專利名稱：Sec2超抗原基因工程肽及其編碼基因和異源表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程肽的基因克隆和異源表達(dá)，具體說(shuō)是一系列具冇 SEC2超抗原活性的基因工程肽、及其編碼基因的制備和異源表達(dá)。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen， SAg)是一組由細(xì)菌或病毒編碼的蛋白質(zhì)分子， 可以極低濃度(l 10ng/mL)刺激大部分T細(xì)胞增生，具有超強(qiáng)的增強(qiáng)機(jī) 體免疫反應(yīng)功能和一定的抗腫瘤活性。因此，超抗原是一種極好的免疫調(diào) 節(jié)劑和增效劑，可望被開發(fā)成潛在的新型抗腫瘤藥物，用于腫瘤治療。
金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins， SEs)是一類 具有代表性的微生物外毒素。由于其極強(qiáng)的T細(xì)胞激活功能，成為一類典 型微生物超抗原，受到人們的廣泛重視。近年來(lái)，人們?cè)趯?duì)金黃色葡萄球 菌腸毒素(SE)結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)功能及其抗腫瘤等進(jìn)行了大量研究工作，其 中主要集中在對(duì)SEA\SEB等的研究方面。我所在世界上首次對(duì)SEC2的基 因進(jìn)行了克隆、測(cè)序并在靶向融合蛋白研究方面取得了開創(chuàng)性成果，為進(jìn) 一步開展腸毒素C2 (SEC2)分子改造及其靶向融合蛋白的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤學(xué)研究顯示利用SEC2作為腫瘤治療的超抗原藥物具有其它藥 物不可比擬的優(yōu)點(diǎn)SEC2較能抗消化并且耐熱以及只需使用很小的劑量就 可引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答和明顯的腫瘤抑制效應(yīng)。盡管如此，在臨床使用過(guò)程中 還不完全盡如人意。1)作為潛在腸胃毒素可引起伴隨著嘔吐和嚴(yán)重腹瀉等 毒副作川；2) SEC2超抗原對(duì)腫瘤細(xì)胞作用位點(diǎn)缺乏靶向性，在增強(qiáng)機(jī)體 免疫功能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，可能對(duì)人體正常細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作HJ; 劑量過(guò)大或應(yīng)用不當(dāng)亦可產(chǎn)生免疫耐受；3)作為潛在的臨床開發(fā)藥物，超 抗原SEC2分子量過(guò)大(約為27.6kD)，不易于靜脈注射和人體吸收。這些 問題限制了其在臨床上的應(yīng)用。因此，如何避免不利義素因素，充分利用 其強(qiáng)大的免疫功能，對(duì)于探索SEC2在抗腫瘤、甚至抗病毒中的作用，具有 非常重要的意義。
針對(duì)超抗原SEC2實(shí)際臨床應(yīng)用中所面臨的毒性效應(yīng)、缺乏靶向性以及 分子量偏大等問題，本發(fā)明根據(jù)金黃色葡萄球菌基因組、生物信息學(xué)等理 論，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)SEC2蛋白分子的定向改造，以獲得--系 列具有超抗原活性的基因工程多肽，這種經(jīng)遺傳改造的超抗原基因工程肽 對(duì)于擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍，改善療效、降低毒副作川具有重要的實(shí)踐意義，
;i有潛在的幵發(fā)應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及SEC2超抗原基因工程肽及其編碼基因和異源表達(dá)方法，其為一系列
具有超抗原活性的基因工程肽，利用本發(fā)明可以在人工控制的條件下，大 量獲得高純度的具有超抗原活性的基因工程肽。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
SEC2超抗原基因工程肽分別為下列任意氨基酸序列之--，
SEC2-1具有序列表SEQ ID N0: 2中氨基酸序列；
SEC2-2具有序列表SEQ ID NO: 4中氨基酸序列；
SEC2-3具有序列表SEQ ID NO: 6中氨基酸序列；
SEC2-4具有序列表SEQ ID NO: 8中氨基酸序列； -
SEC2-5具有序列表SEQ ID NO: 10中氨基酸序列；
SEC2-6具有序列表SEQ ID NO: 12中氨基酸序列；
SEC2-7具有序列表SEQ ID NO: 14中氨基酸序列；
SEC2-8具有序列表SEQ ID NO: 16中氨基酸序列；
SEC2-9具有序列表SEQ ID NO: 18中氨基酸序列；
SEC2-10具有序列表SEQ ID NO: 20中氨基酸序列；
SEC2-11具有序列表SEQ ID NO: 22中氨基酸序列；
SEC2-12具有序列表SEQ ID NO: 24中氨基酸序列；
SEC2-13具有序列表SEQ ID NO: 26中氨基酸序列；
或SEC2-14具有序列表SEQ ID NO: 28屮氨基酸序列。
所述基因工程肽的編碼基因分別對(duì)應(yīng)于下列核苷酸序列之 ，
SEC2-1對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:1 1中堿基序列；
SEC2-2對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:3 '中堿基序列；
SEC2-3對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:5中堿基序列；
SEC2-4對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:7中堿基序列；
SEC2-5對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:9中堿基序歹lj;
SEC2-6對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:11中堿基序列;
SEC2-7 X寸應(yīng)的基因具有序列表SEQID NO:13中堿基序列;
SEC2-8對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:15中堿基序歹'J;
SEC2-9對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQIDNO:17中堿基序列;
SEC2-10對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 19屮堿基序列； SEC2-11對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQ [D NO: 21中堿基序列； SEC2-12對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 23屮堿基序列； SEC2-13對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 25中堿基序列； 或SEC2-14對(duì)應(yīng)的基因具有序列表SEQ ID NO: 27中堿基序列。 SEC2超抗原基因工程肽的異源表達(dá)方法
將編碼這一系列SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列sec2-l、sec2-2、 sec2-3、 sec2-4、 sec2-5、 sec2-6、 sec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-ll、 sec2-12、 sec2-i3或sec2-14分別克隆入表達(dá)載體pET-28a，以大腸桿菌 BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建成異源表達(dá)超抗原活性基因工程肽的基因工程
菌，在培養(yǎng)基中異源表達(dá)有超抗原活性的SEC2-l、SEC2-2、SEC2-3、SEC2-4、 SEC2-5、 SEC2-6、 SEC2-7、 SEC2-8、 SEC2-9、 SEC2-10、 SEC2-11 、 SEC2-12、 SEC2-13或SEC2-14基因工程肽。
所述編碼SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列的克隆方法如下，
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-l-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3，禾tl sec2-l-R: 5， gCCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC :3' 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-l基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物sec2-2-F: 5， gAATTCgAgAgTCAA(XAgACCCTAC 3'禾卩sec2-2-R: 5， gCTL'gAgTTAgTggTTTCCTTCATg 3'通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-2基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-3-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgA 3，和sec2-3-R: 5' gCCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3，通過(guò)PCR 技術(shù)擴(kuò)增出sec2-3基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采川引物sec2-4-F: 5' GAATTCGAGAGTCAACCAGACCCTA 3,和sec2-4-R: 5， gCTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCA 3'通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-4基因片段； —
