一種使用重組耶氏解脂酵母菌株生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法，該方法包括平板活化培養(yǎng)、種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、由菌體提取脂肪與由發(fā)酵上清液提取脂肪等步驟。使用較廉價的紅花籽油代替昂貴的游離LA作為發(fā)酵用底物，既能提高t10，c12-CLA的產(chǎn)量，又能很大程度降低發(fā)酵成本，因此，本發(fā)明使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的應(yīng)用前景。
【專利說明】—種使用重組耶氏解脂酵母菌株生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
【【背景技術(shù)】】
[0002]共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是由一系列含有共軛雙鍵、具有位置和幾何異構(gòu)的十八碳二烯酸的總稱，是必需脂肪酸亞油酸(Linoleic acid, LA)的立體幾何異構(gòu)體，也可看作是亞油酸的次生衍生物。CLA具有多種異構(gòu)體形式，其中cis-9，trans-11-CLA (c9，tll-CLA)、trans_10，cis-12-CLA (tlO，cl2_CLA)兩種異構(gòu)體是含量最多并且確認(rèn)具有生理活性功能的共軛亞油酸單體。CLA作為一種新型的脂肪酸，其生理功能已逐漸被人們所認(rèn)同。CLA具有包括抗癌、抗動脈粥樣硬化、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及抑制脂肪積累等對人類健康有益的效果，并且CLA能夠提高飼料效價防霉變作用而被廣泛的研究。
[0003]因為CLA具有多種獨特的生理功能，被譽為“21世紀(jì)的新型營養(yǎng)素”，越來越多地引起了世界各國政府及科研工作者的重視，美國、加拿大等國已經(jīng)開始把CLA作為營養(yǎng)添加劑大量用于農(nóng)業(yè)及食品工業(yè)。CLA正成為藥物、食品、飼料等研究領(lǐng)域的一個熱點。由于天然CLA主要存在于反芻動物乳制品中，含量非常低；而通過堿催化異構(gòu)化等化學(xué)方法合成的CLA是多種異構(gòu)體的混合物，較難分離純化具有活性功能的異構(gòu)體；所以，研究生物轉(zhuǎn)化法獲得成分單一的功能CLA具有重要的現(xiàn)實意義。
[0004]到目前為止，c9, 111-CLA生物合成的最高產(chǎn)量是Shimizu研究小組通過Delacroixia coronata菌株的delta-9脫飽和酶作用，以33.3mg/mL異油酸(trans-11-octadecenoic acid, t_0A)為底物轉(zhuǎn)生產(chǎn)了 10mg/mL 的 CLA,其中 98% 為 c9,111-CLA ;而tlO，C12-CLA生物合成的最高產(chǎn)量是江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心陳衛(wèi)研究小組構(gòu)建的重組耶氏解脂酵母菌株(CCFM-JU277-9)，通過添加20g/L大豆油，在5L發(fā)酵罐中發(fā)酵38.5h得到CLA的最高產(chǎn)量為4g/L，其中全部為tlO，cl2_CLA。由于CCFM-JU277-9能夠在胞內(nèi)合成亞油酸異構(gòu)酶(PAI)，并催化LA形成專一的tlO，cl2-CLA單體形式，因此增加底物L(fēng)A的含量將有助于增加tlO，C12-CLA的產(chǎn)量。
[0005]因此，本發(fā)明希望通過在培養(yǎng)基中添加LA含量較高的廉價植物油、優(yōu)化植物油的添加時間及添加量，從而實現(xiàn)提高tio, C12-CLA產(chǎn)量的目標(biāo)。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006][要解決的技術(shù)問題]
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0008][技術(shù)方案]
[0009]本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。[0010]本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0011]所述生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法的步驟如下:
[0012]A、平板活化培養(yǎng)
[0013]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到平板培養(yǎng)物；
[0014]B、種子培養(yǎng)
[0015]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時；
[0016]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0017]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0-45小時期間添加終濃度為10~70g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)48~100小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液；
[0018]所述的菌體使用以重量計0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進(jìn)行凍干；
[0019]D、由菌體提取脂肪
[0020]按照以mg計凍干菌體與以ml計8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~1.5，讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進(jìn)行甲酯化2.5~3.5小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘,在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯；
