發(fā)明背景

細(xì)胞培養(yǎng)物用于發(fā)酵過程中以產(chǎn)生多種物質(zhì)、特別是產(chǎn)生蛋白質(zhì)。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物在遺傳上未修飾并且形成自身代謝產(chǎn)物的方法和其中生物以這種方式經(jīng)遺傳修飾，從而它們產(chǎn)生較大數(shù)量的自身物質(zhì)如蛋白質(zhì)或產(chǎn)生外來(異源)物質(zhì)的方法之間進(jìn)行了區(qū)分。向產(chǎn)生多種物質(zhì)的生物供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基保障生物存活并且使得能夠產(chǎn)生所需的目標(biāo)化合物。已知使得能夠最佳培養(yǎng)特定宿主的眾多培養(yǎng)基用于這些目的。

認(rèn)為蛋白質(zhì)生物治療藥(如單克隆抗體)是充分確立的治療嚴(yán)重疾病和病癥如癌癥、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物(參見來自Leader等人的綜述(Leader等人,2008))。不得不密切監(jiān)測(cè)這些高活性化合物的關(guān)鍵分子質(zhì)量屬性以確?；颊叩陌踩院凸δ苡行?。在始自微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物合成的整個(gè)生產(chǎn)過程期間、在蛋白質(zhì)純化、配制和儲(chǔ)存期間能發(fā)生對(duì)目標(biāo)蛋白的非預(yù)期化學(xué)修飾。對(duì)蛋白質(zhì)藥物最常觀察到的化學(xué)降解途徑是天冬酰胺脫酰胺化、天冬氨酸異構(gòu)化(Wakankar和Borchardt,2006；Diepold等人,2012；Dengl等人2013)和氧化(Li等人,1995；Ji等人,2009；Hensel等人,2011)。最近，幾項(xiàng)研究報(bào)告了一種額外的相關(guān)的酶生成的副產(chǎn)物，重組合成的生物治療藥的所謂蛋白質(zhì)SV(Khetan等人,2010；Wen等人,2009；Feeney等人,2013)。SV是在遺傳預(yù)計(jì)的位置處非預(yù)期的氨基酸替換，所述氨基酸替換源自內(nèi)在的核苷酸突變(Bridges,2001)或翻譯期間替代性氨基酸錯(cuò)誤并入(Zeck等人,2012)。認(rèn)為由內(nèi)生底物限制過程中氨?；?tRNA合成酶(aaRS)對(duì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸的混亂引起了翻譯的錯(cuò)誤并入(Feeney等人,2013；Jakubowski,2001)。Gurer-Urhan等人(2006)報(bào)道了游離間-酪氨酸錯(cuò)誤并入細(xì)胞蛋白作為氧化型氨基酸的潛在細(xì)胞毒機(jī)制。

發(fā)明概述

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用間-酪氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基為產(chǎn)生(非內(nèi)源)多肽的真核(宿主)細(xì)胞提供增加的比生產(chǎn)率(qP)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)向真核細(xì)胞培養(yǎng)物添加間-酪氨酸不導(dǎo)致細(xì)胞成活力或終產(chǎn)物滴度顯著降低。這種培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)以不利方式減少/受影響(由減少的活細(xì)胞密度(VCD)和總體生物量產(chǎn)生(如CTI所指示)代表)。在本發(fā)明方法中，不需要進(jìn)行溫度變換、重量摩爾滲透壓濃度變換或pH變換以增加所培養(yǎng)細(xì)胞的比生產(chǎn)率。也不需要通過添加藥物如丙戊酸或丁酸鈉調(diào)節(jié)比生產(chǎn)率。通過額外輸入非限制性濃度的苯丙氨酸控制mRNA翻譯期間在間-酪氨酸存在下替代性氨基酸錯(cuò)誤并入所致的氨基酸序列變體(SV)的出現(xiàn)。

如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是間-酪氨酸用于增加產(chǎn)生/表達(dá)/分泌(非內(nèi)源/外源)多肽的真核宿主細(xì)胞的比生產(chǎn)率的用途。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，真核宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，真核宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，CHO細(xì)胞是正在懸浮生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞/細(xì)胞系(＝CHO懸浮細(xì)胞/細(xì)胞系)。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，CHO細(xì)胞是CHO-K1細(xì)胞。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.2mM至0.7mM的(終)濃度。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.25mM至0.6mM的(終)濃度。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.3mM至0.5mM的(終)濃度。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.3mM至0.4mM的(終)濃度。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)方法相比，比生產(chǎn)率增加了至少5％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少10％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少20％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少25％。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行使用。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在化學(xué)定義的培養(yǎng)基中進(jìn)行使用。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在無蛋白質(zhì)的化學(xué)定義的培養(yǎng)基中進(jìn)行使用。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在以非限制性濃度額外包含苯丙氨酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行使用。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在以非限制性濃度額外包含苯丙氨酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行使用，其中通過連續(xù)輸入或通過發(fā)酵過程開始時(shí)或期間一次或多次獨(dú)立推注(bolus shots)Phe母液，添加苯丙氨酸。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于95.0％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于95.0％。這意味著5％或更少的間-酪氨酸殘基相對(duì)于正確并入的苯丙氨酸殘基錯(cuò)誤并入蛋白質(zhì)序列中。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.25。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.0％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.25并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.0％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.125。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.5％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.125并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.5％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.025。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.9％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.025并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.9％。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在恒定溫度進(jìn)行使用。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在使用過程中以降低的溫度進(jìn)行使用。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，是在恒定的pH進(jìn)行使用。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白或其變體或其片段或其融合物。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白或其變體或其片段或其融合物。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是人源化抗體。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是人源化單克隆抗體。