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-5-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATATg 3,和sec2-5-R: 5， CTCgAgTTATCCATTCTTTgTTgTAAggT 3， 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-5基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采川引物sec2-6-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATATg 3,和sec2-6-R: 5， CTCgAgTTATTTTgTTATTCCT(XAT 3，通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-6基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采川引物sec2-7-F: 5' gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，禾n sec2-7-R: 5, CgCTCgAgTTATCCATACATA(;AAg 3，通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-7基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采/lj引物sec2-8-F: 5' gAATTCgCAAAgAAgTACAAAgATg 3，和sec2-8-R: 5' CgCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3，通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-8基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-9-F: 5' ggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3，和sec2-9-R: 5， CgCTCgAgTTATCCATACACATCAAC 3，通 過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-9基因片段； '
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-10-F: 5， g八ATTCgAgAgTCAACCAgAC 3，和sec2-10-R: 5' CgCTCgAgTTAATCTTTgTACTTC 3，通過(guò)PCR 技術(shù)擴(kuò)增出sec2-10基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采川引物sec2-ll-F: 5， gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3，和sec2-ll-R: 5， CCCgCT(:gAgTTA(;TTTACATAgTAAT 3' 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-11基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-12-F: 5，
gAATTCAAATCAAgTgAg'n'TACTg 3'禾卩sec2-12-R: 5， CgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAAT 3',通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-12基因片段；
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采川引物sec2-13-F: 5， gAATTCggTACgATgggTAATAT 3'禾卩sec2隱13-R: 5， CCgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAA 3'通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-13基因片段 ，
或，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-14-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA3,禾卩sec2-14-R: 5， CgCTCgAgTTATMTAACTCTgTTTTCAC 3， 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-14基因片段。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明為人工構(gòu)建的一系列編碼超抗原基因工程肽的核苷酸序列，竹 次獲知其基因全序列的組成。
2. 本發(fā)明利用PCR技術(shù)，克隆一系列編碼超抗原基因工程肽的核卄酸 基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的一系列超抗原基因工程肽經(jīng)檢驗(yàn)A冇 超抗原的生物學(xué)活性；應(yīng)用本發(fā)明，可提供直接用于^產(chǎn)該一系列超抗原 基l亂T.程肽的基因工程菌株。
3. 本發(fā)明基因的異源表達(dá)提供了制備超抗原抗腫瘤生物制劑的,'新 方法，具有產(chǎn)量高，生產(chǎn)穩(wěn)定，方便純化的特點(diǎn)。


圖l為sec2-i、 sec2-2、 sec2-3、 sec2-4、 sec2-5和sec2-6基因的PCR擴(kuò) 增瓊脂糖凝膠電泳圖，其中1為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，2-7為sec2-l、 sec2隱2、 sec2-3、 sec2-4、 sec2-5和sec2-6基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;
圖2為sec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-11、 sec2-12、 sec2-13禾TI sec2-14基因的PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖，其屮l為DL2000 DNA分子 量冷示準(zhǔn);，2-9為ssec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-11、 sec2-12、 sec2-13 和sec2-14基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖3為超抗原基因工程肽SEC2-1、 SEC2-2、 SEC2-3、 SEC2-4、 SEC2-5、 SEC2-6、 SEC2-7、 SEC2-8、 SEC2-9、 SEC2-10、 SEC2-11、 SEC2-12、 SEC2-13 和SEC2-14的超抗原活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)(外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC增殖實(shí)驗(yàn)) 結(jié)果圖。橫坐標(biāo)為陰性對(duì)照牛血清白蛋白(BSA)、系列超抗原基因工程肽 和陽(yáng)性對(duì)照腸毒素C2;縱坐標(biāo)為酶標(biāo)儀在OD570nm下的讀數(shù)位。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l (1)
(A)超抗原基因工程肽SEC2-1，具有序列表SEQ ID NO: 2屮的氨 基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdllynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn cyfsskdnvgkvtggktcmyggltkhegnhfdngnlqnv-llrvyen krntlsfevqtdkksvtaqeldlk
SEQIDNO.2的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度162個(gè)氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)完整的OC螺旋和8個(gè)P折疊構(gòu)成。其屮
氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個(gè)完整的oc螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68， 81-87， 108-118分別形成四個(gè)(3折疊結(jié)構(gòu)， 129-154位氨基酸殘基形成三個(gè)p折疊。除了7-11， 13-17位兩個(gè)a螺旋及殘 基129-154形成的三個(gè)(3折疊外，其他a螺旋和(3折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成-個(gè) 獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成一個(gè)"P-桶"狀結(jié)構(gòu)，而118位和122位組氨酸殘基形 成兩個(gè)Zn原子結(jié)合位點(diǎn)。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(C)假設(shè)否
(d) 反義否 .
