專利名稱：一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構(gòu)建方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程學(xué)和病毒學(xué)，尤其涉及一種含人類B亞群11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構(gòu)建方法及其用途。該腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纖毛頭的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纖毛頭氨基酸序列而構(gòu)成的雜合腺病毒。該腺病毒通過(guò)對(duì)其增殖必須基因進(jìn)行的有效控制或突變而具有選擇性增殖能力。作為具有更廣的感染譜和改良感染能力的條件增殖型的重組病毒，本發(fā)明的重組溶瘤腺病毒可以用于基因治療尤其是腫瘤的基因治療。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的一大類疾病，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，腫瘤的主要危險(xiǎn)因素不但未得到有效控制，反而愈演愈烈，是其發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升。目前惡性腫瘤的常規(guī)治療難以收到預(yù)期的療效，特別是化療藥物的治療指數(shù)低，毒副作用大。近幾年，包括基因治療在內(nèi)的綜合治療成為腫瘤臨床中不可或缺的一部分。我國(guó)的重組腺病毒p53注射液"Ad-p53"已于2004年上市，成為世界上第一個(gè)上市的癌癥基因治療藥物(WangX等，Mol Cancer Ther. 2008Jun ;7 :1598-1603)。 腺病毒是腫瘤基因治療的最常用的病毒載體，它是一種雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約36kb，衣殼(c即sid)呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，直徑約80-110nm。衣殼含有240個(gè)六聯(lián)體(hexon)、12個(gè)五聯(lián)體(penton)及12根纖毛(fiber)，除此之外還有其他一些小蛋白，如A/I、WI、IX、111 a和IV a2等。六聯(lián)體是形成病毒衣殼20個(gè)三角形面的主要蛋白，12個(gè)頂端是5個(gè)五聯(lián)體亞單位和3個(gè)纖毛蛋白構(gòu)成的復(fù)合物，12根纖毛(Fiber)以五聯(lián)體蛋白為基底由衣殼表面伸出，纖毛頂端形成頭節(jié)區(qū)(knob)。五聯(lián)體和纖毛的頭節(jié)區(qū)可與細(xì)胞表面的病毒受體結(jié)合，在病毒感染細(xì)胞過(guò)程中起著非常重要的作用(Gall JG等，J Virol. 1998 Dec ;72 :10260-10264 ;Sakurai F等，Curr Gene Ther. 2007Aug;7 :229-238)。
人類腺病毒家族有51個(gè)已知血清型，分為6個(gè)亞屬(A-F)。基因治療常用的人的2型(Ad2)及5型(Ad5)腺病毒在血清學(xué)分類上均屬C亞群，在DNA序列上有95%的同源性。腺病毒感染細(xì)胞的過(guò)程是從腺病毒纖毛的頭節(jié)區(qū)粘附到細(xì)胞表面的特異性受體開(kāi)始的。C亞群腺病毒主要與柯薩奇B病毒共用一種受體，因此這種受體被稱為柯薩奇/腺病毒受體(coxsackie/adenovirus rec印tor， CAR)。但是，在人體內(nèi)造血細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、某些表皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞(如膀胱癌、子宮頸癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、頭頸部腫瘤、黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等)表面，CAR是低表達(dá)甚至不表達(dá)的。由于以腺病毒為載體的基因治療中CAR介導(dǎo)的腺病毒進(jìn)入靶細(xì)胞是基因轉(zhuǎn)移中的限速步驟，并且轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞表面CAR表達(dá)水平有關(guān)。低水平表達(dá)的CAR無(wú)疑是制約腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的主要原因，即表現(xiàn)出細(xì)胞對(duì)C亞群腺病毒載體的抗性作用(Kim J等，J Virol. 2002;76 :1892-1903 ;Cripe TP等，Cancer Res. 2001 Aprl ;61 :2953-2960 ;S證ki K等，ClinCancer Res. 2001 ;7 :120-126 ;Wesseling JG等，Gene Ther即y. 2001 ;8 :969-976 ;Bao Y
4等，Prostate. 2005 S印1 ;64 :401-407 ;Stoff-Khalili MA等，Gene Ther. 2005 Dec ;12 :1696-1706)。以CAR為受體的C亞群腺病毒還存在在體內(nèi)會(huì)引起嚴(yán)重毒副作用、人體內(nèi)廣泛存在的Ad5型腺病毒中和抗體很快清除病毒。這些問(wèn)題限制了 Ad5和Ad2的廣泛應(yīng)用。
B亞群腺病毒包括3型、7型、11型、16型、35型、50型腺病毒，該組腺病毒的感染細(xì)胞不通過(guò)CAR受體，主要以CD46分子為吸附受體(Fleischli C等，J Gen Virol. 2007Nov ;88 :2925-2934 ;Pache L等，Virology. 2008 Jun 5 ;375 :573-579 ;Pache L等，JVirol. 2008Aug ;82 :7923-7931) 。 CD46是一種廣泛表達(dá)的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，這種蛋白幾乎表達(dá)在除了紅細(xì)胞以外所有人外周血細(xì)胞、各類干細(xì)胞以及大多數(shù)腫瘤細(xì)胞表面。因此，利用CD46受體的腺病毒載體近來(lái)受到更廣泛的關(guān)注，人們針對(duì)腺病毒載體的靶向性修飾問(wèn)題提出了許多策略。腺病毒Ad5/F35載體即是一種外殼改造的雜合病毒載體，它的主要結(jié)構(gòu)是在現(xiàn)在的Ad5腺病毒載體的基礎(chǔ)上，其受體結(jié)合位置的纖毛改造成了 35型腺病毒(Ad35)的纖毛。因此，Ad5/F35的細(xì)胞受體從Ad5的CAR變成了 CD46，原有的感染吸附受體的改變，提高了它對(duì)血液細(xì)胞、干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的感染效率，感染譜比現(xiàn)在常用的Ad5更廣，且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率普遍比Ad5高(Stone D等，Mol Ther. 2007Dec ;15 :2146-2153 ;Brouwer E等，CancerGene Ther. 2007Feb ;14 :211-219)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，Ad5/F35載體對(duì)髓系來(lái)源的K562細(xì)胞的感染能力明顯優(yōu)于常規(guī)的5型腺病毒載體，對(duì)B淋巴細(xì)胞的感染能力也略高于Ad5載體。AD5/F35的改造改變了載體的感染特性，但是其對(duì)細(xì)胞的毒性作用并沒(méi)有因此而增加，證實(shí)這種方式的改造載體在干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因治療研究中有更廣闊的應(yīng)用空間。
此外，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，B亞群腺病毒可能存在另一種感染細(xì)胞的特異受體。利用Ad5/ll-CMV-GFP和Ad5/35-CMV-GFP分別感染CD46陽(yáng)性表達(dá)的A549和Hela細(xì)胞，Ad5/ll-CMV-GFP的感染效率均比Ad5/35-CMV-GFP高，而同時(shí)用這兩種載體去感染CD46陽(yáng)性表達(dá)的CH0-C2細(xì)胞，效率幾乎一樣(Stone D等，J Virol. 2005 ;79 :5090-5104)。另夕卜，抗血清實(shí)驗(yàn)顯示，Adll-Fiber的knob區(qū)能完全抑制Ad35與A549細(xì)胞的結(jié)合，而Ad35_Fiber的knob區(qū)并不能完全抑制Adll與A549細(xì)胞的結(jié)合(MeiYF等，Virology. 2002 ;295 :3043)。分別用Ad5、Ad5/11和Ad5/35感染11種食道癌細(xì)胞和6種口腔癌細(xì)胞，Ad5/11和Ad5/35對(duì)所有腫瘤細(xì)胞的感染效率均比Ad5要高很多，而且Ad5/ll和Ad5/35的感染效率不依賴于CD46的表達(dá)水平(Ling Y等 Oncol R印.2005 ; 14 :831-835)。因此推測(cè)可能有其他的受體參與調(diào)節(jié)Adll和Ad35對(duì)細(xì)胞的感染。 盡管以腺病毒為載體的腫瘤基因治療在實(shí)驗(yàn)和臨床中取得了一些療效，但是，進(jìn)一步提高腺病毒對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、增強(qiáng)抗腫瘤基因的表達(dá)、使病毒載體具有更特異的靶向性，從而提高療效和安全性，是未來(lái)腫瘤基因治療研究的重點(diǎn)方向。
