雖然啤酒酵母作為蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)似乎有某些固有的局限性，但蛋白質(zhì)分泌研究在啤灑酵母上取得的成功超過(guò)枯草桿菌。1984年10月31日公布的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0123544號(hào)，介紹了啤酒酵母α因子基因的分離，并且將啟動(dòng)子和/或其信號(hào)肽部分與位于某個(gè)質(zhì)粒上編碼相對(duì)于酵母而言的異源蛋白質(zhì)的DNA相結(jié)合，用于轉(zhuǎn)化能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生成熟的單一蛋白質(zhì)的酵母細(xì)胞。1983年9月14日公布的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0088632號(hào)，介紹了在啤酒酵母中表達(dá)和分泌異源蛋白質(zhì)的方法?？墒瞧【平湍敢赃@些或另一些分泌系統(tǒng)能有效分泌的蛋白質(zhì)的大小看來(lái)似乎限于20,000道爾頓左右。正如Smith等所介紹的，克服啤酒酵母作為分泌微生物的這種普遍的低效率要求多重突變(Science 229，1219～1224(1985))。這種趨勢(shì)的一個(gè)例外就是觀察到大于20000道爾頓的曲霉屬酶類(lèi)明顯可以由啤酒酵母分泌，但是這些酶被啤酒酵母高度糖基化，這可能影響分泌的效率。
特殊的興趣在于解脂亞羅威阿酵母，一種用來(lái)產(chǎn)生檸檬酸和單細(xì)胞蛋白質(zhì)的工業(yè)上重要的酵母菌種。它也可用于產(chǎn)生赤蘚糖醇、甘露糖醇和異丙基蘋(píng)果酸。與啤酒酵母相反，解脂亞羅威阿酵母由于能夠有效地把高分子量蛋白(堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和核糖核酸酶)分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，由此有可能回收天然狀態(tài)的異源蛋白質(zhì)而無(wú)需破壞生產(chǎn)細(xì)胞，所以特別令人感興趣并具有特殊的意義。此外，解脂亞羅威阿酵母能分泌很少量的幾種蛋白質(zhì)，因而有可能在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中產(chǎn)生作為主要蛋白質(zhì)的所需異源蛋白質(zhì)，并且簡(jiǎn)化所述的異源蛋白質(zhì)產(chǎn)物的回收。
解脂亞羅威阿酵母產(chǎn)生高水平的胞外蛋白酶，這是由解脂亞羅威阿酵母分泌的主要蛋白質(zhì)。特定的蛋白酶(堿性的、酸性的或中性的)取決于所用的解脂亞羅威阿酵母菌株(Ogrydziak等，J.Gen.Microbiol.(1982)128，1225～1234)。堿性胞外蛋白酶的N-末端氨基酸順序的部分順序分析已由Ogrydziak等人作了報(bào)導(dǎo)(在上述引文中)。
1984年7月25日提交的共同未決專(zhuān)利申請(qǐng)634,505號(hào)，介紹了通過(guò)突變互補(bǔ)作用轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母和克隆解脂亞羅威阿酵母基因的方法，公開(kāi)了通過(guò)解脂亞羅威阿酵母的xpr2突變的互補(bǔ)作用，克隆編碼分泌的堿性蛋白酶的XPR2基因。該方法包括用在載體pLD40上的解脂亞羅威阿酵母基因庫(kù)的Bgl II部分消化產(chǎn)物來(lái)轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母的宿主菌株，已在1985年4月24日公布的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0138508號(hào)即上述美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)的相應(yīng)申請(qǐng)中作了介紹。
本發(fā)明提供制備載體的方法，這類(lèi)載體在被引入解脂亞羅威阿酵母宿主時(shí)，使宿主能夠產(chǎn)生和分泌由異源DNA編碼的特異蛋白質(zhì)于培養(yǎng)基中，這類(lèi)異源DNA可以來(lái)自任何來(lái)源，但特別是來(lái)自真核DNA和合成DNA；提供重組解脂亞羅威阿酵母克隆載體，包括編碼表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)和其他多肽的異源DNA，其中包括適合轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母宿主的質(zhì)粒，特別是整合表達(dá)載體，包括LEU2基因啟動(dòng)子、XPR2基因啟動(dòng)子、堿性蛋白酶前原區(qū)(prepro region)和XPR2終止區(qū)；提供具有異源編碼順序的表達(dá)質(zhì)粒，所述異源編碼順序帶有位于LEU2啟動(dòng)子下游的XPR2分泌信號(hào)，使得在用所說(shuō)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿酵母中能表達(dá)和分泌異源蛋白。
本發(fā)明說(shuō)明成熟異源蛋白質(zhì)的表達(dá)和分泌，特別是從經(jīng)過(guò)遺傳改造的解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞培養(yǎng)物表達(dá)和分泌凝乳酶原和人過(guò)敏毒素C5a。解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞外堿性蛋白酶精確氨基酸順序和DNA順序的發(fā)現(xiàn)使人們有可能確定，異源蛋白質(zhì)可以通過(guò)重組DNA技術(shù)來(lái)表達(dá)和分泌，以供細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)。就凝乳酶原而言，表達(dá)和分泌成熟的酶原(凝乳酶的前體)。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)解脂亞羅威阿酵母可通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行遺傳改造，使產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株能夠表達(dá)和分泌天然狀態(tài)的異源蛋白質(zhì)。這可通過(guò)構(gòu)建攜帶XPR2基因信號(hào)或XPR2基因信號(hào)和第一個(gè)酶原順序(pro1)或兩個(gè)酶原順序(pro1＋pro2)的載體來(lái)完成，XPR2基因是與需要分泌的異源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因順序相連接的。
通過(guò)在DNA載體的XPR2位點(diǎn)上的整合產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化株，包括一段在基因兩端喪失調(diào)節(jié)或結(jié)構(gòu)成分的XPR2基因而不再產(chǎn)生堿性蛋白酶，這一特征不僅為異源蛋白質(zhì)的分泌所需而且也能用于篩選轉(zhuǎn)化株。
此外，攜帶XPR2啟動(dòng)子和編碼堿性蛋白酶分泌信號(hào)順序的順序的載體能夠在轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)分泌成熟的異源蛋白質(zhì)。這種類(lèi)型的有些重組DNA載體能夠?qū)崿F(xiàn)表達(dá)/分泌，而與酵母基因組的整合位點(diǎn)無(wú)關(guān)。一般說(shuō)來(lái)，含有足夠的5′和3′側(cè)翼DNA的載體能夠表達(dá)與整合位點(diǎn)無(wú)關(guān)的產(chǎn)物。
此外還令人驚奇和出乎意料地發(fā)現(xiàn)，將pBR322衍生質(zhì)粒整合到解脂亞羅威阿酵母染色體DNA提供了能夠進(jìn)一步促進(jìn)位點(diǎn)特異性整合轉(zhuǎn)化的同源區(qū)，因此pBR322的整合拷貝可以作為新來(lái)的轉(zhuǎn)化DNA的“連接臺(tái)”(＂docking plat form＂)。將pBR322的駐留拷貝整合到解脂亞羅威阿酵母染色體DNA中，盡管pBR322不是天然的解脂亞羅威阿酵母DNA，然而為整合提供了一個(gè)已知的靶。包括這樣一個(gè)位點(diǎn)的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化受體在兩個(gè)主要方面能夠超過(guò)不含這樣位點(diǎn)的受體，即存在一個(gè)具有已知順序和已知限制圖可作為位點(diǎn)特異性整合的靶區(qū)；通過(guò)用pBR322作為整合的靶位可以確定插入的質(zhì)粒是否含有完整的功能單位或是僅相對(duì)于所需基因的一部分的基因。例如，僅含XPR2基因3′片段的質(zhì)粒就能轉(zhuǎn)化XPR2-1002受體，如果它含有野生型密碼子并在XPR2位點(diǎn)上整合的話。然而，同一個(gè)質(zhì)粒如果被整合到pBR322中的話，也許不能把XPR2-1002宿主轉(zhuǎn)化為蛋白酶陽(yáng)性的表現(xiàn)型，因?yàn)樗鄙偻暾墓δ軉挝弧?br> 因此，在解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株中包括一個(gè)與異源載體DNA同源的區(qū)域，所述同源區(qū)包括該解脂亞羅威阿酵母整合轉(zhuǎn)化期間作為受體位點(diǎn)的外源DNA。除了pBR322及其衍生物外，還有粘粒、像M13和λ一類(lèi)的噬菌體、合成衍生DNA和像pUC13一類(lèi)的普通質(zhì)粒都可用于產(chǎn)生具有“連接臺(tái)”的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株。
“LEU2”啟動(dòng)子順序指的是位于ATG上游的上游非翻譯區(qū)，它含有進(jìn)行表達(dá)所需的大多數(shù)(如果不是全部的話)特征。
“XPR2”啟動(dòng)子順序指的是位于信號(hào)(或前信號(hào))順序之前的上游非翻譯區(qū)，它是進(jìn)行表達(dá)所必需的。此外，有或沒(méi)有pro順序的XPR2基因的信號(hào)，在解脂亞羅威阿酵母啟動(dòng)子而不是XPR2基因的表達(dá)控制下，可用于分泌蛋白質(zhì)。因此，攜帶LEU2啟動(dòng)子和堿性蛋白酶分泌信號(hào)順序的載體，在已經(jīng)轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞中能成功地分泌成熟的異源蛋白質(zhì)。
人過(guò)敏毒素C5a也稱(chēng)為補(bǔ)體蛋白質(zhì)C5a(人C5a)，它是體內(nèi)作為補(bǔ)體激活作用的結(jié)果產(chǎn)生的具有生物活性的多肽片段。它在調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的某些方面起著免疫調(diào)節(jié)劑的作用，其一級(jí)結(jié)構(gòu)和其它過(guò)敏毒素的一級(jí)結(jié)構(gòu)都已清楚。它的生物學(xué)和理化特征在由H.J.Muller-Eberhard和P.A.Miescher合編的《補(bǔ)體》(Complement)一書(shū)中，已由Hugli作了概述(紐約Springer-Verlag出版社出版，1985年73～99頁(yè))。
本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明中可以采用編碼實(shí)際上任何已知氨基酸順序的異源DNA。這里所公開(kāi)的方法在細(xì)節(jié)上作必要的修正后可以用來(lái)產(chǎn)生和分泌任何已知的異源蛋白質(zhì)，其中有代表性的在1985年7月30日公布的美國(guó)專(zhuān)利4,532,207號(hào)中已一一列舉。此外，任何其他解脂亞羅威阿酵母分泌蛋白質(zhì)基因，如核糖核酸酶和酸性蛋白酶基因，可以用來(lái)代替XPR2基因，也可以用由所述的2個(gè)或更多的基因相連的片段所組成的雜種基因，例如XPR2基因的信號(hào)順序和核糖核酸酶基因的啟動(dòng)子順序結(jié)合的雜種基因來(lái)代替。