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcwm^eM)
編碼SEC2-1的基因sec2-l，具有序列表SEQ ID NO: 1中核苷酸序列。
ACTTACAAAATGTACTTATAAGAGTTTATGAAAAT
A AAA
SEQIDNO.l的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度486堿基對(duì)
*類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(StojoA[y/ococcMsaweMS)
(B)超抗原基因工程肽SEC2-2,具有序列表SEQ ID NO: 4巾的氨 基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvyg3nyyvn cyfsskdnvgkvtggktcmyggltkhegnh SEQ ID NO.4的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度122個(gè)氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)完整的a螺旋和5個(gè)P折疊構(gòu)成。其屮 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu) 氨基酸殘基32-39， 47-53, 62-68， 81-87, 108-118分別形成四個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。 除了7-11， 13-17位兩個(gè)a螺旋外，其他a螺旋和P折疊在三維結(jié)構(gòu)屮形成- 個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成一個(gè)"P-桶"狀結(jié)構(gòu)，而118位和122位組氨酸殘基 形成兩個(gè)Zn原子結(jié)合位點(diǎn)。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Stop/oVococcwm/wwj)
編碼SEC2-2的基因sec2-2，具有序列表SEQIDNO: 3中核苷酸序列。 GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAGTTGC ACAAATCAAGTGAGTTTACTGGTACGATGGGTAAT
AACTAAAGTTATGTCTGTAGATAAATTTTTGGCAC
ACAGGTGGTAAAACTTGTATGTATGGAGGAATAA CAAAACATGAAGGAAACCAC SEQIDN0.3的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長(zhǎng)度366堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性 (b)分子類型CDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Stop/yVococcitf awe"s)
(C)超抗原基因工程肽SEC2-3，具有序列表SEQ ID NO: 6屮的氨 基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla
hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykde.vvdvygsnyyvn
cyfsskdnvgkvtggktcmyg
SEQIDNO.6的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度113個(gè)氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)完整的a螺旋和4個(gè)p折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29， 70-78，分別形成四個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68， 81-87分別形成四個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。除了 7-11 ， 13-17位兩個(gè)a螺旋外，其他a螺旋和P折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)獨(dú)立的結(jié) 構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(沒—少/ococc附咖re"s)
編碼SEC2-3的基因sec2-3，具有序列表SEQ ID NO: 5屮核苷酸序列。
TTATGACAAAGTGAAAACAGAGTTATTAAATGAAG
TAAAACTTGTATGTATGGA SEQIDNO.5的信息(參見序列表)
A
c
G
T
G
A
G
A
G
A
c
c
c
A
T
c
c
c
A
G
A
c
c
A
A
c
T
G
A
G
A
G
T
A
A
G
G
G
T
A
G
c
A
G
G
El
c
T
G
A
G
T
G
A
A
c
T
A
A
A
c
c A A
A: G A
T A
A: A
c A
A A
c T
G c
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丁 A
T A
A T
A
El
A
G
T
G
T
c
T
G
c A
A A
A A T
G T T
A
c
G
A
c
T
A
T
G
T
A
T
A
c
A
G
T
A
G
T
A
T
A
T
T
A
A
A
A
G
T
G
A
T
T
A
c
A
A
T
A
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度339堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(C) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(5!to/ /^/ococc附m/w附)
(D) 超抗原基因工程肽SEC2-4，具有序列表SEQ ID NO: 8中的氨 基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdliynlsdkklknydkvktennedlakkykdevvdvygsnyyvn cyfsskdnvgkvtggktcmyggltk SEQIDNO.8的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度117個(gè)氨基酸
*類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)完整的a螺旋和5個(gè)P折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17, 21-29， 70-78，分別形成四個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68, 81-87， 108-117分別形成五個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。 除了7-11， 13-17位兩個(gè)a螺旋外，其他a螺旋和P折疊在三維結(jié)柚中形成一 個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源-金黃色葡萄球菌(iSto/ /zy/ococcMs
編碼SEC2-4的基因sec2-4，具有序列表SEQ ID NO: 7中核tf酸序列。 GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAGTTGC ACAAATCAAGTGAGTTTACTGGTACGATGGGTAA TATGAAATATTTATATGATGATCATTATGTATCAG CAACTAAAGTTATGTCTGTAGATAAATTTTTGGCA
AAAAAATTATGACAAAGTGAAAACAGAGTTATTA AATGAAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGATGAAG
TACAGGTGGTAAAACTTGTATGTATGGAGGAATA ACAAAA
SEQIDN0.7的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度351堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Sto;7/9;/ococc附aMWMS)
(E)超抗原基因工程肽SEC2-5，具有序列表SEQIDNO: IO中的氨 基酸系列
gtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdliynlsdkk-lknydk vktellnedlakkykdevvdvygsnyyvncyfsskdnvgkvtggkt cmyggltkhegnliifdngiilqiivllrvyenkrntlsfevqtdkksvta qeldlkarnninkknlyefnsspyetgylkflenngntfwydmmp apgdkfdqskylmmyndnktvdsksvklevhlttkng SEQIDNO.10的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度221個(gè)氨基酸 類型肽鏈
*鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)完整的a螺旋和12個(gè)P折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基3-11， 52-60, 138-154， 1卯-202分別形成四個(gè)完整的a螺旋結(jié) 構(gòu)；氨基酸殘基14-21， 29-35， 44-50， 63-69，卯畫110，111-136，162-182，及 204-207， 210-219分別形成12個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。其中138-154位形成的a螺旋 和111-136， 162-182,及204-207,210-219形成的七個(gè)P折疊，以及3-ll，52-60， 1卯-202形成的三個(gè)a螺旋和14-21， 29-35， 44-50, 63-69，卯-100所形成的 P折疊在三維結(jié)構(gòu)中分別形成兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。而100位和104位組氨酸 殘基形成兩個(gè)Zn原子結(jié)合位點(diǎn)。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Sto/7/^/ococcwawe鄉(xiāng))
編碼SEC2-5的基因sec2-5，具有序列表SEQIDNO: 9中核苷酸序列,
GTACAAAGATGAAGTAGTTGATGTGTATGGATCA
TAATGTAGGTAAAGTTACAGGTGGTAAAAC-TTGT ATGTATGGAGGAATAACAAAACATGAAGGAAACC
ATAACGGCAATACTTTTTGGTATGATATGATGCCT
AAAAGTGTGAAGATAGAAGTCCACCTTACAACAA AGAATGGA
SEQIDNO.9的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度663堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Sto/^y/ococcwsflweiw)
(F)超抗原基因工程肽SEC2-6，具有序列表SEQIDNO: 12屮的氨 基酸系列
gtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdllynlsdkklknydk vktellnedlakkykdevvdvygsnyyvncyfsskdnvgkvtggkt cmyggltk
SEQIDNO.12的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長(zhǎng)度99個(gè)氨基酸 *類型肽鏈
L
c
A
T
G
T
A
A
A
A
c
A
T
T
T
A
A
c
c
A
A
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G
A
T A
c A:
A A:
A丁
G A
G A
G A
T A:
AG
A 丁
T A
A 丁
G 丁
T J
T A
c G
A A
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G
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G
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A
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G
El
c
A
A
A
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G
T
G
A
A
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T
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T
A
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G
G
A
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G
A
A
A
A
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A
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A
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A
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c
A
A
G
A
A
c
A T
CT
A T
T
T
T
G A
A A
了 w
A A
TT
G A
T T
T A
T G
A G
A A
A c
A A
A A
A A
A G
A T
T A
A T
A A
T c
T c
*鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由2個(gè)完整的a蟝旋和5個(gè)P折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基3-11 ， 52-60，分別形成兩個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu);氨基酸殘基14-21 ， 29-35， 44-50, 63-69，卯-99分別形成五個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。所有a蟪旋和l3折疊 在三維結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，形成 -個(gè)"P-桶"狀結(jié)構(gòu)。
(b)分子類型成熟肽鏈
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Sto/ ;^/ococc附aM/"e附)
編碼SEC2-6的基因sec2-6，具有序列表SEQ ID NO: 11中核苷酸序列。 GGTACGATGGGTAATATGAAATATTTATATGATGA
ATAAATTTTTGGCACATGATTTAATTTATAACATT AGTGATAAAAAACTAAAAAATTATGACAAAGTGA
GTACAAAGATGAAGTAGTTGATGTGTATGGATCA
TAATGTAGGTAAAGTTACAGGTGGTAAAACTTGT ATGTATGGAGGAATAACAAAA SEQ ID NO. 11的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度297堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源-金黃色葡萄球菌(5!to/7/^/ococcMsa眺"s)
(G)超抗原基因工程肽SEC2-7,具有序列表SEQIDNO:'14中的氨 基酸系列
gtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdliynlsdkklk:iiydk: vktellnedlakkykdevvdvygsnyyvncyfsskdiivgkvtggkt cmy g
SEQIDNO.14的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長(zhǎng)度95個(gè)氨基酸 *類型肽鏈
*鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由2個(gè)完整的a螺旋和4個(gè)P折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基3-ll，52-60，分別形成兩個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu);氨基酸殘基14-21， 29-35， 44-50， 63-69分別形成四個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。兩個(gè)a螺旋和四個(gè)P折疊在 三維結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源s金黃色葡萄球菌(及。/ /o;/ococ面awieM5)
編碼SEC2-7的基因sec2-7，具有序列表SEQ ID NO: 13中核苷酸序列。
ATAAATTTTTGGCACATGATTTAATTTATAACATT
GTACAAAGATGAAGTAGTTGATGTGTATGGATCA
AATTACTATGTAAACTGCTATTTTTCATCCAAAGA
TAATGTAGGTAAAGTTACAGGTGGTAAAACTTGT
ATGTATGGA
SEQIDNO.13的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度285堿基對(duì)
