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      一種小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):442274閱讀:187來(lái)源:國(guó)知局
      專利名稱:一種小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因及其應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明涉及一種小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因及其應(yīng)用。
      背景技術(shù)
      小麥穗發(fā)芽(Pre-harvest Sprouting,簡(jiǎn)稱PHS)是指小麥在收獲前遇到陰雨或在潮濕環(huán)境下的穗上發(fā)芽(Groos C,Gay G,Perretant M R,Gervais L,BernardM,Dedryver F,Charmet G.Study of the relationship between pre-harvestsprouting and grain color by quantitative trait loci analysis in a white×red grain bread-wheat cross.Theor Appl Genet,2000,10439-47)。由于小麥穗發(fā)芽時(shí)其籽粒內(nèi)部發(fā)生了一系列的生化反應(yīng),特別是一些碳水化合物降解酶、蛋白水解酶等酶活性升高,降解胚和胚乳中的貯藏物質(zhì),降低小麥的產(chǎn)量和加工品質(zhì)。在降雨較多的年份,即使有的小麥品種籽粒外觀不發(fā)芽,但儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已開始轉(zhuǎn)化,同樣會(huì)影響產(chǎn)量和品質(zhì)。
      日本、英國(guó)、美國(guó)、加拿大、澳大利亞、巴西、德國(guó)、瑞典、印度等國(guó)均受穗發(fā)芽危害,加拿大和澳大利亞尤為嚴(yán)重。據(jù)Derera報(bào)道,從1973-1984年的11個(gè)種植季節(jié)中,澳大利亞平均每年有7%的小麥?zhǔn)芩氚l(fā)芽危害,最嚴(yán)重的1984年,穗發(fā)芽危害程度高達(dá)20%。我國(guó)北方大部分白粒小麥品種對(duì)穗發(fā)芽高度敏感,收獲期遇雨極易引起小麥穗發(fā)芽,例如京津冀地區(qū)1995和2001年穗發(fā)芽嚴(yán)重,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此,國(guó)內(nèi)外育種學(xué)家和生物化學(xué)家對(duì)小麥穗發(fā)芽都很重視,并在其鑒定方法、抗性機(jī)制、遺傳機(jī)理和分子標(biāo)記等方面進(jìn)行了大量研究。
      小麥穗發(fā)芽的分子標(biāo)記是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)領(lǐng)域之一。Anderson等(1993)定位出了10個(gè)與穗發(fā)芽抗性有關(guān)的RFLP標(biāo)記,其中Xcn1.bcd1434和Xcn1.cdo431在1AS染色體上,Xcn1.cdo64在2AS染色體上,Xcn1.Wg996a和Xcn1.bcd120a在2AL染色體上,Xcn1.bdcd450在5DL染色體上,Xcn1.cdo545在4AL染色體上,Xcn1.bcd450在5DL染色體上,Xcn1.bcd426在6BL染色體上(AndersonJ A,Sorrells M E,Tanksley SD.RFLP analysis of genomic regions associatedwith resistance to pre-harvest sprouting in wheat.Crop Sci,1993,33453-459)。
      Roy等(1999)利用STMS(Sequence-tagged Microsatellites)標(biāo)記在6BS染色體上定位了1個(gè)控制穗發(fā)芽的主效基因,與Cwmc104標(biāo)記緊密連鎖。利用STS(Sequence-tagged site)標(biāo)記在7DL染色體上也定位了1個(gè)控制穗發(fā)芽的主效基因,與Xmst101標(biāo)記緊密連鎖(Roy J K,Prasad M,Varshney R K.Identificationof a microsatellite on chromosomes 6B and a STS on 7D of bread wheatshowing an association with pre-harvest sprouting tolerance.Theor ApplGenet,1999,99336-340)。Zanetti等(2000)在2A、3B、5A、6A和7B染色體上也定位了QTL(Zanetti S,Winzeler M,Keller M,Keller B,MessmerM.Geneticanalysis of pre-harvest sproutingin a wheat×spelt cross.Crop Sci,2000,401406-1407)。
      Flintham等(2000)用一組紅粒和白粒的近等基因系來(lái)研究休眠性與R基因的相關(guān)性。研究結(jié)果表明,R基因是一種控制紅粒色的三重基因,位于第三部分同源群染色體的長(zhǎng)臂端,也就是說(shuō)A、B和D染色體組中都含有R基因位點(diǎn),它控制種皮的顏色,屬于母性遺傳。不同來(lái)源的R基因具有對(duì)休眠性和籽粒顏色的雙重效應(yīng)(FlinthamJE(2000)Different genetic components control coat-imposed andembryo-imposed dormancy in wheat.Seed Sci Res 1043-50)。Flintham把這種差異解釋為在胚中還存在一個(gè)與休眠性有密切關(guān)系的主效基因Phs,后來(lái)這個(gè)基因被定位于4AL上,是影響休眠和后熟水平的基因位點(diǎn)(Flintham JE,Adlam R,BassoiM,Holdsworth M,&amp; Gale M.Mapping genes for resistance to sprouting damagein wheat.Euphytica,2002,12639-45)。Himi(2005)證明了R基因能促進(jìn)類黃酮基因的轉(zhuǎn)錄,在白粒品種中,由于R基因沒有表達(dá)而使類黃酮基因的表達(dá)降低(Himi E,Noda K.Red grain color gene(R)of wheat is a Myb-type transcriptionfactor.Euphytica,2005,143239-242)。R基因位點(diǎn)和休眠基因緊密連鎖,所以在小麥穗發(fā)芽抗性品種選育中,R基因所控制的種皮顏色可作為一個(gè)穗發(fā)芽抗性的標(biāo)記來(lái)應(yīng)用。但是這個(gè)標(biāo)記不能應(yīng)用于白粒小麥穗發(fā)芽抗性的標(biāo)記輔助育種。
