專利名稱：利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種西瓜四倍體誘導技術，尤其是利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法。
背景技術：
西瓜是世界十大水果之一，因其多汁、風味濃而受到消費者喜愛。西瓜栽培面積大，在熱帶和亞熱帶地區(qū)都有廣泛栽培；然而西瓜種質資源的遺傳背景比較狹窄，因此采用新的技術方法獲得更多的種質資源非常必要。三倍體無籽西瓜由于其良好的果實品質更受消費者青睞，有著巨大的商業(yè)潛力。三倍體西瓜的獲得是通過常規(guī)二倍體與四倍體雜交而來，三倍體西瓜的生產(chǎn)受許多因素限制，其中一個原因就是四倍體的生產(chǎn)效率低。獲得四倍體的傳統(tǒng)方法是用誘變劑處理活體植株，活體誘導處理部位可為種子、幼苗莖尖、幼苗生長點等，誘變率一般在0.1％-3％，如秋水仙堿處理子葉期的西瓜幼苗，獲得的四倍體頻率低(1％-3％)(Nongkarn-Fongrin等，1993)，且嵌合率高(36％-75％)(McCuistion，1993)。因為傳統(tǒng)的活體誘導處理方法具有誘變率低、嵌合率高、且獲得的四倍體植株稔性低、不易獲得大量四倍體個體等缺陷；而采用離體培養(yǎng)過程中應用誘變劑的誘導技術能夠克服活體誘導技術的缺點，因此人們開始更多的使用離體培養(yǎng)的誘導技術。秋水仙堿是一種在多種植物上普遍應用的化學誘變劑(James F.Hancock，1997)，許多研究者利用它進行了離體培養(yǎng)染色體加倍研究(Giirel等，2000；Zhang等，1995；Li-Ying等，1999；Gmitter等，1991)。秋水仙堿處理會對培養(yǎng)材料產(chǎn)生毒害性，因此在秋水仙堿處理之前，將材料放在不含秋水仙堿的培養(yǎng)基上預培養(yǎng)一段時間，再轉入秋水仙堿培養(yǎng)基處理，這樣可提高材料對秋水仙堿的抗毒害性，同時提高染色體加倍率(Hansen-AL，2000)。
到目前為止，尚無利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體技術的發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種獲得四倍體頻率高的利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法。
本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的提供一種利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法，是依次包括以下步驟1)、選用4天苗齡的西瓜子葉近胚軸端作為外植體；2)、將上述外植體在增植培養(yǎng)基上預培養(yǎng)4.5～5.5天；該增植培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克6-芐基氨基瞟嶺(BA)、0.5毫克吲哚乙酸(IAA)、30克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的；3)、將上述預培養(yǎng)后的外植體浸泡在液體誘導培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器上震蕩后，于黑暗條件下處理11～13小時；該液體誘導培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和200毫克秋水仙堿的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的；4)、將上述處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉移到增植培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后獲得再生芽；5)、將上述再生芽依次進行生根培養(yǎng)、開瓶練苗和移栽溫室，從而獲得四倍體的西瓜再生植株。
作為本發(fā)明的利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法的改進所述步驟2)中預培養(yǎng)時間為5天。步驟3)是在28℃、每分鐘150轉的恒溫振蕩器上震蕩，且處理時間為12小時。
本發(fā)明的步驟1)中所使用的4天苗齡的西瓜子葉近胚軸端作為外植體，是通過如下方法獲得的將飽滿的西瓜種子浸入蒸餾水浸泡6h后，小心去殼，用濃度為10％的次氯酸鈉溶液消毒10min，期間不停振搖，無菌水反復沖洗后接種于MS發(fā)芽培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)28℃黑暗培養(yǎng)，待胚根露出2-3mm時再轉移到培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。然后選用4天苗齡子葉近胚軸端5×5mm小塊(帶1mm下胚軸)作為外植體。該MS發(fā)芽培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入20克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
本發(fā)明的步驟5)具體內(nèi)容如下將步驟4)所得的再生芽轉移到MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根15天后，開瓶練苗2天，小心洗去根部的MS生根培養(yǎng)基，然后移栽到裝有蛭石的營養(yǎng)缽中，澆灌營養(yǎng)液。用塑料薄膜將營養(yǎng)缽遮住，以減少水分蒸發(fā)，并通風透氣，4天后揭去薄膜。移入培養(yǎng)室在有散射光的室內(nèi)培養(yǎng)5天，然后移栽到溫室培養(yǎng)，就可獲得四倍體的西瓜再生植株。所用的MS生根培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入20克蔗糖、6克瓊脂和0.1毫克萘乙酸(NAA)的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
本發(fā)明中使用的所有培養(yǎng)基均用1mol/L的NAOH或HCL調(diào)節(jié)pH值至5.8，在121～126℃之間恒溫滅菌20min。MS基本培養(yǎng)基為Murashige and Skoog1962年發(fā)明的植物組織基本培養(yǎng)基。BA代表6-芐基氨基瞟嶺，NAA代表萘乙酸，IAA代表吲哚乙酸。
本發(fā)明的利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法，利用誘變劑秋水仙堿溶液處理誘導西瓜離體條件下的子葉，使染色體變異加倍；還確定了誘變劑的濃度、處理時間、處理方式及預培養(yǎng)試驗對四倍體離體誘導的影響。因此采用本發(fā)明的方法，四倍體的誘導頻率能達到57.1％；能克服傳統(tǒng)方法中誘導頻率低的缺點，為創(chuàng)制優(yōu)良西瓜種質奠定基礎。


圖1是西瓜子葉外植體(近胚軸端帶1mm的下胚軸)的示意圖；圖2是再生芽的示意圖；圖3是再生苗生根示意圖；圖4是再生苗定植示意圖；圖5是四倍體染色體鑒定圖。