*類型核酸 *鏈型雙鏈 *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最豐刀來(lái)源金黃色葡萄球菌(5!to/7/^/ococatf "we附)
(H)超抗原基因工程肽SEC2-8，具有序列表SEQIDNO: 16屮的氨 基酸系列
akkykdevvdvygsnyyvncyfsskdnvgkvtggktcmyggltkh egnhfdngnlqnvllrvyeiikrntlsfevqtdkksvtaqeldlk SEQIDNO.16的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長(zhǎng)度89個(gè)氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由2個(gè)(X螺旋和5個(gè)P折疊構(gòu)成。其中氨基酸
殘基1-5， 83-89分別形成兩個(gè)a螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘基8-14， 35-45， 56-64， 66-77， 79-81分別形成五個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。兩個(gè)a螺旋和五個(gè)p折疊在三維結(jié)構(gòu) 中形成一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。而45位和49位組氨酸殘基形成兩個(gè)Zn原子結(jié) 合位點(diǎn)。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(S啤/^/ococc附aw咖)
編碼SEC2-8的基因sec2-8，具有序列表SEQIDNO: 15中核苷酸序列。 GCAAAGAAGTACAAAGATGAAGTAGTTGATGTGT
TCCAAAGATAATGTAGGTAAAGTTACAGGTGGTA
AGGAAACCACTTTGATAATGGGAACTTACAAAAT
AATTTCTTTTGAAGTGCAAACTGATAAGAAAAGTG TAACAGCTCAAGAACTAGACATAAAA SEQIDNO.15的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度267堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最凈刀來(lái)源金黃色葡萄球菌(沒qp/i;;/ococcM5
(I)超抗原基因工程肽SEC2-9，具有序列表SEQ ID NO: 18中的氨 基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmlcylyddhyvsatkvinsvdkfla hdliynlsdkklktiydkvktellnedlalcky"evvdvyg
SEQ ID NO. 18的信息(參見序列表)
(a)序列特征
*長(zhǎng)度86個(gè)氨基酸
*類型肽鏈
*鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)完整的a螺旋和4個(gè)l3折疊構(gòu)成。其屮 氨基酸殘基7-11， 13-17, 21-29, 70-78，分別形成四個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53, 62-68， 81-86分別形成四個(gè)p折疊結(jié)構(gòu)。除7-U, 13-17形成的兩個(gè)a螺旋外，其他兩個(gè)a螺旋和四個(gè)p折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成 一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(55top/9;/ococciw
編碼SEC2-9的基因sec2-9，具有序列表SEQ ID NO: 17中核苷酸序列。 GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAGTTGC ACAAATCAAGTGAGTTTACTGGTACGATGGGTAA TATGAAATATTTATATGATGATCATTATGTATCAG
TAGTTGATGTGTATGGA
SEQ ID NO. 17的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度258堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Slto/7/j[y/ococcMsat/rc旭)
(J)超抗原基因工程肽SEC2-10，具有序列表SEQIDNO: 20屮的氨 基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykd SEQ ID NO.20的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長(zhǎng)度79個(gè)氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
T A
T T
A A
A G
A T
T G
A A
G T
A T
T A
G c
T A
c A
T T
G A
T T
AT
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A T
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A T
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A A
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A A
G A
A: A
c c
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A G
A A
G A
T G
G A
A A
A A
A c
c G
A A
G T
T T
A T
T A
T G
A A
A A
A G
A T
A A
A A
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)完整的ct螺旋和3個(gè)p折疊構(gòu)成。其屮 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29, 70-78，分別形成四個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68，分別形成三個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。除7-11， 13-17 形成的兩個(gè)a螺旋外，其他兩個(gè)a螺旋和四個(gè)p折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)獨(dú) 立的結(jié)構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Sto/7/^/ococc附flwe附)
列,
編碼SEC2-10的基因sec2-10，具有序列表犯QIDNO: 19中核昔酸序
ACAAATCAAGTGA(3TTTACTGGTACGATGGGTAA
TATGAAATATTTATATGATGATCATTATGTATCAG
CAACTAAAGTTATGTCTGTAGATAAATTTTTGGCA
AAAAAATTATGACAAAGTGAAAACAGAGTTATTA AATGAAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGAT SEQIDNO.19的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度237堿基對(duì) *類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(沒qp /ococcM5
(K)超抗原基因工程肽SEC2-11,具有序列表SEQ ID NO: 22中的 氨基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdliynlsdkklknydkvktellnedlakkykdevvdvygsriyyvn SEQIDNO.22的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長(zhǎng)度92個(gè)氨基酸 *類型肽鏈
鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由4個(gè)完整的cx螺旋和4個(gè)P折疊構(gòu)成。其屮 氨基酸殘基7-11, 13-17, 21-29， 70-78，分別形成四個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu)； 氨基酸殘基32-39， 47-53， 62-68， 81-86分別形成四個(gè)p折疊結(jié)構(gòu)。除7-11， 13-17形成的兩個(gè)a螺旋外，其他兩個(gè)a螺旋和四個(gè)財(cái)廠f疊在三維結(jié)構(gòu)中形成 一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