如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是一種在表達(dá)編碼多肽的核酸的真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括在包含間-酪氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核宿主細(xì)胞。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.2mM至0.7mM的(終)濃度。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.25mM至0.6mM的(終)濃度。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.3mM至0.5mM的(終)濃度。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.3mM至0.4mM的(終)濃度。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少5％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少10％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少20％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少25％。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，真核宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，真核宿主細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，CHO細(xì)胞是CHO懸浮細(xì)胞/以懸浮方式生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，CHO細(xì)胞是CHO-K1細(xì)胞。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行所述方法。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在化學(xué)定義的培養(yǎng)基中進(jìn)行所述方法。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在無蛋白質(zhì)的化學(xué)定義的培養(yǎng)基中進(jìn)行所述方法。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在以非限制性濃度額外包含苯丙氨酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行所述方法。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在以非限制性濃度額外包含苯丙氨酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行所述方法，其中通過連續(xù)輸入或通過發(fā)酵過程開始時(shí)或期間一次或多次獨(dú)立推注Phe母液，添加苯丙氨酸。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于95.0％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于95.0％。這意味著5％或更少的間-酪氨酸殘基相對(duì)于正確并入的苯丙氨酸殘基錯(cuò)誤并入蛋白質(zhì)序列中。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.25。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.0％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.25并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.0％。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.125。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.5％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.125并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.5％。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.025。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.9％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.025并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.9％。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在恒定溫度進(jìn)行所述方法。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在使用過程中以降低的溫度進(jìn)行所述方法。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在恒定的pH進(jìn)行所述方法。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白或其變體或其片段或其融合物。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白或其變體或其片段或其融合物。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是人源化抗體。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是人源化單克隆抗體。

如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是以低于或等于1.25的摩爾比包含間-酪氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基。如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是以低于或等于1.25的摩爾比包含間-酪氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于95.0％。這意味著5％或更少的間-酪氨酸殘基相對(duì)于正確并入的苯丙氨酸殘基錯(cuò)誤并入蛋白質(zhì)序列中。

如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是以低于或等于0.25的摩爾比包含間-酪氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基。如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是以低于或等于0.25的摩爾比包含間-酪氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.0％。

如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是以低于或等于0.125的摩爾比包含間-酪氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基。如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是以低于或等于0.125的摩爾比包含間-酪氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.5％。

如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是以低于或等于0.025的摩爾比包含間-酪氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基。如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是以低于或等于0.025的摩爾比包含間-酪氨酸和苯丙氨酸的培養(yǎng)基并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.9％。

在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是化學(xué)定義的培養(yǎng)基。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是無蛋白質(zhì)的化學(xué)定義的培養(yǎng)基。

發(fā)明的詳細(xì)描述

認(rèn)為調(diào)節(jié)真核細(xì)胞的比生產(chǎn)率(qP)是解決產(chǎn)品質(zhì)量屬性(如蛋白質(zhì)N-糖基化微觀不均一性、電荷變體、蛋白質(zhì)聚集物和片段特征)改變的有力工具。例如，假定中等qP支持翻譯后N-糖基化，原因是目標(biāo)蛋白可以在聚糖形成區(qū)室即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體具有較長(zhǎng)停留時(shí)間(Hossler等人,2009)。

目前，生物技術(shù)實(shí)踐中通過藥物如組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑丙戊酸和丁酸鈉(Lee等人,2009；Murray-Beaulieu等人,2009)或通過化學(xué)-物理參數(shù)如溫度變換(Hendrick等人,2001)、pH變換(Yoon等人,2005)和增加重量摩爾滲透壓濃度(Han等人,2009)，實(shí)現(xiàn)對(duì)qP的調(diào)節(jié)。這些方案具有明顯缺點(diǎn)。HDAC抑制劑在一方面嚴(yán)重降低細(xì)胞成活力并誘導(dǎo)凋亡，這可能造成次生問題如目標(biāo)蛋白片段化和在蛋白質(zhì)純化期間宿主細(xì)胞蛋白和DNA清除不良。在另一方面，化學(xué)-物理參數(shù)難以在GMP設(shè)施中控制并且經(jīng)常因容器限制和不同傳質(zhì)(mass transfer)而在不同生物反應(yīng)器的變換動(dòng)力學(xué)方面變動(dòng)。本文中報(bào)道了向生物技術(shù)工藝特別補(bǔ)充間-酪氨酸是一個(gè)在不影響細(xì)胞成活力和不需要化學(xué)物理調(diào)節(jié)情況下增加真核細(xì)胞qP、尤其CHO細(xì)胞qP的有前景的現(xiàn)有工藝替代項(xiàng)。

但是，Gurer-Orhan等人,(2006)已經(jīng)報(bào)道，某些水平的間-酪氨酸濃度在貼壁生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)。

如本文中報(bào)道的本發(fā)明至少部分地基于以下觀察結(jié)果：用間-酪氨酸補(bǔ)充培養(yǎng)基導(dǎo)致產(chǎn)生外源多肽的真核懸浮細(xì)胞、尤其CHO懸浮細(xì)胞的比生產(chǎn)率(qP)增加。

與Gurer-Orhan等人的觀察結(jié)果相反，添加間-酪氨酸不導(dǎo)致細(xì)胞毒效應(yīng)(即細(xì)胞成活力和終產(chǎn)物滴度未受顯著影響，不過細(xì)胞生長(zhǎng)以不利方式受到影響，如可以依據(jù)降低的活細(xì)胞密度(VCD)和總生物量產(chǎn)生(如CTI所指示)見到(參見圖1至圖5)。

因此，如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是間-酪氨酸增加產(chǎn)生多肽的真核宿主細(xì)胞的比生產(chǎn)率的用途。