      此外,還有許多穗發(fā)芽抗性的QTL被定位到不同的染色體區(qū)段上,包括4BS上的Hd、5AL上的BI和6BL上的B2等位點(diǎn)所控制的芒性(Derera N F.Preharvest fieldsprouting in cereal.CRC Press,Inc,1989),2DL上的C位點(diǎn)控制的穗型,2B和2D位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)的控制上表皮蠟質(zhì)的位點(diǎn)(King R W.&amp;P.von Wettstein-Knowles.Epicuticular waxes and regulation of ear wetting and pre-harvest sproutingin barley and wheat.Euphytica,2000,112157-166),以及在4B和4D短臂上發(fā)現(xiàn)的矮稈基因位點(diǎn),均與降低淀粉酶活性相關(guān)(Flintham JE,Angus WJ,GaleMD,Heterosis,overdominance for grain yield,and alpha-anylase activity inF1 hybirds between nearisogenic Rht dwarf and tall wheat.Journal ofAgricultural Science,1997,129371-378)。雖然芒性、穗型、株高和籽粒表皮蠟質(zhì)的標(biāo)記與穗發(fā)芽抗性相關(guān),但是它們并不是影響穗發(fā)芽抗性的主要因素,所以這些標(biāo)記能夠在育種中應(yīng)用的很少。
      綜上所述,盡管已開發(fā)的小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)的分子標(biāo)記很多,但大多數(shù)為AFLP和SSR標(biāo)記,實(shí)用性差,而且有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。
      Nakamura(2001)研究了強(qiáng)休眠品種Minamino和非休眠品種Tozan中Vp-1基因的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在成熟胚中Minamino的Vp-1的表達(dá)量大于Tozan(Nakamura S,Toyama T(2001)Isolation of a VP1 homologue from wheat and analysis of itsexpression in embryos of dormant and non-dormant cultivars.J Exp Bot52875-876)。Vp-1B基因的序列見序列1,此序列所編碼的蛋白序列見序列4。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因。
      本發(fā)明所提供的小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因,名稱為Vp-1Bc,具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列;2)與序列表中SEQ ID №3的DNA序列具有90%以上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列;3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
      上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC),0.1% SDS的溶液中,在65℃下雜交并洗膜。
      Vp-1Bc基因是Vp-1B基因的等位變異,在Vp-1B基因的第三個(gè)內(nèi)含子中缺失了83bp的核苷酸序列。
      Vp-1B基因具有序列表中序列1的核苷酸序列,全長(zhǎng)4034bp。Vp-1B基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成,自序列1的5′端第1位至1527位脫氧核苷酸為第一外顯子,自序列1的5′端第1528位至1737位脫氧核苷酸為第一內(nèi)含子,自序列1的5′端第1738位至1858位脫氧核苷酸為第二外顯子,自序列1的5′端第1859位至2181位脫氧核苷酸為第二內(nèi)含子,自序列1的5′端第2182位至2282位脫氧核苷酸為第三外顯子,自序列1的5′端第2283位至2903位脫氧核苷酸為第三內(nèi)含子,自序列1的5′端第2904位至2950位脫氧核苷酸為第四外顯子,自序列1的5′端第2951位至3051位脫氧核苷酸為第四內(nèi)含子,自序列1的5′端第3052位至3128位脫氧核苷酸為第五外顯子,自序列1的5′端第3129位至3644位脫氧核苷酸為第五內(nèi)含子,自序列1的5′端第3645位至4034位脫氧核苷酸為第六外顯子。Vp-1B基因編碼具有序列表中序列4的氨基酸序列。
      Vp-1Bc基因具有序列表中序列3的核苷酸序列,Vp-1Bc基因在Vp-1B基因的自序列1的5′端第2710位至2794位脫氧核苷酸間缺失了83bp。Vp-1Bc基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成,自序列3的5′端第1位至1527位脫氧核苷酸為第一外顯子,自序列3的5′端第1528位至1737位脫氧核苷酸為第一內(nèi)含子,自序列3的5′端第1738位至1858位脫氧核苷酸為第二外顯子,自序列3的5′端第1859位至2181位脫氧核苷酸為第二內(nèi)含子,自序列3的5′端第2182位至2282位脫氧核苷酸為第三外顯子,自序列3的5′端第2283位至2820位脫氧核苷酸為第三內(nèi)含子,自序列3的5′端第2821位至2867位脫氧核苷酸為第四外顯子,自序列3的5′端第2868位至2968位脫氧核苷酸為第四內(nèi)含子,自序列3的5′端第2969位至3045位脫氧核苷酸為第五外顯子,自序列3的5′端第3046位至3561位脫氧核苷酸為第五內(nèi)含子,自序列3的5′端第3562位至3951位脫氧核苷酸為第六外顯子。Vp-1Bc基因編碼具有序列表中序列4的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
      含有本發(fā)明Vp-1Bc基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
      本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種輔助篩選穗發(fā)芽抗性小麥的方法。
      本發(fā)明所提供的輔助篩選穗發(fā)芽抗性小麥的方法,是檢測(cè)待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中是否缺失了83bp的核苷酸序列,如該待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中缺失了83bp的核苷酸序列,則該待測(cè)小麥為候選穗發(fā)芽抗性小麥。
