一種曲馬多人工抗原的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種曲馬多人工抗原的制備方法。
【背景技術(shù)】
[000引曲馬多，英文名；Tramadol(I順)，是一種非阿片類中樞性鎮(zhèn)痛藥，雖也可與阿片受 體結(jié)合，但其親和力很弱，主要用作鎮(zhèn)痛藥，可緩解普通到嚴(yán)重的疼痛。該藥是人工合成的， 作用于μ-阿片類受體W及去甲腎上腺素和血清張力素系統(tǒng)。曲馬多可用于治療中等至嚴(yán) 重的疼痛。有研究表明，曲馬多對去甲腎上腺素和血清張力素系統(tǒng)的作用W及減輕痛感的 作用，可W減輕抑郁癥和焦慮癥的痛苦。
[0003]曲馬多主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其作用廣，對急慢性疼痛有效，對人體的作用類 似嗎啡和海洛因。作為唯一一種中樞性鎮(zhèn)痛藥，由于其鎮(zhèn)痛效果強(qiáng)大而成癒性低故而在臨 床上得到廣泛使用。但隨著曲馬多的廣泛使用，曲馬多成癒的問題引起關(guān)注。據(jù)有關(guān)資料顯 示，正常人如每天服用曲馬多200毫克，大約半年后會產(chǎn)生藥物依賴，而如果每天服用300 到400毫克（6到8顆藥)甚至更多，可在短期內(nèi)上癒。長期大劑量服用可致中樞神經(jīng)興奮、 呼吸抑制，并可產(chǎn)生耐受性和成癒性及其他不良反應(yīng)。鹽酸曲馬多成癒的現(xiàn)象，在世界范圍 內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)，世界衛(wèi)生組織因此將該藥列入了世界第五大被濫用的藥品。2008年，中國將鹽 酸曲馬多作為精神藥品進(jìn)行管制。
[0004] 其結(jié)構(gòu)式為：
目前，對曲馬多的檢測主要依靠高效液相色譜法（HPLC)，氣相色譜（GC)，薄層色譜 (TLC)，質(zhì)樸（Μ巧等，但是存在儀器昂貴，檢測費(fèi)時(shí)，并且需要專業(yè)技術(shù)人員進(jìn)行操作，不能 達(dá)到現(xiàn)代檢測對快速，準(zhǔn)確的要求。而免疫分析法可W彌補(bǔ)W上所有缺點(diǎn)，免疫分析法是一 種利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)檢測各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的分析方 法，該方法的前提就是需要提供特異性的抗原和抗體。因此有必要提供一種有效的曲馬多 人工抗原的制備方法，制備的曲馬多人工抗原可用于免疫制備具有特異性的曲馬多抗體， 進(jìn)一步用于檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷與不足，提供一種曲馬多人工抗原 的制備方法，所制備的曲馬多人工抗原可進(jìn)行動(dòng)物免疫，取得相應(yīng)的曲馬多抗體，可用于各 種曲馬多類免疫分析法的研究，為曲馬多類的檢測提供更加方便快速準(zhǔn)確的途徑。
[0006] 一種曲馬多人工抗原的制備方法，其特征在于，包括W下步驟： (1)制備人工半抗原： (a)將鹽酸曲馬多溶于純化水，滴加25%氨氧化鋼，游離使之抑W10 ;加入5-漠戊酸 己醋330ul，在80~9(TC的油浴中反應(yīng)3小時(shí)。展開劑；95%己醇；氨水；二氯甲焼；1，4-二 氧六環(huán)=8: 1: 10: 1 (v/v)，Rf=0. 6-0. 7。
[0007] (b)反應(yīng)結(jié)束后，用IN鹽酸調(diào)抑=5. 5,減壓蒸干，得油狀產(chǎn)物I。
[0008] (C)產(chǎn)物I用薄層色譜分析（TLC)法分離，展開劑；95%己醇；氨水；二氯甲焼；1， 4-二氧六環(huán)=8: 1: 10:l(v/v)，Rf=0. 6-0. 7。收集所需部分硅膠，用無水己醇提取，減壓 蒸干，得無色油狀產(chǎn)物II。
[0009] (d)產(chǎn)物II按比例加入純化水后，用DAS調(diào)抑=9,減壓蒸干。按比例加入N，N-二 甲基甲醜胺，過濾，濾液蒸干，得曲馬多半抗原。反應(yīng)比例；產(chǎn)物II;純化水；N，N-二甲基甲 醜胺：=l〇〇mg; 10ml; 10ml。
[0010] (2)制備曲馬多人工抗原： (e) 將曲馬多半抗原溶于N，N-二甲基甲醜胺中，加入N-居基玻巧醜亞胺、環(huán)己基碳醜 二亞胺，反應(yīng)比例；曲馬多半抗原；N，N-二甲基甲醜胺；N-居基玻巧醜亞胺；環(huán)己基碳醜二 亞胺=20mg;lml;10mg;17mg，室溫?cái)埌璺磻?yīng)18小時(shí)W上，反應(yīng)結(jié)束后離必取上清液記為A 液； (f) 將氯化鋼與十二水磯酸氨二鋼、二水磯酸二氨鋼W摩爾比為78. 3:4. 2:1溶于雙 蒸水中，制備鋼離子濃度為0.Imol/L的PBS緩沖液，pH為7. 2^7. 4 ; (g) 將BGG蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液； 化）將A液緩慢滴加到B液，A液與B液的體積比為1:5,得到的混合液在2-8°C條件 下靜置保存過夜，得到人工抗原混合液； (i)將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，透析結(jié)束后離必取上清液即得到人工抗 原：曲馬多-牛丙種球蛋白。