(b) 分子類型成熟肽鏈
(c) 假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(沒a/7/2;;/ococc附
編碼SEC2-11的基因sec2-11，具有序列表SEQ ID NO: 21中核苷酸序列。
GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAGTTGC ACAAATCAAGTGAGTTTACTGGTACGATGGGTAA TATGAAATATTTATATGATGATCATTATGTATCAG
AAAAAATTATGACAAAGTGAAAACAGAGTTATTA
TAGTTGATGTGTATGGATCAAATTACTATGTAAAC SEQIDNO.21的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度276堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(及邵/^/ococcwa"WMj)
(L)超抗原基因工程肽SEC2-12,具有序列表SEQ ID NO: 24屮的 氨基酸系列
ksseftgtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdliynlsdkkl knydkvktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn
SEQIDNO.24的信息(參見序列表)
(a)序列特征
*長(zhǎng)度80個(gè)氨基酸
*類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由3個(gè)完整的a螺旋和4個(gè)p折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基1-5， 9-17， 58-66，分別形成三個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘 基20-27， 35-41, 50-56， 69-74分別形成四個(gè)p折疊結(jié)構(gòu)。除1-5形成的一 個(gè)a螺旋外，其他兩個(gè)a螺旋和四個(gè)p折疊在三維結(jié)構(gòu)屮形成一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu) 域。
(b)分子類型成熟肽鏈 (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(5to/ /^/ococcw
編碼SEC2-12的基因sec2-12，具有序列表SEQlt)NO: 23屮核苷酸序列。
GAAATATTTATATGATGATCATTATGTATCAGCAA CTAAAGTTATGTCTGTAGATAAATTTTTGGdACAT
GAAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGATGAAGTAG TTGATGTGTATGGATCAAATTACTATGTAAAC SEQIDNO.23的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度240堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型CDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(&a/ /iy/ococc旭咖rg附)
(M)超抗原基因工程肽SEC2-13，具有序列表SEQ ID NO: 26屮的 氨基酸系列
gtmgnmkylyddhyvsatkvmsvdkflahdliynlsdkklknydk vktellnedlakkykdevvdvygsnyyvn
SEQIDN0.26的信息(參見序列表)
(a)序列特征
*長(zhǎng)度74個(gè)氨基酸 *類型肽鏈 *鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)山2個(gè)完整的0C螺旋和4個(gè)I3折疊構(gòu)成。其屮 氨基酸殘基3-11 ， 70-78，分別形成四個(gè)完整的ot螺旋結(jié)構(gòu);氨基酸殘基14-21 ， 29-35， 44-50， 63-68分別形成四個(gè)P折疊結(jié)構(gòu)。兩個(gè)ot螺旋和四個(gè)P折疊在 三維結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域。
(b)分子類型成熟肽鏈
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(5!f—y/ococc"sfli/鄉(xiāng)j)
編碼SEC2-13的基因sec2-13，具有序列表SEQIDNO: 25中核苷酸序列。
AATTACTATGTAAAC
SEQIDNO，25的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度222堿基對(duì)
*類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Sta/ ;^/ococc附aMWMs)
(N)超抗原基因工程肽SEC2-14，具有序列表SEQ ID NO: 28屮的 氨基酸系列
esqpdptpdelhksseftgtmgtimkylyddhyvsatkvmsvdkfla hdllynlsdkklknydkvktell
SEQIDN0.28的信息(參見序列表) (a)序列特征
*長(zhǎng)度69個(gè)氨基酸 *類型肽鏈
A G
G A
TT
A G
G T
T c
A T
T G
A T
T A
T T
T T
A G
A T
Gc
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T
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A
A
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A
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A
c
c
G
G
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A
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T
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A
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A
c
A
G
T
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A
A
A
T
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A
A
A
A
A
A
T
A
G
G
A
A A
G T
A A
A G
A G
c T
G A
A T
丁 G
T T
丁 G
A T
G A
A G
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T.G
A A
A T
AG
T A
T A
A G
T T
T A
G G
A A
G A
A A
c c
A A
A T
A G
*鏈型單鏈
*結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)由3個(gè)完整的ot螺旋和3個(gè)p折疊構(gòu)成。其中 氨基酸殘基7-11， 13-17， 21-29分別形成四個(gè)完整的a螺旋結(jié)構(gòu)；氨基酸殘 基32-39， 47-53， 62-68分別形成三個(gè)p折疊結(jié)構(gòu)。除7-11, 13-17形成的兩 個(gè)a螺旋外，其他一個(gè)a蠊旋和三個(gè)p折疊在三維結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu) 域。
(b)分子類型成熟肽鏈
(C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Stop/i;;/ococc附awe附)
編碼SEC2-14的基因sec2-14，具有序列表SEQIDNO: 27屮核苷酸序列。
GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAGT TGCACAAATCAAGTGAGTTTACTGGTACGAT GGGTAATATGAAATATTTATATGATGATCAT TATGTATCAGCAACTAAAGTTATGTCTGT人G ATAAATTTTTGGCACATGATTTAATTTATAAC ATTAGTGATAAAAAACTAAAAAATTATGACA AAGTGAAAACAGAGTTATTA SEQIDN0.27的信息(參見序列表)
(a) 序列特征
*長(zhǎng)度207堿基對(duì) *類型核酸
*鏈型雙鏈
*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性
(b) 分子類型cDNA (C)假設(shè)否
(d) 反義否
(e) 最初來(lái)源金黃色葡萄球菌(Sto/^/ococcw離e附)