包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有這里所述的DNA順序或核苷酸順序的功能等同物。遺傳密碼的簡(jiǎn)并性容許由其他的密碼子代替某些密碼子，兩者指代的是相同的氨基酸，因此產(chǎn)生相同的蛋白質(zhì)。事實(shí)上，DNA或核苷酸順序在很大程度上是可以改變的，因?yàn)槌说鞍彼岷蜕彼嵬猓阎母鞣N氨基酸都可以由一個(gè)以上的密碼子進(jìn)行編碼。因此，部分或全部XPR2基因都可以人工合成，產(chǎn)生出與圖3的DNA順序具有明顯差別的DNA順序。但其編碼的氨基酸順序可以保持。給定的DNA或核苷酸順序這種功能上的更替提供了用融合的外來(lái)DNA順序促進(jìn)分泌和/或加工所編碼的異源蛋白的機(jī)會(huì)。因此凡是因遺傳密碼所致的XPR2基因及其片段的核苷酸順序的所有變化都包括在本發(fā)明內(nèi)。此外，也可能除去一些密碼子或由除了簡(jiǎn)并碼子外的密碼子取代一個(gè)或更多的密碼子，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上改變的多肽，但與由未改變的DNA分子產(chǎn)生的多肽相比，在實(shí)用性和活性方面基本上是相同的。所述這兩種多肽的功能都是相同的，如同兩種DNA分子產(chǎn)生兩種多肽，盡管所述的兩種DNA分子之間差別與遺傳密碼的簡(jiǎn)并性無(wú)關(guān)。其最簡(jiǎn)單的例子就是凝乳酶原A和凝乳酶原B，它們是凝乳酶原的兩種等位基因形式，其區(qū)別僅在于，在凝乳酶原A的286位上是天冬氨酸殘基，而在凝乳酶原B的286位上是甘氨酸殘基。
利用這個(gè)方法，通過(guò)應(yīng)用得自解脂亞羅威阿酵母XPR2基因和/或LEU2基因的表達(dá)和分泌信號(hào)，表達(dá)和分泌哺乳動(dòng)物的異源蛋白質(zhì)凝乳酶原和人過(guò)敏毒素C5a已經(jīng)在解脂亞羅威阿酵母中取得成功。凝乳酶原和人過(guò)敏毒素C5a的DNA順序通過(guò)合成的寡核苷酸連接到XPR2基因順序上假定為編碼堿性磷酸酶信號(hào)肽的位點(diǎn)或蛋白酶前體加工位點(diǎn)以產(chǎn)生基因構(gòu)建體，上述兩個(gè)位點(diǎn)被命名為pro1和pro2，所產(chǎn)生的基因構(gòu)建體然后經(jīng)整合轉(zhuǎn)化插入到解脂亞羅威阿酵母中。重組培養(yǎng)物表達(dá)具有凝乳酶原和人過(guò)敏毒素C5a的分子量和免疫反應(yīng)活性的異源蛋白質(zhì)并輸出到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。如此產(chǎn)生的凝乳酶原可以認(rèn)為是其天然構(gòu)型的折疊形式，因?yàn)槌デ半暮笏哂型耆拿富钚浴?br> 此處所用的“重組DNA材料”一詞包括含有至少下列材料之一的任何材料解脂亞羅威阿酵母的XPR2基因、信號(hào)(或前信號(hào))、por1和pro2(共同構(gòu)成pro區(qū))、啟動(dòng)子或其終止順序；LEU2啟動(dòng)子；以及可能由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性所產(chǎn)生的功能與上述順序相同的順序。所述重組DNA材料中具有代表性的材料為DNA片段、質(zhì)?；蜉d體，或含有上述順序中任一個(gè)或者全部順序的轉(zhuǎn)化株。
材料New England Biolabs供給的限制性核酸內(nèi)切酶和T4連接酶，Bethesda Research Laboratories供給的細(xì)菌堿性磷酸酶，PL-biochemicals供給的T4多核苷酸激酶，和New EnglandNuclear供給的[γ-32P]ATP。所有的酶都是在提供者所推薦的條件下使用的。
培養(yǎng)基GPP培養(yǎng)基-(甘油/ -蛋白胨培養(yǎng)基)，(每升)含有6.7克甘油、1.6克Difco -蛋白胨、1.7克不含氨基酸和硫酸銨的Difco酵母含氮堿基化合物、30毫克尿嘧啶、和0.5毫升/升分子量為2000的聚丙二醇(Polysciences)溶于40mM磷酸緩沖液(pH6.8)。(聚丙二醇為進(jìn)行凝乳酶分析進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)省略不用)。 -蛋白胨在磷酸緩沖液中單獨(dú)進(jìn)行高壓滅菌。YEPD(酵母提取物/蛋白胨/右旋糖培養(yǎng)基)，(每升)含有5克酵母提取物、10克蛋白胨和20克右旋糖。
大腸桿菌生長(zhǎng)在37℃的LB培養(yǎng)基中。LB培養(yǎng)基(每升)含有10克細(xì)菌胰酶解蛋白胨(Bactotryptone)、10克細(xì)菌酵母提取物、10克氯化鈉；用氫氧化鈉將pH調(diào)至7.5。
DNA順序分析這里所描述的來(lái)自各種質(zhì)粒的DNA片段都是在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分離并用Maxam等人的方法(Methods inEnzymology，65，499(1980))測(cè)序。
連接方法DNA片段，包括被切割的載體質(zhì)粒，都是用T4 DNA連接酶通過(guò)混合所需要的組分進(jìn)行連接(帶有適宜的構(gòu)建末端的DNA片段以提供正確的配對(duì))。微克量的載體和插入片段需加約10單位的連接酶。將所得的連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12菌株MM294(ATCC-33625)或HB101(ATCC-33694)的感受態(tài)細(xì)胞中。
化學(xué)合成DNA的制備為構(gòu)建用于表達(dá)和分泌凝乳酶的雜種基因，用改進(jìn)的Phosphoramidite方法(Sinha等，Tetrahedron Letters24，5843(1983))通過(guò)Genetic Design 6500(Watertown，MA)DNA自動(dòng)合成儀合成8個(gè)寡核苷酸，并且從6M尿素-20％聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行純化。將互補(bǔ)寡核苷酸的等分部分在TE(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM NaEDTA)中在4℃條件下互相混合和退火過(guò)液。雙股寡核苷酸的等分部分(約2微克)在37℃下用T4多核苷酸激酶在反應(yīng)混合物中進(jìn)行磷酸化，該反應(yīng)混合物20μl含有70mM Tris(pH7.6)、10mM氯化鎂、5mM二硫蘇糖醇、5mM ATP。
質(zhì)粒DNA制備質(zhì)粒DNA的大量制備采用Holmes等人的方法(Anal.Biochem.，114，195～197(1981))，然后用溴乙錠-氯化銫浮力密度梯度離心。質(zhì)粒DNA的小量制備采用Birnboim等人的堿性SDS方法(NAR1，1513(1979))。
凝乳酶原的表達(dá)/分泌載體的構(gòu)建進(jìn)行一系列不同的構(gòu)建體的制備是為了獲得最終表達(dá)載體。所有各個(gè)步驟都在附圖中予以說(shuō)明。一般說(shuō)來(lái)，DNA片段是用凝膠電泳分離，并與另一些片段，或者被切割的DNA質(zhì)粒，于4℃的20微升50mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM氯化鎂、20mM二硫蘇糖醇、1mM ATP和200單位的T4連接酶中進(jìn)行連接。如果需要用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行DNA的部分消化，則需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳的切割時(shí)間。
培養(yǎng)液中凝乳酶原的鑒定含有表達(dá)載體的酵母轉(zhuǎn)化株在GPP培養(yǎng)基(同上)中生長(zhǎng)過(guò)夜。離心去除酵母細(xì)胞后，將1毫升的50％TCA加到每個(gè)5毫升等分的培養(yǎng)液中，在4℃下保持60分鐘。離心得到沉淀，再用2毫升冷丙酮洗兩次。將沉淀的蛋白質(zhì)溶于100微升的SDS樣品緩沖液，等分部分在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳(Laemmli，U.K.，(1970)Nature227，680)。凝膠分辨的蛋白質(zhì)通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移到硝化纖維素(Schleicher和Schuell，0.22微米)，用凝膠片經(jīng)免疫印跡分析法(Hawkes，R.等，(1982)Anal.Biochem.119，142)進(jìn)行凝乳酶原的鑒定。濾紙涂上家兔抗凝乳酶原抗體，然后與結(jié)合羊抗兔IgG抗體的過(guò)氧化物酶(Cappel，Malvern，Pa)保溫。結(jié)合抗體用4-氯-1-萘酚和過(guò)氧化氫染色檢測(cè)。
培養(yǎng)液中凝乳酶原的凝乳活性各種解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)液按照Ernstrom改進(jìn)方法(J.Dairy Sci.41，1664(1958))測(cè)定凝乳活性。簡(jiǎn)言之測(cè)定包括測(cè)量凝乳酶在活化的培養(yǎng)上清液中凝結(jié)緩沖過(guò)的脫脂乳所需的時(shí)間長(zhǎng)度并與純化凝乳酶標(biāo)準(zhǔn)物比較這些數(shù)值。酵母培養(yǎng)物(25毫升)在GPP培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜。離心后去除細(xì)胞，將5毫升培養(yǎng)上清液的等分部分在真空條件下冷凍干燥。把每份經(jīng)冷凍干燥的上清液再懸浮于300微升蒸餾水中。還要制備一組純化的牛犢凝乳酶原稀釋液作為對(duì)照參考標(biāo)準(zhǔn)。在培養(yǎng)基中和對(duì)照條件下的凝乳酶原的活化是通過(guò)加入大約5～10微升的濃鹽酸，使pH值達(dá)到大約2左右，在22℃下保溫1小時(shí)。脫脂乳的制備是將60克干燥的脫脂奶粉(Difco)加到500毫升的41.5mM醋酸鈉(pH6.3)和13.6mM氯化鈣中，在4℃條件下攪拌20分鐘。制備后立即進(jìn)行底物測(cè)定。將每個(gè)制備的酶以60微升為一等分(相當(dāng)于1毫升的培養(yǎng)上清液)，在37℃下加到1毫升等分的脫脂乳中，記錄凝結(jié)時(shí)間。
用于C5a基因的合成寡核苷酸的制備用于C5a結(jié)構(gòu)基因合成的寡脫氧核苷酸的化學(xué)制備是采用改進(jìn)的Phosphoramidite方法(Sinha等，在上述引文中)在一個(gè)DNA自動(dòng)合成儀Genetic Design6500(Watertown，MA)上用可控多孔玻璃載體進(jìn)行的。用3％(重量/體積)二氯乙酸的二氯甲烷溶液進(jìn)行脫三苯甲基作用，用飽和四唑的乙腈溶液加以Phosphoramidites線性激活，以二乙氧基膦四唑化物封端，用含水碘/THF氧化(Matteucci等，1981，J.Amer.Chem.Soc.105，3183)。每個(gè)加入周期的總時(shí)間是14分鐘。得到圖9中的10個(gè)47聚體A-J片段，每個(gè)步驟的平均得率為98.8％(用三苯甲基分析)，用Matteucci等人(在上述引文中)的方法解封，從0.3M醋酸鈉中經(jīng)乙醇沉淀出并在退火前先在10％聚丙烯酰胺-尿素變性凝膠上用制備性凝膠電泳進(jìn)行分離。
人C5a基因的組裝、克隆和順序測(cè)定圖9表示所需蛋白質(zhì)的氨基酸順序和制備編碼人C5a蛋白質(zhì)的基因所需的合成寡核苷酸的排列。除A和F外的所有低聚物，都是在它們的5′末端用T4多核苷酸激酶進(jìn)行磷酸化。基因的組裝包括退火和連接兩個(gè)主要反應(yīng)，兩個(gè)反應(yīng)含有低聚物A、B、I和J，以及低聚物C、D、E、F、G和H。最終得到的94堿基對(duì)和141堿基對(duì)雙股DNA片段都是在10％聚丙烯酰胺凝膠上電泳后進(jìn)行分離，相互共同連接，他們的235堿基對(duì)產(chǎn)物用凝膠電泳分離。含有編碼C5a的結(jié)構(gòu)基因的235堿基對(duì)DNA片段插在pBR322 DNA載體的EcoRI和HindIII兩個(gè)位點(diǎn)之間并轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12菌株HB101感受態(tài)細(xì)胞。從6個(gè)轉(zhuǎn)化株分離得到的DNA質(zhì)粒的限制性酶切分析表明6個(gè)克隆中有5個(gè)含有大小合適的EcoRI/HindIII片段。這些質(zhì)粒中每個(gè)質(zhì)粒的C5a基因區(qū)的核苷酸順序都用Maxam等人的方法(Methods Enzymol.65，499(1980))測(cè)定。