人11型腺病毒載體與傳統(tǒng)的C組腺病毒載體相比，有諸多的優(yōu)點(diǎn)血清中中和抗體的陽(yáng)性率較低；與Ad5、 Ad35之間也沒(méi)有交叉免疫反應(yīng)；感染細(xì)胞不依賴CAR受體，對(duì)包括造血干細(xì)胞、原代腫瘤細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞在內(nèi)的許多重要細(xì)胞都有較高感染效率；肝臟毒性低，免疫副作用小。因此，開(kāi)發(fā)Adll載體，高效轉(zhuǎn)染多數(shù)干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，靶向殺滅腫瘤干細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)徹底殺滅腫瘤的目的，將有十分重要的意義。 基因治療方案中采用的腺病毒載體，多數(shù)采用沒(méi)有復(fù)制能力的增殖缺陷型腺病毒。雖然增殖缺陷型腺病毒在體內(nèi)外顯示了一定的安全性，然而至今在臨床試驗(yàn)中應(yīng)用的大多數(shù)此類腺病毒載體尚存在表達(dá)外源基因的時(shí)間短、免疫原性較強(qiáng)、高滴度時(shí)有明顯的細(xì)胞毒性等許多缺點(diǎn)，因此臨床療效不佳。 要解決上述問(wèn)題，需要一種能在腫瘤細(xì)胞中具有特異性增殖能力、能提高外源基因拷貝數(shù)和表達(dá)量、并且可以溶解殺死腫瘤細(xì)胞的條件增殖型腺病毒載體，即溶瘤腺病毒載體。國(guó)內(nèi)外溶瘤腺病毒項(xiàng)目進(jìn)展較快，國(guó)內(nèi)上海三維公司的H101項(xiàng)目2005年底被批準(zhǔn)上市(Yu W等，Curr Cancer Drug Targets. 2007 Mar ;7 :141-148)。越來(lái)越多的數(shù)據(jù)證明，溶瘤腺病毒有希望成為新一代的腫瘤治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
所要解決的技術(shù)問(wèn)題 基因治療方案中采用的腺病毒載體，多數(shù)采用人類C亞群5型腺病毒(Ad5)，其感染細(xì)胞的過(guò)程依賴于CAR。但是，在人體內(nèi)造血細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、某些表皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面，CAR低表達(dá)甚至不表達(dá)。因此，低水平表達(dá)的CAR成為制約該類型腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的主要原因，即表現(xiàn)出細(xì)胞對(duì)C亞群腺病毒載體的抗性作用。以CAR為受體的C亞群腺病毒還存在在體內(nèi)會(huì)引起嚴(yán)重毒副作用、人體內(nèi)廣泛存在的5型腺病毒中和抗體很快清除病毒。 基因治療方案中采用的腺病毒載體，多數(shù)采用沒(méi)有復(fù)制能力的增殖缺陷型腺病毒。該類腺病毒載體普遍存在表達(dá)外源基因的時(shí)間短、免疫原性較強(qiáng)、高滴度時(shí)有明顯的細(xì)胞毒性等許多缺點(diǎn)，影響了其臨床療效。 因此，進(jìn)一步提高病毒載體對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、增強(qiáng)抗腫瘤基因的表達(dá)、使病毒載體具有更特異的靶向性，從而提高療效和安全性，是未來(lái)腫瘤基因治療研究的重點(diǎn)方向。 采用的技術(shù)方案 本發(fā)明的目的在于提供一種可用于多種人體腫瘤的基因治療的增殖型重組溶瘤腺病毒，該重組溶瘤腺病毒能夠克服當(dāng)前增殖缺陷型腺病毒載體(如Ad-p53)轉(zhuǎn)運(yùn)及表達(dá)抗癌基因效率低下、無(wú)靶向性的缺點(diǎn)，克服以人Ad5增殖型腺病毒載體(如H101、0NYX-015)僅具有單一抗腫瘤機(jī)制、對(duì)腫瘤細(xì)胞感染力低下、安全性不佳等缺點(diǎn)，其抗腫瘤療效得以提
高，安全性得以改善。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種含B亞群11型腺病毒纖毛頭(knob)氨基酸編碼序列的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，該重組病毒的基因組含B亞群11型腺病毒纖毛頭(knob)氨基酸編碼序列，所述11型腺病毒纖毛蛋白編碼序列，既可以是11型腺病毒，也可以是用人類11型腺病毒纖毛頭(knob)的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纖毛頭氨基酸序列而構(gòu)成。 在實(shí)施例中，該增殖型重組溶瘤腺病毒的骨架序列是5型腺病毒(Ad5)，并由11型腺病毒纖毛頭的氨基酸序列取代5型腺病毒的纖毛頭氨基酸序列，其纖毛蛋白編碼序列如SEQ ID N0:1所示。病毒載體構(gòu)建方面，通過(guò)兩種實(shí)施方案來(lái)說(shuō)明含ll型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒的功能的改進(jìn)和用途，一是采用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子調(diào)控Ela基因，同時(shí)用人缺氧反應(yīng)元件(HRE)調(diào)控Elb區(qū)基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)，構(gòu)建增殖型溶瘤腺病毒，二是對(duì)Elb-55kDa實(shí)施突變，使其失去活性，從而使病毒的增殖獲得腫瘤特異性。在外源基因選擇方面，通過(guò)兩種實(shí)施方案來(lái)說(shuō)明含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒介導(dǎo)基因表達(dá)的功能和用途，一是攜帶人趨化因子CCL5基因，二是攜帶綠色熒光蛋白報(bào)告基因EGFP。 含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒能夠識(shí)別CD46膜受體和可能存在的其他特異受體，從而能高效感染人造血系統(tǒng)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、原代腫瘤細(xì)胞等重要細(xì)胞，且免疫原性較低，與傳統(tǒng)的C組腺病毒載體無(wú)交叉免疫反應(yīng)；該腺病毒基因組通過(guò)基因缺失或者基因調(diào)節(jié)的有效控制，使其選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)基本不增殖；該腺病毒可作為基因轉(zhuǎn)移的載體，在其基因組中同時(shí)插入多種抗腫瘤治療基因，使腫瘤治療基因隨病毒的復(fù)制在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。通過(guò)病毒增殖和抗癌基因雙重作用，特異性殺滅腫瘤細(xì)胞，用于治療多種人體腫瘤。
人類腺病毒有A、B、C、D、E、F 6個(gè)不同亞屬，它們對(duì)宿主細(xì)胞的親嗜性、致瘤性及疾病史各不相同。本發(fā)明涉及腺病毒B亞群ll型。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，腺病毒基因組的纖毛蛋白編碼序列由人11型腺病毒纖毛蛋白基因組成。所述11型腺病毒纖毛蛋白基因，既可以是完整的野生型11型腺病毒的纖毛蛋白編碼序列，也可以是由11型腺病毒纖毛頭的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纖毛頭氨基酸序列雜合而成。該病毒能夠識(shí)別CD46膜受體和其他可能存在的特異受體，而不再依賴于CAR受體，從而使其感染人腫瘤細(xì)胞的感染譜更廣，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高，提高了它對(duì)人造血系統(tǒng)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、原代腫瘤細(xì)胞等重要細(xì)胞的感染效率。在實(shí)施方案中，所述重組腺病毒的11型纖毛蛋白基因序列如SEQ ID N0 :1所示，其中(l)第1-134位堿基5型腺病毒纖毛的tail蛋白編碼序列；(2)第135-981位堿基11型腺病毒纖毛的shaft、knob蛋白編碼序列。 另一方面，本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，該腺病毒基因組通過(guò)腫瘤特異性啟動(dòng)子對(duì)增殖必需基因的有效控制，使其選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖，而在正常細(xì)胞內(nèi)基本不增殖，從而使其靶向人腫瘤細(xì)胞，保證腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高度增殖，發(fā)揮溶瘤作用。