如本文中報(bào)道的一個(gè)方面是一種在表達(dá)編碼多肽的核酸的真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多肽的方法，所述方法包括在包含間-酪氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)真核宿主細(xì)胞。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，真核宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自以下哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括CHO細(xì)胞(例如CHO-K1或CHO DG44)、BHK細(xì)胞、NS0細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK 293細(xì)胞、HEK 293EBNA細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞和COS細(xì)胞。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，CHO細(xì)胞是CHO懸浮細(xì)胞。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，CHO細(xì)胞是CHO-K1細(xì)胞。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以在添加至培養(yǎng)基的間-酪氨酸的某個(gè)濃度范圍實(shí)現(xiàn)比生產(chǎn)率的增加。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.2mM至0.7mM的濃度。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.25mM至0.6mM的濃度。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.3mM至0.5mM的濃度。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，添加間-酪氨酸以產(chǎn)生0.3mM至0.4mM的濃度。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少5％。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少10％。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少20％。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，與不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程相比，比生產(chǎn)率增加了至少25％。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)為了實(shí)現(xiàn)增加的比生產(chǎn)率，不需要進(jìn)行溫度變換、重量摩爾滲透壓濃度變換或pH變換，并且也不需要添加藥物如丙戊酸或丁酸鈉調(diào)節(jié)比生產(chǎn)率，如本領(lǐng)域中報(bào)道。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，也可以額外地在如本文報(bào)道的方法中進(jìn)行/包括對(duì)培養(yǎng)過程的這些調(diào)整。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在恒定溫度進(jìn)行所述使用或方法。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在使用過程中以降低的溫度進(jìn)行所述使用或方法。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在恒定的pH進(jìn)行所述使用或方法。

通過額外輸入非限制性濃度的苯丙氨酸控制因翻譯期間添加間-酪氨酸至培養(yǎng)基時(shí)可能出現(xiàn)的替代性氨基酸錯(cuò)誤并入所致的可能氨基酸序列變體(SV)。

在表1中，顯示示蹤肽的Phe→xTyr(x意指間-Tyr和/或鄰-Tyr)序列變體形成數(shù)量/頻率/分?jǐn)?shù)(在第14天補(bǔ)充0.1mM、0.3mM和0.4mM鄰-Tyr和間-Tyr時(shí)Phe→xTyr錯(cuò)誤并入的最大水平)。

從補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)的上清液間-Tyr、鄰-Tyr和L-Phe以及相應(yīng)Phe→xTyr錯(cuò)誤并入的數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出間-Tyr/Phe和鄰-Tyr/Phe的閾值比率，所述比率導(dǎo)致99.9％、99.5％、99.0％和95.0％的所產(chǎn)生序列最終精確度(指鄰-Tyr和間-Tyr錯(cuò)誤并入)。

表1

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)的間Tyr/Phe最大閾值比率1.25、0.25、0.125或0.025可以在產(chǎn)生的多肽中控制/避免不想要的SV(分別具有95.0％、99.0％、99.5％或99.9％序列精確度)，同時(shí)比生產(chǎn)率增加。無論是否進(jìn)行額外的Phe補(bǔ)充，比生產(chǎn)率仍增加(參見圖8)。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基以非限制性濃度額外包含苯丙氨酸。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于95.0％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于95.0％。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.25。在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.0％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.0％。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.125。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.5％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.5％。

在全部方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于0.025。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.9％。在這個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，間-酪氨酸/苯丙氨酸的摩爾比低于或等于1.25并且相對(duì)于Phe→m-Tyr錯(cuò)誤并入的蛋白質(zhì)序列最終精確度高于或等于99.9％。

定義

如本文所用的“生物量”指培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的量或重量?？梢酝ㄟ^確定活細(xì)胞密度、總細(xì)胞密度、(相對(duì)于活細(xì)胞密度和總細(xì)胞密度的)細(xì)胞時(shí)間積分、(相對(duì)于活細(xì)胞密度和總細(xì)胞密度的)細(xì)胞體積時(shí)間積分、細(xì)胞壓積、干重或濕重直接或間接地測(cè)量生物量。

如本文所用的“生物反應(yīng)器”指用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)的任何容器。一般地，生物反應(yīng)器將至少是1升并且可以是10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10000、12000升或更大或它們之間的任何體積。生物反應(yīng)器的內(nèi)部條件包括但不限于pH、溶解氧和溫度，一般在培養(yǎng)時(shí)間期間控制。生物反應(yīng)器可以包括適于容納在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下懸浮于培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物任何材料，所述材料包括玻璃、塑料或金屬。

如本文所用的“細(xì)胞密度”指在給定培養(yǎng)基體積中存在的細(xì)胞數(shù)目。

“細(xì)胞成活力”指相對(duì)于特定時(shí)間處培養(yǎng)物中活和死細(xì)胞總數(shù)而言在該時(shí)間活著的細(xì)胞的部分。

術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)物”指在轉(zhuǎn)瓶、燒瓶、玻璃或不銹鋼培養(yǎng)容器等中以懸浮或貼壁方式生長(zhǎng)的細(xì)胞。術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)物”還涵蓋大規(guī)模方案，如生物反應(yīng)器。本發(fā)明涵蓋用于大規(guī)模和小規(guī)模產(chǎn)生多肽的細(xì)胞培養(yǎng)方法。可以使用和備選地以分批、分瓶分批(split-batch)、補(bǔ)料分批或灌流模式運(yùn)行多種方法，所述方法包括但不限于流化床生物反應(yīng)器、搖瓶培養(yǎng)或攪拌罐生物反應(yīng)器系統(tǒng)。