      可用PCR方法檢測(cè)待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中是否缺失了83bp的核苷酸序列。
      所述PCR方法為以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板,用由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,如果得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有大小為569bp的條帶,則所述待測(cè)小麥為候選穗發(fā)芽抗性小麥品種。
      由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的一對(duì)引物名稱為Vp1B3,是根據(jù)Vp-1基因在B基因組上穗發(fā)芽抗性與敏感性材料之間的差異設(shè)計(jì)的一個(gè)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的STS標(biāo)記,位于3BL。
      所述檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%的瓊脂糖檢測(cè),130V電壓電泳1.5小時(shí)。
      本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種輔助篩選穗發(fā)芽敏感小麥的方法。
      本發(fā)明所提供的輔助篩選穗發(fā)芽敏感小麥的方法,是檢測(cè)待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中有無(wú)插入和缺失突變,如該待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中無(wú)插入和缺失突變,則該待測(cè)小麥為候選穗發(fā)芽敏感小麥;所述插入突變?yōu)樵赩p-1B基因的第三內(nèi)含子中插入193bp的核苷酸序列的突變,所述缺失突變?yōu)樵赩p-1B基因的第三內(nèi)含子中缺失83bp的核苷酸序列的突變。
      可用PCR方法檢測(cè)待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中是有無(wú)插入和缺失突變。
      所述PCR方法為以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板,用由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,如果得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中無(wú)大小為845bp和569bp的條帶,則所述待測(cè)小麥為候選穗發(fā)芽敏感小麥。
      本發(fā)明的輔助篩選穗發(fā)芽抗性或敏感小麥的方法特別適合于白粒小麥品種。
      本發(fā)明的輔助篩選穗發(fā)芽抗性或敏感小麥的方法可用于小麥穗發(fā)芽抗性育種的早代選擇,大大縮短了育種周期,加快育種速度,降低育種成本,具有操作簡(jiǎn)單,成本低廉,周期短的優(yōu)點(diǎn),適于推廣應(yīng)用,為小麥抗穗發(fā)芽育種提供了技術(shù)支持,為選育穗發(fā)芽抗性小麥種質(zhì)提供了一種快捷的選擇方法。


      圖1為Vp1B3在17個(gè)不同穗發(fā)芽抗性品種中擴(kuò)增的帶型圖2為84個(gè)不同穗發(fā)芽抗性材料與用Vp1B3所擴(kuò)增出的三種片段的關(guān)系柱狀圖具體實(shí)施方式
      下述實(shí)施例中小麥材料均購(gòu)自國(guó)家種質(zhì)資源基因庫(kù)。
      本發(fā)明利用普通小麥Vp-1基因的保守序列設(shè)計(jì)了引物,分別對(duì)A、B和D基因組的Vp-1基因進(jìn)行擴(kuò)增,在A基因組和D基因組上沒有發(fā)現(xiàn)差異;而在B基因組上,與穗發(fā)芽敏感性材料相比,在第三個(gè)內(nèi)含子中穗發(fā)芽抗性材料存在一個(gè)193bp的插入或83bp的缺失,插入類型大部分存在于少數(shù)的穗發(fā)芽抗性極高且非常穩(wěn)定的幾個(gè)地方品種中,缺失類型存在于抗性品種中。根據(jù)Vp-1基因在B基因組上穗發(fā)芽抗性與敏感性材料之間的差異設(shè)計(jì)了一個(gè)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的STS標(biāo)記-Vp1B3,結(jié)果表明這個(gè)標(biāo)記呈現(xiàn)出多態(tài)性,在抗性品種中出現(xiàn)845bp或569bp的片段,在感性品種中出現(xiàn)652bp的片段。進(jìn)一步對(duì)穗發(fā)芽抗性品種進(jìn)行擴(kuò)增得到Vp-1B基因的兩個(gè)等位變異VP-1Bb和VP-1Bc。
      以種子發(fā)芽指數(shù)GI作為穗發(fā)芽抗性的指標(biāo)進(jìn)行穗發(fā)芽抗性評(píng)價(jià),種子發(fā)芽指數(shù)GI為第七天的總發(fā)芽數(shù)占總種子數(shù)的百分?jǐn)?shù)。種子發(fā)芽指數(shù)GI大于70%為穗發(fā)芽敏感品種,種子發(fā)芽指數(shù)GI為30-50%為穗發(fā)芽中性品種,發(fā)芽指數(shù)GI為0-15%為穗發(fā)芽抗性品種。
      實(shí)施例1、兩個(gè)Vp-1B基因的等位變異VP-1Bb和VP-1Bc的的獲得1、兩個(gè)Vp-1B基因的等位變異VP-1Bb和VP-1Bc的發(fā)現(xiàn)以穗發(fā)芽敏感材料中優(yōu)9507(發(fā)芽指數(shù)GI為89%)和穗發(fā)芽高抗材料萬(wàn)縣白麥子(發(fā)芽指數(shù)GI為8%)及穗發(fā)芽抗性材料西農(nóng)979(發(fā)芽指數(shù)GI為15%)為材料,對(duì)其Vp-1基因在A、B和D基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增,然后測(cè)序,結(jié)果表明Vp-1基因在A基因組和D基因組上沒有發(fā)現(xiàn)差異;而在B基因組上,與穗發(fā)芽敏感材料中優(yōu)9507相比,在第三個(gè)內(nèi)含子中,穗發(fā)芽抗性材料中存在差異即在穗發(fā)芽高抗材料萬(wàn)縣白麥子中存在一個(gè)193bp的插入,在穗發(fā)芽抗性材料西農(nóng)979中存在一個(gè)83bp的缺失。將在B基因組的Vp-1基因(即Vp-1B基因)的第三個(gè)內(nèi)含子中插入193bp的Vp-1B等位基因命名為Vp-1Bb,將在B基因組的Vp-1基因(即Vp-1B基因)的第三個(gè)內(nèi)含子中缺失83bp的Vp-1B等位基因命名為Vp-1Bc。Vp-1B基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。