專利名稱：一種基因組dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)，特別涉及DNA分離提取和純化方法。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)在近幾十年的發(fā)展非常迅猛，對基因的研究己經(jīng)遍及醫(yī)學(xué)、 農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)及生物各學(xué)科領(lǐng)域?；蚪MDNA的提取是分子生物學(xué)最常用 的實驗技術(shù)之一，在上述各領(lǐng)域中都有使用。20世紀(jì)后期，提取基因組DNA 常用的方法是細(xì)胞破膜后利用有機(jī)溶劑(苯酚、氯仿、異戊醇等)使蛋白質(zhì) 變性達(dá)到與DNA分離的目的。這些有機(jī)溶劑對人體皮膚、呼吸道粘膜、眼睛 等有較大的傷害，而且試劑殘留對環(huán)境污染較大；后來又出現(xiàn)了利用DNA吸 附材料來達(dá)到蛋白質(zhì)與DNA分離的目的，這種方法解決了毒性和污染問題， 但這種材料成本相對較高，操作比較繁瑣，針對的生物樣品局限性較大。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種提取并純化基因組DNA的方法， 該方法可以針對絕大多數(shù)生物樣品，操作簡單、經(jīng)濟(jì)、無毒無污染，高質(zhì)高 效。
本發(fā)明的提取基因組DNA的方法包括步驟(l)裂解樣本細(xì)胞按300ul 人全血樣本或10~40mg動植物組織樣本計算，在樣本中加入300ul細(xì)胞裂解 液(5 50 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)， 0.2 20mmol/L EDTA (pH8.0)， 0.1 10%SDS)，裂解樣本細(xì)胞，用移液器來回吹打混勻；(2) RNase消化加入 4 10mg/ml的RNase溶液并混勻，37。C消化15 60分鐘；(3)蛋白沉淀 將樣品放置冰上使其快速冷卻，向冷卻后的樣品中加入ioow蛋白沉淀液(1 10mol/L(NH4)2SO4或1 1Omol/LNH4Ac)，震蕩充分混勻，13， OOOrpm離心 2分鐘；(4) DNA沉淀將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到100%異丙醇中，來回顛 倒充分混合，13， 000rpm離心2分鐘，倒去上清，將離心管倒置于濾紙上除 去殘液，然后加入0.5 lml70X乙醇，并來回顛倒離心管十?dāng)?shù)次，洗滌DNA 沉淀，13， 000rpm離心1分鐘，倒去上清液，將離心管倒置于濾紙上空氣干 燥10分鐘或者真空抽干3 5分鐘；(5) DNA的溶解加入50 100pl TE或者滅菌雙蒸水，敲打混勻，65"C水浴15分鐘或37。C溶解過夜。產(chǎn)物置于4°C 保存，如需要長時間保存，也可置于-20'C或-8(TC下。
本發(fā)明的提取樣本對象可以是全血、骨髓、培養(yǎng)細(xì)胞、動物組織、植物 組織、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及酵母菌。但針對不同的樣本，裂解 處理的步驟有所不同。
對于培養(yǎng)細(xì)胞，收集l 3X10e個細(xì)胞后加入30(Hd細(xì)胞裂解液，用移液 器來回吹打混勻。
對于人類及動物組織標(biāo)本，先用研磨，剪碎等方法處理樣本，每10 20mg 組織中加入300^il細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻。人類及動物組織標(biāo)本 中因蛋白含量非常高，需在細(xì)胞裂解液消化后加入1 5^1蛋白酶K溶液 (5~40pg^l) 55t:消化過夜，直到無肉眼可見的組織團(tuán)塊。
對于血液和骨髓標(biāo)本，每30(^1樣品中需先加入900^1紅細(xì)胞裂解液(10 50Ommol/LNH4Cl, 0.1 1Ommol/LEDTA， l~100mmol/L KHC03)，室溫放置 5分鐘，并不時來回顛倒混勻，直至溶液變得清亮。此步目的是裂解紅細(xì)胞， 外周血和骨髓中的紅細(xì)胞是無細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中不含有基因組DNA，所以 需要和白細(xì)胞分離去除。將裂解后的溶液13， OOOrpm離心l分鐘，離心管底 可見白色的白細(xì)胞沉淀，紅細(xì)胞已裂解并分散到上清液中。小心去除上清， 最后保留約20 30pl的上清液，并用其將白細(xì)胞沉淀重懸。往重懸的白細(xì)胞 中加入30(Hil細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻。