[0021]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0022]按照以ml計發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進(jìn)行甲酯化0.5~3小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0023]根據(jù)本 發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下:
[0024]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20mino
[0025]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下:[0026]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下:
[0028]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，然后在溫度115 °C的條件下滅菌20min。
[0029]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的無機酸選自硫酸或鹽酸；所述的無機堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述無機酸或無機堿水溶液的濃度是2.0~4.0moI/Lο
[0030]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的乳化植物油制備方法如下:
[0031 ] 把植物油添加到以重量計0.6%吐溫80水溶液中，直到植物油的濃度達(dá)到150~250g/L，接著使用超聲設(shè)備在功率200W的條件下進(jìn)行超聲處理4~6分鐘，再使用0.22 μ m無菌濾膜過濾除菌。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的添加的植物油為紅花籽油。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的乳化植物油是在重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進(jìn)入生長穩(wěn) 定期時添加的。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的洗滌菌體在溫度-10°C~-30°C與真空度1.0~10.0Pa的條件下進(jìn)行凍干。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟D中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是1.3g/L~3.5g/L ;在步驟E中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是
0.5g/L ~6.8g/L。
[0036]下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0037]本發(fā)明涉及一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法。
[0038]重組耶氏解脂酵母菌株(Yarrowialipolytica) CCFM-JU277-9 已于 2013 年 3 月06日在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCCN0.7284，具體參見CN 103233036A。
[0039]所述生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法的步驟如下:
[0040]A、平板活化培養(yǎng)
[0041]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到平板培養(yǎng)物。
[0042]所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下:
[0043]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸水溶液或無機堿水溶液，將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0044]在這個步驟中，使用的恒溫培養(yǎng)箱是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海森信實驗儀器有限.公司以商品名隔水式恒溫培養(yǎng)箱銷售的產(chǎn)品。[0045]在這個步驟以及后續(xù)步驟中，所述的無機酸選自硫酸或鹽酸。在本發(fā)明中使用的是無機酸水溶液。所述的無機堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀。使用的是無機堿水溶液。所述無機酸或無機堿水溶液的濃度是2.0-4.0moI/Lο
[0046]B、種子培養(yǎng)
[0047]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在 溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時。
[0048]所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下:
[0049]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
[0050]在這個步驟中，所述的種子培養(yǎng)是在培養(yǎng)搖床中進(jìn)行的，本發(fā)明使用的培養(yǎng)搖床是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海智誠分析儀器制造有限公司以商品名恒溫培養(yǎng)振蕩器銷售的產(chǎn)品。
[0051]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0052]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0-45小時期間添加終濃度為10~70g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)48~100小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液；
[0053]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下:
[0054]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，然后在溫度115 °C的條件下滅菌20min。