Vp-1B基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成,自序列1的5′端第1位至1527位脫氧核苷酸為第一外顯子,自序列1的5′端第1528位至1737位脫氧核苷酸為第一內(nèi)含子,自序列1的5′端第1738位至1858位脫氧核苷酸為第二外顯子,自序列1的5′端第1859位至2181位脫氧核苷酸為第二內(nèi)含子,自序列1的5′端第2182位至2282位脫氧核苷酸為第三外顯子,自序列1的5′端第2283位至2903位脫氧核苷酸為第三內(nèi)含子,自序列1的5′端第2904位至2950位脫氧核苷酸為第四外顯子,自序列1的5′端第2951位至3051位脫氧核苷酸為第四內(nèi)含子,自序列1的5′端第3052位至3128位脫氧核苷酸為第五外顯子,自序列1的5′端第3129位至3644位脫氧核苷酸為第五內(nèi)含子,自序列1的5′端第3645位至4034位脫氧核苷酸為第六外顯子。Vp-1Bb基因具有序列表中序列2的核苷酸序列,Vp-1Bb基因在Vp-1B基因的自序列1的5′端第2497位至2498位脫氧核苷酸間插入了193bp。Vp-1Bb基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成,自序列2的5′端第1位至1527位脫氧核苷酸為第一外顯子,自序列2的5′端第1528位至1737位脫氧核苷酸為第一內(nèi)含子,自序列2的5′端第1738位至1858位脫氧核苷酸為第二外顯子,自序列2的5′端第1859位至2181位脫氧核苷酸為第二內(nèi)含子,自序列2的5′端第2182位至2282位脫氧核苷酸為第三外顯子,自序列2的5′端第2283位至3096位脫氧核苷酸為第三內(nèi)含子,自序列2的5′端第3097位至3143位脫氧核苷酸為第四外顯子,自序列2的5′端第3144位至3245位脫氧核苷酸為第四內(nèi)含子,自序列2的5′端第3246位至3322位脫氧核苷酸為第五外顯子,自序列2的5′端第3323位至3838位脫氧核苷酸為第五內(nèi)含子,自序列2的5′端第3839位至4227位脫氧核苷酸為第六外顯子。Vp-1Bc基因具有序列表中序列3的核苷酸序列,Vp-1Bc基因在Vp-1B基因的自序列1的5′端第2710位至2794位脫氧核苷酸間缺失了83bp。Vp-1Bc基因由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成,自序列3的5′端第1位至1527位脫氧核苷酸為第一外顯子,自序列3的5′端第1528位至1737位脫氧核苷酸為第一內(nèi)含子,自序列3的5′端第1738位至1858位脫氧核苷酸為第二外顯子,自序列3的5′端第1859位至2181位脫氧核苷酸為第二內(nèi)含子,自序列3的5′端第2182位至2282位脫氧核苷酸為第三外顯子,自序列3的5′端第2283位至2820位脫氧核苷酸為第三內(nèi)含子,自序列3的5′端第2821位至2867位脫氧核苷酸為第四外顯子,自序列3的5′端第2868位至2968位脫氧核苷酸為第四內(nèi)含子,自序列3的5′端第2969位至3045位脫氧核苷酸為第五外顯子,自序列3的5′端第3046位至3561位脫氧核苷酸為第五內(nèi)含子,自序列3的5′端第3562位至3951位脫氧核苷酸為第六外顯子。
      2、Vp-1B基因、VP-1Bb基因和VP-1Bc基因的獲得以中優(yōu)9507的基因組DNA為模板,以Vp-1B3F/R(5’-TGCTCCTTTCCCAATTGG-3’;5’-ACCCTCCTGCAGCTCATT-3’)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到具有序列表中序列1的核苷酸序列的Vp-1B基因。其中,PCR擴(kuò)增條件為先94℃預(yù)變性5分鐘;然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘,60℃復(fù)性1分鐘,72℃延伸1分鐘;最后72℃延伸10分鐘。
      以萬(wàn)縣白麥子的基因組DNA為模板,以Vp-1B3F/R(5’-TGCTCCTTTCCCAATTGG-3’;5’-ACCCTCCTGCAGCTCATT-3’)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到具有序列表中序列2的核苷酸序列的Vp-1Bb基因。其中,PCR擴(kuò)增條件為先94℃預(yù)變性5分鐘;然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘,60℃復(fù)性1分鐘,72℃延伸1分鐘;最后72℃延伸10分鐘。
      以西農(nóng)979的基因組DNA為模板,以Vp-1B3F/R(5’-TGCTCCTTTCCCAATTGG-3’;5’-ACCCTCCTGCAGCTCATT-3’)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到具有序列表中序列3的核苷酸序列的Vp-1Bc基因。其中,PCR擴(kuò)增條件為先94℃預(yù)變性5分鐘;然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘,60℃復(fù)性1分鐘,72℃延伸1分鐘;最后72℃延伸10分鐘。
      實(shí)施例2、用Vp-1B、VP-1Bb和VP-1Bc基因的第三內(nèi)含子間的差異輔助篩選穗發(fā)芽抗性小麥和穗發(fā)芽敏感小麥1、根據(jù)Vp-1B、VP-1Bb和VP-1Bc的序列設(shè)計(jì)了STS標(biāo)記Vp1B3,引物序列為上游5’-TGCTCCTTTCCCAATTGG-3(序列5);下游5’-ACCCTCCTGCAGCTCATTG-3’(序列6)。然后用該引物擴(kuò)增17個(gè)不同穗發(fā)芽抗性的白粒品種(圖1),擴(kuò)增反應(yīng)總體以20μl為例,反應(yīng)液組成為2μl 10×PCR buffer,4種dNTP各125μM,各8pmol的上下游引物,1.0單位的rTaq酶和50ng小麥基因組DNA。反應(yīng)程序是先94℃預(yù)變性5分鐘;然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)94℃變性1分鐘,60℃復(fù)性1分鐘,72℃延伸1分鐘;最后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物保存于4℃。然后用2.0%的瓊脂糖凝膠在130V電壓電泳1.5小時(shí)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。結(jié)果如圖1所示,出現(xiàn)三種帶型在抗性品種中出現(xiàn)845bp或569bp的片段,在感性品種中出現(xiàn)652bp的片段。圖1中的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)是100bp DNA ladder。