[0011] 由于曲馬多的分子量較小，單獨(dú)作用時(shí)不具有免疫原性或免疫原性較弱，因此必 須將其與大分子載體比如牛丙種球蛋白連接形成曲馬多抗原后，才能刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的 曲馬多抗體。本發(fā)明在制備曲馬多人工抗原過程中，所選的位點(diǎn)和交聯(lián)方法都沒有明顯改 變其結(jié)構(gòu)，保留了抗原決定簇。在曲馬多半抗原和牛丙種球蛋白之間引入橋結(jié)構(gòu)，暴露抗原 決定簇，所獲得的曲馬多人工抗原保持了曲馬多的結(jié)構(gòu)特異性，有利于相應(yīng)曲馬多抗體的 產(chǎn)生。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)方案分為兩步，第一步為半抗原的制備及檢測：W曲馬多為原料通 過化學(xué)修飾，和5-漠戊酸己醋反應(yīng)得到含駿基的半抗原；第二步為人工抗原的制備與檢 巧h通過碳二亞胺法使之與牛丙種球蛋白度GG)結(jié)合制備曲馬多的人工抗原即曲馬多-牛 丙種球蛋白。其反應(yīng)方程式如下：
本發(fā)明制備得到的曲馬多人工抗原可通過w下方法進(jìn)行鑒定： 偶聯(lián)物蛋白濃度的測定：精確量取Proteinstandard(BGG)分別配制成濃度為0. 2， 0. 4,0. 6,，0. 8, 1. 0, 1. 2, 1. 6mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，混勻，取50ul各濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA，混勻，再加入2. 0mlreagentB,反應(yīng)10分鐘 后W分光光度計(jì)測得吸光度。空白液為reagentA250ul加reagentB2.0ml。W0D值 為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。精確量取樣品量為50ul，加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA,搖勻，再加入2. 0mlreagentB,反應(yīng)10分鐘 后W分光光度計(jì)測得吸光度。通過已得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品濃度。本發(fā)明計(jì)算得曲馬多 抗原的蛋白濃度為2. 35mg/ml。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 曲馬多人工抗原制備分為兩步，第一步為半抗原的制備及檢測：W曲馬多為原料 通過化學(xué)修飾，和了二酸酢反應(yīng)得到含駿基的半抗原；第二步為人工抗原的制備與檢測： 通過碳二亞胺法使之與牛丙種球蛋白度GG)結(jié)合制備曲馬多的人工抗原即曲馬多-牛丙種 球蛋白。
[0014] 實(shí)施例1 (1)制備人工半抗原： (a)將200mg鹽酸曲馬多溶于4ml純化水，滴加4滴25%氨氧化鋼，游離使之抑W10; 加入5-漠戊酸己醋330ul，在80~9(TC的油浴中反應(yīng)3小時(shí)。展開劑；95%己醇；氨水；二氯 甲焼；1，4-二氧六環(huán)=8: 1: 10: 1 (v/v)，Rf=0. 64。
[0015] (b)反應(yīng)結(jié)束后，用IN鹽酸調(diào)抑=5. 5,減壓蒸干，得油狀產(chǎn)物I。
[0016] (C)產(chǎn)物I用薄層色譜分析（TLC)法分離，展開劑；95%己醇；氨水；二氯甲焼；1， 4-二氧六環(huán)=8: 1: 10:l(v/v)，Rf=0.6-0.7。收集所需部分硅膠，用無水己醇提取，減壓 蒸干，得124mg無色油狀產(chǎn)物II。
[0017] (d)產(chǎn)物II加入12. 4ml純化水后，用DAS調(diào)抑=9,減壓蒸干。加入12. 4mlN，N-二 甲基甲醜胺，過濾，濾液蒸干，得曲馬多半抗原llOmg。
[0018] (2)制備曲馬多人工抗原： (e) 將曲馬多半抗原溶于5.5mlN，N-二甲基甲醜胺中，加入55mgN-居基玻巧醜亞 胺、94mg環(huán)己基碳醜二亞胺，室溫?cái)埌璺磻?yīng)20小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后離必取上清液記為A液； (f) 將氯化鋼與十二水磯酸氨二鋼、二水磯酸二氨鋼W摩爾比為78. 3:4. 2:1溶于雙 蒸水中，制備鋼離子濃度為0.Imol/L的PBS緩沖液，pH為7. 2^7. 4 ; (g) 將BGG蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液； 化）將A液緩慢滴加到B液，A液與B液的體積比為1:5,得到的混合液在2-8°C條件 下靜置保存過夜，得到人工抗原混合液； (i)將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，透析結(jié)束后離必取上清液即得到人工抗 原：曲馬多-牛丙種球蛋白。