對于植物組織樣本，先在液氮中用研磨棒將樣本磨碎。每20 40mg樣品 中加入30(Hd細(xì)胞裂解液，來回顛倒混勻后，置于65t:消化60分鐘。
對于革蘭氏陰性細(xì)菌，先用1.5ml離心管收集lml左右細(xì)菌懸液(約0.5 2X1()9個細(xì)胞)，13， OOOrpm離心15秒收集菌體。加入300^1細(xì)胞裂解液， 用移液器來回吹打混勻后，置于8(TC消化5分鐘。
對于革蘭氏陽性細(xì)菌及酵母菌，用1.5ml離心管收集lml左右細(xì)菌懸液(約 1 3X1()8個細(xì)胞)，13， 000 rpm離心15秒收集菌體。加入30(HU細(xì)胞懸浮 液(0.1 1Ommol/L Nacl， 0.2 50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)， 0.1 20mmol/L EDTA (pH8.0)),用移液器來回吹打混勻。加入1^1溶菌酶(20mg/ml)置于37°C 消化30鐘。由于革蘭氏陽性細(xì)菌和酵母菌細(xì)胞壁非常堅實，加入溶菌酶消化 有利于細(xì)胞壁的裂解。消化產(chǎn)物于13， OOOrpm離心1分鐘收集沉淀。向沉淀 中加入300W細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻后，置于80。C消化5分鐘。
本方法中，用陰離子去構(gòu)劑SDS裂解細(xì)胞，同時SDS還可以抑制細(xì)胞中或環(huán)境里的DNase的活性，提供DNA穩(wěn)定的環(huán)境。RNA可以用RNA酶消化
除去。去除蛋白質(zhì)時，使用高濃度的(NH4)2S04溶液代替了傳統(tǒng)的有機(jī)溶液。
最后，基因組DNA用乙醇沉淀回收并溶解在含有DNA穩(wěn)定劑的緩沖液中。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法能夠快速得到高純度高質(zhì)量的基因組DNA，整個過 程可快至30分鐘，得到的DNA片段約為50 500Kb，可用于Southern, PCR， RFLP， DNA文庫構(gòu)建等各種分子生物學(xué)實驗。并且，本方法操作簡單、無需 復(fù)雜設(shè)備、花費低廉，更重要的是清潔無毒，對使用者和環(huán)境均無害。
具體實施例方式
以下用具體實施方式
對本發(fā)明進(jìn)行具體闡述，下列所有實施例中所述的 操作步驟皆為以在1.5ml離心管中操作為例。如需大規(guī)模提取，按比例放大試 劑與樣品量即可。
所用的緩沖液和試劑
細(xì)胞裂解液5 50mmol/LTris.Cl(pH8.0)， 0.2 20mmol/LEDTA(pH8.0)， 0,1 腦SDS;
紅細(xì)胞裂解液10 500mmol/L NH4Cl， 0.1 10mmol/L EDTA ， l~100mmol/LKHCO3;
細(xì)胞懸浮液0.1 10mmol/LNacl， 0.2 50mmol/LTris.Cl(pH8.0)， 0.1 20mmol/LEDTA(pH8.0);
蛋白沉淀液1 1 Omol/L (NH4)2S04或1 1 Omol/L NH4Ac;
蛋白酶K溶液(5~40|ig4il);
RNase (4 10mg/ml);
溶菌酶(20mg/ml);
異丙醇(100%);
乙醇(70%)。
實施例l:培養(yǎng)細(xì)胞基因組DNA的提取
1) 收集3X1()S個培養(yǎng)細(xì)胞，加入300^il細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹 打混勻；
2) 加入1.0^1 8 mg/ml的RNase溶液并混勻；
3) 37'C消化30分鐘；
4) 將樣品放置冰上l分鐘，使其快速冷卻；
5) 向冷卻的樣品中加入10(^1蛋白沉淀液，震蕩充分混勻；
6) 13， 000rpm離心2分鐘；7) 準(zhǔn)備一個新的1.5ml離心管，加入400^1 100%異丙醇；
8) 用移液器小心將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到異丙醇中并來回顛倒充分 混合；