具體實施例方式
實施例1、利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法，依次進行以下步驟1)、制作外植體將飽滿的西瓜種子浸入蒸餾水浸泡6h后，小心去殼，用濃度為10％的次氯酸鈉溶液消毒10min，期間不停振搖，無菌水反復沖洗后接種于MS發(fā)芽培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)28℃黑暗培養(yǎng)，待胚根露出2-3mm時再轉移到培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。然后選用4天苗齡子葉近胚軸端5×5mm小塊(帶1mm下胚軸)作為外植體，該外植體的形狀如圖1所示。所用的MS發(fā)芽培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入20克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
2)、將上述外植體在增植培養(yǎng)基上預培養(yǎng)5天；增植培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
3)、將上述預培養(yǎng)后的外植體浸泡在液體誘導培養(yǎng)基中，在28℃、每分鐘150轉的恒溫振蕩器上震蕩后，于黑暗條件下處理12小時；液體誘導培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克BA、0.5毫克IAA、30克蔗糖和200毫克秋水仙堿的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
4)、將上述處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉移到增植培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后獲得再生芽；該再生芽的形狀如圖2所示。所用的增植培養(yǎng)基同步驟2)中的增植培養(yǎng)基，培養(yǎng)室培養(yǎng)條件設定為白天溫度25-27℃，夜間溫度18-20℃，16/8h光周期，光照強度3000勒克司(lx)。
5)、將上述25天后的再生芽轉移到MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根15天后(如圖3所示)，開瓶練苗2天，小心洗去根部的MS生根培養(yǎng)基，然后移栽到裝有蛭石的營養(yǎng)缽中，澆灌營養(yǎng)液。用塑料薄膜將營養(yǎng)缽遮住，以減少水分蒸發(fā)，并通風透氣，4天后揭去薄膜。移入培養(yǎng)室在有散射光的室內(nèi)培養(yǎng)5天，然后移栽到溫室培養(yǎng)(如圖4所示)，就可獲得四倍體的西瓜再生植株。所用的MS生根培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入20克蔗糖、6克瓊脂和0.1毫克NAA的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的。
實施例2、對上述西瓜再生植株進行四倍體的鑒定早上8:00～9:00取上述西瓜再生植株的幼嫩根尖1～2cm作為材料，0.002M 8-羥基喹啉20℃處理2小時，乙醇洗滌，乙醇∶冰醋酸(體積比3∶1)固定液20℃固定12小時，用純酒精洗滌2～3次直至材料不含冰醋酸的味道，再用蒸餾水洗滌，用1mol/L鹽酸保持45℃解離30分鐘，蒸餾水洗滌，卡寶品紅染色，置于顯微鏡下觀察，各取30個染色體清晰的細胞進行染色體計數(shù)，四倍體染色體鑒定圖如圖5所示。結論為采用本發(fā)明方法可以獲得高頻率的四倍體西瓜再生植株。
所有上述實驗過程中所用到的試劑為植物組織培養(yǎng)過程中的基本試劑，均可購自Sigma和上海生工生物工程有限公司。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法，其特征是依次包括以下步驟1)、選用4天苗齡的西瓜子葉近胚軸端作為外植體；2)、將上述外植體在增植培養(yǎng)基上預培養(yǎng)4.5～5.5天；所述增植培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克6-芐基氨基瞟嶺、0.5毫克吲哚乙酸、30克蔗糖和7克瓊脂的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的；3)、將上述預培養(yǎng)后的外植體浸泡在液體誘導培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器上震蕩后，于黑暗條件下處理11～13小時；所述液體誘導培養(yǎng)基是按照每升MS基本培養(yǎng)基內(nèi)加入2毫克6-芐基氨基瞟嶺、0.5毫克吲哚乙酸、30克蔗糖和200毫克秋水仙堿的比例，并調(diào)節(jié)pH值為5.8所制成的；4)、將上述處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉移到增植培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后獲得再生芽；5)、將上述再生芽依次進行生根培養(yǎng)、開瓶練苗和移栽溫室，從而獲得四倍體的西瓜再生植株。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法，其特征是所述步驟3)是在28℃、每分鐘150轉的恒溫振蕩器上震蕩。
3.根據(jù)權利要求2所述的利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法，其特征是所述步驟2)中預培養(yǎng)時間為5天。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法，其特征是所述步驟3)中處理時間為12小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用秋水仙堿離體誘導西瓜四倍體的方法，依次包括以下步驟1)、選用4天苗齡的西瓜子葉近胚軸端作為外植體；2)、將外植體在增植培養(yǎng)基上預培養(yǎng)4.5～5.5天；3)、將預培養(yǎng)后的外植體浸泡在液體誘導培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩器上震蕩后，于黑暗條件下處理11～13小時；4)、將處理完畢的外植體用無菌水沖洗干凈后，轉移到增植培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)25天后獲得再生芽；5)、將再生芽依次進行生根培養(yǎng)、開瓶練苗和移栽溫室，從而獲得四倍體的西瓜再生植株。采用本發(fā)明的方法可以獲得高頻率的四倍體西瓜再生植株。
文檔編號C12N5/04GK1806524SQ20061004959
公開日2006年7月26日 申請日期2006年2月24日 優(yōu)先權日2006年2月24日
發(fā)明者張明方, 張全美, 楊景華, 齊曉花 申請人:浙江大學