[0019] (3)曲馬多人工抗原的鑒定： 偶聯(lián)物蛋白濃度的測定：精確量取Proteinstandard(BGG)分別配制成濃度為0. 2， 0. 4,0. 6,，0. 8, 1. 0, 1. 2, 1. 6mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度，混勻，取50ul各濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA，混勻，再加入2. 0mlreagentB,反應(yīng)10分鐘 后W分光光度計(jì)測得吸光度?？瞻滓簽閞eagentA250ul加reagentB2.0ml。W0D值 為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。精確量取樣品量為50ul，加 入到一次性比色杯中，加入250ulreagentA,搖勻，再加入2. 0mlreagentB,反應(yīng)10分鐘 后W分光光度計(jì)測得吸光度。通過已得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品濃度。本發(fā)明計(jì)算得曲馬多 抗原的蛋白濃度為2. 35mg/ml。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種曲馬多人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 制備人工半抗原： (a) 將鹽酸曲馬多溶于純化水，滴加25%氫氧化鈉，游離使之pH~10 ;加入5-溴戊酸 乙酯330ul，在8(T90°C的油浴中反應(yīng)3小時(shí)；展開劑：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4_二氧 六環(huán)=8: 1: 10: 1 (v/v)，Rf=0.6-0.7; (b) 反應(yīng)結(jié)束后，用IN鹽酸調(diào)pH=5.5,減壓蒸干，得油狀產(chǎn)物I; (c) 產(chǎn)物I用薄層色譜分析（TLC)法分離，展開劑：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4_二 氧六環(huán)=8: 1: 10: 1(>八），1^=0.6-0.7;收集所需部分硅膠，用無水乙醇提取，減壓蒸干， 得無色油狀產(chǎn)物Π; (d) 產(chǎn)物II按比例加入純化水后，用DAS調(diào)pH=9,減壓蒸干；按比例加入N,N-二甲 基甲酰胺，過濾，濾液蒸干，得曲馬多半抗原；反應(yīng)比例：產(chǎn)物II:純化水：N，N-二甲基甲酰 胺：=100mg:10ml:10ml; (2) 制備曲馬多人工抗原： (e) 將曲馬多半抗原溶于N，N-二甲基甲酰胺中，加入N-羥基琥珀酰亞胺、環(huán)己基碳酰 二亞胺，反應(yīng)比例：曲馬多半抗原：N，N-二甲基甲酰胺：N-羥基琥珀酰亞胺：環(huán)己基碳酰二 亞胺=20mg:1ml:10mg:17mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18小時(shí)以上，反應(yīng)結(jié)束后離心取上清液記為A 液； (f) 將氯化鈉與十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉以摩爾比為78. 3:4. 2:1溶于雙 蒸水中，制備鈉離子濃度為〇.lmol/L的PBS緩沖液，pH為7. 2~7. 4 ; (g) 將BGG蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液； (h) 將A液緩慢滴加到B液，A液與B液的體積比為1:5,得到的混合液在2-8°C條件 下靜置保存過夜，得到人工抗原混合液； (i) 將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，透析結(jié)束后離心取上清液即得到人工抗 原：曲馬多-牛丙種球蛋白。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種曲馬多人工抗原的制備方法，第一步為半抗原的制備及檢測：以曲馬多與5-溴戊酸乙酯為原料通過化學(xué)修飾，接臂，反應(yīng)得到含羧基的半抗原；第二步為人工抗原的制備與檢測：通過碳二亞胺法使之與牛丙種球蛋白(BGG)結(jié)合制備曲馬多的人工抗原即曲馬多-牛丙種球蛋白。所制備的曲馬多人工抗原可進(jìn)行動(dòng)物免疫，取得相應(yīng)的曲馬多抗體，可用于各種曲馬多類免疫分析法的研究，為曲馬多的檢測提供更加方便快速準(zhǔn)確的途徑。
【IPC分類】C07K1/107, C07K14/47
【公開號】CN105367645
【申請?zhí)枴緾N201410412351
【發(fā)明人】韓潔茹, 董媛媛
【申請人】艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2014年8月21日