[0055]在這個步驟中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)是在震蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行的，本發(fā)明使用的震蕩培養(yǎng)箱是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海智誠分析儀器制造有限公司以商品名恒溫培養(yǎng)振蕩器銷售的產(chǎn)品。
[0056]所述的乳化植物油制備方法如下:
[0057]把植物油添加到以重量計0.6%吐溫80水溶液中，直到植物油的濃度達(dá)到150~250g/L，接著使用超聲設(shè)備在功率200W的條件下進(jìn)行超聲處理4~6分鐘，再使用0.22 μ m無菌濾膜過濾除菌。
[0058]根據(jù)本發(fā)明，所述的植物油是小麥胚芽油、大豆油、紅花籽油、亞麻油、菜籽油、葵花籽油或核桃仁油。
[0059]優(yōu)選地，所述的植物油是小麥胚芽油、大豆油、紅花籽油、葵花籽油或核桃仁油。
[0060]更優(yōu)選地，所述的植物油是紅花籽油。
[0061]在這個步驟中，使用的超聲設(shè)備是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由美國SONICS公司以商品名超聲波細(xì)胞粉碎機銷售的產(chǎn)品。
[0062]在這個步驟中，使用的0.22 μ m無菌濾膜是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由上海興亞凈化材料廠公司以商品名微孔濾膜銷售的產(chǎn)品。
[0063]由于誘導(dǎo)亞油酸異構(gòu)酶(PAI)蛋白表達(dá)的啟動子是在對數(shù)期末期或穩(wěn)定期初期才啟動表達(dá)外源基因(參見文獻(xiàn) MadzakC, TretonB, Blanchin-Roland S.Strong hybridpromoters and integrative expression/secretion vectors for quas1-constitutiveexpression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.Journal ofMolecular Microbiology and Biotechnology, 2000, 2 (2): 207-216),所以 PAI 蛋白在對數(shù)期末期或穩(wěn)定期前期大量合成的。如果在發(fā)酵初期添加植物油會使大量的底物L(fēng)A作為碳源供細(xì)胞生長繁殖，進(jìn)入穩(wěn)定期后剩余的LA才被PAI蛋白催化合成tlO，cl2-CLA。為了使盡量多的LA作為底物用于合成tlO，C12-CLA,需要確定植物油的最佳添加時間。
[0064]研究發(fā)現(xiàn)，植物油添加時間對tlO，C12-CLA的產(chǎn)量有明顯的影響。以紅花籽油為例研究了植物油的最佳添加時間。在發(fā)酵開始、重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9菌體對數(shù)期中期與對數(shù)期末期添加紅花籽油所得到的tlO，C12-CLA的產(chǎn)量，比進(jìn)入穩(wěn)定期添加紅花籽油時所達(dá)到的產(chǎn)量低得多，說明在PAI蛋白量積累最多時添加紅花籽油使更多的底物L(fēng)A流向tlO，C12-CLA合成途徑，具體情況見實施例2。
[0065]研究還發(fā)現(xiàn)，植物油添加量對tlO，C12-CLA的產(chǎn)量也有明顯的影響。以紅花籽油為例研究植物油添加量發(fā)現(xiàn)，紅花籽油終濃度從10g/L增加到70g/L時，tlO，cl2-CLA的產(chǎn)量從逐漸增加轉(zhuǎn)變?yōu)橹饾u降低，而tlO，C12-CLA的得率則從43%逐漸降低到12.3%，具體情況見實施例3。所述的得率是指tlO，cl2-CLA產(chǎn)量(g/L)與添加紅花籽油量(g/L)的比值。
[0066]得到的菌體使用以重量計0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進(jìn)行凍干。
[0067]NaCl水溶液洗滌的目的在于洗掉菌體細(xì)胞表面附著的脂肪酸所述的凍干是讓所述的洗滌菌體在溫度-10°C~-30°c與真空度1.0~10.0Pa的條件下進(jìn)行冷凍干燥。
[0068]在這個步驟中，進(jìn)行凍干所使用的設(shè)備是目前市場上銷售的產(chǎn)品，例如由美國LABC0NC0公司以商品名凍干機銷`售的產(chǎn)品。
[0069]D、由菌體提取脂肪
[0070]按照以mg計凍干菌體與以ml計8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~1.5，讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進(jìn)行甲酯化2.5~3.5小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘,在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0071]在本發(fā)明中，采用常規(guī)氣相色譜定量分析方法(參見文獻(xiàn)Baixi Zhang, ChunchiRong ect.De novo synthesis of trans—10，cis_12conjugated linoleic acid inoleaginous yeast Yarrowia Lipolytica.Microbial Cell Factories, 2012，11:51)分析了在所述脂肪酸甲酯中的共軛亞油酸t(yī)lO，C12-CLA含量。
[0072]在這個步驟中，所述脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)lO，C12-CLA的含量分別是1.3g/L ~3.5g/L。
[0073]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0074]按照以ml計發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進(jìn)行甲酯化0.5~3小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0075]采用上述常規(guī)氣相色譜定量分析方法分析，所述脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)lO，cl2-CLA的含量分別是0.5g/L~6.8g/L。