該腫瘤特異性啟動(dòng)子可以是以下任何一種腫瘤特異性啟動(dòng)子或增強(qiáng)子(a)癌胚抗原啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(b)甲胎蛋白啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(c)人表皮生長(zhǎng)因子受體家族(EGFRs)的受體酪氨酸激酶(包括EGFR、 Her-2、 Her_3和Her_4)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(d)乳腺癌相關(guān)抗原DF3/MUC1啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(e)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體KDR的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(f)L-plastin啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成員的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(h)前列腺素特異性抗原的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(i)缺氧誘導(dǎo)因子-l(HIF-l)調(diào)控的缺氧反應(yīng)元件保守序列；(j)轉(zhuǎn)錄因子E2F啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；和(k)人端粒酶亞基啟動(dòng)子。
本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一個(gè)病毒增殖必需基因受一種腫瘤特異性啟動(dòng)子控制。該病毒增殖必需基因可以是Ela。該溶瘤腺病毒能夠在在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性地增殖復(fù)制，表達(dá)Ela，發(fā)揮Ela抗腫瘤作用。Ela可以通過(guò)抑制Her-2/neu基因的轉(zhuǎn)錄、阻斷NF- k B的活性、提高免疫細(xì)胞的殺傷效應(yīng)、增強(qiáng)轉(zhuǎn)移抑制基因nm23的表達(dá)等多種途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療、放療的敏感性。該溶瘤腺病毒與化療和放療合用，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感性，進(jìn)一步提高治療效果。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一個(gè)病毒增殖必需基因受一種腫瘤特異性啟動(dòng)子控制。腫瘤特異性啟動(dòng)子控制的病毒增殖必需基因還可以是Elb-55kDa、 Elb-19kDa、 E2或E4，該增殖必需基因可以是野生型的，也可以是經(jīng)過(guò)缺失、突變等改造的基因變體。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，其Elb-55kDa蛋白功能喪失，通過(guò)對(duì)編碼Elb-55kDa蛋白的基因序列進(jìn)行全部缺失、點(diǎn)突變、部分缺失、插入突變或者插入終止密碼子等方式。Elb-55kDa是腺病毒在正常細(xì)胞增殖復(fù)制必需的而在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制時(shí)的非必需的蛋白，Elb-55kDa編碼基因的選擇性缺失可以使腺病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)保持增殖復(fù)制的能力，而在正常細(xì)胞中失去復(fù)制能力。
本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，其Elb-19kDa蛋白功能喪失通過(guò)對(duì)編碼Elb-19kDa蛋白的基因序列進(jìn)行全部缺失、點(diǎn)突變、部分缺失、插入突變或者插入終止密碼子等方式。腺病毒Elb-19kDa基因與凋亡抑制基因Bcl-2同源，編碼的Elb-19kDa蛋白能夠結(jié)合Bax或/和Bak啟動(dòng)下游的凋亡抑制程序，Elb-19kDa還可以破壞Fas介導(dǎo)的凋亡過(guò)程，保護(hù)感染的細(xì)胞免受TNF-a介導(dǎo)的殺傷作用。Elb-19kDa基因失活，因而該病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖的特異性得以提高，而在正常細(xì)胞內(nèi)的增殖活性被削弱。Elb-19kDa蛋白功能的喪失，不但能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡通路的恢復(fù)，而且有利于病毒在正常細(xì)胞內(nèi)的快速清除以及在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的快速釋放和播散，使該溶瘤腺病毒治療腫瘤的特異性更好，效能更強(qiáng)。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，其基因組中預(yù)置了多克隆位點(diǎn)，可作為基因轉(zhuǎn)移的載體。該位點(diǎn)可以在Ela啟動(dòng)子上游，也可以在Ela和Elb之間，或在E3區(qū)，便于攜帶各種抗腫瘤基因表達(dá)盒。將抗腫瘤基因插入該病毒的外源基因多克隆位點(diǎn)，發(fā)揮多重抗腫瘤效能。隨著病毒在腫瘤內(nèi)的特異性增殖復(fù)制，其攜帶的抗腫瘤基因的拷貝數(shù)和表達(dá)量得到提高，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或殺滅腫瘤細(xì)胞。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，其抗腫瘤基因的選擇還可以是下列任意一種(a)干擾素系列免疫調(diào)節(jié)因子基因；(b)白細(xì)胞介素系列免疫調(diào)節(jié)因子基因；(c)細(xì)胞集落剌激因子基因；(d)抑癌基因；(e)原癌基因反義序列；(f)人腫瘤表皮生長(zhǎng)因子受體家族(EGFRs)的抗體基因；(g)具有抗血管生成的內(nèi)皮抑素、血管抑素及其片段、纖溶酶原激活因子抑制劑、Canstatin、血小板反應(yīng)蛋白等核苷酸序列；(h)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子家族基因；(i)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體基因；(j)藥物前提轉(zhuǎn)化基因(又稱自殺基因)；和(k)腫瘤壞死因子基因。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，抗腫瘤基因表達(dá)盒中編碼序列受人類巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的控制，該順式作用元件插入抗腫瘤基因序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與翻譯起始位點(diǎn)之間，保證該基因蛋白在病毒感染的腫瘤內(nèi)部高效表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)活性?？鼓[瘤基因還可以受下列啟動(dòng)子控制(a)癌胚抗原啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(b)甲胎蛋白啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(c)人表皮生長(zhǎng)因子受體家族(EGFRs)的受體酪氨酸激酶(包括EGFR、 Her_2、 Her_3和Her-4)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(d)乳腺癌相關(guān)抗原DF3/MUC1啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(e)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)受體KDR的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(f)L-plastin啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(g)凋亡抑制蛋白家族(IAP)成員的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(h)前列腺素特異性抗原的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(i)缺氧誘導(dǎo)因子-l(HIF-l)調(diào)控的缺氧反應(yīng)元件保守序列；(j)轉(zhuǎn)錄因子E2F啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；和(k)人端粒酶亞基啟動(dòng)子。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，抗腫瘤基因表達(dá)盒中編碼序列的加尾序列為SV40 Poly A，該順式作用元件插入基因核苷酸序列的翻譯終止密碼子之后。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，至少一個(gè)病毒增殖必需基因受一種腫瘤特異性啟動(dòng)子控制。