用于大腸桿菌的C5a表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和特性鑒定DNA片段分離的方法和連接反應(yīng)的條件采用1982年Maniatis等發(fā)表的方法(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor)。大腸桿菌trp啟動(dòng)子-操縱子，開(kāi)始是從ptrpL1得到的(Edman等，(1981)Nature 291，503)，含有用于C5a表達(dá)質(zhì)粒(pC5a-48)的trp啟動(dòng)子-操縱子順序的360堿基對(duì)EcoRI片段，是由凝乳酶原表達(dá)質(zhì)粒pPFZ-R2中分離得到的，關(guān)于這一點(diǎn)在1985年7月3日公布的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0147178號(hào)中已作了介紹。
解脂亞羅威阿酵母培養(yǎng)液中C5a的鑒定除了羊抗C5a和免抗羊免疫球蛋白G(Cappel)用于免疫印跡外，采用如上介紹的鑒定凝乳酶原方法。羊抗人C5a抗體的制備采用Manderino等人的方法(J.Immunol.Methods 53，41-50(1982))。
載體pLD40已在1985年4月24日公布的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0138508號(hào)中作了介紹。微生物名稱(chēng)ATCC 20774(CCTCC 86-142)解脂亞羅威阿酵母 PC30869ATCC 20781(CCTCC 86-149)解脂亞羅威阿酵母 DL112-PC-30869，帶XPR2的轉(zhuǎn)化株ATCC 20776(CCTCC 86-144)解脂亞羅威阿酵母 DL-148。
解脂亞羅威阿酵母 ATCC20688(CCTCC 86-152)的轉(zhuǎn)化株，帶由SnaBI消化的pLS-3ATCC 20775(CCTCC 86-143)解脂亞羅威阿酵母 DL-144。
解脂亞羅威阿酵母 ATCC20688(CCTCC 86-152)的轉(zhuǎn)化株，帶未切割的pLS-3ATCC 20777(CCTCC 86-145)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶由SnaBI切割的pC5aX-3ATCC 20778(CCTCC 86-146)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶由SnaBI消化的pXX-11ATCC 20779(CCTCC 86-147)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶由SnaBI切割的pXX-22ATCC 20780(CCTCC 86-148)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶由SnaBI切割的pXX-33ATCC 20794(CCTCC 86-150)解脂亞羅威阿酵母PC-30869的轉(zhuǎn)化株，帶pLD56ATCC 20795(CCTCC 86-151)解脂亞羅威阿酵母ATCC 20794(CCTCC 86-150)的轉(zhuǎn)化株，帶由NruI切割的pLX-34上述載體根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定都保藏在美國(guó)馬里蘭州洛克維爾美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，這是一個(gè)公認(rèn)的承擔(dān)永久性保存樣品的保藏機(jī)構(gòu)。如果本申請(qǐng)被授予專(zhuān)利，該中心將隨時(shí)準(zhǔn)備接待公眾。在本申請(qǐng)未決期間，這些樣品可以提供給美國(guó)專(zhuān)利和商標(biāo)局授權(quán)去那里的官員進(jìn)行測(cè)定，項(xiàng)目編號(hào)為37CFR1.14和35USC122；根據(jù)外國(guó)專(zhuān)利法，在向這些國(guó)家提交過(guò)本申請(qǐng)副本或其成果的，也可以使用這些樣品。由于授予了專(zhuān)利，對(duì)于公眾利用所保藏的微生物的全部限制措施將不可避免地予以撤消。
解脂亞羅威阿酵母ATCC20774(CCTCC 86-142)(Pfizer公司培養(yǎng)物保藏所鑒定編號(hào)為PC30869)的分類(lèi)學(xué)研究是由J.R.DeZeeuw博士負(fù)責(zé)的，他提供了下述說(shuō)明。所用的方法是由J.L.Eodder在《酵母菌》(第二版)(N.Holland Publishing Co.，
Amsterdam，1970)一書(shū)中推薦的那些方法。
CBS599是解脂假絲酵母典型培養(yǎng)物(《酵母菌》，第二版，N.Holland Publishing Co.，Amsterdam，1970)，CBS6124在《酵母菌》(第三版)一書(shū)中是解脂復(fù)膜孢子酵母的典型培養(yǎng)物，對(duì)兩者進(jìn)行了比較。較早還稱(chēng)為解脂擬內(nèi)孢霉。其無(wú)性狀態(tài)是解脂假絲酵母。確定這個(gè)種的分類(lèi)學(xué)地位的是van der Walt和von Arx(Antonie vanLeeuwenhoek，46，517～512(1980))?，F(xiàn)時(shí)較佳的名稱(chēng)為解脂亞羅威阿酵母。
菌株P(guān)C-30869的培養(yǎng)、形態(tài)和生理特征與由Kreger-van Rij編的《酵母菌》(第三版，第406～408頁(yè)，Elsevier Science PublishersB.V.，Amsterdam，1984)一書(shū)中所列的解脂復(fù)膜孢子酵母的規(guī)范介紹是一致的。
表1解脂亞羅威阿酵母菌株的比較Pfizer公司 資料來(lái)源基因型登記號(hào)PC-30265NRRL YB-423(即CBS 6124)，野生型，二倍體《酵母菌》(第三版)中的典型培養(yǎng)物PC-30286CBS 599，《酵母菌》 MATA野生型，單倍(第二版)中的典型 體培養(yǎng)物PC-30869參閱下面的介紹 MATB bio-6，leu2-40.
xpr2-1002PC-30869是由遺傳上適于重組的解脂亞羅威阿酵母PC-22208的突變體構(gòu)建的，解脂亞羅威阿酵母PC-22208是由Pfizer公司從土壤中分離的，解脂亞羅威阿酵母PC-30026則是NRRL Y-1094的次代培養(yǎng)物。PC-30869在表型上與其野生型親代的差異在于①不產(chǎn)生具有活性的胞外堿性蛋白酶；②生長(zhǎng)需要生物素；③要求L-亮氨酸作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。
PC-30869在酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖(YEPD)培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期間，芽細(xì)胞呈卵圓形，平均大小為2.6×5.5微米。在YEPD瓊脂上，真假菌絲體都突起，有胚泡孢子，兩側(cè)大多數(shù)為單個(gè)的。沒(méi)有明顯的類(lèi)胡蘿卜素色素。該物是作為“B”交配型單倍體與測(cè)定微生物種的有權(quán)堿性的測(cè)交品系進(jìn)行雜交(表5)。典型的子囊孢子的形成是V8瓊脂上進(jìn)行觀察的。碳同化的模式見(jiàn)附表2。沒(méi)有進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。銨離子和尿素(無(wú)硝酸鹽)是可以被利用的唯一氮源(表3)。菌株P(guān)C-30869要求維生素B1和D-生物素(表4)。只有維生素B1是該培養(yǎng)物的野生型親本所需要的。在37℃下未看到生長(zhǎng)。
表2碳同化作用*碳源參考列表介紹** 培養(yǎng)物30265 30286 308691.L-阿拉伯糖 -- - -2.纖維二糖-- - -3.赤蘚醇 ++++ +++ +++4.D-半乳糖-- - -5.D-葡萄糖 -+++ +++ +++6.肌醇 ----7.乳糖 ----8.麥芽糖 ----9.D-甘露糖醇 ++++ +++ +++10.棉子糖----11.核糖醇----12.D-核糖-(+) --++13.L-鼠李糖 ----14.可溶性淀粉----15.蔗糖 ----16.海藻糖----17.D-木糖----18.琥珀酸++++ +++ +++19.檸檬酸++++ +++ +++*基礎(chǔ)培養(yǎng)基是細(xì)菌酵母氮基質(zhì)補(bǔ)加10微克/升的D生物素和149毫克/升的L-亮氨酸乙酯鹽酸鹽，以提供100毫克/升的L-亮氨酸。
**Kreger-van Rij.(在上述引文中)。
表3氮同化作用*氮源 參考列表介紹**培養(yǎng)物30265 30286 308691.(NH4)2SO4+ +++++++++2.KNO3- - - -3.尿素 + +++++++++*基礎(chǔ)培養(yǎng)基是細(xì)菌酵母碳基質(zhì)補(bǔ)加116毫克/升的酮異己酸鈉，以提供對(duì)應(yīng)的100毫克/升的L-亮氨酸，再補(bǔ)加10微克/升的D-生物素。
**Kreger-van Rij.(在上述引文中)表4需要的維生素*補(bǔ)加內(nèi)容***參考結(jié)論** 培養(yǎng)物30265 30286 308691.缺 - 極微 極微 -2.維生素B1.HCl+ +++ +++ -3.D-生物素- 極微 極微 極微4.維生素B1+ +++ +++ ++++生物素*基礎(chǔ)培養(yǎng)基是無(wú)細(xì)菌維生素酵母基質(zhì)加149毫克/升的L-亮氨酸乙酯鹽酸鹽，以提供100毫克/升的L-亮氨酸。
**Kreger van Rij.(在上述引文中)。
***如所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基再補(bǔ)加200微克/升維生素B1·HCl和/或10微克/升的D-生物素。
表5子囊孢子的形成測(cè)交菌株 交配培養(yǎng)物30265 30286 30869缺號(hào)(自交配培養(yǎng)物) ++ - -30264(A交配型)++ - +++30267(B交配型)++ +++ -①培養(yǎng)物30264和30267是由L.J.Wickerham博士惠供的異性交配型單倍體菌株，已在Science(167，141(1970))上作了正式介紹。
②30264是Wickerham的解脂亞羅威阿酵母YB-421③30267是Wickerham的解脂亞羅威阿酵母YB-423-12表6其他特征參考數(shù)據(jù)* 培養(yǎng)物30265 3028630869細(xì)胞形狀 卵圓形 卵圓形卵圓形卵圓形細(xì)胞的平均體積(微米) (2～4.5)×(4-22) 3.3×9.1 3.0×8.2 2.6×5.5營(yíng)養(yǎng)繁殖 芽殖 芽殖 芽殖 芽殖發(fā)酵 缺 缺缺缺37℃時(shí)生長(zhǎng)不生長(zhǎng) 不生長(zhǎng)不生長(zhǎng)不生長(zhǎng)菌落生長(zhǎng) 三個(gè)培養(yǎng)物生長(zhǎng)相似并與文獻(xiàn)介紹一致。真假菌絲體都突起，有胚孢子，兩側(cè)大多數(shù)是單個(gè)的。沒(méi)有明顯的類(lèi)胡蘿卜素色素。*Kreger van Rij.(在上述引文中)。
PC-30689不同于專(zhuān)利文獻(xiàn)所介紹的解脂亞羅威阿酵母的其他菌株，是基于將其表型進(jìn)行比較的結(jié)果(表7和8)。
ATCC20228(Nubel等，美國(guó)專(zhuān)利4,155,811)的特征在于具有像這個(gè)種的典型菌株CBS599和CBS6124的野生型營(yíng)養(yǎng)。尤其是它不需要尿嘧啶、亮氨酸或?yàn)樯L(zhǎng)用的生物素，以及使明膠液化。
ATCC 20628(DeZeeuw等，美國(guó)專(zhuān)利4,407,953)不像ATCC20228需要補(bǔ)加生長(zhǎng)用的亮氨酸。像ATCC20228一樣，它也不需要尿嘧啶或生物素。它也液化明膠。