如本發(fā)明內(nèi)部可互換使用的術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)用培養(yǎng)基”或“培養(yǎng)基”指用于生長(zhǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)液。這種營(yíng)養(yǎng)液通常包括對(duì)于生長(zhǎng)和維持細(xì)胞環(huán)境必需的多種因子。例如，常見的營(yíng)養(yǎng)液可以包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基制劑、取決于培養(yǎng)類型和偶而取決于選擇劑的多種補(bǔ)充物。一般地，這類溶液提供細(xì)胞最低生長(zhǎng)和/或存活所需要的必需氨基酸和非必需氨基酸、維生素、能量源、脂質(zhì)和痕量元素。這種溶液還可以含有增強(qiáng)生長(zhǎng)和/或存活高于最低速率的補(bǔ)充性組分，包括但不限于激素和/或其他生長(zhǎng)因子、特定離子如鈉、氯、鈣、鎂和磷酸鹽、緩沖組分、維生素、核苷或核苷酸、痕量元素、氨基酸、脂質(zhì)和/或葡萄糖或其他能量源。培養(yǎng)基有利地配制為對(duì)細(xì)胞存活和增殖最佳的pH和鹽濃度。培養(yǎng)基可以是無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，即這種培養(yǎng)基將不含全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，而將含有未限定的肽，例如來自植物水解物的肽。培養(yǎng)基可以包含人血清白蛋白和人轉(zhuǎn)鐵蛋白，但潛在地包含動(dòng)物衍生的胰島素和脂質(zhì)，或含有人血清白蛋白、人轉(zhuǎn)鐵蛋白、人胰島素和化學(xué)限定脂質(zhì)的無外來物培養(yǎng)基(xeno-free medium)。備選地，培養(yǎng)基可以是化學(xué)成分確知的培養(yǎng)基，即其中全部物質(zhì)均確定并且以確定濃度存在的培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基可以僅含有重組蛋白和/或激素或無蛋白質(zhì)的化學(xué)成分確知培養(yǎng)基，即如果需要，僅含有低分子量組分和合成肽/激素?；瘜W(xué)成分確知的培養(yǎng)基還可能完全不含任何蛋白質(zhì)。

術(shù)語“細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”指可以向其中引入/轉(zhuǎn)染核酸(例如編碼異源多肽的核酸)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括用于增殖載體/質(zhì)粒的原核細(xì)胞和用于表達(dá)核酸的真核細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞選自以下哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括CHO細(xì)胞(例如CHO-K1或CHO DG44)、BHK細(xì)胞、NS0細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、HEK 293細(xì)胞、HEK 293EBNA細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞和COS細(xì)胞。為了宿主細(xì)胞發(fā)酵并且因此為了表達(dá)目的多肽，使用培養(yǎng)基。通常，CHO細(xì)胞廣泛用于以小規(guī)模在實(shí)驗(yàn)室中或以大規(guī)模在生產(chǎn)過程中表達(dá)藥物多肽。歸因于其廣泛分布和使用，CHO細(xì)胞的特征性屬性和遺傳背景是熟知的。因此，CHO細(xì)胞由監(jiān)管當(dāng)局批準(zhǔn)用來生產(chǎn)用于人類的治療性蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO懸浮細(xì)胞系/以懸浮方式生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞系。

本發(fā)明的方法適用于以大規(guī)模即產(chǎn)業(yè)方式生產(chǎn)分泌型異源多肽。

用來以大規(guī)模生產(chǎn)所需多肽的細(xì)胞的培養(yǎng)通常由一系列獨(dú)立培養(yǎng)組成，其中除最終培養(yǎng)(即大規(guī)模培養(yǎng)，即這個(gè)系列中的最后一個(gè)培養(yǎng))之外的全部培養(yǎng)均進(jìn)行直至培養(yǎng)容器中達(dá)到某個(gè)細(xì)胞密度。如果預(yù)定的細(xì)胞密度達(dá)到，則整個(gè)培養(yǎng)物或其級(jí)分用來接種下一個(gè)培養(yǎng)容器，所述培養(yǎng)物具有更大的體積，其體積至多100倍于先前的培養(yǎng)物。以更大體積充當(dāng)至少一個(gè)進(jìn)一步培養(yǎng)之基礎(chǔ)的全部培養(yǎng)稱作“種子發(fā)酵”或“種子培養(yǎng)”。僅在大規(guī)模培養(yǎng)中，即在不意在以更大體積充當(dāng)進(jìn)一步培養(yǎng)之基礎(chǔ)的培養(yǎng)(又稱作“主要發(fā)酵”)中才有根據(jù)培養(yǎng)基或培養(yǎng)時(shí)間中產(chǎn)生的分泌型異源免疫球蛋白的濃度所確定的培養(yǎng)終點(diǎn)。如本申請(qǐng)中使用的術(shù)語“大規(guī)?！敝腹I(yè)生產(chǎn)過程的最終培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，大規(guī)模培養(yǎng)以至少100升體積、在另一個(gè)實(shí)施方案中以至少500升、在又一個(gè)實(shí)施方案中以至少1000升體積直至25,000升體積進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，最終(即大規(guī)模)培養(yǎng)基不含真核選擇劑。

如本文所用的“分瓶(splitting)”又稱作細(xì)胞的傳代或繼代培養(yǎng)。這包括將小數(shù)目的細(xì)胞轉(zhuǎn)移入新鮮的培養(yǎng)基，從而分瓶的細(xì)胞接種所述新的培養(yǎng)物。在懸浮培養(yǎng)物中，含有一些細(xì)胞的少量培養(yǎng)物稀釋于更大體積的新鮮培養(yǎng)基中。

如本文所用的“滴度”指由給定量的培養(yǎng)基體積中哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組表達(dá)的多肽總量。滴度一般以如下單位表述：毫克多肽/毫升培養(yǎng)基。

“基因”指作為例如染色體上或質(zhì)粒上可以實(shí)現(xiàn)肽、多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)的區(qū)段的核酸。在編碼區(qū)(即結(jié)構(gòu)基因)旁邊，基因包含其他功能性元件，例如信號(hào)序列、啟動(dòng)子、內(nèi)含子和/或終止子。

“結(jié)構(gòu)基因”指無信號(hào)序列的基因區(qū)域，即編碼區(qū)。

如本文所用，術(shù)語“表達(dá)”指細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。宿主細(xì)胞中目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄水平可以基于細(xì)胞中存在的相應(yīng)mRNA的量確定。例如，從選定核酸轉(zhuǎn)錄的mRNA可以通過PCR或通過RNA印跡雜交定量(參見Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。由選定核酸編碼的蛋白質(zhì)可以通過多種方法定量，例如通過ELISA、通過測(cè)定該蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性或通過使用識(shí)別并結(jié)合于該蛋白質(zhì)的抗體，采用與這類活性無關(guān)的測(cè)定法(如蛋白質(zhì)印跡法或放射免疫測(cè)定法)定量(參見Sambrook等人，1989，上文)。