其多個(gè)增殖必需基因之間可以由多核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列連接，使之共同受腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控，或由多個(gè)腫瘤特異性啟動(dòng)子分別調(diào)控。實(shí)施例中，以雙啟動(dòng)子分別控制Ela和Elb基因，人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子控制Ela基因，人缺氧反應(yīng)元件(HRE)調(diào)控Elb區(qū)基因(Elb_55kDa和Elb-19kDa基因)。 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于，該病毒突變體由人類腺病毒載體、腫瘤特異性啟動(dòng)子的順式作用元件、人類11型腺病毒纖毛蛋白基因和抗腫瘤基因表達(dá)盒可操作地連接而成。該增殖型溶瘤腺病毒由含人類11型腺病毒纖毛蛋白基因的骨架質(zhì)粒與攜帶抗腫瘤基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)通過(guò)Cre-loxP重組酶切割系統(tǒng)定點(diǎn)重組而產(chǎn)生。其含人類11型腺病毒纖毛蛋白基因的骨架質(zhì)粒序列如SEQ ID N0:2所示，其中(l)第l-85位堿基腺病毒ITR序列；(2)第562-700位堿基SV40\AN序列；(3)第1245-2294位堿基pSP13Cre序列；(4)第2375-2716位堿基HCMV\IE序列；(5)第2962-3819位堿基amp編碼序列；(6)第4901-4934位堿基LoxP序列;(7)第31516-31649位堿基:5型腺病毒纖毛蛋白的tail編碼序列；(8)第31649-32496位堿基11型腺病毒纖毛蛋白基因的shaft、 knob編碼序列；(8)第35554-35655位堿基腺病毒ITR序列；(9)其余5型腺病毒基因組序列，見(jiàn)MicrobixBiosystems公司的pBHGloxdeltaEl， 3Cre序列。
實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果 1.本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，該腺病毒具有外源基因的多克隆位點(diǎn)，可用于構(gòu)建多種抗腫瘤基因治療的腺病毒產(chǎn)品，為腫瘤的基因治療建立一種療效可靠的技術(shù)平臺(tái)。 2.本發(fā)明提供的溶瘤腺病毒具有多重抗腫瘤機(jī)制和特異性優(yōu)勢(shì)1)該重組病毒的基因組含11型腺病毒纖毛蛋白蛋白編碼序列，使病毒能夠識(shí)別CD46膜受體，從而高效感染人造血系統(tǒng)細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞、原代腫瘤細(xì)胞等重要細(xì)胞；2)以腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒增殖必須基因表達(dá)，使病毒在大多數(shù)類型的人類腫瘤細(xì)胞中增殖并破壞腫瘤細(xì)胞，其調(diào)控具有嚴(yán)謹(jǐn)性和安全性；3)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)高效而特異性表達(dá)的Ela，促進(jìn)病毒增殖，同時(shí)其本身也具有抗腫瘤作用；4)將編碼抗腫瘤基因的核苷酸序列插入該病毒的基因組中，隨著病毒在腫瘤內(nèi)的特異性增殖復(fù)制，其攜帶的抗腫瘤基因的拷貝數(shù)和表達(dá)量增加，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。 3.本發(fā)明提供的溶瘤腺病毒，比國(guó)內(nèi)目前已上市的基因治療產(chǎn)品重組p53腺病毒注射液"Ad-p53"具有更好的廣譜性和感染效率，療效得到提高；比國(guó)內(nèi)目前已上市的增殖 腺病毒產(chǎn)品H101具有更好的療效和更高的安全性，適應(yīng)于人類絕大多數(shù)類型惡性腫瘤的 治療。 附圖簡(jiǎn)述

圖1表示含11型腺病毒纖毛蛋白基因編碼序列的腺病毒載體pCL0N9-F11的構(gòu)建 流程。 圖2表示腺病毒包裝質(zhì)粒pPE3的構(gòu)建流程。
圖3表示pPE3-F11構(gòu)建流程。 圖4表示L02正常肝細(xì)胞，MOI = 10感染Ad5-EGFP，熒光細(xì)胞約占25%左右。
圖5表示L02正常肝細(xì)胞，MOI = 10感染SG511-EGFP，熒光細(xì)胞約占85%左右。
圖6表示S匪C-7721肝癌細(xì)胞，M01 = 10感染Ad5-EGFP，熒光細(xì)胞約占35%左右。
圖7表示SMMC-7721肝癌細(xì)胞，MOI = 10感染SG511-EGFP，熒光細(xì)胞約占95%左 右。 圖8表示用人CCL5基因引物擴(kuò)增1_4號(hào)腺病毒克隆，均能擴(kuò)增出349bp條帶，與 陽(yáng)性對(duì)照(P) —致，說(shuō)明1-4號(hào)腺病毒均含有CCL5基因。其中Ml :100bp DNA Ladder ;N : 陰性對(duì)照；P :陽(yáng)性對(duì)照(pENTR12-CCL5) ;1-4 :SG511-CCL5病毒克隆 圖9表示SG511-CCL5在肝癌細(xì)胞中隨著時(shí)間呈幾何倍數(shù)增殖，具有良好的增殖能 力，而在正常細(xì)胞株BJ中的增殖倍數(shù)很低。 圖10表示SG511-CCL5治療組同其他對(duì)照組相比，顯示出更強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)作 用，腫瘤體積一直明顯小于對(duì)照組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0. 05)，說(shuō)明嵌合增殖型腺病毒 SG511-CCL5對(duì)肝癌動(dòng)物模型有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展。
發(fā)明詳述 下面通過(guò)實(shí)施例闡述本發(fā)明的實(shí)施方式，所述實(shí)施例僅用于例示性闡示本發(fā)明， 其不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明通過(guò)同等的變型和改良的技術(shù)方 案都包含在本發(fā)明中。 在實(shí)施例中，第一方案以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子控制5型腺病毒Ela， 用人缺氧反應(yīng)元件(HRE)調(diào)控Elb區(qū)基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)為例；第二方案 對(duì)Elb-55kDa實(shí)施突變，使其失去活性，從而使病毒的增殖獲得腫瘤特異性，構(gòu)建含11型腺 病毒纖毛蛋白基因的溶瘤腺病毒載體。在實(shí)施例的具體實(shí)施中，以人趨化因子CCL5基因和 綠色熒光蛋白報(bào)告基因(EGFP)為例設(shè)立兩種策略，構(gòu)建攜帶目的基因的腺病毒載體。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 :含11型腺病毒纖毛蛋白基因編碼序列的腺病毒載體pCL0N9-F11的構(gòu)
建 第一步合成含11型腺病毒纖毛蛋白基因編碼序列如SEQ ID N0:3所示，命名 Ad5Fll，其中(l)第236-369位堿基5型腺病毒纖毛tail蛋白編碼序列；(2)第367-1216 位堿基11型腺病毒纖毛shaft、 knob蛋白編碼序列；(3)其余堿基5型腺病毒基因組序 歹lj， i Microbix Biosystems &^]白勺pBHGloxdeltaEl， 3Cre ，歹lj。第二步合成VT176序列(SEQ ID NO :4)禾PVT177序列(SEQ IDNO :5)，構(gòu)建pCL0N9
10載體。Ad5F11序列經(jīng)Pacl+Hindlll酶切，回收2656bp片段，與pCL0N9/PacI+Hind111酶切 的載體連接，構(gòu)建成pCL0N9-Fll，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定確認(rèn)。構(gòu)建步驟如圖l所示。
實(shí)施例2 :BJ5183細(xì)胞內(nèi)同源重組第一步pCL0N9-F11經(jīng)HindlII+Aat11酶切，回收5913bp片段。 第二步合成ADP序列(SEQ ID NO :6)，如圖2所示，構(gòu)建腺病毒包裝質(zhì)粒pPE3。第三步pPE3載體經(jīng)PacI酶切，回收線性化載體。pCL0N9-Fll/HindlII+Aat11 4
微升，pPE3/PacI 2微升，共同轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BJ5183(Qbiogene公司)。鋪板培養(yǎng)，
挑取克隆進(jìn)行酶切鑒定，正確者命名為pPE3-Fll，經(jīng)大樣質(zhì)粒提取純化，保存于深低溫冰箱
中。pPE3-F11構(gòu)建流程如圖3所示。 實(shí)施例3 :含Adll腺病毒纖毛蛋白基因的腺病毒在體外對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的感染力實(shí)驗(yàn)