[0076]在本發(fā)明中，共軛亞油酸t(yī)lO, C12-CLA得率是共軛亞油酸t(yī)lO, cl2_CLA的含量(g/L)與添加紅花籽油量(g/L)的比值。
[0077]通過前面描述與實施例可以清楚地知道，采用本發(fā)明方法制備的脂肪酸甲酯中共軛亞油酸t(yī)io，C12-CLA的含量遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)所達(dá)到的含量。 [0078][有益效果]
[0079]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明使用紅花籽油(SaO)時，tlO，cl2_CLA的產(chǎn)量最高達(dá)到2.44g/L，是不添加植物油時tlO，C12-CLA含量的55倍之多，比添加價格昂貴的游離LA的產(chǎn)量還要高約30%以上。添加紅花籽油的終濃度為30g/L、50g/L、70g/L時，在發(fā)酵84h時tlO，C12-CLA產(chǎn)量分別達(dá)到9.lg/L、9.7g/L及8.6g/L。使用較廉價的紅花籽油代替昂貴的游離LA作為發(fā)酵用底物，既能提高tlO，C12-CLA的產(chǎn)量，又能很大程度降低發(fā)酵成本，因此，本發(fā)明使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的應(yīng)用前景。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0080]圖1是重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9在發(fā)酵培養(yǎng)過程中的生長曲線。
【【具體實施方式】】
[0081 ] 通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
[0082]實施例1:使用不同植物油制備含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯
[0083]該實施例的實施步驟如下:
[0084]A、平板活化培養(yǎng)
[0085]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到平板固體培養(yǎng)基。
[0086]使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的平板固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度28°C的條件下平板活化培養(yǎng)4天，得到所述的平板培養(yǎng)物；
[0087]B、種子培養(yǎng)
[0088]按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到種子培養(yǎng)基。[0089]使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度28°C與200rpm的條件下培養(yǎng)46小時；
[0090]C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0091]按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用2.0mol/L硫酸或氫氧化鈉水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至6.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0092]把小麥胚芽油、大豆油、紅花籽油、亞麻油、菜籽油、葵花籽油或核桃仁油植物油分別添加到以重量計0.6%吐溫80水溶液中，直到所述植物油的濃度達(dá)到200g/L，接著使用超聲設(shè)備在功率200W的條件下進(jìn)行超聲處理5分鐘，再使用0.22 μ m無菌濾膜過濾除菌，得到相應(yīng)的乳化植物油。
[0093]按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計1.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度28°C與200rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0_45小時期間添加終濃度為10g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)72小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在8000rpm的條件下離心分離15分鐘,得到菌體與發(fā)酵上清液。
[0094]所述的菌體使用以重量計0.85%NaCl水溶液洗滌2次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著在溫度_20°C與真空度
5.0Pa的條件下進(jìn)行凍干。
[0095]D、 由菌體提取脂肪
[0096]按照以mg計凍干菌體與以ml計10%鹽酸-甲醇溶液之比為35:1.0,讓步驟C所得到的凍干菌體與10%鹽酸-甲醇溶液在溫度50°C的條件下進(jìn)行甲酯化3.0小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取10分鐘，接著在6000rpm的條件下離心分離3分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯，采用常規(guī)氣相色譜定量分析脂肪酸甲酯，確定產(chǎn)物10t, 12c -CLA的含量；
[0097]E、由發(fā)酵上清液提取脂肪
[0098]按照以ml計發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:10.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液3次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的10%鹽酸-甲醇溶液在溫度50°C的條件下進(jìn)行甲酯化I小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取10分鐘，接著在6000rpm的條件下離心分離3分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
[0099]采用本說明書描述的氣相色譜定量分析方法測定了，本實施例制備所使用的植物油的主要脂肪酸組成，其結(jié)果列于表1中，本實施例制備所得到的脂肪酸甲酯中的lot，12c - CLA含量，其結(jié)果列于表2中。