術(shù)語“多肽”是由肽鍵接合的氨基酸殘基組成的聚合物，無論是否為天然或合成地產(chǎn)生。少于約20個(gè)氨基酸殘基的多肽可以作“肽”。包含兩條或更多條氨基酸鏈或包含長(zhǎng)度為100個(gè)氨基酸或更大的氨基酸鏈的多肽可以稱作“蛋白質(zhì)”。多肽或蛋白質(zhì)還可以包含非肽組分，如糖基團(tuán)或金屬離子。糖和其他非肽取代基可以由產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞添加至該蛋白質(zhì)，并且可以隨細(xì)胞的類型變動(dòng)。蛋白質(zhì)和多肽在本文中根據(jù)它們的氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)定義；附加物如糖基團(tuán)通常不指明，然而可以存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白重鏈或免疫球蛋白輕鏈或片段、其融合物或綴合物?！巴庠础被颉胺莾?nèi)源”多肽是不源自所用宿主細(xì)胞內(nèi)部的多肽。

如本文所用的術(shù)語“核酸”是由獨(dú)立核苷酸組成的聚合物，即多核苷酸。它指天然存在的核酸或部分或完全非天然存在的核酸，所述核酸例如編碼可以重組產(chǎn)生的多肽。核酸可以由分離的或通過化學(xué)手段合成的DNA片段構(gòu)成。核酸可以整合至另一個(gè)核酸中，例如整合在宿主細(xì)胞的表達(dá)質(zhì)?；蚧蚪M/染色體中。質(zhì)粒包括穿梭載體和表達(dá)載體。一般地，質(zhì)粒也將包含原核增殖單元，其包含分別用于細(xì)菌中復(fù)制和選擇載體的復(fù)制起點(diǎn)(例如ColE1復(fù)制起點(diǎn))和選擇標(biāo)記(例如氨芐青霉素或四環(huán)素抗性基因)。

術(shù)語“免疫球蛋白”指包含至少兩個(gè)所謂輕鏈多肽(輕鏈)和兩個(gè)所謂重鏈多肽(重鏈)的分子。每個(gè)重鏈多肽和輕鏈多肽包含可變結(jié)構(gòu)域(可變區(qū))(通常是多肽鏈的氨基端部分)，所述可變結(jié)構(gòu)域包含能夠與抗原相互作用的結(jié)合區(qū)。每個(gè)重鏈多肽和輕鏈多肽還包含恒定區(qū)(通常是羧基端部分)。重鏈的恒定區(qū)介導(dǎo)免疫球蛋白i)與攜帶Fcγ受體(FcγR)的細(xì)胞(如吞噬細(xì)胞)或ii)與攜帶新生兒Fc受體(FcRn)(也稱作Brambell受體)的細(xì)胞結(jié)合。它還介導(dǎo)與某些因子的結(jié)合，包括經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的因子如組分C1q。

術(shù)語“免疫球蛋白”在本文中以最廣意義使用并且涵蓋多種免疫球蛋白結(jié)構(gòu)物，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和免疫球蛋白片段，只要它們顯示出所需的抗原結(jié)合活性即可。

取決于重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，將免疫球蛋白劃分為不同類別：IgA類、IgD類、IgE類、IgG類和IgM類。這些類別中的某些類別進(jìn)一步劃分成亞類(同種型)，即IgG的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或IgA的IgA1和IgA2。根據(jù)免疫球蛋白所屬的類別，重鏈恒定區(qū)分別稱作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白是IgG類免疫球蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白具有人恒定區(qū)或衍生自人源的恒定區(qū)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白屬于IgG4亞類或IgG1、IgG2或IgG3亞類，所述抗體以這樣的方式受到修飾，從而不能檢測(cè)到Fcγ受體(例如FcγRIIIa)結(jié)合作用和/或C1q結(jié)合作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白是人IgG4亞類或突變的人IgG1亞類。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白是具有突變L234A和L235A的人IgG1亞類。在另一個(gè)實(shí)施方案中，就Fcγ受體結(jié)合作用而言，免疫球蛋白是IgG4亞類或IgG1或IgG2亞類，在L234、L235、和/或D265中具有突變，和/或含有PVA236突變。在又一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白具有選自S228P、L234A、L235A、L235E、SPLE(S228P和L235E)和/或PVA236的突變(PVA236意指從IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(按單字母氨基酸代碼給出)或IgG4的EFLG由PVA替換)。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白是IgG4亞類并且具有IgG4的突變S228P，或免疫球蛋白是IgG1亞類并且具有突變L234A和L235A。

免疫球蛋白的輕鏈或重鏈的可變結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)而包含不同區(qū)段，即4個(gè)構(gòu)架區(qū)(FR)和3個(gè)高變區(qū)(CDR)。

“免疫球蛋白片段”指包含結(jié)構(gòu)域群組的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的多肽，所述結(jié)構(gòu)域群組包括免疫球蛋白重鏈的可變結(jié)構(gòu)域、C_H1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、C_H2結(jié)構(gòu)域、C_H3結(jié)構(gòu)域、C_H4結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域或C_L結(jié)構(gòu)域。還包括其衍生物及變體。額外地，可以存在可變結(jié)構(gòu)域，其中缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸或氨基酸區(qū)域。

“免疫球蛋白綴合物”指借助肽鍵與其他多肽綴合的包含免疫球蛋白重鏈或輕鏈至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的多肽。其他多肽是非免疫球蛋白肽，如激素、生長(zhǎng)受體、抗融合肽(antifusogenic peptide)等。

如本文所用，“Phe非限制性”或“Phe非限制”濃度意指苯丙氨酸以過多的量輸入，即始于第6日直至第14日每天用例如0.6mM Phe補(bǔ)充培養(yǎng)物。在不額外輸入的情況下，截至第10或第11日，Phe通常將是限制性的(“Phe限制”)?？梢酝ㄟ^連續(xù)輸入或備選地通過發(fā)酵過程開始時(shí)或期間一次或多次獨(dú)立推注Phe母液，添加苯丙氨酸補(bǔ)充物。