ATCC20668(CCTCC 86-152)(歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0138508)即使培養(yǎng)基中補(bǔ)加了尿嘧啶和亮氨酸，也只是僅僅能夠生長(zhǎng)。這種對(duì)尿嘧啶的需要就使ATCC20688(CCTCC 86-152)跟ATCC20228和ATCC20628得以區(qū)別。ATC C20688(CCTCC 86-152)不需要生物素，而能使明膠液化。
培養(yǎng)物PC-30689不同于上述所有菌株，它需要生物素和亮氨酸，但不需要生長(zhǎng)用的尿嘧啶，它也不能使明膠液化。
表7營(yíng)養(yǎng)要求從所列培養(yǎng)基中去掉的營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)物無(wú) 亮氨酸 尿嘧啶 生物素CRS599++++++ +++ +++CBS6124++++++++++++ATCC20228 ++++++++++++ATCC20628 +++- ++++++ATCC20688(CCTCC 86-152)+++- - +++PC-30869 +++- +++-完全培養(yǎng)基含有16.7克/升的無(wú)細(xì)菌維生素酵母基質(zhì)加100毫克/升的尿嘧啶、100毫克/升的L-亮氨酸、10微克/升的D-生物素，和200微克/升的維生素B1鹽酸鹽。
表8明膠液化作用培養(yǎng)物 液化作用CBS599 +CBS6124 +ATCC20228 +ATCC20628 +ATCC20688(CCTCC 86-152) +PC-30869-培養(yǎng)基含有120克/升的明膠、16.7克/升的無(wú)細(xì)菌維生素酵母基質(zhì)加100毫克/升的尿嘧啶、100毫克/升的L-亮氨酸、10微克/升的D-生物素和200微克/升的維生素B1鹽酸鹽。


圖1由解脂亞羅威阿酵母菌株DL112分離得到的重疊質(zhì)粒pLD57、pLD58和pLD62的部分線性限制圖。*
圖2為XPR2基因合成寡核苷酸探針。從已經(jīng)發(fā)表的成熟蛋白酶的前25個(gè)氨基酸殘基中大多數(shù)殘基的順序(Ogsydziak等，在上述引文中)，標(biāo)有I和II的兩個(gè)區(qū)為構(gòu)建32倍或不足32倍簡(jiǎn)并的14聚體寡核苷酸探針提供了可能性。兩個(gè)區(qū)分別在7和18位氨基酸起始。為每個(gè)區(qū)制備了4個(gè)不同的8倍簡(jiǎn)并的混合探針并指定了圖中所示的170～186之間的編號(hào)。在所示的預(yù)期核酸順序中，“X”表示所有四種堿基，U表示兩種嘌呤，Y表示兩種嘧啶。
圖3XPR2基因的核苷酸順序啟動(dòng)子、pre(-157～-136)，pro1(-135～-98)，pro2(-97～-1)，堿性細(xì)胞外蛋白酶和終止順序。
圖4構(gòu)建終止密碼子載體pterm4的順序。
圖5構(gòu)建質(zhì)粒pLS-3的順序和限制性圖。
圖6構(gòu)建質(zhì)粒pXX-33的順序和限制性圖。
圖7構(gòu)建質(zhì)粒pXX-22的順序和限制性圖。
圖8構(gòu)建質(zhì)粒pXX-11的順序和限制性圖。
圖9人過(guò)敏毒素C5a氨基酸順序。
圖10質(zhì)粒pC5a-48的限制性圖。
圖11構(gòu)建質(zhì)粒pC5aX-3的順序和限制性圖。
圖12LEU2基因的核苷酸順序。
圖13構(gòu)建質(zhì)粒pLX-34的順序和限制圖。
XPR2基因的順序分析克隆的XPR2基因的DNA順序分析是用化學(xué)降解法(Maxam等，1980，Methods Enzymol.65，499)在由質(zhì)粒pLD57、pLD58、pLD62(圖1)和pLD84、pLD86(參閱下面所述)制備的重疊限制性片段上完成的。結(jié)果表明克隆的酵母基因組DNA實(shí)際上含有胞外堿性蛋白酶的基因。XPR2基因的核苷酸順序和由核苷酸順序推測(cè)的帶有信號(hào)順序的堿性蛋白酶前體的氨基酸順序在圖3中給出。胞外蛋白酶的氨基酸順序中的大部分順序過(guò)去都是未知的(Ogrydziak等，在上述引文中)，這里是第一次提出。此外，需要胞外蛋白酶表達(dá)和分泌的順序這里也是第一次予以介紹。編碼堿性蛋白酶、它的前體和信號(hào)順序的DNA順序由1362堿基對(duì)組成(圖3)。這些多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由核苷酸順序推斷得到的，共有454個(gè)氨基酸殘基。堿性蛋白酶是以前體的形式在細(xì)胞內(nèi)合成的，這種前體形式經(jīng)過(guò)蛋白水解加工形成被分泌的狀態(tài)或成熟狀態(tài)。分析由核苷酸順序推斷得到的氨基末端氨基酸順序表明假定的信號(hào)肽存在于前體分子中。所述信號(hào)肽含有22個(gè)氨基酸殘基，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)類(lèi)似于高等真核生物和原核生物信號(hào)肽的結(jié)構(gòu)(Perlman等，1983，J.Mol.Biol.167，391)。通常與已知的成熟堿性蛋白酶(Ogrydziak等，1982，J.Gen.Microbiol.128，1225)的25個(gè)氨基末端氨基酸相一致的所指示的氨基酸順序中的一個(gè)區(qū)之前是含有信號(hào)肽和2個(gè)胰蛋白酶型的切割位點(diǎn)(Lys-Arg)的157個(gè)氨基酸殘基。用所述切割位點(diǎn)把pro區(qū)分為pro1(-135～-98)和pro2(-97～-1)，參見(jiàn)圖3。成熟堿性蛋白酶有由核苷酸推斷出的297個(gè)氨基酸。預(yù)示來(lái)自核苷酸順序的各種蛋白酶形式的氨基酸順序是與純化形式的酶的大小一致的。除了堿性蛋白酶前體結(jié)構(gòu)順序外，還測(cè)定了5′端側(cè)翼順序片段大約700堿基對(duì)和3′端側(cè)翼順序的600堿基對(duì)。這些區(qū)的分析，說(shuō)明它們含有類(lèi)似于其他真核啟動(dòng)子和終止密碼子的順序，而且對(duì)堿性蛋白酶的表達(dá)來(lái)說(shuō)多半是不可缺少的。
如上所述，轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母的方法和通過(guò)突變的互補(bǔ)作用克隆解脂亞羅威阿酵母基因的方法，包括通過(guò)xpr2突變的互補(bǔ)作用克隆編碼分泌的堿性蛋白酶的XPR2基因，已在歐洲專(zhuān)利0138508中作了報(bào)導(dǎo)。該報(bào)導(dǎo)中所述方法包括通過(guò)用BglII部分消化載體pLD40中的解脂亞羅威阿酵母基因庫(kù)后轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母宿主菌株，所述載體的特征是它攜有含有解脂亞羅威阿酵母LEU2區(qū)的小片段和3個(gè)EcoRI、4個(gè)EcoRV、6個(gè)AvaI、1個(gè)BglII、1個(gè)NcoI、1個(gè)ApaI、2個(gè)XhoI和1個(gè)BstXI核酸內(nèi)切酶的限制性位點(diǎn)。解脂亞羅威阿酵母XPR2轉(zhuǎn)化株中的一個(gè)轉(zhuǎn)化株用來(lái)回收來(lái)自解脂亞羅威阿酵母NRRL Y-1094中的野生型基因(pLD84和pLD86)，解脂亞羅威阿酵母NRRL Y-1094如實(shí)施例一所述供表達(dá)/分泌載體構(gòu)建時(shí)用。
LEU2基因的順序分析pLD25(歐洲專(zhuān)利0138508)中克隆的LEU2基因的DNA順序分析是在重疊限制性片段上用化學(xué)降解法(Maxam等，1980，Methods Enzymol.65，499)測(cè)定的。為了對(duì)β-異丙基蘋(píng)果酸(IPM)脫氫酶密碼區(qū)和恰當(dāng)?shù)拈喿x框架進(jìn)行定位，利用了以前測(cè)定的啤酒酵母LEU2基因所示的氨基酸順序(Andreadis等，1984，J.Biol.Chem.259，8059)。鑒定出了解脂亞羅威阿酵母基因組順序區(qū)，該基因組順序編碼同源于啤酒酵母蛋白質(zhì)順序區(qū)的氨基酸順序。2.8Kb LEU2基因的核苷酸順序和由核苷酸順序推斷得到的β-IPM脫氫酶氨基酸順序在圖12中給出。此外，表達(dá)解脂亞羅威阿酵母β-IPM脫氫酶需要的順序這里是第一次予以介紹。編碼這405個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)的DNA順序是由1215堿基對(duì)組成的(圖12)。除了β-IPM脫氫酶編碼順序外，測(cè)定了5′端順序的大約798堿基對(duì)和3′端順序的797堿基對(duì)(包括TAA轉(zhuǎn)譯終止密碼子)。對(duì)這些區(qū)的分析表明它們包括類(lèi)似于其他真核生物的啟動(dòng)子和終止密碼子的順序，而且是表達(dá)時(shí)必不可少的。
解脂亞羅威阿酵母LEU2基因的5′上游區(qū)在轉(zhuǎn)譯起點(diǎn)前78堿基對(duì)和在所說(shuō)mRNA起點(diǎn)前30堿基對(duì)含有TATATATA順序。對(duì)于真核生物中轉(zhuǎn)錄的啟始具有重要意義的第2個(gè)順序是CAAT盒，在LEU2基因中，這部分順序定位在假定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前74堿基對(duì)，假定的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)自ATG起-48堿基對(duì)(圖12)。
Zaret等(Cell 28，563(1982))認(rèn)為3′下游區(qū)在終止密碼(TAA)之后的72至120核苷酸上有一段順序與5′-TAG…TA(T)GT…TTT-3′順序同源，這對(duì)啤酒酵母中的轉(zhuǎn)錄終止很重要。
實(shí)施例一所用宿主菌株是ATCC 20774(CCTCC 86-142)(MATBleu2-40 bio-6 xpr 2-1002)。XPR2轉(zhuǎn)化株-解脂亞羅威阿酵母ATCC 0781是在脫脂乳指示平板上形成區(qū)帶的一個(gè)菌落，然后從缺亮氨酸平板上進(jìn)行平板影印培養(yǎng)。用歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0138508中的方法從轉(zhuǎn)化株中制備染色體DNA并用來(lái)回收被分泌的蛋白酶的基因。染色體DNA用BglII酶進(jìn)行部分消化，并連接到含有大腸桿菌復(fù)制子和來(lái)自載體的氨芐菁霉素抗性基因的環(huán)化片段上，用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌。染色體DNA也用SalI酶消化并用于在Southern實(shí)驗(yàn)中指示轉(zhuǎn)化株正常LEU2區(qū)未曾受到干擾。(LEU2區(qū)的SalI到EcoRI間的520bp片段即是包含于pLD40中的5′至LEU2片段間的順序用作探針)。為此，由于同源性對(duì)于把質(zhì)粒庫(kù)整合到解脂亞羅威阿酵母中是必需的，所以XPR2區(qū)肯定是整合位點(diǎn)。三個(gè)重疊但不同的質(zhì)粒pLD57、pLD58和pLD62開(kāi)始是從解脂亞羅威阿酵母ATCC 20781(CCTCC 86-149)回收的。它們?cè)趫D1中給出。與基于已知的成熟分泌性蛋白酶蛋白質(zhì)的前25個(gè)氨基酸殘基順序(圖2和3)合成的針對(duì)XPR2基因的合成寡核苷酸探針雜交表明分泌性蛋白酶的基因已被克隆。為了測(cè)定回收的基因是代表野生型拷貝還是突變型拷貝，用pLD58轉(zhuǎn)化受體解脂亞羅威阿酵母菌株。由于沒(méi)有從任何依賴(lài)于亮氨酸的轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生蛋白酶陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株，所以結(jié)論是pLD58含有該基因的等位基因突變。