第一步以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子控制5型腺病毒Ela，插入位點(diǎn) Notl+Swal，構(gòu)建腺病毒載體pQW-hTERT-Ep-HRE (見(jiàn)專利ZL028138198， 一種高效表達(dá)抗癌 基因的腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的病毒及其用途；現(xiàn)改名為pSG502)。其中hTERT啟動(dòng)子調(diào)控 Ela基因，同時(shí)用人缺氧反應(yīng)元件(HRE)調(diào)控Elb區(qū)基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)。 所述hTERT啟動(dòng)子核心序列如SEQ ID NO :7所示，缺氧反應(yīng)元件HRE序列如SEQ ID NO :8 所示。 第二步將EGFP基因(SEQ ID NO :9)插pSG502，構(gòu)建成pSG502-EGFP， EGFP插入 位點(diǎn)為EcoRI+SalI。 第二步含有EGFP基因的腺病毒質(zhì)粒pSG502-EGFP與骨架質(zhì)粒pPE3_Fll共轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞(購(gòu)于加拿大Microbix Biosystems公司，該細(xì)胞由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn) 化，含5型腺病毒El區(qū)，腺病毒DNA對(duì)其具有高轉(zhuǎn)染率，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)重組產(chǎn)生具有感染力的 腺病毒)，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)重組。轉(zhuǎn)染具體方法步驟參見(jiàn)Invitrogen公司的LipoFectamine2000 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)。重組產(chǎn)物經(jīng)PCR鑒定正確者命名為SG511-EGFP。 EGFP基因PCR引物 為上游引物5'-GCTCTAGAGAATTCACCATGGTGAGCAAGGGC-3' (SEQ ID NO : 10)，下游引物5'-CGGGATCCGTCGACTTATTACCTAGATCCGGTGG-3， (SEQ ID NO :11)，擴(kuò)增片段793bp。
第三步將EGFP基因插入腺病毒質(zhì)粒pDC315 (MicrobixBiosystems公司)中的 EcoRI+Sall位點(diǎn)，構(gòu)建成pDC315-EGFP，與骨架質(zhì)粒pPE3進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)重組，重組產(chǎn)物經(jīng)PCR 鑒定正確者命名為Ad5-EGFP，作為對(duì)照病毒。該對(duì)照病毒為含5型腺病毒纖毛蛋白基因的 病毒載體。 第四步正常細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞株分別按5X 105細(xì)胞/孔鋪在6孔板中，在37°C 孵箱5% C02培養(yǎng)，第二天換無(wú)血清液體lml，然后按MOI = 10分別加入重組溶瘤腺病毒 SG511-EGFP和Ad5-EGFP， 24小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察。 觀察結(jié)果圖4中為L(zhǎng)02正常肝細(xì)胞，M01 = 10感染Ad5-EGFP，熒光細(xì)胞約占25% 左右。圖5中為L(zhǎng)02正常肝細(xì)胞，M01 = 10感染SG511-EGFP，熒光細(xì)胞約占85X左右。圖 6中為SMMC-7721肝癌細(xì)胞，MOI = 10感染Ad5-EGFP，熒光細(xì)胞約占35%左右。圖7中為 SMMC-7721肝癌細(xì)胞，M01 = 10感染SG511-EGFP，熒光細(xì)胞約占95%左右。表明SG511-EGFP 感染能力明顯強(qiáng)于Ad5-EGFP。 實(shí)施例4 :含11型腺病毒纖毛蛋白基因編碼序列、Elb-55kDa失活的溶瘤腺病毒的
重組
以我們前期構(gòu)建成功的Elb-55kDa失活的腺病毒載體pXC-delElb (錢其軍等，中 華醫(yī)學(xué)雜志.2002,82 :557-560)為基礎(chǔ)，與pPE3_Fll共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，重組含11型腺 病毒纖毛蛋白基因編碼序列的腺病毒SG211，該病毒Elb-55kDa失活，獲得在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特 異增殖的能力。 實(shí)施例5 :攜帶抗腫瘤基因的腺病毒載體的構(gòu)建 本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的重組溶瘤腺病毒，其特征在于，通 過(guò)基因缺失或者基因調(diào)節(jié)的有效控制，使其選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖；其基因組中預(yù)置 了多克隆位點(diǎn)，該位點(diǎn)可以攜帶各種抗腫瘤基因表達(dá)盒。溶瘤腺病毒載體以人端粒酶逆轉(zhuǎn) 錄酶(hTERT)啟動(dòng)子控制5型腺病毒Ela基因，同時(shí)用人缺氧反應(yīng)元件(HRE)調(diào)控Elb區(qū) 基因(Elb-55kDa和Elb-19kDa基因)為例，抗腫瘤基因以人趨化因子CCL5基因?yàn)槔?。?時(shí)構(gòu)建非增殖的腺病毒載體為對(duì)照病毒。 第一步以人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子控制5型腺病毒Ela，插入位點(diǎn) Notl+Swal，構(gòu)建腺病毒載體pSG502 (見(jiàn)專利ZL028138198)。其中hTERT啟動(dòng)子核心序列 如SEQ ID NO :7所示。 第二步合成含有人趨化因子CCL5基因核苷酸序列(SEQ IDN0 :12)，其 5'端和3'端分別引入EcoRI和BamHI位點(diǎn)，經(jīng)EcoRI+BamHI酶切后分別插入質(zhì)粒 pENTRll(Invitrogen LifeTechnology Inc.)和pDC315多克隆位點(diǎn)區(qū)，構(gòu)成pENTR12-CCL5 和pDC315-CCL5，再分別與骨架質(zhì)粒pPE3-F11進(jìn)行重組，重組產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定正確者命名 為pPE3-Fll-CCL5和Ad5Fll-CCL5。 實(shí)施例6 :含11型腺病毒纖毛蛋白基因的溶瘤腺病毒的細(xì)胞內(nèi)重組及擴(kuò)增純化
本發(fā)明提供一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒，對(duì)腫瘤 細(xì)胞具有良好感染能力和靶向性。 第一步將構(gòu)建好的5型腺病毒質(zhì)粒pSG502，與含有11型腺病毒纖毛蛋白基因 的雜合腺病毒載體質(zhì)粒pPE3-Fll-CCL5，通過(guò)LipoFectamine2000共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。 pPE3-Fll-CCL5含有5型腺病毒右臂，缺失El區(qū)，其重組酶系統(tǒng)Cre/LoxP可以保證病毒 的高效重組。在載體共轉(zhuǎn)染后的9-14天，陸續(xù)出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過(guò)三次病毒空斑純化(具 體方法參見(jiàn)GeneTransfer and Expression Protocols, Murray EJ主編，Humana Press, Clifton， New Jersey)，重組得到溶瘤腺病毒SG511_CCL5。 第二步重組溶瘤腺病毒的鑒定，以腺病毒Ela基因引物排除野生型腺病毒，以人 CCL5基因引物鑒定重組腺病毒是否含有CCL5序列。腺病毒Ela基因引物上游引物5' _c ggaattcaccatgagacatattatc-3， (SEQ ID NO : 13)，下游引物5，-gcgtcgacttatggcctggggcg -3' (SEQID NO :14)，擴(kuò)增片段1005bp。人CCL5基因引物為上游引物5，-CGGAATTCACCATG AAGGTCTCCGCGGCAG-3' (SEQ ID NO :15)，下游引物5'-CGGGATCCCTATAACTGGAAGTCATCATCCAT TG-3' (SEQ ID NO :16)，擴(kuò)增片段349bp。 如圖8所示，以人CCL5基因引物擴(kuò)增1_4號(hào)腺病毒克隆，均能擴(kuò)增出349bp條帶， 與陽(yáng)性對(duì)照(P) —致，說(shuō)明l-4號(hào)腺病毒均含有CCL5基因。 第三步重組溶瘤腺病毒在HEK293細(xì)胞中大量擴(kuò)增，應(yīng)用氯化銫梯度離心的方法 純化腺病毒(具體方法參見(jiàn)GeneTransfer andExpression Protocols, Murray EJ主編， Humana Press, Clifton， Newjersey)。用TCID50法測(cè)得重組溶瘤腺病毒SG511-CCL5的滴度達(dá)到2. 79X101Qpf ii /ml。 實(shí)施例7 :重組溶瘤腺病毒SG511-CCL5的在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn)