術(shù)語“增加的比生產(chǎn)率(specific productivity)”意指在本文所述的條件下，相應(yīng)宿主細(xì)胞的比生產(chǎn)率相對(duì)于不補(bǔ)充間-酪氨酸的相同生產(chǎn)過程更高。作為細(xì)胞每日生產(chǎn)能力(產(chǎn)生的多肽/蛋白質(zhì)的量，例如以皮克計(jì))的測(cè)量，比生產(chǎn)率(qP)如實(shí)施例中所反映的那樣計(jì)算。

附圖簡(jiǎn)述

圖1間-Tyr調(diào)節(jié)Phe限制條件下的CHO生物量生成。(A)補(bǔ)料分批法，使用兩種系列連續(xù)進(jìn)料：進(jìn)料1和進(jìn)料2。在過程開始時(shí)，對(duì)CHO補(bǔ)料分批培養(yǎng)不補(bǔ)充(對(duì)照)、補(bǔ)充0.1mM、0.3mM或0.4mM對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr。作為CHO細(xì)胞生物量生成的測(cè)量，顯示了對(duì)-Tyr(B)、鄰-Tyr(C)和間-Tyr(D)補(bǔ)充的細(xì)胞時(shí)間積分(CTI)。

圖2在Phe限制條件下間-Tyr和鄰-Tyr在CHO細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)中的不同作用。顯示對(duì)-Tyr(A)、鄰-Tyr(B)和間-Tyr(C)補(bǔ)充的活細(xì)胞密度。顯示不補(bǔ)充對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr的補(bǔ)料分批培養(yǎng)作為對(duì)照。

圖3在CHO補(bǔ)料分批培養(yǎng)中補(bǔ)充間-Tyr和鄰-Tyr不改變Phe限制條件下的產(chǎn)物產(chǎn)率。顯示對(duì)-Tyr(A)、鄰-Tyr(B)和間-Tyr(C)補(bǔ)充的產(chǎn)物濃度。顯示不補(bǔ)充對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr的補(bǔ)料分批培養(yǎng)作為對(duì)照。

圖4在Phe限制條件下間-Tyr補(bǔ)充增加細(xì)胞特異性產(chǎn)物形成率qP。顯示對(duì)-Tyr(A)、鄰-Tyr(B)和間-Tyr(C)補(bǔ)充的細(xì)胞特異性產(chǎn)物形成率qP。顯示不補(bǔ)充對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr的補(bǔ)料分批培養(yǎng)作為對(duì)照。

圖5間-Tyr和鄰-Tyr對(duì)Phe限制條件下CHO細(xì)胞成活力的不同作用。顯示對(duì)-Tyr(A、D)、鄰-Tyr(B、E)和間-Tyr(C、F)補(bǔ)充的細(xì)胞成活力和上清液LDH活性。顯示不補(bǔ)充對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr的補(bǔ)料分批培養(yǎng)作為對(duì)照。

圖6間-Tyr調(diào)節(jié)Phe非限制條件下的CHO生物量生成。(A)補(bǔ)料分批法使用兩種系列連續(xù)進(jìn)料：進(jìn)料1和高Phe濃度的進(jìn)料2。在過程開始時(shí)，對(duì)CHO補(bǔ)料分批培養(yǎng)不補(bǔ)充(對(duì)照)、補(bǔ)充0.1mM、0.3mM或0.4mM對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr。作為CHO細(xì)胞生物量生成的測(cè)量，顯示對(duì)-Tyr(B)，鄰-Tyr(C)和間-Tyr(D)補(bǔ)充的細(xì)胞時(shí)間積分(CTI)。

圖7在CHO補(bǔ)料分批培養(yǎng)中補(bǔ)充間-Tyr和鄰-Tyr不改變Phe非限制條件下的產(chǎn)物產(chǎn)率。顯示對(duì)-Tyr(A)、鄰-Tyr(B)和間-Tyr(C)補(bǔ)充的產(chǎn)物濃度。顯示不補(bǔ)充對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr的補(bǔ)料分批培養(yǎng)作為對(duì)照。

圖8在Phe非限制條件下間-Tyr補(bǔ)充增加細(xì)胞特異性產(chǎn)物形成率qP。顯示對(duì)-Tyr(A)、鄰-Tyr(B)和間-Tyr(C)的細(xì)胞特異性產(chǎn)物形成率qP。顯示不補(bǔ)充對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr的補(bǔ)料分批培養(yǎng)作為對(duì)照。

提供以下實(shí)施例和附圖以輔助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實(shí)范圍在所附權(quán)利要求書中闡述?？梢岳斫?，可以對(duì)所述方法作修改而不脫離本發(fā)明的精神。

試劑和材料

從Sigma-Aldrich(慕尼黑，德國(guó))獲得DL-鄰-酪氨酸(2-羥基-DL-苯丙氨酸)、DL-間-酪氨酸(3-羥基-DL-苯丙氨酸)、L-對(duì)-酪氨酸、L-苯丙氨酸和鹽酸胍。L-鄰-酪氨酸(2-羥基-L-苯丙氨酸)和L-間-酪氨酸(3-羥基-L-苯丙氨酸)購(gòu)自RSP Amino Acids,LLC(Shirley,MA,USA)。全部其他試劑均購(gòu)自Merck(達(dá)姆施塔特，德國(guó))和Sigma-Aldrich(慕尼黑，德國(guó))。

細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)

對(duì)于全部細(xì)胞培物實(shí)驗(yàn)，使用表達(dá)人源化單克隆抗體的重組CHO-K1細(xì)胞系，稱作克隆1。使用L-蛋氨酸亞砜亞胺(L-methionine sulfoximine)敏感性CHO-K1宿主細(xì)胞系(Lonza，Cologne，德國(guó))生成重組CHO-K1細(xì)胞系。在種子系列培養(yǎng)期間，將細(xì)胞在補(bǔ)充有50μM L-蛋氨酸亞砜亞胺(Sigma Aldrich，慕尼黑，德國(guó))的無蛋白質(zhì)、化學(xué)成分確知的CD-CHO培養(yǎng)基(Life Technologies，達(dá)姆施塔特，德國(guó))中培育。使用增濕培養(yǎng)箱，7％CO₂和37℃環(huán)境在搖瓶中進(jìn)行種子系列培養(yǎng)。每3天至4天將細(xì)胞分瓶以繼代培養(yǎng)和擴(kuò)充培養(yǎng)物。對(duì)于全部實(shí)驗(yàn)，使用直至實(shí)驗(yàn)開始時(shí)培養(yǎng)物中年齡相同(大約21代)的細(xì)胞。

