專利名稱：紅細(xì)胞富集與rt－pcr聯(lián)合檢測(cè)禽流感病毒方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種鑒定病毒，特別是鑒定禽流感H5、H9亞型病毒的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian Influenza)是一種重要的人獸共患病，其病原為禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)，目前危害性最大的禽流感病毒主要是H5、H7和H9亞型。由于該病危害性大，發(fā)病急，因此，對(duì)該病的快速診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前RT-PCR方法是禽流感主要快速檢測(cè)方法之一(如中國(guó)專利ZL200410014289.9禽流感病毒多重PCR檢測(cè)方法)，該方法提供了一種快速、特異的檢測(cè)禽流感病毒并鑒定其亞型的方法。如何進(jìn)一步提高RT-PCR方法檢測(cè)禽流感病毒的靈敏性，提高其在實(shí)際臨床樣品中的檢出率，是該方法能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紅細(xì)胞富集與RT-PCR聯(lián)合檢測(cè)禽流感病毒方法，提高RT-PCR方法對(duì)禽流感臨床樣品的檢出率。
本發(fā)明先采用濃度為1％的紅細(xì)胞凝集、解凝集，得到富集的禽流感病毒，然后用Trizol kit提取樣本基因RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個(gè)基因，最后電泳鑒定。
本發(fā)明根據(jù)禽流感病毒能夠凝集紅細(xì)胞，并且可以在一定條件下從紅細(xì)胞上脫離下來的特點(diǎn)，建立了紅細(xì)胞富集臨床樣品中禽流感病毒的方法，該方法聯(lián)合多重RT-PCR檢測(cè)臨床樣品，提高快速檢測(cè)方法對(duì)禽流感臨床樣品檢出率，進(jìn)一步完善了RT-PCR方法在禽流感臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明較常規(guī)的禽流感病毒富集方法簡(jiǎn)單、快速，尤其是對(duì)少量禽流感病毒的富集。
本發(fā)明所述凝集、解凝集方法是將樣本與濃度為1％的紅細(xì)胞混合，在4℃環(huán)境條件下，靜置40min～50min后，于4℃、2000rpm離心5min，棄去上清，加入PBS，緩慢懸浮紅細(xì)胞，將收集的懸浮紅細(xì)胞于37℃水浴30min～40min后，2000rpm離心5min，收集上清，即為富集的禽流感病毒樣品。
具體實(shí)施例方式
步驟1雞紅細(xì)胞的制備于10mL注射器中先吸入約3mL抗凝劑(3.8％檸檬酸三鈉)，從健康雞翅靜脈或心臟采血，用生理鹽水洗滌3次，前2次1500rpm離心5min，最后1次同速度離心10min，棄上清，用無菌生理鹽水配成1％懸液，置4℃待用。
步驟2雞紅細(xì)胞富集禽流感病毒方法富集方法程序如下10mL待測(cè)樣品上清中加入1mL 1％的雞紅細(xì)胞，靜置于4℃環(huán)境溫度下40min～50min后，2000rpm、4℃離心5min，棄去上清，再加入200μL PBS，緩慢懸浮紅細(xì)胞，取出懸浮紅細(xì)胞于37℃水浴30min～40min后，2000rpm離心5min，上清即為富集的禽流感病毒樣品。
通過該方法可以將樣品富集約50倍。

步驟3PBS緩沖液的配方(1L)NaCl 8.0gKCl0.2gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O 2.9g調(diào)pH至7.2～7.4，121℃，20min高壓滅菌，冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩?br> 步驟4雞紅細(xì)胞富集禽流感病毒方法與RT-PCR方法的聯(lián)合應(yīng)用將單獨(dú)RT-PCR與RT-PCR聯(lián)合紅細(xì)胞富集方法應(yīng)用于78份臨床確診組織樣品的檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行雞胚病毒分離對(duì)照，比較其檢測(cè)結(jié)果。每一份樣品的具體操作過程如下取兩份5g臨床確診禽流感的禽類(雞、鴨、鵝、鵪鶉、鴕鳥等)組織(肝臟、脾臟)樣品，剪碎后充分研磨，一份加入適量PBS，反復(fù)凍融3次，8000rpm，4℃離心10min，收獲上清，直接應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)；另一份加入10mL PBS，按照實(shí)施例2中所述方法經(jīng)紅細(xì)胞富集后再應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)。RT-PCR方法參見專利號(hào)ZL200410014289.9發(fā)明專利禽流感病毒多重PCR檢測(cè)方法。
下表為三種檢測(cè)方法檢測(cè)臨床樣品結(jié)果比較

試驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)78份臨床確診樣品，AIV檢出率為44.9％；而應(yīng)用紅細(xì)胞富集與RT-PCR聯(lián)合檢測(cè)上述臨床樣品，AIV檢出率顯著提高，而且與雞胚分離結(jié)果的符合率為100％。紅細(xì)胞富集AIV方法顯著提高了RT-PCR對(duì)臨床樣品的檢出率。
以上實(shí)施例表明發(fā)明人成功建立了紅細(xì)胞富集AIV的方法，經(jīng)驗(yàn)證紅細(xì)胞富集方法能顯著提高RT-PCR方法對(duì)禽流感病毒H5、H9亞型臨床樣品的檢出率。
權(quán)利要求
1.紅細(xì)胞富集與RT-PCR聯(lián)合檢測(cè)禽流感病毒方法，用Trizol kit提取樣本基因RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個(gè)基因，最后電泳鑒定，其特征在于在用Trizol kit提取樣本基因RNA前，先采用濃度為1％的紅細(xì)胞凝集、解凝集，得到富集的禽流感病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述紅細(xì)胞富集與RT-PCR聯(lián)合檢測(cè)禽流感病毒方法，其特征在于所述凝集、解凝集方法是將樣本與濃度為1％的紅細(xì)胞混合，在4℃環(huán)境條件下，靜置40min～50min后，于4℃、2000rpm離心5min，棄去上清，加入PBS，緩慢懸浮紅細(xì)胞，將收集的懸浮紅細(xì)胞于37℃水浴30min～40min后，2000rpm離心5min，收集上清，即為富集的禽流感病毒樣品。
全文摘要
紅細(xì)胞富集與RT－PCR聯(lián)合檢測(cè)禽流感病毒方法，本發(fā)明公開了一種鑒定病毒，特別是鑒定禽流感H5、H9亞型病毒的檢測(cè)方法。先采用濃度為1％的紅細(xì)胞凝集、解凝集，得到富集的禽流感病毒，然后用Trizol kit提取樣本基因RNA，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行一次性PCR擴(kuò)增特定的多個(gè)基因，最后電泳鑒定。該方法聯(lián)合多重RT－PCR檢測(cè)臨床樣品，提高快速檢測(cè)方法對(duì)禽流感臨床樣品檢出率，進(jìn)一步完善了RT－PCR方法在禽流感臨床檢測(cè)中的應(yīng)用。本發(fā)明較常規(guī)的禽流感病毒富集方法簡(jiǎn)單、快速，尤其是對(duì)少量禽流感病毒的富集。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1932042SQ20061004148
公開日2007年3月21日 申請(qǐng)日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者焦新安, 曾顯營(yíng), 耿士忠, 潘志明, 黃金林, 孫林, 殷月蘭, 劉秀梵 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)