圖1中,1為CA9722(發(fā)芽指數(shù)GI為91.5%,擴(kuò)增到652bp條帶),2為豐抗13(發(fā)芽指數(shù)GI為98.5%,擴(kuò)增到652bp條帶),3為內(nèi)鄉(xiāng)173(發(fā)芽指數(shù)GI為4.0%,擴(kuò)增到569bp條帶)),4為山農(nóng)9號(hào)(發(fā)芽指數(shù)GI為11%,擴(kuò)增到569bp條帶),5為晉麥5號(hào)(發(fā)芽指數(shù)GI為97.5%,擴(kuò)增到652bp條帶),6為蜀萬(wàn)761(發(fā)芽指數(shù)GI為0.5%,擴(kuò)增到569bp條帶),7為石家莊54(發(fā)芽指數(shù)GI為88.5%,擴(kuò)增到652bp條帶),8為SW 95-16117(發(fā)芽指數(shù)GI為2.5%,擴(kuò)增到569bp條帶),9為川農(nóng)94-DH343(發(fā)芽指數(shù)GI為5.5%,擴(kuò)增到569bp條帶),10為白玉皮(發(fā)芽指數(shù)GI為7.5%,擴(kuò)增到569bp條帶),11為昌樂5(發(fā)芽指數(shù)GI為52.0%,擴(kuò)增到652bp條帶),12為輝縣紅(發(fā)芽指數(shù)GI為15.0%,擴(kuò)增到652bp條帶),13為陜西54(發(fā)芽指數(shù)GI為6.0%,擴(kuò)增到569bp條帶),14為科遺26(發(fā)芽指數(shù)GI為96.5%,擴(kuò)增到652bp條帶),15為川育21729(發(fā)芽指數(shù)GI為7.5%,擴(kuò)增到845bp條帶),16為南大2419(發(fā)芽指數(shù)GI為4.5%,擴(kuò)增到569bp條帶),17為早洋麥(發(fā)芽指數(shù)GI為1.0%,擴(kuò)增到845bp條帶)。
      2、選取84個(gè)不同穗發(fā)芽抗性的白粒品種來(lái)檢測(cè)本發(fā)明的輔助篩選穗發(fā)芽抗性或敏感小麥的可行性。
      分別以84個(gè)不同穗發(fā)芽抗性的白粒品種的基因組DNA為模板,按照步驟1的方法進(jìn)行擴(kuò)增和電泳,結(jié)果表明共有8個(gè)品種擴(kuò)增出845bp的片段,其中3個(gè)品種是穗發(fā)芽抗性材料(發(fā)芽指數(shù)GI為0-15%),另外5個(gè)品種是穗發(fā)芽中抗材料(發(fā)芽指數(shù)GI為31%-50%);39個(gè)品種擴(kuò)增出569bp的片段,其中30個(gè)品種是穗發(fā)芽抗性材料(發(fā)芽指數(shù)GI為0-15%),7個(gè)品種是中抗材料,另外2個(gè)品種是穗發(fā)芽感性材料。37個(gè)品種擴(kuò)增出652bp的片段,20個(gè)品種是穗發(fā)芽敏感材料,15個(gè)品種是穗發(fā)芽中抗材料,另外2個(gè)材料是穗發(fā)芽抗性材料。而且,具有845bp的材料比具有569bp的材料更抗穗發(fā)芽。
      84個(gè)不同穗發(fā)芽抗性材料與用Vp1B3所擴(kuò)增出的三種片段的關(guān)系如圖2所示。圖2中,白柱表示擴(kuò)增到569bp片段的品種數(shù),黑柱是擴(kuò)增出652bp片段的品種數(shù),灰柱是擴(kuò)增出845bp片段的品種數(shù)。
      表1.84份白粒中國(guó)小麥品種的穗發(fā)芽指數(shù)GI與STS標(biāo)記的多態(tài)性

      序列表&lt;160&gt;6&lt;210&gt;1&lt;211&gt;4034&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小麥屬普通小麥中優(yōu)9507(Triticum aestivum L cv Zhongyou 9507)&lt;400&gt;1atggacgcct ccgccggctc gtcgccgccg cggcactcgc agggggacgc gccgaggcgc 60ggcgggccgc accgcgggaa gggccccgcg gtggagatcc ggcagggaga ggacgacttc 120atgttcgcgc aggatacctt cccggccctc ccggacttcc cttgcctctc ctcgccgtcg 180agctccacct tctcctcctc ctcgtcttcc aactcctcca gcgccttcgc tgccccagcg 240ggagcgggcg ggcgcggggc cgagggggcg cgcggcgagc cgtccgagcc tgcagcggcc 300ggggacggga tggacgacct ctccgacatc gaccacctgc tcgacttcgc gtccatcaac 360gacgacgtcc cctgggacga cgagccgctc ttccccgacg tcgggatgat gctggaggat 420gtcatctccg agcagcagct ccagcagcct ccggcgggcc acggcacggc cgggagaacg 480gcgtcgcatg cggcctctgg tggaggagag gatgccttca tgggtggcgg cggcacgggg 540agcgcggcgg acgacctgcc gctgttcttc atggagtggc tcaagaacaa ccgcgactgc 600atctcggccg aggacctccg cagcatccgc ctccgtcgat ccaccatcga ggccgcggcc 660gcgcgcctcg gtggggggcg ccagggcacc atgcagctgc tcaagctcat cctcacctgg 720gtgcagaacc accacctgca gaagaagcgc ccccgcgtcg gcgccatgga tcaggaggcg 780ccgccggcag gaggccagct ccctagcccc ggcgcaaacc ccggctacga attccccgcg 840gagacgggtg ccgccgctgc cacatcatgg atgccctacc aggccttctc gccaactgga 900tcctacggcg gcgaggcgat ctacccattc cagcagggct gcagcactag cagcgtggcc 960gtgagcagcc agccgttctc cccgccggcg gcgcccgaca tgcacgccgg ggcctggccc1020ctgcagtacg cggcgttcgt cccagctgga gccacatccg caggcactca aacatacccg1080atgccgccgc cgggggccgt gccgcagccg ttcgcggccc ccggattcgc cgggcagttc1140ccgcagcgga tggagccggc ggcgaccagg gaggcccgga agaagcggat ggcgaggcag1200cggcgcttgt cgtgcctgca gcagcagcgg agccagcagc tgaatctgag ccagatccaa1260accggcggct tccctcaaga gcaatccccc cgcgcggcgc actcggcgcc ggtcacgccg1320ccgtcgtccg gctggggagg cctctggacg caacaggccg tccagggcca gctcatggtc1380caggtcccga atccgctgtc gacgaagtcc aattcctcaa ggcagaagca gcaaaaaccc1440