間-Tyr和鄰-Tyr補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)

全部補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)均使用搖瓶培養(yǎng)系統(tǒng)、無選擇壓力L-蛋氨酸亞砜亞胺的化學(xué)成分確知CD-CHO培養(yǎng)基和兩個(gè)適宜的系列連續(xù)施加的進(jìn)料(進(jìn)料1和進(jìn)料2)進(jìn)行。將產(chǎn)生人源化單克隆抗體的重組CHO-K1細(xì)胞用3×10⁵個(gè)活細(xì)胞/mL接種并且培養(yǎng)14天。接種前，用0.1mM、0.3mM或0.4mM鄰-Tyr、間-Tyr或?qū)?Tyr無菌補(bǔ)充CD-CHO基礎(chǔ)培養(yǎng)基。使用未補(bǔ)充鄰-Tyr、間-Tyr或?qū)?Tyr的對(duì)照培養(yǎng)作為參照。通過增加進(jìn)料2中的Phe濃度，實(shí)現(xiàn)苯丙氨酸(Phe)非限制條件。

活細(xì)胞密度、成活力和細(xì)胞時(shí)間積分(Cell Time Integral)

為了分析活細(xì)胞密度和總細(xì)胞密度，使用自動(dòng)化Cedex HiRes系統(tǒng)(Roche Diagnostics，曼海姆，德國(guó))。使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法并且根據(jù)制造商的說明書分析每份樣品和每天超過10張照片，評(píng)價(jià)活細(xì)胞密度和總細(xì)胞密度的區(qū)別?；罴?xì)胞密度(VCD)和細(xì)胞成活力分別如等式1(Equ1)和等式2(Equ2)中所述那樣計(jì)算。

(Equ1) 活細(xì)胞密度＝N_{臺(tái)盼藍(lán)陰性}×(10⁵個(gè)活細(xì)胞/ml)

(Equ2) 細(xì)胞成活力＝N_{臺(tái)盼藍(lán)陰性}/(N_{臺(tái)盼藍(lán)陰性}+N_{臺(tái)盼藍(lán)陽性}細(xì)胞)×100％

作為過程中生成的總生物量的指標(biāo)，如下計(jì)算累積性細(xì)胞時(shí)間積分(CTI)(Equ3)。

(Equ3) 細(xì)胞時(shí)間積分＝Σ(0.5×(VCD_n-1+VCD_n)×(t_n–t_n-1))×(10⁵個(gè)活細(xì)胞×d/ml)

使用Cobas Integra 400plus系統(tǒng)(Roche Diagnostics，曼海姆，德國(guó))，分析無細(xì)胞上清液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。

IgG滴度定量和qP的計(jì)算

通過Cobas Integra 400plus系統(tǒng)(Roche，曼海姆，德國(guó))根據(jù)制造商的方案或通過如先前所描述的PorosA HPLC法(Zeck等人,2012)，定量產(chǎn)物滴度。根據(jù)等式4計(jì)算總比生產(chǎn)率qP以分析細(xì)胞生產(chǎn)能力。

(Equ 4)qP＝(滴度_n-滴度_n-1)/(CTI_n–CTI_n-1)×(pg/(活細(xì)胞×d))

確定肽序列變體和用合成肽鑒定間-Tyr和鄰-Tyr序列變體

如先前所述那樣進(jìn)行肽序列變體的定量(Zeck等人,2012)。簡(jiǎn)而言之，通過添加變性緩沖液(0.4M Tris，8M鹽酸胍，pH 8)至終體積240μL，使抗體樣品(250μg)變性。通過添加在變性緩沖液中新制備的20μL 0.24M DTT并在37℃溫育60分鐘，實(shí)現(xiàn)還原。隨后，通過添加水中的20μL 0.6M碘乙酸在室溫在暗處，使樣品烷基化15分鐘。通過添加30μL DTT溶液，失活過量的烷基化試劑。隨后使用NAP 5 Sephadex G-25 DNA級(jí)柱(GE Healthcare，慕尼黑，德國(guó))，將樣品的緩沖液交換成大約480μL 50mM Tris/HCl，pH 7.5。用胰蛋白酶在37℃進(jìn)行5小時(shí)(比率1:37)消化。將獲得的肽混合物進(jìn)樣和在不預(yù)處理的情況下使用反相HPLC分離(Agilent 1100 Cap LC,Agilent Technologies,德國(guó))。來自Varian(達(dá)姆施塔特，德國(guó))的Polaris 3 C18-醚柱(1x 250mm；3μm粒徑，孔徑)用于分離。溶劑是水中(A)和乙腈中(B)的0.1％甲酸(SigmaAldrich，慕尼黑，德國(guó))。在37℃在80分鐘期間運(yùn)行2％B至38％B的線性梯度。將HPLC洗脫物使用Triversa NanoMate(Advion，Ithaca，NY)和380nL/分鐘分割，輸入以正離子模式運(yùn)行的LTQ Orbitrap經(jīng)典串聯(lián)質(zhì)譜儀(ThermoFisher Scientific，Dreieich，德國(guó))。為了確認(rèn)提取的離子層析圖中的鄰-Tyr峰和間-Tyr峰，我們使用以下合成肽：mAb HC66-72DQFTISR(未修飾的)、DQpYTISR、DQmYTISR和DQoYTISR。合成肽購(gòu)自Biosyntan GmbH(柏林，德國(guó))。