存在于野生型菌株NRRL Y-1094中的XPR2基因形式是通過(guò)大腸桿菌菌落的雜交試驗(yàn)得到的。探針用的是由測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)含有整個(gè)結(jié)構(gòu)基因的2Kb PvuI-EcoRI片段。正如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0138508所介紹的，從pLD40中NRRL Y-1094 DNA的Sau3A部分消化的片段的原始庫(kù)中，獲得與本探針雜交的一些克隆。其中兩個(gè)克隆含有非常相似于被命名為pLD84和pLD86的質(zhì)粒，他們被用來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體。兩種質(zhì)粒含有相同的XPR2密碼子的5′末端即Sau3A位點(diǎn)(被結(jié)合重新產(chǎn)生載體的BamHI位點(diǎn))，圖3中的順序就是從此開(kāi)始的。每個(gè)都含有蛋白酶的全部結(jié)構(gòu)基因和假定的轉(zhuǎn)錄終止密碼子，并且包括來(lái)自NRRL Y-1094菌株的XPR2密碼子大約4至5Kb的整個(gè)插入片段。pLD86中的插入片段3′端含有額外的幾百堿基對(duì)。為了構(gòu)建表達(dá)載體，我們用的是3′擴(kuò)展到BglII位點(diǎn)的順序(堿基對(duì)2655)，所以兩個(gè)質(zhì)粒供應(yīng)了相同的DNA，其作用是與圖3的順序相等的。
表達(dá)/分泌載體的構(gòu)建為了實(shí)現(xiàn)表達(dá)和分泌解脂亞羅威阿酵母中的凝乳酶原而設(shè)計(jì)的一個(gè)計(jì)劃采用在整合性克隆載體中的各種雜交基因的構(gòu)建體。這樣一個(gè)途徑創(chuàng)造出幾個(gè)具有廣泛的共同DNA順序區(qū)域的不同的質(zhì)粒。事實(shí)上，用于組裝質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建方案是用凝乳酶原基因插入到所示的XPR2信號(hào)肽加工位點(diǎn)假定的pro1加工位點(diǎn)和已知能產(chǎn)生成熟堿性蛋白酶的裂解位點(diǎn)的3′端。一般說(shuō)來(lái)對(duì)異源基因而言，理想的是插在用于表達(dá)的酵母啟動(dòng)子和終止順序之間。已認(rèn)識(shí)到雜交基因順序的氨基末端順序部分隨著不同的質(zhì)粒構(gòu)建體而變化，但是凝乳酶原結(jié)構(gòu)基因順序、XPR2終止密碼子順序和穿梭載體DNA在各個(gè)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建體中則是相同的。于是計(jì)劃把相同的凝乳酶原結(jié)構(gòu)基因片段和終止密碼子/載體質(zhì)粒用于如下所述的各個(gè)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建中。不同的凝乳酶原表達(dá)/分泌質(zhì)粒構(gòu)建體在緊接著XPR2基因啟動(dòng)子順序下游的N末端堿性蛋白酶前體順序的長(zhǎng)度范圍內(nèi)有所變化，所說(shuō)的前體順序在凝乳酶原基因順序之前。為此，在XPR2凝乳酶原接合區(qū)內(nèi)，把各個(gè)表達(dá)質(zhì)粒的啟動(dòng)子片段的組分設(shè)計(jì)成可變的順序。所有表達(dá)/分泌載體都用含有三個(gè)組成片段的相似的連接反應(yīng)進(jìn)行組裝。
用于構(gòu)建終止密碼子載體pterm4的實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)圖4所示。首先將合成連接子與含有XPR2基因3′末端的片段連接，后者包括轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號(hào)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用核酸內(nèi)切酶KpnI切割質(zhì)粒pLD84，再用合成連接子雙股DNA連接(圖4)。用核酸內(nèi)切酶HindIII和BglII切割連接產(chǎn)物并將一個(gè)760堿基對(duì)片段插入到用相同的兩個(gè)核酸內(nèi)切酶進(jìn)行線性化的質(zhì)粒pLD41中，得到pterm4。質(zhì)粒pterm4用它的限制制性圖來(lái)鑒定。對(duì)用EcoRV、EcoRI、KpnI、BglII-HindIII和BglII-BclI等一系列限制性核酸內(nèi)切酶消化的結(jié)果進(jìn)行分析。消化提供了合適的片段，證明在如歐洲專(zhuān)利0138508所述的穿梭質(zhì)粒pLD41中存在著合成連接子和XPR2基因的“完整”3′末端。圖4給出了這個(gè)7.3Kb終止密碼子載體的部分圖。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pLS-3的構(gòu)建圖5概述了用于解脂亞羅威阿酵母中分泌凝乳酶原的起始質(zhì)粒的構(gòu)建。其限制性圖在圖5中給出。凝乳酶原分泌質(zhì)粒的構(gòu)建是從制備含有大部分凝乳酶原結(jié)構(gòu)基因順序的片段著手的。從大腸桿菌凝乳酶原表達(dá)質(zhì)粒pPFZ-84A中分離出含有編碼凝乳酶原的6-365殘基密碼順序的1080堿基對(duì)BclI-BamHI(部分)DNA片段。(質(zhì)粒pPFZ-84A是凝乳酶原表達(dá)質(zhì)粒pPFZ-R2的衍生物，它的構(gòu)建在1985年7月3日公布的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0147178號(hào)中已作了介紹，并且已用限制性片段置換法通過(guò)合成寡核苷酸指導(dǎo)的誘變制成。具體地說(shuō)，pPFZ-84A不同于pPFZ-R2僅有兩處，即在凝乳酶原氨基酸殘基214(天冬酰胺→天冬氨酸)286(天冬氨酸→甘氨酸)兩個(gè)堿基對(duì)，從而編碼所謂的凝乳酶原A等位基因，但兩個(gè)質(zhì)粒都含有凝乳酶原的理想順序并且在這個(gè)實(shí)施例中作用是相等的)。含有編碼堿性蛋白酶前體和凝乳酶原1至5的密碼順序的XPR2啟動(dòng)子組成片段按下述方法制備。從XPR2亞克隆質(zhì)粒pLD90分離出含有啟動(dòng)子區(qū)和堿性蛋白酶基因5′末端的870堿基對(duì)HindIII-AvaI DNA片段，它與具有下述結(jié)構(gòu)的人工合成片段連接5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGAGCTGAGATCACTAG3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTG 5′譯讀方向→這個(gè)順序含有AvaI粘性末端，然后是對(duì)堿性蛋白酶前肽的最后9個(gè)密碼子進(jìn)行編碼的順序，接著對(duì)凝乳酶原的前4個(gè)氨基酸進(jìn)行編碼的，最后在BamHI位點(diǎn)終止。啟動(dòng)子組成片段是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)，借助T4連接酶將人工合成片段和870bp HindIII-AvaI片段連接后再用HindIII和BamHI切割而得到的。最后得到的連接順序通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純化，選出916堿基對(duì)HindIII-BamHI DNA片段。如上所述，雜交基因的3′末端是由終止密碼子/載體質(zhì)粒pterm4得到的。質(zhì)粒pterm4用HindIII-BclI消化，并從瓊脂糖凝膠中分離出大約7.3Kb HindIII-BclI終止密碼子/載體DNA片段，該片段含有XPR2終止密碼子、LEU2可選擇標(biāo)記物和pBR322。
凝乳酶原表達(dá)/分泌質(zhì)粒pLD-3通過(guò)對(duì)3個(gè)組成DNA片段(用HindIII-BclI切割的pterm4質(zhì)粒、以及916堿基對(duì)HindIII-BamHI啟動(dòng)子和1080堿基對(duì)BamHI-BclI凝乳酶原基因的片段)的保溫而結(jié)合在一起，構(gòu)建如上所述有連接酶T4參加(見(jiàn)圖5)。連接的混合物采用Dagert等人(Gene 6，23-28(1979))的氯化鈣方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從選擇出的氨芐菁霉素抗性轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒，質(zhì)粒pLS-3用其限制性圖進(jìn)行鑒定(圖6A)。這個(gè)質(zhì)粒的XPR2-凝乳酶區(qū)經(jīng)測(cè)序，肯定為人工合成DNA的適合順序和理想片段的恰當(dāng)?shù)慕Y(jié)合。
pLD90的制備。這種質(zhì)粒含有源自pLD84的亞克隆。如下所述，將自XPR2啟動(dòng)子區(qū)的PvuI位點(diǎn)至終止區(qū)的EcoRI位點(diǎn)的DNA區(qū)亞克隆到pBR322的HindIII位點(diǎn)。用上述的兩個(gè)限制性酶消化幾微克pLD84。然后，被消化的DNA分子的“粘性”末端用DNA聚合酶I的克列諾夫(Klenow)片段填平。將激酶處理過(guò)的HindIII連接子(由New England Biolabs供應(yīng)的CAAGCTTG)用T4 DNA連接酶加到末端。去除多余的連接子，用HindIII酶進(jìn)行連續(xù)消化，形成HindIII粘性末端。將DNA分子的混合物在制備性瓊脂糖凝膠上電泳，切下所需的2Kb帶，進(jìn)行純化，與經(jīng)HindIII消化過(guò)的并經(jīng)細(xì)菌堿性磷酸酶處理過(guò)的載體pBR322一起加到連接反應(yīng)中。連接混合物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌。帶有靠近pBR322的EcoRI位點(diǎn)的XPR2終止密碼子的EcoRI位點(diǎn)的方向取名為pLD90，相反方向的則取名為pLD91。
包括在pLS-3中的XPR2啟動(dòng)子區(qū)的5′末端是PvuI位點(diǎn)，大約是從圖3所列順序區(qū)開(kāi)始起的280堿基對(duì)。發(fā)現(xiàn)含有野生型蛋白酶基因的質(zhì)粒在這樣大量啟動(dòng)子控制下，當(dāng)被整合到基因組在遠(yuǎn)離固有的xpr2座位的位點(diǎn)時(shí)，不能使轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生大量的蛋白酶(在脫脂乳平板上的透明區(qū)作出的鑒定)。
我們注意到，如果pLS-3含有縮短的因而是“有缺陷”的啟動(dòng)子，那么從質(zhì)粒與固有的野生型XPR2基因重組的整合結(jié)果，產(chǎn)生完整的啟動(dòng)子，它控制凝乳酶原融合產(chǎn)物的表達(dá)；但有缺陷的啟動(dòng)子則是控制蛋白酶的表達(dá)。類(lèi)似基因破碎型的試驗(yàn)是用Shortle等人(Science 217371～373，1982)的啤酒酵母活性基因來(lái)完成的。與我們的預(yù)料相一致的是，有些帶有pLS-3不依賴(lài)亮氨酸的轉(zhuǎn)化株，現(xiàn)在知道實(shí)際上就是有缺陷的蛋白酶。有缺陷的蛋白酶轉(zhuǎn)化株與不希望要的副產(chǎn)品如在leu2上的基因轉(zhuǎn)化株相比，更可能是所需要的在XPR2座位上的整合株。關(guān)于受體菌株ATCC20688(CCTCC 86-152)，我們發(fā)現(xiàn)未切割的pLS-3產(chǎn)生6.5％蛋白酶缺陷的轉(zhuǎn)化株，反之，用SnaBI切割的質(zhì)粒所產(chǎn)生的蛋白酶缺陷的轉(zhuǎn)化株約為70％。就這種轉(zhuǎn)化而言，基因破碎都可回避為了從所有轉(zhuǎn)化株中證實(shí)合適的整合而需要進(jìn)行大量的Southern印跡試驗(yàn)。
含有在XPR2啟動(dòng)子控制下的野生型蛋白酶結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒(位于圖3所列順序的起始處)，當(dāng)其被整合到解脂亞羅威阿酵母細(xì)胞除xpr2座位外的位點(diǎn)上時(shí)，可以表達(dá)大量的蛋白酶?？墒牵瑥倪@類(lèi)整合株中有效地表達(dá)異源基因可能要求進(jìn)一步改進(jìn)這個(gè)控制區(qū)DNA。