正常細(xì)胞株和腫瘤細(xì)胞株分別按5X 105細(xì)胞/孔鋪在6孔板中，在37t:孵箱5% C02培養(yǎng)，第二天換無(wú)血清液體lml，然后按MOI = 5加入重組溶瘤腺病毒SG511-CCL5，培養(yǎng) 90分鐘后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，將病毒洗去，與加入5%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)， 分別在0小時(shí)、48小時(shí)、96小時(shí)收集，凍融三次，用TCID50法來(lái)檢測(cè)病毒滴度(方法參見(jiàn)美 國(guó)Qbiogene公司的AdEasyTM操作手冊(cè))。以0小時(shí)病毒滴度為參照，算出病毒在48小時(shí)、 96小時(shí)的增殖倍數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SG511-CCL5在肝癌細(xì)胞中隨著時(shí)間呈幾何倍數(shù)增殖，具有良 好的增殖能力，而在正常細(xì)胞株BJ中的增殖倍數(shù)很低，具體如圖9所示。
實(shí)施例8 :重組溶瘤腺病毒SG511-CCL5動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 第一步4 6周齡BALB/C裸鼠50只，平均重量22 27g，由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物培育中心提供，清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。 第二步體外培育人肝癌細(xì)胞S匪C-7721，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞，0. 25%胰 酶消化，離心、收集細(xì)胞后用PBS液重懸，3000g室溫離心2分鐘，棄上清，再用PBS液重懸后 離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5 X 107個(gè)/ml 。 第三步于裸鼠右肋背部皮下接種S匪C-7721細(xì)胞，O. lml/只。接種三周左右后， 可見(jiàn)接種部位皮下長(zhǎng)出米粒大小硬結(jié)，移植瘤模型建成。待瘤體直徑生長(zhǎng)至7-9mm時(shí)開(kāi)始 治療。挑選40只皮下腫瘤生長(zhǎng)至7-9mm的S匪C-7721移植瘤進(jìn)行治療，將裸鼠隨機(jī)分分為 5組。給藥途徑為直接瘤內(nèi)多點(diǎn)注射。 第四步每日觀察小鼠的生活狀態(tài)并定期測(cè)量腫瘤的體積，定期測(cè)量一次腫瘤的 最長(zhǎng)徑(A)及其垂直徑(B)，按公式(AXB2)/2計(jì)算腫瘤的體積，觀察不同劑量組的療效。
實(shí)驗(yàn)設(shè)置帶CCL5基因的非增殖型的腺病毒Ad5Fll-CCL5和不帶CCL5基因的增 殖型腺病毒SG511(其名稱為人腺病毒5/11嵌合型SG511，保藏日為2009年1月9日，保 藏號(hào)為CCTCC-V2000903，保藏地點(diǎn)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)為對(duì)照病毒。結(jié)果發(fā)現(xiàn) SG511-CCL5治療組同其他對(duì)照組相比，顯示出更強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，腫瘤體積一直明 顯小于對(duì)照組，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0. 05)，說(shuō)明雜合增殖型腺病毒SG511-CCL5對(duì)肝癌 動(dòng)物模型有很強(qiáng)的抗腫瘤作用，能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展(見(jiàn)圖10)。 SG511-CCL5治療 組同其他對(duì)照組相比，顯示出更強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)作用，腫瘤體積一直明顯小于對(duì)照組，有 顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P < 0. 05)，說(shuō)明嵌合增殖型腺病毒SG511-CCL5對(duì)肝癌動(dòng)物模型有很強(qiáng)的 抗腫瘤作用，能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)展。
序列表 〈110〉第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院 〈120〉 一種含11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構(gòu)建方法及 其用途 〈130〉IDC080XXX
〈160>16 〈170>PatentIn version 3. 2
〈210>1
〈211>981
〈212>DNA〈213〉 11纖毛序列〈400>1atgaagcgcgcaagaccgtctg皿gateccttcaaccccgtgtetccatetg3C3Cgg皿60accggtcctccaactgtgccttttcttectcctccctttgtetcccccaa120gagagtccccctggagttcttgttteacccC3C3ggCgg3180tctctecagcte腿gtggg郷gggactt織gtggatg3C3CC皿Cggttttttgaaa240gtgccaccacaccactcgtt皿gactggtcactcteteggttteccacte300ggagccggattggg朋cg朋ctttgtetca皿tteggac33ggacttec3360ttcaattcaaacaacatttgcattgatgacccttetggacaggagtc皿c420cccaccgaagccaactgtcatccagtgaatcteatgattg■cteacactegttea朋ctggagcactegtcactgcatttgtttetgttetaggagtetct540atetgcteactec3C3C3gattectgcagagctgtttttc600gattctectggteatttectaactegactctcatccctcaaaactccact660tC3gg3C3朋acatggctectggtgccattacteatgcteaaggtttcatgcccagcacg720actgcctetcctttcaatgateattctegaactecatttecggaacttgt780tectecacagctegtgatcgcactgcttttcccattgacatetctgtcatgctteaccga8403gagc朋tea3tg3Cg3g3Catcatettgtattcgteteacttggtcctgg皿C3C3gg3■gatgccccag3ggtgC3朋Cctctgctecaaccctegtcacctccccattteccttttec960tecatcagag朋gacgactg981〈210>2〈211>35655〈212>DNA〈213>Ad5/ll重組載體序列〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (721) (721)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (849) . (849)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222〉 (874) . (874)〈223>n isa， c， g，或t〈220〉〈221>misc—feature〈222>(1118) . (1118)
〈223〉n isa， c， g，或t〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉(1197). (1197)〈223〉n isa， c， g，或t〈220〉〈221〉misc_feature〈222〉 (2254) (2254)〈223〉n isa， c， g，或t〈400〉2ttettttgga郷gggtggagtttgtgacgtggcgcgggg60cgtggg雄ggggcgggtgacgtegtegtgtggcgg朋gtgtgatgttgc朋gtgtggcg120皿gcgacggatgtggc朋朋gtgacgtttttggtgtgcgccggatccaca180ggacgggtgtggtcgccatgatcgcgtagtcgategtggctccaagtegcg皿gCg3gC3240ggactgggcggcggcca朋gcggtcggacagtgctccgag皿cgggtgcgcatega朋tt300gcatcaacgcatatagcgct3gC3gC3CgCcatagtgactggcgatgctgtcgg朋tgga360cgatetcccgc朋gaggcccggcagteccggcat朋cc朋gcctatgcctacagcatcca420gggtgacggtgccg郷atg3Cg3tg3gCgcattgttagatttcatacacggtgcctgac■tgcgttegcaatttaactgtgate朋cteccgcatte皿gcttetcgttcg咖tttggg540ggatcttcgatgctegacgatccagacatgttgatgagtttgg3C3朋CC600ac朋cteg朋aaaatgcttttttgtgatgctattgcttta660tttgtaaccattataagctggttgctcgaagtcgacgatcCg朋C3朋Cg720nccc朋cacccgtgcgttttattctgtctttttattgccgatcccctcag780c皿g朋ggcgateg皿ggcgatgcgctgcg皿tcgggagcggcgateccgte朋gcacg3840gg朋gcggncagcccattcgccgccatgtttttnagcaatgccaacgcta■tgtcctgatagcggtccgcc3C3CCC3gCCtcgacaattccaacctteccc皿gagttcg960ccaaactcagacatcacttt3gC皿皿CCgcgccgtgcttcttcctcggtggcattcatc1020cagcactecgcatacttttgg3C3gg朋3Cgc皿cggatettgagtcaat1080atcaggcattctatcgctcagctttacagtgacaatgncggctggcgact1140gcttecagacagcactacatattttccgtcgatgttga朋tcctttctcatatgtcncca1200ateattetegcaatcatttacgcgtteatggcteatcgccatcttccagc12603ggCgC3CC3ttgcccctgtttcactetcc郷ttecggatetegttcatgacaatettt1320acattggtccagccaccagcttgcatgatctccggtettgaaactccagcgcgggccate1380tctcgcgcggctccgacacgggcactgtgtCC3g3CC3ggccaggtatctCtg3CC3g3g1440tcatccttegcgccgtaaatc皿tcgatg3gttgcttcaaaaatcccttcc郷gcgcga1500gttgategctggctggtggc卿tggcgcggcaacaccattttttctgacccggc皿皿c1560aggtegttettcggatcatcagctecaccagagacgg3朋tccatcgctcgaccagttta1620gttacccccaggct皿gtgccttctctacacctgcggtgcteaccagcgttttcgttctg1680cc朋tetggattaacattctcccaccgtcagtecgtg卿tetcttteaccctgatcctg
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〈400>3gccgtteattaagatcttettcccttteac60ttctgtccag tttettcagcagcacctcct tgccctcctc120ccagctctggtettgcagcttcctcctggctgcaaactttctccacaatc teaatggaat180gtcagtttcctcctgttcctgtccatccgcacccactetcttcatgttgt tgcagatgaa240gcgcgcaagaccgtctgaagateccttcaa ccccgtgtetccatetg3C3 cgga皿ccgg300tcctccaactgtgccttttcttectcctccctttgtetccccc皿tgggt ttc皿gagag360tccccctggagttcttectt皿ccccactaacaaccacag gcggatctct4203C3gctea朋gtggg郷gggacttecagtgg3tg3C3CC皿Cggttttt tg皿3g皿皿■cateagtgcc3CC3C3CC3Ctcgtteagactggtcactctateggtttec cacteggagc540cggattgggaggac皿ggac ttecattc皿600atttgcattgatgac皿tetteacaccttatgg3C3gg3g tc皿ccccac660cg皿gcc皿ctgtcaaatcatgaactccag tgaatcteatgattgcaaat teattcteac720actegtte皿3Ctgg3gC3Ctegtcactgcatttgtttetgtteteggag tetcteac皿780tttteatetgcteactecacgcagagctgt ttttcgattc840
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〈212>DNA〈213>引物序列〈400>5agctteatte atctegatgcggccgcggatccactagtctcgagaccggtc51〈210>6〈211>1067〈212>DNA〈213>5型腺病毒ADP基因序列〈400>6tgacacatgc agctcccggag3CggtC3C3gcttgtctgtaagcggatgcCgggElgC卿60caagcccgtc agggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggctteactetgcg120gcatcagagc agattgtectgagagtgcaccatetgcggtgtga朋teccgcacagatgc180gteaggag朋朋teccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttggg朋240gggcgatcgg tgcgggcctcttcgctettecgccagctggcg腿gggggatgtgctgca300aggcgattea gttgggteacgccagggttttcccagtcacgacgttgtea朋cgacggcc360agtgaattga ccggtctcgag￡ictegtgg￡itccgcggccgccgcteccggacttecatct4203cc3ca朋te cacccc朋gtttctgcctttgtcaateactgggateacttgggCEltgtgg■tggttctcca tegcgcttetgtttgtetgccttettettetgtggctcatctgctgccte540朋gcgca朋c gcgcccgaccacccatctetagtcccatcattgtgcteca600gatgg朋tcc ategattggaCgg3Ctg朋3cacatgttcttttctcttacagtetgatte660朋tgag3cat gattcctcgagtttttetettectgacccttgttgcgctttttttgtgcg720tgctccacat tggcteagteategtteatt朋gcttggcgteatcatggtcategctgtt780tcctgtgtga aattgttetccgctcacaattCC3C3C朋Catecgagccgg朋gcate朋840gtgteaagcc tggggtgcct￡l￡ltg￡lgtg￡lgcteactcacatteattgcgttgcgctcact■gcccgctttc cagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcatteatg朋tcggccaacgcgc960ggggEl卿gg cggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgc1020gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtetcagctcactc咖ggcg1067〈210>7〈211>271〈212>DNA〈213>hTERT啟動(dòng)子核心序列〈400>73g3tctC3C3 gacgcccaggaccgcgcttcccacgtggcgg3ggg3Ctgg gg3CCCgggC60acccgtcctg ccccttcaccttccagctccgcctcctccgcgcggaccccgccccgtccc120gacccctccc gggtccccggcccagccccctccgggccctcccagcccctccccttcctt180tccgcggccc cgccctctcctcgcggcgcgagtttcaggcagcgctgcgtcctgctgcgc240acgtgggaag ccctggccccggccactcgag271〈210>8〈211>247
〈212>DNA〈213>HRE序列〈400>8actegtccacagtgcatecg tgggctccaacaggtcctcttccacagtgc atecgtgggc60tccaacaggtcctcttccac3gtgcatecgtgggctccaacaggtcctct tccacagtgc120atecgtgggctccaacaggtcctcttccac3gtgcatecgtgggctccaa caggtcctct180tggteggcgtgtecggtggg aggtctetet皿gcagagctcgtttegtga accgtcagat240cactegt247〈210>9〈211>747〈212>DNA〈213>EGFP報(bào)告基因序列〈400>9EltggtgElgCElElgggCgElggElgctgttcaccggggtggtgcccatcctggt cgagctggac60ggcgacgtea3CggCC3C朋gttcagcgtgtccggcgagggcgagggcga tgccacctec120ggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggc皿gctgcccgtgcc ctggcccacc180ctcgtgaccaccctgacctecggcgtgcagtgcttcagccgcteccccga ccacatgaag240cagcacgacttcttcaagtccgccatgcccg皿ggctecgtccaggagcg caccatcttc300ttc朋ggacgacggc朋ctecaagacccgcgccg郷tga3gttCg3ggg Cg3C3CCCtg360gtg朋ccgcatcgagctg朋gggcatcgac3CggC皿C3t cctggggcac420朋gCtgg3gtC3gCC3C皿Cgtctetetcatggccgac皿gcag皿g皿c■ggcatcaaggtgaacttcaagatccgccac皿C3tCg3ggacggcagcgt gcagctcgcc540gaccactecc3gC3g朋C3Cccccatcggcgacggccccgtgctgctgcc cgacaaccac600tecctgagcacccagtccgcCCtg3gC皿3gaccccaacg3g皿gcgcga tcaratggtc660ctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagct gtec皿gtcc720ggactcagatccaccggatcteggtea747〈210>10〈211>32〈212>DNA〈213>引物序列〈400>10gctctegagaattcaccatg:gtgagc卿g gc32〈210>11〈211>34〈212>DNA〈213>引物序列〈400>11cgggatccgtcgacttatta,cctagatccg gtgg34〈210>12
