專(zhuān)利名稱：海帶全基因組dna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA提取方法，特別是涉及到一種海帶孢子體全基因組DNA提取方法。
大型海藻細(xì)胞內(nèi)不僅具有很高的核酸酶活性，而且其細(xì)胞壁含有大量的多糖，且其組成因物種不同而各異。在紅藻和褐藻當(dāng)中，含硫酸基和羧基的多糖占主要組成部分。在成熟海帶孢子體的細(xì)胞壁和細(xì)胞間隙，也因?yàn)楹写罅康亩嗵?，造成在核酸提取過(guò)程中的共沉淀，從而影響了核酸的純度。目前國(guó)內(nèi)外在分子水平開(kāi)展對(duì)大型紅、褐藻的研究當(dāng)中，為了去除多糖的干擾，通常采用經(jīng)典的CsCl超速離心的方法，但此方法對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作技術(shù)要求較高，而且花費(fèi)較高；另外也有研究人員采用諸如柱過(guò)濾等純化方法，雖然較好地純化了基因組DNA，但在純化過(guò)程中易造成基因組DNA的丟失和損害，而且不夠經(jīng)濟(jì)。若要開(kāi)展種群遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記輔助育種等研究，由于需要處理的實(shí)驗(yàn)樣品較多，對(duì)于以上所采用的物理或化學(xué)方法，其煩瑣、昂貴的缺陷更加顯得不利于實(shí)驗(yàn)研究的進(jìn)行。
本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便、易行的方法，用以從新鮮、冷凍海帶孢子體或干制標(biāo)本等各種材料中提取高質(zhì)量的全基因組DNA。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為1)用無(wú)菌海水清洗海帶孢子體，并在12-14℃光照培養(yǎng)箱中復(fù)蘇6-8小時(shí)，然后將組織剪成1-2mm的小片。
2)按1∶8的比例(g/ml)向組織中加入酶解液(0.8M甘露醇，50mM檸檬酸三鈉，1％纖維素酶，0.5％離析酶R-10，褐藻酸裂解酶0.2U/ml)，放置于搖床上(70×g)，14℃黑暗條件下酶解6-8小時(shí)。
3)所得解離單細(xì)胞經(jīng)篩絹(240目)過(guò)濾，并以3000×g離心收集。按1∶6比例(mg/ml)加入CTAB提取緩沖液[3％CTAB(w/v)，1.4M NaCl，20mM EDTA，10mM Tris-Cl(pH7.8)，2％巰基乙醇(w/v)]，水浴45-60min。
4)在上述體系中加入等量氯仿∶戊醇，離心(11000×g，10min)，取上清，加2/3體積冷異丙醇，-20℃放置20min，再離心(5100×g，10min)。所得沉淀用70％冷乙醇洗滌沉淀。
5)將沉淀溶解于TE溶液[10mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA]，4℃離心(11000×g，5min)，取上清。
6)所得上清中加入1/3體積7.5M NH4Ac和2.5體積95％的乙醇，-20℃放置30min，離心(11000×g，15min)，沉淀用70％冷乙醇清洗，真空干燥，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明海帶全基因組DNA提取方法區(qū)別于傳統(tǒng)的超速離心等機(jī)械物理方法和純化等化學(xué)方法，其優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)全基因組DNA提取材料先進(jìn)行生物處理，以去除多糖的污染。所使用的材料不僅僅限于新鮮的海帶孢子體，還可以是冷凍的成熟海帶孢子體或干制保存的標(biāo)本。而且本方法還可以應(yīng)用于其它海藻如裙帶菜、紫菜等大型褐、紅藻全基因組DAN的提取。所得的高質(zhì)量基因組DNA可廣泛應(yīng)用于海藻種群遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記育種等各項(xiàng)研究。