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      atatattaat agcaataaca tcgtattcat cttgcaaaat agttttatat catgcatatc3420tccctattct ttatgcatat tatgaggtca aaatcaagtg ttggagactg aaaagtcaga3480tgtctatgtc ttgtattctg tgagggatgg agtatatagg actgtttgtc tttggagttt3540ggatatctaa ttaagtacgt actagcagaa ctatctgtgt tcttgttgtg catttgaatg3600aattgtctat acatcagcta atctcagcct ttctgtgtac caccagctga tacgcggcgt3660gaaggtaaga gctcaacagg atctagccaa gcacaagaat gccagtccag agaaaggtgg3720ggcgtccgac gtgaaggcgg gcggagaaga cggtggttgc aaagagaagt ctccgcacgg3780tgtccggcga tctcgccagg aagccagctc catgaaccag atggcggtga gcatctgaaa3840tgagcaggct cgccgtccga tcccccattg aagactactt aattagctag ctcaagtata3900cctgctaatg atgatcaaat cgatctcccg ttctatgatc cgtgcttccg tgtactgccg3960tagccctagt tagggatgat gatactaaag tagctatcgg tttcttggtc agatgtgacg4020ctgaagaatg gcat 4034&lt;210&gt;2&lt;211&gt;4227&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;小麥屬普通小麥萬(wàn)縣白麥子(Triticum aestivum L cv Wanxian whitewheat)&lt;400&gt;2atggacgcct ccgccggctc gtcgccgccg cggcactcgc agggggacgc gccgaggcgc 60ggcgggccgc accgcgggaa gggccccgcg gtggagatcc ggcagggaga ggacgacttc 120atgttcgcgc aggatacctt cccggccctc ccggacttcc cttgcctctc ctcgccgtcg 180agctccacct tctcctcctc ctcgtcttcc aactcctcca gcgccttcgc tgccccagcg 240ggagcgggcg ggcgcggggc cgagggggcg cgcggcgagc cgtccgagcc tgcagcggcc 300ggggacggga tggacgacct ctccgacatc gaccacctgc tcgacttcgc gtccatcaac 360gacgacgtcc cctgggacga cgagccgctc ttccccgacg tcgggatgat gctggaggat 420gtcatctccg agcagcagct ccagcagcct ccggcgggcc acggcacggc cgggagaacg 480gcgtcgcatg cggcctctgg tggaggagag gatgccttca tgggtggcgg cggcacgggg 540agcgcggcgg acgacctgcc gctgttcttc atggagtggc tcaagaacaa ccgcgactgc 600atctcggccg aggacctccg cagcatccgc ctccgtcgat ccaccatcga ggccgcggcc 660gcgcgcctcg gtggggggcg ccagggcacc atgcagctgc tcaagctcat cctcacctgg 720gtgcagaacc accacctgca gaagaagcgc ccccgcgtcg gcgccatgga tcaggaggcg 780
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      atggacgcct ccgccggctc gtcgccgccg cggcactcgc agggggacgc gccgaggcgc 60ggcgggccgc accgcgggaa gggccccgcg gtggagatcc ggcagggaga ggacgacttc 120atgttcgcgc aggatacctt cccggccctc ccggacttcc cttgcctctc ctcgccgtcg 180agctccacct tctcctcctc ctcgtcttcc aactcctcca gcgccttcgc tgccccagcg 240ggagcgggcg ggcgcggggc cgagggggcg cgcggcgagc cgtccgagcc tgcagcggcc 300ggggacggga tggacgacct ctccgacatc gaccacctgc tcgacttcgc gtccatcaac 360gacgacgtcc cctgggacga cgagccgctc ttccccgacg tcgggatgat gctggaggat 420gtcatctccg agcagcagct ccagcagcct ccggcgggcc acggcacggc cgggagaacg 480gcgtcgcatg cggcctctgg tggaggagag gatgccttca tgggtggcgg cggcacgggg 540agcgcggcgg acgacctgcc gctgttcttc atggagtggc tcaagaacaa ccgcgactgc 600atctcggccg aggacctccg cagcatccgc ctccgtcgat ccaccatcga ggccgcggcc 660gcgcgcctcg gtggggggcg ccagggcacc atgcagctgc tcaagctcat cctcacctgg 720gtgcagaacc accacctgca gaagaagcgc ccccgcgtcg gcgccatgga tcaggaggcg 780ccgccggcag gaggccagct ccctagcccc ggcgcaaacc ccggctacga attccccgcg 840gagacgggtg ccgccgctgc cacatcatgg atgccctacc aggccttctc gccaactgga 900tcctacggcg gcgaggcgat ctacccattc cagcagggct gcagcactag cagcgtggcc 960gtgagcagcc agccgttctc cccgccggcg gcgcccgaca tgcacgccgg ggcctggccc1020ctgcagtacg cggcgttcgt cccagctgga gccacatccg caggcactca aacatacccg1080atgccgccgc cgggggccgt gccgcagccg ttcgcggccc ccggattcgc cgggcagttc1140ccgcagcgga tggagccggc ggcgaccagg gaggcccgga agaagcggat ggcgaggcag1200cggcgcttgt