33
〈211>345〈212>DNA〈213〉人趨化因子CCL5序列〈400>12gaattcacca tgaaggtctc cgcggcagcc ctcgctgtca tcctcattgc tactgccctc60tgcgctcctg catctgcctc cccatattcc tcggacacca caccctgctg ctttgcctac120attgcccgcc cactgccccg tgcccacatc aaggagtett tctecaccag tggcaagtgc180tccaacccag cagtcgtctt tgtcacccga aagaaccgcc aagtgtgtgc caacccagag240朋g朋3tggg ttCggg￡lgt￡l C3tC朋Ctct ttgg￡lg￡ltg￡l gCtt￡lg￡lCtt gg￡lg￡ltgtt￡l300gctccctete tcccaatgga tgatgacttc cagttetegg gatcc345〈210>13〈211>26〈212>DNA<213>引物序列〈400>13cggaattcac catgagacat attatc26〈210>14〈211>23〈212>DNA〈213〉引物序列<400>14gcgtcgactt atggcctggg gcg23〈210>15〈211>30〈212>DNA〈213〉引物序列〈400〉15cggaattcac catgaaggtc tccgcggcag30〈210>16〈211>34〈212>DNA〈213〉引物序列〈400>16cgggatccct ataactggaa gtcatcatcc attg3權(quán)利要求
一種增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于該重組腺病毒含B亞群11型腺病毒纖毛頭的氨基酸編碼序列；并且該病毒基因組至少一個(gè)病毒增殖必需基因被突變或者被缺失而失去功能，或所述病毒在增殖必需基因序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與翻譯起始位點(diǎn)ATG之間可操作地插入順式作用元件，所述元件控制基因組中至少一個(gè)病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄。
2. 權(quán)利要求l的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于該重組腺病毒纖毛頭的氨基酸序 列為人類B亞群11型腺病毒纖毛頭的氨基酸序列。
3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒在增殖必需基 因序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與翻譯起始位點(diǎn)ATG之間可操作地插入的是腫瘤特異性啟動(dòng)子的 順式作用元件。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述腫瘤特異性啟動(dòng)子 選自(a) 癌胚抗原啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(b) 甲胎蛋白啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(c) 人表皮生長(zhǎng)因子受體家族的受體酪氨酸激酶啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(d) 乳腺癌相關(guān)抗原DF3/MUC1啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(e) 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體KDR的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(f) L-plastin啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(g) 凋亡抑制蛋白家族成員的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(h) 前列腺素特異性抗原的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；(i) 缺氧誘導(dǎo)因子-1調(diào)控的缺氧反應(yīng)元件保守序列； (j)轉(zhuǎn)錄因子E2F啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列；禾口 (k)人端粒酶亞基啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其突變體序列 中的至少一種。
5 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒增殖必需基因 是野生型的或者經(jīng)過(guò)突變的編碼Ela、Elb-55kDa、Elb-19kDa、E2或E4的基因。
6. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒增殖必需 基因是經(jīng)過(guò)點(diǎn)突變、插入突變、插入終止密碼子、完全或部分缺失而失活的Elb-55kDa或 Elb-19kDa基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于其還可操作地連接有外 源基因表達(dá)盒。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述外源基因選自(a) 干擾素類免疫調(diào)節(jié)因子的基因；(b) 白細(xì)胞介素類免疫調(diào)節(jié)因子的基因；(c) 細(xì)胞集落剌激因子的基因；(d) 抑癌基因;(e) 原癌基因的反義序列；(f) 人腫瘤表皮生長(zhǎng)因子受體家族的抗體基因；(g) 編碼抗血管生成因子的內(nèi)皮抑素、血管抑素及其片段、纖溶酶原激活因子抑制劑、 Canstatin、血小板反應(yīng)蛋白的核苷酸序列；(h) 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子家族的基因；(i) 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子抗體的基因；(j)自殺基因；禾口(k)腫瘤壞死因子的基因中的至少一種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的增殖型重組溶瘤腺病毒，其特征在于所述病毒載體為選自C亞群的2型或者5型腺病毒中的至少一種。
10. 權(quán)利要求1的增殖型重組溶瘤腺病毒，其保藏日為2009年1月9日，保藏編號(hào)為CCTCC-V200903 ，保藏地點(diǎn)為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。
11. 構(gòu)建權(quán)利要求2所述的增殖型重組溶瘤腺病毒的方法，其特征在于通過(guò)基因工程方法用人類B亞群11型腺病毒纖毛頭的氨基酸序列取代非11型腺病毒的纖毛頭氨基酸序列；且使所述病毒的至少一個(gè)增殖必需基因被突變或者被缺失而失去功能，或使所述病毒在增殖必需基因序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與翻譯起始位點(diǎn)ATG之間可操作地插入順式作用元件，所述元件控制基因組中至少一個(gè)病毒增殖必需基因的轉(zhuǎn)錄。
12. 權(quán)利要求1所述增殖型重組溶瘤腺病毒載體，其作為基因的載體而用于制備基因治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程學(xué)和病毒學(xué)，尤其涉及一種含人類B亞群11型腺病毒纖毛蛋白基因的增殖型重組溶瘤腺病毒、其構(gòu)建方法及其用途。該腺病毒可以是11型腺病毒，也可以是用11型腺病毒纖毛蛋白的編碼序列取代非11型腺病毒的纖毛蛋白編碼序列而構(gòu)成的雜合腺病毒。該腺病毒通過(guò)對(duì)其增殖必須基因進(jìn)行的有效控制或突變而具有選擇性增殖能力。作為具有更廣的感染譜和改良感染能力的條件增殖型的重組病毒，本發(fā)明的重組溶瘤腺病毒可以用于基因治療尤其是腫瘤的基因治療。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101781636SQ20091004551
公開(kāi)日2010年7月21日 申請(qǐng)日期2009年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者吳孟超, 吳紅平, 李琳芳, 蘇長(zhǎng)青, 錢其軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院