9) 13, 000rpm離心2分鐘。此時管底可見白色團(tuán)塊；
10) 倒去上清，將離心管倒置于濾紙上吸去殘液，然后加入50(^1 70% 乙醇，并來回顛倒離心管十?dāng)?shù)次，洗滌DNA沉淀；
11) 13， OOOrpm離心1分鐘，小心倒去上清液，將離心管倒置于濾紙上， 空氣干燥10分鐘；
12) 加入100WTE，用移液器吹打混勻；
13) 65'C水浴15分鐘溶解DNA;
14) 將DNA樣品保存于-20'C保存。
用該方法可從l-3Xl(^個培養(yǎng)細(xì)胞中提取10 30嗎的基因組DNA。 實施例2:人外周血基因組DNA的提取
1) 往300ixl抗凝的人外周血樣品中加入900^il紅細(xì)胞裂解液，室溫放 置5分鐘，并不時來回顛倒混勻，直至溶液變得清亮；
2) 將清亮后的溶液13, OOOrpm離心1分鐘，離心管底可見白色沉淀; 用200|_d移液器小心吸去上清并廢棄，最后保留約20 30pl的上清 液，并用其將沉淀重懸；
3) 往重懸的白細(xì)胞中加入300^1細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻；
4) 其余步驟同實施例1中步驟2) ~步驟14)。 用該方法可從300^1全血中提取5 15嗎的基因組DNA。
實施例3:人類組織標(biāo)本基因組DNA的提取
1) 取人類組織標(biāo)本，先用研磨，剪碎等方法處理樣本；
2) 每10 20mg組織中加入300jxl細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻;
3) 在細(xì)胞裂解液消化后加入1 5^1蛋白酶K溶液，55'C消化過夜， 直到無肉眼可見的組織團(tuán)塊；
4) 其余步驟同實施例1中步驟2) ~步驟14)。 用該方法可從10~20mg組織中提取10 30pg的基因組DNA。
實施例4:植物組織樣本基因組DNA的提取1) 對于植物組織樣本，先在液氮中用研磨將樣本磨碎；
2) 每20 40mg樣品中加入30(^1細(xì)胞裂解液，來回顛倒混勻后，置 于65"C消化60分鐘
3) 其余步驟同實施例1中步驟2) ~步驟14)。 用該方法可從20 40mg植物組織中提取5 20pg的基因組DNA。
實施例5:革蘭氏陰性菌基因組DNA的提取
1) 先用1.5ml離心管收集lml左右革蘭氏陰性菌懸液(約0.5 2X109 個細(xì)胞)，13， OOOrpm離心15秒收集菌體；
2) 加入30(Hd細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻后，置于8(TC消化 5分鐘；
3) 其余步驟同實施例1中步驟2) ~步驟14)。 用該辦法可從lml革蘭氏陰性菌懸液中提取20嗎的基因組DNA。
實施例6:革蘭氏陽性菌基因組DNA的提取
1) 用1.5ml離心管收集lml左右細(xì)菌懸液(約1 3X1()S個細(xì)胞)，13， 000 rpm離心15秒收集菌體；
2) 加入300^1細(xì)胞懸浮液，用移液器來回吹打混勻；
3) 加入1^1溶菌酶置于37X:消化30鐘。由于革蘭氏陽性細(xì)菌及酵母 菌細(xì)胞壁非常堅實，加入溶菌酶消化有利于細(xì)胞壁的裂解；
4) 消化產(chǎn)物于13， OOOrpm離心l分鐘，收集沉淀；
5) 向沉淀中加入300^1細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻后，置于 8(TC消化5分鐘；
6) 其余步驟同實施例1中步驟2) ~步驟14)。 用該辦法可從lml革蘭氏陽性菌懸液中提取6~12嗎的基因組DNA。
權(quán)利要求
1. 一種基因組DNA的提取方法，其特征在于包括步驟(1)裂解樣本細(xì)胞在樣本中加入細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻；所述細(xì)胞裂解液成分為5～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.2～20mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1～10％SDS；(2)RNase消化加入4～10mg/mL的RNase溶液并混勻，37℃消化15～60分鐘；(3)蛋白沉淀將樣品快速冷卻，加入蛋白沉淀液，充分混勻，13,000rpm離心2分鐘；所述蛋白沉淀液成分為1～10mol/L(NH4)2SO4或1～10mol/LNH4Ac；(4)DNA沉淀將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到100％異丙醇中，來回顛倒充分混合，13,000rpm離心2分鐘，倒去上清，將離心管倒置于濾紙上除去殘液，然后加入70％乙醇，并來回顛倒離心管十?dāng)?shù)次，洗滌DNA沉淀，13，000rpm離心1分鐘，倒去上清液，將離心管倒置于濾紙上空氣干燥10分鐘或者真空抽干3～5分鐘。