凝乳酶原的分泌用未切割pLS-3DNA和用SnaBI消化的pLS-3 DNA轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母菌株ATCC20688(CCTCC86-152)，可分別獲得xpr-leu+轉(zhuǎn)化株ATCC20775(CCTCC86-143)(DL144)和ATCC20776(CCTCC 86-144)(DL148)。將這些轉(zhuǎn)化菌株接種到含有YEPD培養(yǎng)基的試管中。細(xì)胞在28℃下生長(zhǎng)過(guò)夜。將這些培養(yǎng)物的等分試樣(250微升)以1∶100稀釋到每份為25毫升的GPP培養(yǎng)基中。在28℃下細(xì)胞在搖瓶中生長(zhǎng)16～18小時(shí)，測(cè)得600nm處吸光率為5.0-7.0，然后經(jīng)離心收獲細(xì)胞，通過(guò)濃縮上清液并將濃縮物進(jìn)行SDS-PAGE，測(cè)定所得到的培養(yǎng)液或上清液中的凝乳酶原。通過(guò)電泳把板狀凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素紙上，電泳在20mM Tris堿、150mM甘氨酸、20％甲醇存在下以，500毫安在4℃下進(jìn)行2小時(shí)。板狀凝膠中移出的蛋白質(zhì)是用考馬斯藍(lán)染色來(lái)鑒定的。
硝酸纖維素紙?jiān)?7℃下干燥，在65℃烘烤1小時(shí)，然后在TBS(200mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH7.5)中漂洗。將硝酸纖維素紙置于含有10％馬血清(Gibco，Chagrin Falls，俄亥俄)的TBS中，在室溫下保溫30分鐘，然后在含有10％馬血清和經(jīng)適當(dāng)稀釋的凝乳酶原抗體的TBS中在室溫條件下保溫16小時(shí)。再將硝酸纖維素紙放在TBS中漂洗三次，10分鐘，接著在含有10％馬血清的TBS中保溫，然后在含有10％馬血清和經(jīng)適當(dāng)稀釋的結(jié)合了辣根過(guò)氧化物酶的羊抗兔IgG抗體的TBS中保溫2小時(shí)。再將硝化纖維素紙?jiān)赥BS中漂洗3次，10分鐘，在4-氯-1-萘酚(3毫克/毫升的甲醇溶液)中顯色，然后加到含有0.01％過(guò)氧化氫的TBS中至濃度為0.5毫克/毫升。測(cè)定兩個(gè)上清液中存在分子量為40,000的凝乳酶原。
在酸活化濃縮培養(yǎng)上清液(見(jiàn)上)后，在從含有pLS-3轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物ATCC20775和20776制備的樣品中存在著明顯的凝乳活性。正如所預(yù)料的，在受體解脂亞羅威阿酵母ATCC20688的對(duì)照培養(yǎng)上清液中沒(méi)有得到凝乳活性。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-33的構(gòu)建為了把pLS-3轉(zhuǎn)入改進(jìn)的表達(dá)質(zhì)粒pXX-33所作出的改進(jìn)已在圖6中作了概述。這種改進(jìn)增加了XPR2啟動(dòng)區(qū)280堿基對(duì)，就pLS-3而言，表達(dá)質(zhì)粒pXX-33含有一個(gè)編碼完整的堿性蛋白酶前肽原(prepro-peptide)(157個(gè)氨基酸殘基)的雜交基因，堿性蛋白酶被連接到整個(gè)凝乳酶原的結(jié)構(gòu)基因順序上。
在以比pLS-3中多280bp的XPR2啟動(dòng)子構(gòu)建凝乳酶原表達(dá)/分泌質(zhì)粒之前，有必要將含有完整堿性蛋白酶基因的一個(gè)限制性片段亞克隆到HindIII位點(diǎn)。這個(gè)亞克隆是通過(guò)把合成連接子加到由XPR2基因組文庫(kù)克隆pLD86分離得到的限制性片段中組裝而成。構(gòu)建這種帶有上游區(qū)HindIII位點(diǎn)的XPR2亞克隆是從制備含有所有堿性蛋白酶基因的DNA片段著手的。XPR2克隆pLD-86的基因組區(qū)中的2.3Kb EcoRI-BamHI(部分)片段是通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化的，用合成片段進(jìn)行連接，其順序?yàn)?′GATCGAAGCTTG3′3′ TTCGAACTTAA5′這種連接子順序含有一個(gè)BamHI粘性末端(但不再重新產(chǎn)生BamHI位點(diǎn))，然后先后為HindIII位點(diǎn)和EcoRI粘性末端。連接產(chǎn)物用HindIII消化，然后插入到pBR322的HindIII位點(diǎn)。質(zhì)粒pXHP-24通過(guò)它的限制性圖予以鑒定，成為用于未來(lái)表達(dá)構(gòu)建體的XPR2啟動(dòng)子片段的來(lái)源。
在質(zhì)粒pXHP-24中，亞克隆的XPR2基因含有的5′XPR2啟動(dòng)子順序比pLS-3中所含有XPR2啟動(dòng)子順序多大約280堿基對(duì)。首先，啟動(dòng)子組成片段通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)，用合成DNA片段(如上面所述的pLS-3)和pXHP-24中的1150堿基對(duì)HindIII-AvaI片段借助T4連接酶進(jìn)行連接，然后用HindIII及BamHI切割后得到。將所得到的連接順序通過(guò)凝膠電泳純化，選出大約1196堿基對(duì)HindIII-BamHI片段。第二個(gè)片段含有編碼6～151個(gè)凝乳酶原氨基酸殘基的順序，是從經(jīng)BamHI和XmaI切割的pLS-3以及凝膠純化所得到的440堿基對(duì)BamHI-XmaI DNA片段進(jìn)行制備的。第三個(gè)含有凝乳酶原基因的剩余部分、XPR2終止密碼子和載體順序的片段是由用HindIII和XmaI切割的pLS-3，以及凝膠純化大約8.0Kb HindIII-XmaI載體片段進(jìn)行制備的。然后將三個(gè)片段用上述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行連接。將連接反應(yīng)產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從根據(jù)氨芐青霉素抗性選出的轉(zhuǎn)化株中分離出質(zhì)粒，質(zhì)粒pXX-33用它的限制性圖進(jìn)行鑒定(圖6)。對(duì)這種質(zhì)粒的蛋白酶-凝乳酶原區(qū)測(cè)序證實(shí)了所需片段的正確連接。
然后用經(jīng)SnaBI切割的pXX-33轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母ATCC20774提供解脂亞羅威阿酵母ATCC20780，通過(guò)如上面所述的pLS-3的情況測(cè)定轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物分泌到培養(yǎng)基中的凝乳酶原。結(jié)果證明在培養(yǎng)上清液中存在凝乳酶原。
在酸活化濃縮的培養(yǎng)上清液后(見(jiàn)上)，在由轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物解脂亞羅威阿酵母ATCC20780中制備的樣品中觀察到明顯的凝乳活性。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-22的構(gòu)建構(gòu)建表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-22的實(shí)驗(yàn)步驟已在圖7中給出。表達(dá)載體在兩個(gè)方面不同于pLS-3。如同pXX-33一樣，它含有附加的280堿基對(duì)片段的XPR2啟動(dòng)子順序。其次，它含有編碼堿性蛋白酶信號(hào)肽的順序和僅僅38個(gè)前肽(pro1)的氨基酸殘基。
構(gòu)建pXX-22的計(jì)劃與pXX-33相似。首先，啟動(dòng)子組成片段是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的連接反應(yīng)，用pXHP-24中的890堿基對(duì)HindIII-BglII片段以及合成片段借助T4連接酶進(jìn)行連接，再用HindIII和BamHI消化之后得到的，合成片段的順序?yàn)?′GATCTTGCTGAGATCACTAG 3′3′AACGACTCTAGTGATCCTAG 5′得到的連接順序通過(guò)凝膠電泳分離920堿基對(duì)HindIII-BamHIDNA片段進(jìn)行純化。另一個(gè)編碼凝乳酶原6～151殘基的片段，是由pLS-3經(jīng)BamHI和XmaI切割以及凝膠純化所得到的440堿基對(duì)BamHI-XmaI DNA片段而分離出來(lái)的。第三個(gè)含有凝乳酶原基因其余部分、XPR2終止區(qū)和載體順序的片段是通過(guò)用HindIII和XmaI切割pLS-3以及凝膠純化大約8.0Kb載體片段進(jìn)行制備的。然后將3個(gè)DNA片段用上述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行連接。將連接反應(yīng)物用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選擇的轉(zhuǎn)化株中分離出質(zhì)粒，質(zhì)粒pXX-22是用它的限制性圖進(jìn)行鑒定的(圖7)。
然后用經(jīng)SnaBI切割的pXX-22轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母ATCC20774，以提供解脂亞羅威阿酵母ATCC20779，通過(guò)如上面所述的pLS-3的情況測(cè)定轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物在培養(yǎng)液中分泌的凝乳酶原。按照上述方法確定在培養(yǎng)上清液中存在著凝乳酶原。在酸活化濃縮的培養(yǎng)上清液后(見(jiàn)上)，在由轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物解脂亞羅威阿酵母ATCC20779中制備的樣品中觀察到顯著的凝乳活性。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-11的構(gòu)建構(gòu)建凝乳酶原表達(dá)/分泌質(zhì)粒pXX-11的實(shí)驗(yàn)步驟在圖8中作了概述。這種質(zhì)粒含有XPR2啟動(dòng)子順序和連接編碼凝乳酶原順序的22個(gè)氨基酸殘基信號(hào)肽。用于pXX-11的構(gòu)建計(jì)劃與用于pXX-22和pXX-33的構(gòu)建計(jì)劃相類(lèi)似。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，啟動(dòng)子組成片段是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的連接反應(yīng)，用pXHP-24中大約750堿基對(duì)HindIII-BgIII DNA片段和合成片段在T4連接酶存在下連接，再經(jīng)HindIII和BamHI切割后獲得的，其中合成片段的順序?yàn)?′ TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3′3′AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5′→所得連接順序通過(guò)凝膠電泳純化，選出790堿基對(duì)HindIII-BamHI DNA片段。編碼凝乳酶原殘基6～151的另一個(gè)片段則是從pLS-3中經(jīng)BamHI和XmaI切割并經(jīng)凝膠純化所得到的440堿基對(duì)BamHI-XmaI DNA片段分離出來(lái)。第3個(gè)含有凝乳酶原結(jié)構(gòu)基因其余部分、XPR2終止密碼子和穿梭載體順序的片段則是通過(guò)用HindIII和XmaI切割pLS-3并經(jīng)凝膠純化的大約8.0Kb載體片段進(jìn)行制備的。然后將3個(gè)DNA片段用上述標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行連接。連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選擇的轉(zhuǎn)化株中分離出質(zhì)粒，質(zhì)粒pXX-11用它的限制性圖進(jìn)行鑒定(圖8)。質(zhì)粒的XPR2-凝乳酶原部分的測(cè)序證實(shí)了合適的合成DNA順序及所需片段的正確連接。
然后用經(jīng)過(guò)SnaBI切割的pXX-11轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母ATCC20774產(chǎn)生解脂亞羅威阿酵母20778，通過(guò)如上面所述的pLS-3方法測(cè)定轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物分泌在培養(yǎng)基中的凝乳酶原。按照上述方法，確定在培養(yǎng)上清液中存在著凝乳酶原。
凝乳測(cè)定(見(jiàn)上)表明，在含有pXX-11的轉(zhuǎn)化株ATCC20778的培養(yǎng)上清液中存在著明顯的凝乳活性。
實(shí)施例二連接臺(tái)的構(gòu)建對(duì)應(yīng)于ATCC20774中的bio-6等位基因的野生型BIO基因按如下方法通過(guò)互補(bǔ)進(jìn)行克隆。經(jīng)Sau3A部分消化插入pLD40的BamHI位點(diǎn)(這是在EcoRI位點(diǎn)上的pBR322＋LEU2)的解脂亞羅威阿酵母染色體DNA構(gòu)建了基因文庫(kù)，制備了大量文庫(kù)DNA作為混合培養(yǎng)大腸桿菌質(zhì)粒制備物(這是與用于克隆XPR2基因相同的文庫(kù))。用酶ApaI(在LEU2區(qū)進(jìn)行一次切割)消化幾微克的文庫(kù)DNA，通過(guò)將轉(zhuǎn)化混合物涂覆在缺亮氨酸的合成培養(yǎng)基上，用該DNA轉(zhuǎn)化ATCC20774(leu2 xpr2 bio)。獲得幾萬(wàn)個(gè)不依賴(lài)亮氨酸的轉(zhuǎn)化株。為了搞清哪些菌落含有包括BIO基因的文庫(kù)質(zhì)粒(如果有的話)，把不依賴(lài)亮氨酸的轉(zhuǎn)化株平板影印轉(zhuǎn)移到含有生物素選擇培養(yǎng)基的瓊脂平板上(每升配方25毫克脫硫生物素、20克葡萄糖、5克硫酸銨、1克KH2PO4、0.5克MgSO4·7H2O、0.1克CaCl2、0.1克NaCl、500微克硼酸、400微克硫胺素·HCl、400微克ZnSO4·7H2O、400微克MnSO4·H2O、200微克Na2MoO4·2H2O、200微克FeCl3·6H2O、100微克KI和40微克CuSO4·5H2O)。
一種生長(zhǎng)在生物素選擇培養(yǎng)基上的解脂亞羅威阿酵母BIO+轉(zhuǎn)化株，取名為DL31。我們著手從解脂亞羅威阿酵母菌株DL31中回收含有BIO基因的基因文庫(kù)質(zhì)粒。從培養(yǎng)菌株DL31中制備染色體DNA。用限制性酶ApaI消化幾微克這種染色體DNA就能切除文庫(kù)質(zhì)粒。將被消化的DNA的等分部份用于連接反應(yīng)，使未知的文庫(kù)質(zhì)粒環(huán)化。然后將連接混合物用來(lái)轉(zhuǎn)化氨芐青霉素抗性大腸桿菌培養(yǎng)物，以回收進(jìn)入大腸桿菌的含有BIO的未知質(zhì)粒。獲得了少量的氨芐青霉素抗性大腸桿菌轉(zhuǎn)化株。用大腸桿菌轉(zhuǎn)化株進(jìn)行小規(guī)模的質(zhì)粒制備。這樣得到的質(zhì)粒DNA的限制性消化物表明含BIO的未知質(zhì)粒，正如所預(yù)料的那樣等同于在BamHI位點(diǎn)帶有插入片段的pLD40。這種質(zhì)粒一定源于我們的基因文庫(kù)，取名為pLD51。
質(zhì)粒pLD56是通過(guò)去除pLD51中的LEU2基因作為pLD51的亞克隆而產(chǎn)生的，介紹如下。用酶EcoRI消化質(zhì)粒pLD51的等分部分，以去除LEU區(qū)。被消化的DNA用于DNA的連接反應(yīng)，使質(zhì)粒環(huán)化。然后完成大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，以克隆含有BIO的較小質(zhì)粒。有一種氨芐青霉素抗性大腸桿菌轉(zhuǎn)化株表明含有所期望的較小質(zhì)粒，取名pLD56。完成了pLD56的一些限制性消化。含有BIO的pLD56片段，作為在pBR322的BamHI位點(diǎn)存在的一個(gè)插入片段，長(zhǎng)約3.6Kb。
一張非常粗略的解脂亞羅威阿酵母DNA的3.6Kb插入片段插入pBR322的BamHI位點(diǎn)(包括pLD56)的限制性圖將在下面介紹，從插入開(kāi)始的大約距離以bp數(shù)示于括號(hào)內(nèi)。量值的估計(jì)是從幾塊瓊脂糖凝膠得出的，量值的誤差相當(dāng)大PvuII(800)，PvuII(1200)，PstI(1800)，MluI(2000)，PstI(2300)，EcoRV(2700)，NcoI(3200)(取向pBR322的SalI位點(diǎn)居于所述各位點(diǎn)之先，HindIII位點(diǎn)在各位點(diǎn)之后)。
菌株ATCC20774(MATB leu2-40 bio-6 xpr2-1002)用完整的pLD56(pBR322＋含有BIO基因的約3.6Kb解脂亞羅威阿酵母染色體DNA)轉(zhuǎn)化。對(duì)3個(gè)不依賴(lài)生物素的不同轉(zhuǎn)化株與其親代菌株作比較，進(jìn)行NruI切割(以pBR322為目標(biāo))pLD40(在pBR322上的LEU2)的高頻轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，以測(cè)定哪些含有整合到BIO區(qū)的固有pBR322。因?yàn)閜LD40都整合到固有的pBR322中，所以3個(gè)轉(zhuǎn)化株都顯示出高頻轉(zhuǎn)化。這已由Southern印跡雜交試驗(yàn)所確認(rèn)。3個(gè)原始的解脂亞羅威阿酵母BIO轉(zhuǎn)化株中有一株取名為DL118并進(jìn)一步用作DNA受體。上述的限制性圖需要確定(1)以什么作為BIO特異性雜交探針(一個(gè)NcoI-PvuII片段)；(2)需要用哪種酶來(lái)正確地切除pLD56質(zhì)粒(MluI)；(3)哪個(gè)酶只在pBR322部分中進(jìn)行一次切割(ClaI)；(4)哪種酶完全不能切割質(zhì)粒(ApaI)。ATCC20774和DL118(已用BIO片段探測(cè))中DNA的ClaI和ApaI消化物的Southern雜交表明，正如預(yù)料的一樣，DL118的生物素區(qū)(在與ATCC20774的BIO區(qū)相比較時(shí))是被附加的近似于pLD56大小的DNA破壞了。DL118 DNA的MluI消化片段(已用pBR322進(jìn)行探測(cè))進(jìn)一步表明附加的DNA與完整的pLD56同樣大小。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pLX-34的構(gòu)建構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒是把帶有XPR2分泌信號(hào)(157個(gè)氨基酸前原順序)的凝乳酶密碼順序置于LEU2啟動(dòng)子的下游。這種表達(dá)質(zhì)粒顯示出除了XPR2啟動(dòng)子外的啟動(dòng)子可用來(lái)成功地分泌異源蛋白質(zhì)。此外，這種表達(dá)載體能夠?qū)崿F(xiàn)與解脂亞羅威阿酵母基因組中整合位點(diǎn)無(wú)關(guān)的表達(dá)/分泌。成功地分泌帶有除了XPR啟動(dòng)子外的其他啟動(dòng)子的凝乳酶原說(shuō)明為了鑒定解脂亞羅威阿酵母中另外新的更強(qiáng)的啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)載體的可能性。此外，這種方法能夠用來(lái)獲得表達(dá)培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物具有兩個(gè)分離的雜交凝乳酶原基因，一個(gè)由LEU2啟動(dòng)子表達(dá)，另一個(gè)由XPR2啟動(dòng)子表達(dá)，被分別整合在宿主基因組中不同的位點(diǎn)上。
構(gòu)建表達(dá)載體的試驗(yàn)步驟在圖13中已作了概述，該載體含有凝乳酶原基因，帶有用LEU2啟動(dòng)子順序表達(dá)的堿性蛋白酶分泌信號(hào)(157個(gè)氨基酸的XPR2前原順序)。構(gòu)建這種質(zhì)粒是從制備LEU2啟動(dòng)子片段起始的，該片段含有上述β-異丙基苯果酸脫氫酶基因的ATG轉(zhuǎn)譯起始密碼子前的5′非轉(zhuǎn)譯順序大約300堿基對(duì)(圖12)。從穿梭載體pLD40中分離出為L(zhǎng)EU2啟動(dòng)子順序的270堿基對(duì)部分編碼的300堿基對(duì)HindIII-FokI DNA片段。這個(gè)片段用T4連接酶與54堿基對(duì)具有下列順序的合成連接子連接，----------Leu2-------FokI5′-ATACAACCACACACATCCACAATG3′-TTGGTGTGTGTAGGTGTTAC-----------------Xpr2----------------BglIAAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC -3′TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC-5′然后用HindIII進(jìn)行消化。所得連接順序再用凝膠電泳分離大約360堿基對(duì)的HindIII-BglI DNA片段進(jìn)行純化。編碼XPR2前原順序的剩余部分和凝乳酶原的前152個(gè)氨基酸殘基的另一個(gè)組成片段是從表達(dá)質(zhì)粒pXX-33(圖6)經(jīng)BglI和XamI切割分離出來(lái)的，再用凝膠純化得到887堿基對(duì)DNA片段。第三個(gè)片段含有凝乳酶原基因的剩余部分、XPR2終止密碼子和載體順序，它是通過(guò)HindIII和XmaI切割pXX-33，再經(jīng)切割大約8.0Kb載體片段再經(jīng)凝膠純化制備得到的。將這三個(gè)DNA片段用上述標(biāo)準(zhǔn)方法連接。連接反應(yīng)物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株HB101。從選出的氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化株中分離質(zhì)粒，質(zhì)粒pLX-34用它的限制性圖(圖13)進(jìn)行鑒定。
用經(jīng)NruI切割的pLX-34 DNA來(lái)轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母ATCC20794(DL118)，以提供解脂亞羅威阿酵母ATCC20795(DL251)，并按上述pLS-3時(shí)的方法測(cè)定由不依賴(lài)亮氨酸的轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)物分泌到培養(yǎng)液中的凝乳酶原。這種轉(zhuǎn)化方法指導(dǎo)pLX-34整合到預(yù)先引入宿主染色體bio座位上的pBR322順序中(如上所述)。pLX-34在這個(gè)位點(diǎn)上的整合是用Southern分析法予以證實(shí)的。
用DL118作為受體Southern雜交實(shí)驗(yàn)按下述方法進(jìn)行DL118轉(zhuǎn)化株DNA的NruI消化片段(例如當(dāng)參入質(zhì)粒是凝乳酶原表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，就與凝乳酶原探針雜交)精確地切割了參入質(zhì)粒。用幾毫微克經(jīng)NruI消化的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒檢查雜交帶的正確大小，這些轉(zhuǎn)化株DNA(已用32P標(biāo)記的pBR322進(jìn)行探測(cè))的MluI消化片段(在轉(zhuǎn)化質(zhì)粒中MluI不切割)也表明DL118固有的pBR322順序由于加入了一個(gè)或更多個(gè)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的分子而受到破壞。這證明整合是在所需位點(diǎn)上發(fā)生的。
將轉(zhuǎn)化株培養(yǎng)物解脂亞羅威阿酵母ATCC20795(DL251)置于YEPD培養(yǎng)基中于22℃培養(yǎng)，以利于由LEU2啟動(dòng)子表達(dá)。在培養(yǎng)上清液中存在的凝乳酶原用酸活化培養(yǎng)上清液的凝乳測(cè)定(見(jiàn)上)予以證實(shí)并經(jīng)免疫印跡分析(見(jiàn)上)確認(rèn)。上述結(jié)果表明，這個(gè)雜交基因是一個(gè)獨(dú)立的表達(dá)單位，當(dāng)在除了XPR2或LEU2外的位點(diǎn)上整合時(shí)，能夠表達(dá)/分泌。這個(gè)特點(diǎn)使人們能夠用多重雜交基因構(gòu)建表達(dá)培養(yǎng)物，它具有產(chǎn)生高水平的細(xì)胞外凝乳酶原的潛在能力。