(2)編碼超抗原基因工程肽的全基因sec2-l、 sec2-2、 sec20、 sec2-4、 sec2國(guó)5、 sec2-6、 sec2-7、 sec2-8、 sec2誦9、 sec2-10、 sec2-11、 sec2-12、 sec2-13 和sec2-14的PCR擴(kuò)增
1)金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取
接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37'C搖床過(guò)夜培 養(yǎng)，取1.5ml的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA (基 因組DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾， J.G塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國(guó)
紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。
2) PCR引物設(shè)計(jì)及反應(yīng)條件
分別設(shè)計(jì)合成PCR引物用來(lái)擴(kuò)增sec2-l 、sec2-2、sec2-3、sec2-4、sec2隱5、 sec2-6、 sec2-7、 sec2-8、 sec2-9、 sec2-10、 sec2-ll、 sec2-12、 sec2-13和sec2-14 的基因片斷，引物序列如上述發(fā)明內(nèi)容外所述；
PCR反應(yīng)體系為10 X Pyrobest buffer 5 u 1、 dNTP250umo1、 0.02% BSA2li 1、上下游引物各25pmol、模板金黃色葡萄球菌基因組DNA0.1 y g、 ExTaq DNA聚合酶2U,無(wú)菌超純水補(bǔ)齊體積至50 w 1。
各基因片斷的PCR反應(yīng)條件均為
第一階段95'C， 5分鐘；
第二階段94'C， 30秒;55'C, 30秒;72。C， 60秒(除secl-5片斷， secl-5片斷采用卯秒)共30個(gè)循環(huán)； 第三階段72'C， IO分鐘；
3) SEC2基因的鑒定各片斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳 分析并分離(參見附圖1、 2所示)，切下相應(yīng)大小的目的帶，按杭州維特 潔生化技術(shù)有限公司膠回收試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行膠問收；回收產(chǎn)物分別 與pGEM-T克隆載體連接，構(gòu)建成一系列超抗原基因工程肽的基因克隆載 體pGEM-T-sec2-l 、 pGEM-T國(guó)sec2曙2 、 pGEM-T-sec2-3 、 pGEM-T-sec2-4 、 pGEM-T-sec2-5 、 pGEM-T-sec2-6 、 pGEM-T-sec2-7 、 pGEM陽(yáng)T-sec2誦8 、 pGEM-T畫sec2-9 、 pGEM誦T-sec2畫10、 pGEM國(guó)T-sec2誦11 、 pGEM-T-sec2-12、 pGEM-T-sec2-13和pGEM-T-sec2-14。連接反應(yīng)按Promega公司產(chǎn)品pGEM國(guó)T 試劑盒使用說(shuō)明書。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，(轉(zhuǎn)化操作 按F.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G塞德曼，J.A.史 密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》美國(guó)紐約John Whey & Sons 出版社1995年第三版P39-40),篩選陽(yáng)性克隆并以Sanger雙脫氧末端終止 法測(cè)定DNA序列。
實(shí)施例2
超抗原基因工程肽的表達(dá)
1)超抗原基因工程肽表達(dá)載體的構(gòu)建分別將基因克隆載體 pGEM-T-sec2-l 、 pGEM-T-sec2曙2 、 pGEM國(guó)T-sec2-3 、 pGEM-T-sec2誦4 、 pGEM-T-sec2-5 、 pGEM畫T-sec2隱6 、 pGEM-T-sec2-7 、 pGEM-T-sec2-8 、 pGEM-T-sec2-9 、 pGEM曙T-sec2畫10 、 pGEM誦T-sec2-11 、 pGEM-T國(guó)sec2-12 、 pGEM-T-sec2-13和pGEM-T-sec2-14質(zhì)粒DNA以￡co/J/、 JS^o/雙酶切，膠 回收試劑盒回收相應(yīng)的超抗原基因工程肽的基因片段。以T4 DNA連接酶 分別連接入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表達(dá)載體，構(gòu)建^^表達(dá)載體pET-28a-sec2國(guó)l、 pET歸28a-sec2國(guó)2、 pET-28a-sec2-3、 pET-28a-sec2隱4、 pET-28a-sec2-5、 pET-28a-sec2-6 、 pET國(guó)28a-sec2-7 、 pET-28a曙sec2畫8 、 pET-28a-sec2-9 、 pET-28a-sec2-10、 pET-28a-sec2-11 、 pET-28a-sec2-12、 pET-28a-sec2-13和
pET-28a-sec2-14。轉(zhuǎn)化五.co/z'BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Sanger雙脫氧末端 終止法測(cè)序鑒定正確重組克隆。
2)超抗原基因工程肽的誘導(dǎo)表達(dá)和純化分別接種轉(zhuǎn)化了各表達(dá)載體 質(zhì)粒的BL21(DE3)單菌落于含40 ng/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過(guò) 夜活化培養(yǎng)，以1%接種量轉(zhuǎn)接下一級(jí)，37'C搖床培養(yǎng)至OD6o。為0.6，加 入終濃度1.0mmol/L的IPTG， 30t!誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)。
分別離心收集菌體，重懸于1/5體積的平衡緩沖液(20mM Tirs-HCl， 0. 5M NaCl, 20mM imidazole, pH7.9)，以0. 5ml/min速度上樣 于預(yù)先平衡好的Ni親和層析柱；以含50mM imidazole的平衡緩沖液洗滌 10個(gè)柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液(20mM Tirs-HCl， 0. 5M NaCl， 200mM imidazole, pH7.9)洗脫下目的產(chǎn)物既各超 抗原基因工程肽SEC2-1、 SEC2-2、 SEC2-3、 SEC2-4、 SEC2-5、 SEC2-6、 SEC2國(guó)7、 SEC2國(guó)8、 SEC2-9、 SEC2-10、 SEC2國(guó)11、 SEC2-12、 SEC2-13和 SEC2-14。
洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。
實(shí)施例3
超抗原基因工程肽的超抗原活性
取正常新鮮人外周血抗凝后，密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。 用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，以1X 105cells/well 加到96孔板中，分別將經(jīng)純化的各超抗原基因工程肽SEC2-1、 SEC2-2、 SEC2國(guó)3、 SEC2-4、 SEC2畫5、 SEC2隱6、 SEC2-7、 SEC2-8、 SEC2-9、 SEC2畫10、 SEC2-11、 SEC2-12、 SEC2-13和SEC2-14終濃度50ng/ml加入各孔，以BSA 作為陰性對(duì)照，SEC2標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性對(duì)照，每樣3個(gè)復(fù)孔。按常規(guī)條件培 養(yǎng)96h，加入50ulAvdl的MTT液。繼續(xù)培養(yǎng)4h， 1000r/min離心收集細(xì)胞， 加入DMSO120ul/we11，溶解15min后，酶標(biāo)儀上以570nm測(cè)定各孔的吸光 值(參見附圖3所示，超抗原基因工程肽刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn))。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，微量的本發(fā)明中的超抗原基因工程肽即可有效的刺激 人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生增殖。其刺激能力與SEC2標(biāo)準(zhǔn)品相比 未有較顯著降低。其中SEC2-1、 SEC2-4、 SEC2-5和SEC2-8因未破壞超抗 原.卞要功能區(qū)且分子量較SEC2有所減小，等同質(zhì)量濃度下顯示出與SEC2 標(biāo)準(zhǔn)品相當(dāng)?shù)腜BMC刺激增殖能力。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明中的-系列超 抗原基因工程肽都具有一定的超抗原生物活性，其強(qiáng)大的休外刺激PBMC 增被能力顯示出利用本發(fā)明屮的系列超抗原基因工程肽作為新型抗腫癇生 物制劑，具有巨大的開發(fā)潛力。