[0100]表1:不同植物油的主要脂肪酸組成(重量％)
[0101]
【權(quán)利要求】
1.一種使用重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生產(chǎn)含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于該方法的步驟如下: A、平板活化培養(yǎng) 使用接菌環(huán)將重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9接種于裝在平板中的固體培養(yǎng)基上，然后置于恒溫培養(yǎng)箱中在溫度20~32°C的條件下平板活化培養(yǎng)2~6天，得到平板培養(yǎng)物； B、種子培養(yǎng) 使用接菌環(huán)挑取在步驟A平板活化培養(yǎng)的培養(yǎng)物接種到液體種子培養(yǎng)基中，然后置于試管中，在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下培養(yǎng)40~52小時； C、發(fā)酵培養(yǎng) 按照以發(fā)酵培養(yǎng)基體積計0.5%~2.0%接種量，將步驟B得到的種子培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于發(fā)酵錐形瓶中在溫度20~32°C與150~250rpm的條件下震蕩培養(yǎng)，在發(fā)酵0-45小時期間 添加終濃度為10~70g/L的乳化植物油，震蕩培養(yǎng)48~100小時，得到一種發(fā)酵培養(yǎng)物，它在7500~8500rpm的條件下離心分離10~18分鐘，得到菌體與發(fā)酵上清液； 所述的菌體使用以重量計0.70~1.00%NaCl水溶液洗滌2~3次，得到的洗滌液與所述的發(fā)酵上清液合并，合并的發(fā)酵上清液用于后續(xù)處理；洗滌的菌體接著進(jìn)行凍干； D、由菌體提取脂肪 按照以mg計凍干菌體與以ml計8~12%鹽酸-甲醇溶液之比為20~50:0.5~1.5,讓步驟C所得到的凍干菌體與8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~-65°C的條件下進(jìn)行甲酯化2.5~3.5小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在5000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯； E、由發(fā)酵上清液提取脂肪 按照以ml計發(fā)酵上清液與氯仿甲醇混合液之比為1:8.0~12.0，用按照體積比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并發(fā)酵上清液2~4次，提取液合并，用氮氣吹干，再加入與氯仿甲醇混合液等體積的8~12%鹽酸-甲醇溶液在溫度45~65°C的條件下進(jìn)行甲酯化0.5~3小時，然后加入與鹽酸-甲醇溶液等體積的正己烷提取5~15分鐘，接著在3000~7000rpm的條件下離心分離2~5分鐘，在分離上清液后所得到的殘余物再重復(fù)上述提取操作I~2次，分離上清液合并，用氮氣吹干，得到所述的含有共軛亞油酸的脂肪酸甲酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的平板固體培養(yǎng)基制備方法如下: 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源、5g/L硫酸銨和20g/L瓊脂粉，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至5.5，再加入瓊脂粉，然后在溫度115°C的條件下滅菌20mino
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下: 按照20g/L葡萄糖、1.7g/L無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與5g/L硫酸銨，將葡萄糖、無硫酸銨無氨基酸酵母氮源與硫酸銨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的pH調(diào)節(jié)至5.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下: 按照20g/L葡萄糖、10g/L酵母粉與20g/L蛋白胨，將葡萄糖、酵母粉與蛋白胨溶解于蒸餾水中，再使用無機酸或無機堿水溶液將所得到溶液的PH調(diào)節(jié)至6.5，然后在溫度115°C的條件下滅菌20min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于所述的無機酸選自硫酸或鹽酸；所述的無機堿選自氫氧化鈉或氫氧化鉀；所述無機酸或無機堿水溶液的濃度是 2.0 ~4.0mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳化植物油制備方法如下: 把植物油添加到以重量計0.6%吐溫80水溶液中，直到植物油的濃度達(dá)到150~250g/L,接著使用超聲設(shè)備在功率200W的條件下進(jìn)行超聲處理4~6分鐘，再使用0.22 μ m無菌濾膜過濾除菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的所述的添加的植物油為紅花籽油。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳化植物油是在重組耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9進(jìn)入生長穩(wěn)定期時添加的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗滌菌體在溫度-10°C~_30°C與真空度1.0~10.0Pa的條件下進(jìn)行凍干。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟D中，所述共軛亞油酸的tlO，C12-CLA含量分別是1.3g/L~3.5g/L ;在步驟E中，所述共軛亞油酸的tlO，cl2_CLA含量分別是 0.5g/L ~6.8g/L。
【文檔編號】C12P7/64GK103725723SQ201410020846
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】陳衛(wèi), 張白曦, 陳海琴, 李敏, 顧震南, 趙建新, 張秋香, 劉小鳴, 趙國忠, 張灝, 陳永泉 申請人:江南大學(xué)