下面詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例實(shí)施例一取新鮮成熟海帶孢子體，用無(wú)菌海水清洗去除雜藻及其它附著物，用剪刀將組織剪碎1-2mm，取1克放入有8ml酶解液的小錐形瓶中，再加入褐藻酸裂解酶，使其終濃度達(dá)到0.2U/ml，錐形瓶放在搖床上(70×g)在黑暗的培養(yǎng)箱中(14℃)酶解6-8小時(shí)左右。然后取出用240目的篩絹過(guò)濾去除未酶解的碎片，離心(3000×g)收集單細(xì)胞，并用海水清洗3-5次，去除可能的污染。取30-100mg的單細(xì)胞，加入0.6mlCTAB提取緩沖液，65℃溫浴45-60min，其間輕緩地?fù)u動(dòng)3-5次，再加入等量的氯仿∶異戊醇(v/v，24∶1)，輕輕搖動(dòng)，室溫下離心(11000×g，10min)，上清液轉(zhuǎn)移到另一新離心管中，向離心管中加入2/3體積的異丙醇，-20℃放置20分鐘后，室溫下離心(5100×g，5min)。用70％的乙醇洗滌沉淀，干燥后溶解于100-200μlTE緩沖液。4℃離心(11000×g，5min)，取上清液溶解于1/3體積7.5M NH4Ac和2.5倍體積95％的乙醇，-20℃放置30min以上，離心(11000×g，15min)后再用70％乙醇清洗，真空干燥，溶解于適量無(wú)菌水或TE緩沖液中4℃保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例二取冷凍海帶孢子體或干制標(biāo)本，放入無(wú)菌海水中，在12-14℃光照培養(yǎng)箱中恢復(fù)24小時(shí)，光周期為12h/12h。其它步驟同以上實(shí)施例所表述的海帶孢子體經(jīng)酶解生物處理和全基因組DNA見(jiàn)

圖1和圖2。
權(quán)利要求
1.一種海帶全基因組DNA提取方法，其特征在于以下操作1)用無(wú)菌海水清洗海帶孢子體，按1∶8的比例(g/ml)加入酶解液(甘露醇0.8M，檸檬酸三鈉50mM，纖維素酶1％，離析酶R-100.5％，褐藻酸裂解酶0.2U/ml)，放置于搖床上(70×g)，在14℃黑暗條件下酶解6-8小時(shí)。2)將1)所得解離單細(xì)胞經(jīng)篩絹(240目)過(guò)濾，并以3000×g離心收集。按1∶6比例(mg/ml)加入CTAB提取緩沖液[3％CTAB(w/v)，1.4M NaCl，20mM EDTA，10mM Tris-Cl(pH7.8)，2％巰基乙醇(w/v)]，水浴45-60min。3)向2)體系中加入等量氯仿∶戊醇，離心，取上清，加冷異丙醇沉淀，再離心。所得沉淀用乙醇洗滌，溶解于TE溶液[10mM Tris-Cl(pH8.0)，1mM EDTA]，離心取上清。4)在3)所得上清中加入7.5M NH4Ac和95％的乙醇，低溫放置，離心，用70％冷乙醇清洗，真空干燥，于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求1所述的全基因組DNA提取方法，其特征在于所用的DNA提取材料為新鮮或冷凍的海帶孢子體，也可以是干制標(biāo)本。
3.如權(quán)利要求1所述的全基因組DNA提取方法，其特征在于所用的DNA提取材料是冷凍孢子體或干制標(biāo)本時(shí)，應(yīng)事先用海水浸泡。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種海帶全基因組DNA提取方法。在傳統(tǒng)的海藻基因組DNA提取方法中，多采用CsCl超速離心等物理方法或柱純化等化學(xué)方法以去除多糖污染，既不經(jīng)濟(jì)又費(fèi)力、耗時(shí)。本方法的特征在于將DNA提取材料清洗、經(jīng)適量的褐藻酸裂解酶處理，去除部分多糖，再沉淀分離得到單細(xì)胞，用陽(yáng)離子型去污劑十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)消化，苯酚、異戊醇抽提，除去剩余多糖，異丙醇沉淀、臨界干燥，最后用冷乙醇洗滌、沉淀，真空干燥。采用該生物處理方法可成功提取高質(zhì)量的海帶全基因組DNA，并應(yīng)用于海帶種群遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、分子標(biāo)記輔助育種等研究，且該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、易于操作，適合在普通生物實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1401782SQ02111328
公開(kāi)日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2002年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月11日
發(fā)明者周志剛, 胡遠(yuǎn)皆 申請(qǐng)人:上海水產(chǎn)大學(xué)