cgtgcctgca gcagcagcgg agccagcagc tgaatctgag ccagatccaa1260accggcggct tccctcaaga gcaatccccc cgcgcggcgc actcggcgcc ggtcacgccg1320ccgtcgtccg gctggggagg cctctggacg caacaggccg tccagggcca gctcatggtc1380caggtcccga atccgctgtc gacgaagtcc aattcctcaa ggcagaagca gcaaaaaccc1440tcgccggacg cagcagcgag gccgccctcc ggcggcgccg ccacgccgca tcgcccgggg1500caggcgtcgg cttccaataa gcagcggcag caggtgcatg catgcacgaa cacctcttgc1560catccatcca tcgatcgcca tcccgcatag aatcacaagc cattgctccc caaataaagt1620gtgcgtgctt cgtaatggac gcacatcgct gtccagcgat aggatatgca tgcgcgcgtg1680cgtgtctgtt ttacctgcac ggtgaattgc gtttctcaac gaggttccgt gcatgcgcgc1740agggtgcgag gacgccggcg gcggcgccgg cggcaggaga caagaacctg cggttcctgc1800tgcagaaggt gctcaagcag agcgacgtcg gaaccctcgg ccgcatcgtg ctccccaaag1860tgaggcagtc acctccctat cgcggtcttc ttcctccatc cgcccgaccc atgcaccact1920
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      Pro Ala Ala Ala Gly Asp Gly Met Asp Asp Leu Ser Asp Ile Asp His100 105 110Leu Leu Asp Phe Ala Ser Ile Asn Asp Asp Val Pro Trp Asp Asp Glu115 120 125Pro Leu Phe Pro Asp Val Gly Met Met Leu Glu Asp Val Ile Ser Glu130 135 140Gln Gln Leu Gln Gln Pro Pro Ala Gly His Gly Thr Ala Gly Arg Thr145 150 155 160Ala Ser His Ala Ala Ser Gly Gly Gly Glu Asp Ala Phe Met Gly Gly165 170 175Gly Gly Thr Gly Ser Ala Ala Asp Asp Leu Pro Leu Phe Phe Met Glu180 185 190Trp Leu Lys Asn Asn Arg Asp Cys Ile Ser Ala Glu Asp Leu Arg Ser195 200 205Ile Arg Leu Arg Arg Ser Thr Ile Glu Ala Ala Ala Ala Arg Leu Gly210 215 220
      Gly Gly Arg Gln Gly Thr Met Gln Leu Leu Lys Leu Ile Leu Thr Trp225 230 235 240Val Gln Asn His His Leu Gln Lys Lys Arg Pro Arg Val Gly Ala Met245 250 255Asp Gln Glu Ala Pro Pro Ala Gly Gly Gln Leu Pro Ser Pro Gly Ala260 265 270Asn Pro Gly Tyr Glu Phe Pro Ala Glu Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr275 280 285Ser Trp Met Pro Tyr Gln Ala Phe Ser Pro Thr Gly Ser Tyr Gly Gly290 295 300Glu Ala Ile Tyr Pro Phe Gln Gln Gly Cys Ser Thr Ser Ser Val Ala305 310 315 320Val Ser Ser Gln Pro Phe Ser Pro Pro Ala Ala Pro Asp Met His Ala325 330 335Gly Ala Trp Pro Leu Gln Tyr Ala Ala Phe Val Pro Ala Gly Ala Thr340 345 350
      Ser Ala Gly Thr Gln Thr Tyr Pro Met Pro Pro Pro Gly Ala Val Pro355 360 365Gln Pro Phe Ala Ala Pro Gly Phe Ala Gly Gln Phe Pro Gln Arg Met370 375 380Glu Pro Ala Ala Thr Arg Glu Ala Arg Lys Lys Arg Met Ala Arg Gln385 390 395 400Arg Arg Leu Ser Cys Leu Gln Gln Gln Arg Ser Gln Gln Leu Asn Leu405 410 415Ser Gln Ile Gln Thr Gly Gly Phe Pro Gln Glu Gln Ser Pro Arg Ala420 425 430Ala His Ser Ala Pro Val Thr Pro Pro Ser Ser Gly Trp Gly Gly Leu435 440 445Trp Thr Gln Gln Ala Val Gln Gly Gln Leu Met Val Gln Val Pro Asn450 455 460Pro Leu Ser Thr Lys Ser Asn Ser Ser Arg Gln Lys Gln Gln Lys Pro465 470 475 480
      Ser Pro Asp Ala Ala Ala Arg Pro Pro Ser Gly Gly Ala Ala Thr Pro485 490 495His Arg Pro Gly Gln Ala Ser Ala Ser Asn Lys Gln Arg Gln Gln Gly500 505 510Ala Arg Thr Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly Asp Lys Asn Leu Arg515 520 525Phe Leu Leu Gln Lys Val Leu Lys Gln Ser Asp Val Gly Thr Leu Gly530 535 540Arg Ile Val Leu Pro Lys Lys Glu Ala Glu Thr His Leu Pro Glu Leu545 550 555 560Lys Thr Gly Asp Gly Ile Ser Ile Pro Ile Glu Asp Ile Gly Thr Ser565 570 575Gln Val Trp Ser Met Arg Tyr Arg Phe Trp Pro Asn Asn Lys Ser Arg580 585 590Met Tyr Leu Leu Glu Asn Thr Gly Asp Phe Val Arg Ser Asn Glu Leu595 600 605