實(shí)施例三人C5a的合成基因的順序?qū)崿F(xiàn)由細(xì)菌產(chǎn)生人過(guò)敏毒素C5a而設(shè)計(jì)的計(jì)劃，類(lèi)似于如在歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0147178號(hào)中所述的用于合成和表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的先前方法。采用構(gòu)建的一個(gè)基因，其中用于編碼激活的補(bǔ)體成分C5a的順序是人工合成的。給出已知的人C5a的氨基酸順序，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)編碼其74個(gè)氨基酸信息的DNA片段(圖9)。選擇合成基因順序以擴(kuò)大大腸桿菌和啤酒酵母優(yōu)選密碼子的利用，并可使限制性核酸內(nèi)切酶的若干位點(diǎn)便于鑒定。這項(xiàng)方案可以通過(guò)在編碼C5a多肽第一個(gè)氨基酸的三聯(lián)體之前引入蛋白質(zhì)合成的ATG起始密碼子，使得過(guò)敏毒素在大腸桿菌內(nèi)直接表達(dá)。為便于在所需的取向上插入到質(zhì)粒pBR322中，設(shè)計(jì)的合成C5a基因在其末端含有EcoRI和HindIII限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。為了獲得C5a基因順序，通過(guò)phosporamidite方法合成10個(gè)47聚體并且組裝成235bp雙股DNA片段。將C5a基因片段插入到被適當(dāng)切割的pBR322中，并從隨機(jī)挑選的轉(zhuǎn)化株中通過(guò)質(zhì)粒DNA的限制性切割分析來(lái)鑒定克隆基因。然后采用DNA順序測(cè)定法分析若干C5a克隆，鑒別出帶有正確順序的克隆。在被檢查的5個(gè)克隆中有2個(gè)找到了預(yù)期的C5a基因區(qū)的核苷酸順序。
人C5a的細(xì)菌表達(dá)構(gòu)建C5a表達(dá)質(zhì)粒是從用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI切割C5a亞克隆起始的，然后用細(xì)菌堿性磷酸酶處理脫磷酸化。用含有trp啟動(dòng)子—操縱子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)順序的pPFZ-R2中的360bp EcoRI DNA片段，構(gòu)建C5a表達(dá)質(zhì)粒。用連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株HB101的感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)各個(gè)轉(zhuǎn)化中的一些抗藥性菌落進(jìn)行純化，并對(duì)它們的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶圖譜分析，以鑒定在能導(dǎo)致C5a基因轉(zhuǎn)錄的取向上帶有trp啟動(dòng)子的那些表達(dá)質(zhì)粒。從上述連接反應(yīng)中得到的多重分離物與含有過(guò)敏毒素基因的質(zhì)粒相一致，所說(shuō)的過(guò)敏毒素基因鄰近直接表達(dá)C5a所需的構(gòu)型中的細(xì)菌啟動(dòng)子順序。C5a表達(dá)質(zhì)粒pC5a-48的限制性圖見(jiàn)圖10。
人過(guò)敏毒素在解脂亞羅威阿酵母中的表達(dá)和分泌編碼分泌人過(guò)敏毒素C5a的表達(dá)/分泌載體pC5aX-3的制備技術(shù)如實(shí)施例一對(duì)pXX-33所述。然后將解脂亞羅威阿酵母ATCC20774用這個(gè)分泌載體轉(zhuǎn)化，并測(cè)定由轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物產(chǎn)生的人C5a，除了在免疫印跡步驟中用羊抗C5a和兔抗羊IgG，其余如上所述。對(duì)本實(shí)施例所述的質(zhì)粒，證實(shí)了C5a存在于培養(yǎng)上清液中。
表達(dá)/分泌質(zhì)粒pC5aX-3的構(gòu)建構(gòu)建過(guò)敏毒素表達(dá)/分泌質(zhì)粒pC5aX-3的實(shí)驗(yàn)步驟在圖11中概述。這個(gè)質(zhì)粒含有“完整”XPR2啟動(dòng)子的順序、以及與編碼74個(gè)C5a氨基酸殘基的合成順序連接的157個(gè)氨基酸殘基信號(hào)和肽原。pC5aX-3的構(gòu)建計(jì)劃類(lèi)似于pXX-33。首先，用HindIII和AvaI切割質(zhì)粒pXHP-24(或含有所需順序的另一個(gè)質(zhì)粒)，凝膠純化含有XPR2啟動(dòng)子的1150堿基對(duì)片段。另一個(gè)片段含有XPR2肽原的3′端和C5a結(jié)構(gòu)基因順序，是借助T4連接酶通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)連接反應(yīng)，用大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pC5a-48中的約220堿基對(duì)HinfI-HindIIIDNA片段和帶有下列順序的合成片段連接，然后再用AvaI和HindIII進(jìn)行切割得到的。
5′CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGA3′3′CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5′所得的連接順序通過(guò)凝膠電泳純化，選擇出大約250堿基對(duì)的AvaI-HindIII片段。含有啟動(dòng)子的HindIII-AvaI片段和編碼C5a的AvaI-HindIII片段用T4連接酶連接，然后用HindIII消化。約1.4Kb片段進(jìn)行凝膠純化并且用經(jīng)HindIII切割的pterm4(如上所述)連接。連接反應(yīng)物用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌K12菌株MM294。從所選的轉(zhuǎn)化株中分離出氨芐青霉素抗性質(zhì)粒，質(zhì)粒pC5aX-3用其限制圖進(jìn)行鑒定。然后將解脂亞羅威阿酵母菌株P(guān)C-30869(ATCC20774)用經(jīng)SnaBI切割的pC5aX-3進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并按上述方法測(cè)定由轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物分泌在培養(yǎng)基中的過(guò)敏毒素。用上述方法證實(shí)培養(yǎng)上清液中存在C5a。人們認(rèn)為由與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的核糖體合成的許多蛋白質(zhì)是以糖蛋白形式產(chǎn)生的。實(shí)際上，糖基化可影響給定蛋白質(zhì)的分泌。真核蛋白質(zhì)的N連接糖基化作用發(fā)生在三肽順序天冬酰胺-X-蘇氨酸和天冬酰胺-X-絲氨酸，其中X可以是除了可能的天冬氨酸外的任何氨基酸(Hubbard，S.等，1981，Ann.Rev.Biochem.50；555)。凝乳酶原的氨基酸順序包括這樣兩個(gè)三肽順序，但對(duì)分泌在解脂亞羅威阿酵母培養(yǎng)物中的凝乳酶原進(jìn)行凝膠電泳分析證明沒(méi)有糖基化的跡象。在另一些分泌的真核蛋白質(zhì)中，也并不是所有的天冬酰胺-X-蘇氨酸/絲氨酸位點(diǎn)都被糖基化。很可能三肽順序內(nèi)的某些天冬酰胺并不糖基化，因?yàn)樗鼈冸y以接近糖基化酶。
關(guān)于人C5a，氨基酸順序包括單個(gè)糖基化位點(diǎn)或三肽順序(天冬酰胺-異亮氨酸-絲氨酸)，該順序通常具有與天冬酰胺相連的復(fù)合低聚糖(Fernandez，H.等，1976，J.Immunol.117，1688)。分泌到解脂亞羅威阿酵母培養(yǎng)基中的部分C5a分子似乎被糖基化，因?yàn)榭乖钚缘膶拝^(qū)是在免疫印跡的高分子量部分。這種不均一的電泳遷移率與所觀察到的其他分泌蛋白質(zhì)類(lèi)似，可能是由于糖基化程度不同所致。在本發(fā)明中，某些分泌的異源蛋白質(zhì)的表觀糖基化啟示人們，解脂亞羅威阿酵母的表達(dá)和分泌對(duì)產(chǎn)生許多正常的糖基化真核蛋白質(zhì)將是有用的。
*從XPR2轉(zhuǎn)化株DL112回收質(zhì)粒的圖解說(shuō)明(參閱圖1)。各個(gè)標(biāo)記區(qū)是(從左到右)解脂亞羅威阿酵母未經(jīng)測(cè)序部分、pBR322、EcoRI位點(diǎn)與連接解脂亞羅威阿酵母DNA(以前為BamHI位點(diǎn))之間的小片段、解脂亞羅威阿酵母LEU2基因、pBR322的大片段、和已測(cè)序的XPR2的突變等位基因?！癇”是BglII位點(diǎn)，“E”是EcoRI位點(diǎn)。用線條表示回收的3個(gè)質(zhì)粒，它們?cè)贐glII位點(diǎn)的末端連接成環(huán)形分子。
權(quán)利要求
1.一種制備不產(chǎn)生堿性蛋白酶的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株的方法，該方法包括，用XPR表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母XPR+菌株。
2.一種檢測(cè)具有在XPR2基因上整合的載體DNA的解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株的方法，該方法包括(i)用XPR表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化解脂亞羅威阿酵母XPR+菌株；(ii)篩選(i)中產(chǎn)生的失去堿性蛋白酶活性的轉(zhuǎn)化株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述XPR+解脂亞羅威阿酵母菌株是用未切割的質(zhì)粒pLS-3 DNA或用經(jīng)SnaB I消化的pLS-3 DNA轉(zhuǎn)化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述解脂亞羅威阿酵母具有解脂亞羅威阿酵母ATCC20688的鑒定特征。
5.制備解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株的方法，該方法包括，將一個(gè)表達(dá)載體整合到一個(gè)解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株中，該轉(zhuǎn)化株包含一個(gè)與異源載體DNA同源的同源區(qū)，所述同源區(qū)包含在所述解脂亞羅威阿酵母整合轉(zhuǎn)化期間用作受體部位的外源DNA。
全文摘要
解脂亞羅威阿酵母的XPR2和LEU2基因順序的排列，重組解脂亞羅威阿酵母克隆載體，包括編碼表達(dá)哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)和其他多肽的異源DNA；用XPR2基因啟動(dòng)子、堿性蛋白質(zhì)前原區(qū)和XPR2終止密碼子區(qū)等整合的表達(dá)載體，能夠在已轉(zhuǎn)化的解脂亞羅威阿酵母的細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)異源蛋白質(zhì)并將異源蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外；解脂亞羅威阿酵母轉(zhuǎn)化株包括所述的載體和質(zhì)粒；并提供制備載體的方法。
文檔編號(hào)C12N1/16GK1141339SQ9610092
公開(kāi)日1997年1月29日 申請(qǐng)日期1996年1月15日 優(yōu)先權(quán)日1985年10月18日
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