2. 如權(quán)利要求1所述的基因組DNA的提取方法，其特征在于所述樣本為 培養(yǎng)細(xì)胞；所述裂解液的加入量為每1~3乂106個培養(yǎng)細(xì)胞中加入30(^1 細(xì)胞裂解液。
3. 如權(quán)利要求1所述的基因組DNA的提取方法，其特征在于所述樣本為 人類及動物組織；所述裂解步驟(l)為先研磨、剪碎樣本，每10~20mg 組織中加入300^1細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻；細(xì)胞裂解液消化 后再加入l 5pl蛋白酶K溶液，55'C消化過夜。
4. 如權(quán)利要求1所述的基因組DNA的提取方法，其特征在于所述樣本為 血液或骨髓；所述裂解步驟(l)為按每300(^1樣品加入90(Hd紅細(xì)胞裂解 液室溫放置5分鐘，并不時來回顛倒混勻，直至溶液變得清亮，所述紅 細(xì)胞裂解液組成為10 500mmol/L NH4Cl， 0.1 10mmol/L EDTA， l~100mmol/LKHCO3;將裂解后的溶液13， OOOrpm離心1分鐘，去除上 清，保留白細(xì)胞沉淀，向白細(xì)胞沉淀中加入30(Hd細(xì)胞裂解液，用移液器 來回吹打混勻。
5. 如權(quán)利要求1所述的基因組DNA的提取方法，其特征在于所述樣本為植物組織；所述裂解步驟(l)為先在液氮中用研磨棒將樣本磨碎，按每 20 40mg樣品加入30(^1細(xì)胞裂解液，來回顛倒混勻后，置于65'C消化 60分鐘。
6. 如權(quán)利要求1所述的基因組DNA的提取方法，其特征在于所述樣本為 革蘭氏陰性細(xì)菌；所述裂解步驟(l)為按0.5 2乂109個菌體細(xì)胞加入 300)!l細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻后，置于8(TC消化5分鐘。
7. 如權(quán)利要求1所述的基因組DNA的提取方法，其特征在于所述樣本為 革蘭氏陽性細(xì)菌或酵母菌；所述裂解步驟(l)為按每1 3乂108個菌體細(xì) 胞加入30(HU細(xì)胞懸浮液，所述細(xì)胞懸浮液成分為0.1 10mmol/LNad， 0.2 50mmol/LTris.Cl(pH8.0)， 0.1 20mmol/L EDTA (pH8.0);用移液器 來回吹打混勻后加入1^1濃度為20mg/ml的溶菌酶，置于37'C消化30 鐘；消化產(chǎn)物于13， OOOrpm離心1分鐘，收集沉淀；向沉淀中加入300(al 細(xì)胞裂解液，用移液器來回吹打混勻后，置于8(TC消化5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因組DNA的提取方法，在樣本中加入細(xì)胞裂解液(5～50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，0.2～20mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1～10％SDS)，裂解樣本細(xì)胞；RNase消化；(3)將樣品冷卻，加入蛋白沉淀液(1～10mol/L(NH4)₂SO₄或1～10mol/L NH₄Ac)，離心沉淀去除蛋白；將離心后的上清液轉(zhuǎn)移到100％異丙醇中，離心沉淀DNA。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法能夠快速得到高純度高質(zhì)量的基因組DNA，整個過程可快至30分鐘，得到的DNA片段約為50～500Kb。并且，本方法操作簡單、無需復(fù)雜設(shè)備、花費低廉，清潔無毒，對使用者和環(huán)境均無害。
文檔編號C12P19/00GK101413018SQ20081014385
公開日2009年4月22日 申請日期2008年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者鋼 周, 敏 朱, 胡維新 申請人:中南大學(xué)