權(quán)利要求
1.SEC2超抗原基因工程肽，其特征在于分別為下列任意氨基酸序列之一，SEC2-1具有序列表SEQ ID NO2中氨基酸序列；SEC2-2具有序列表SEQ ID NO4中氨基酸序列；SEC2-3具有序列表SEQ ID NO6中氨基酸序列；SEC2-4具有序列表SEQ ID NO8中氨基酸序列；SEC2-5具有序列表SEQ ID NO10中氨基酸序列；SEC2-6具有序列表SEQ ID NO12中氨基酸序列；SEC2-7具有序列表SEQ ID NO14中氨基酸序列；SEC2-8具有序列表SEQ ID NO16中氨基酸序列；SEC2-9具有序列表SEQ ID NO18中氨基酸序列SEC2-10具有序列表SEQ ID NO20中氨基酸序列；SEC2-11具有序列表SEQ ID NO22中氨基酸序列；SEC2-12具有序列表SEQ ID NO24中氨基酸序列；SEC2-13具有序列表SEQ ID NO26中氨基酸序列；或SEC2-14具有序列表SEQ ID NO28中氨基酸序列。
4.按照權(quán)利要求3所述異源表達(dá)方法，其特征在于所述編碼SEC2超抗原基因工程肽的核苷酸序列的克隆方法如下，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-l-F: 5' gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3'禾H sec2國(guó)l-R: 5， gCCTCgAgTTATTTTATgTCTAgTTC 3， 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-l基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物sec2-2-F: 5， gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTAC 3，和sec2-2畫R: 5， gCTCgAgTTAgTggTTTCCTTCATg 3'通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-2基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-3-F: 5， gAATTCgAgAgTCAACCAgA 3，和sec2咖3-R: 5， gCCTCgAg菌CCATACATACAAg 3'通過(guò)PCR 技術(shù)擴(kuò)增出sec2-3基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-4-F: 5' GAATTCGAGAGTCAACCAGACCCTA 3，和sec2-4漏R: 5， gCTCg八gTTATTTTgTTATTCCTCCA 3，通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-4基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-5-F: 5， gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，和sec2-5-R: 5， CTCgAgTTATCCATTCnTgTTgTAAggT 3, 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-5基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，釆用引物sec2-6-F: 5， gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，和sec2-6國(guó)R: 5， CTCgAgTTATTTTgTTATTCCTCCAT 3'通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-6基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采.用引物sec2-7-F: 5， gAATTCggTACgATgggTAATATg 3，和sec2-7-R: 5， CgCTCgAgTTATCCATACATACAAg 3'通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-7基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-8-F: 5， gAATTCgCAAAgAAgTACAAAgATg 3，和sec2-8-R: 5， CgCTCgAgTTATTTTATgTCTA^TTC 3'通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-8基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-9-F: 5， ggAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3'禾口 sec2畫9-R: 5， CgCTCgAgTTATCCATACACATCAAC 3，通 過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-9基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采川引物sec2-10-F: 5， gMTTCgAgAgTCMCCAgAC 3，和sec2-10-R: 5， CgCTCgAgTTAA''CTTTgTACTTC 3，通過(guò)PCR 技術(shù)擴(kuò)增出sec2-10基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采川引物sec2-ll-F: 5，gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3，和sec2-ll-R: 5， CCCgCTCgAgTTAGTTTAC/VT八gTAAT 3， 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-11基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-12-F: 5' gAATTCAAATCAAgTgAgTTTACTg 3，和sec2-12國(guó)R: 5， CgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAAT 3，通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-12基因片段；以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-13-F: 5， gAATTCggTACgATgggTMTAT 3，和sec2誦13-R: 5， CCgCTCgAgTTAgTTTACATAgTAA 3，通過(guò) PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-13基因片段；或，以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用引物sec2-14-F: 5， gAATTCgAgAgTCAACCAgACCCTA 3，和sec2-14-R: 5， CgCTCgAgTTATAATAACTCTgTTTTCAC 3， 通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出sec2-14基因片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程肽的基因克隆和異源表達(dá)，具體說(shuō)是一系列具有SEC2超抗原活性的基因工程肽、及其編碼基因的制備和異源表達(dá)，SEC2-1～SEC2-14分別具有序列表SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和SEQ ID NO28中氨基酸序列。克隆的核苷酸序列可在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，其表達(dá)的分別所對(duì)應(yīng)的蛋白SEC2-1～SEC2-14經(jīng)檢驗(yàn)具有超抗原的生物學(xué)活性。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101113165SQ20061004733
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日
發(fā)明者迪 常, 張惠文, 張成剛, 徐明愷, 王小剛, 蘇振成, 艷 陳 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)科健生物技術(shù)有限公司