計(jì)算罰分系數(shù)和代用標(biāo)記(Surrogate Makers)用于Phe→鄰-Tyr和Phe→間-Tyr序列變體預(yù)測(cè)

我們假設(shè)，并入間-Tyr和/或鄰-Tyr而非Phe可以由這樣的簡(jiǎn)化模型描述，所述簡(jiǎn)化模型假設(shè)懲罰使用間-Tyr和/或鄰-Tyr而不懲罰使用Phe。這個(gè)罰分系數(shù)可以因不同來源如L-Phe更好轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞和/或蛋白質(zhì)合成期間盡力防止使用間-Tyr和/或鄰-Tyr的編輯機(jī)制而產(chǎn)生。這種假設(shè)導(dǎo)致等式

(Equ 5)p×r×[x]＝[y]，

其中p是罰分系數(shù)，r是平均間-Tyr濃度或鄰-Tyr濃度對(duì)Phe濃度的比率(在給定時(shí)間間隔期間)，[x]是(在時(shí)間區(qū)間中)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的濃度)和[y]是具有序列變體的產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的濃度。注意這個(gè)模型不包括任何對(duì)導(dǎo)致例如相移的時(shí)間、過程階段、Phe和間-Tyr濃度或鄰-Tyr濃度比率的依賴性。罰分系數(shù)的計(jì)算簡(jiǎn)單明了(Equ7)。

(Equ 6)p＝[y]/(r×[x])

類似地，已知罰分系數(shù)，還可能就無序列變體的產(chǎn)物的目的百分?jǐn)?shù)而言計(jì)算間-Tyr濃度或鄰-Tyr濃度對(duì)Phe濃度的比率。

實(shí)施例1

間-酪氨酸補(bǔ)充對(duì)苯丙氨酸限制條件下比生產(chǎn)率(qP)調(diào)節(jié)的影響

Gurer-Orhan等人之前已報(bào)道了，向CHO細(xì)胞補(bǔ)充間-Tyr顯示劑量依賴性細(xì)胞毒性。在濃度篩選中，當(dāng)補(bǔ)充0.5mM間-Tyr時(shí)觀察到MTX減少CHO細(xì)胞的能力為50％減少(Gurer-Orhan等人,(2006))。迄今尚未報(bào)告用于細(xì)胞培養(yǎng)物中鄰-Tyr補(bǔ)充的數(shù)據(jù)或濃度。使用劑量依賴性培養(yǎng)方案，目的在于確定間-Tyr和鄰-Tyr對(duì)CHO細(xì)胞生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)性和可耐受濃度。為此，對(duì)材料和方法中描述的CHO培養(yǎng)模型補(bǔ)充0.1mM、0.3mM或0.4mM對(duì)-Tyr、鄰-Tyr或間-Tyr。遵循所謂“對(duì)照”或“陽性對(duì)照”，我們使用未補(bǔ)充的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法作為參比。這里，截至第10/11日將Phe進(jìn)入限制。

在第一方案中，分析間-Tyr和鄰-Tyr對(duì)宏觀細(xì)胞生長(zhǎng)標(biāo)志物、活細(xì)胞密度(VCD)、細(xì)胞成活力和作為總生物量產(chǎn)生的細(xì)胞時(shí)間積分(CTI)的作用。在第9/10日，測(cè)試全部培養(yǎng)物，例外是補(bǔ)充間-Tyr的一個(gè)培養(yǎng)物，達(dá)到大約180x 10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的最大VCD，而間-Tyr處理的CHO克隆1顯示劑量依賴性減少的最大VCD(圖2)。觀察到間-Tyr補(bǔ)充的CHO培養(yǎng)物的累積性CTI減少(圖1)。

與Gurer-Orhan等人先前發(fā)表的數(shù)據(jù)相反，在我們的補(bǔ)料分批CHO培養(yǎng)模型中未觀察到間-Tyr補(bǔ)充對(duì)細(xì)胞成活力的明顯影響。然而，補(bǔ)充鄰-Tyr顯示細(xì)胞成活力較低，在第14日小于60％，并且與對(duì)照和間-Tyr補(bǔ)充以及對(duì)-Tyr補(bǔ)充相比，上清液中最終乳酸脫氫酶活性較高(圖5)。

通過產(chǎn)物濃度分析確定的培養(yǎng)物總生產(chǎn)率揭示了各試驗(yàn)情形之間沒有差異(圖3)。全部培養(yǎng)物均顯示滴度從第11/12日起停滯不升。另外，單一的間-Tyr顯示總體較高的比生產(chǎn)率qP(圖4)。與對(duì)照相比，Phe限制條件下補(bǔ)充0.1mM、0.3mM和0.4mM間-Tyr將qP分別增加+5％、+26％和+36％。

實(shí)施例2

間-酪氨酸補(bǔ)充對(duì)苯丙氨酸非限制條件下比生產(chǎn)率(qP)調(diào)節(jié)的影響

在第二方案中，分析了Phe非限制條件下間-Tyr和鄰-Tyr補(bǔ)充在CHO補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的作用。為此，增加進(jìn)料2中Phe的量以防止Phe限制(圖6)。

再次，測(cè)試全部培養(yǎng)物，例外是補(bǔ)充間-Tyr的一個(gè)培養(yǎng)物，達(dá)到大約35,000至40,000x 10⁵個(gè)細(xì)胞*h/ml的相似CTI，而間-Tyr處理的CHO克隆1顯示CTI的劑量依賴性減少(圖6)。對(duì)全部試驗(yàn)的條件未觀察到產(chǎn)物滴度差異(圖7)。但是，與前文描述的Phe限制條件相比，向CHO培養(yǎng)物提供足夠的Phe阻止了產(chǎn)物滴度的停滯不升。間-Tyr補(bǔ)充顯示總體較高的比生產(chǎn)率qP(圖4)，甚至在Phe非限制條件下也是如此(圖8)。與對(duì)照相比，Phe非限制條件下補(bǔ)充0.1mM、0.3mM和0.4mM間-Tyr將qP分別增加+3％、+26％和+28％。

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