      Gln Glu Gly Asp Phe Ile Val Leu Tyr Ser Asp Val Lys Ser Gly Lys610 615 620Tyr Leu Ile Arg Gly Val Lys Val Arg Ala Gln Gln Asp Leu Ala Lys625 630 635 640His Lys Asn Ala Ser Pro Glu Lys Gly Gly Ala Ser Asp Val Lys Ala645 650 655Gly Gly Glu Asp Gly Gly Cys Lys Glu Lys Ser Pro His Gly Val Arg660 665 670Arg Ser Arg Gln Glu Ala Ser Ser Met Asn Gln Met Ala Val Ser Ile675 680 685&lt;210&gt;5&lt;211&gt;18&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
      &lt;223&gt;
      &lt;400&gt;5tgctcctttc ccaattgg 18&lt;210&gt;6&lt;211&gt;19&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;人工序列&lt;220&gt;
      &lt;223&gt;
      &lt;400&gt;6accctcctgc agctcattg 19
      權(quán)利要求
      1.一種小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因,具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列;2)與序列表中SEQ ID №3的DNA序列具有90%以上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列;3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
      2.含有權(quán)利要求1所述的小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或工程菌。
      3.一種輔助篩選穗發(fā)芽抗性小麥的方法,是檢測(cè)待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中是否缺失了83bp的核苷酸序列,如該待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中缺失了83bp的核苷酸序列,則該待測(cè)小麥為候選穗發(fā)芽抗性小麥。
      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于所述方法中用PCR方法檢測(cè)待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中是否缺失了83bp的核苷酸序列。
      5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于所述PCR方法以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板,用由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,如果得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中有大小為569bp的條帶,則所述待測(cè)小麥為候選穗發(fā)芽抗性小麥。
      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于所述檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法是對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%的瓊脂糖檢測(cè),130V電壓電泳1.5小時(shí)。
      7.根據(jù)權(quán)利要求3、4、5或6所述的方法,其特征在于所述待測(cè)小麥為白粒小麥品種。
      8.一種輔助篩選穗發(fā)芽敏感小麥的方法,是檢測(cè)待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中有無(wú)插入和缺失突變,如該待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中無(wú)插入和缺失突變,則該待測(cè)小麥為候選穗發(fā)芽敏感小麥種;所述插入突變?yōu)樵赩p-1B基因的第三內(nèi)含子中插入193bp的核苷酸序列的突變,所述缺失突變?yōu)樵赩p-1B基因的第三內(nèi)含子中缺失83bp的核苷酸序列的突變。
      9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于所述方法中,用PCR方法檢測(cè)待測(cè)小麥的Vp-1B基因的第三內(nèi)含子中有無(wú)插入和缺失突變;所述PCR方法為以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板,用由序列表中序列5和序列6的核苷酸序列組成的一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,如果得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中無(wú)大小為845bp和569bp的條帶,則所述待測(cè)小麥品種為候選穗發(fā)芽敏感小麥品種。
      10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法,其特征在于所述待測(cè)小麥為白粒小麥品種。
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因及其應(yīng)用。該小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因,具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的核苷酸序列;2)與序列表中SEQ ID №2的DNA序列具有90%以上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列;3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。可利用該基因輔助篩選穗發(fā)芽抗性小麥或穗發(fā)芽敏感小麥。該輔助篩選穗發(fā)芽抗性或敏感小麥的方法可用于小麥穗發(fā)芽抗性育種的早代選擇,大大縮短了育種周期,加快育種速度,降低育種成本,具有操作簡(jiǎn)單,成本低廉,周期短的優(yōu)點(diǎn),適于推廣應(yīng)用,為小麥抗穗發(fā)芽育種提供了技術(shù)支持,為選育穗發(fā)芽抗性小麥種質(zhì)提供了一種快捷的選擇方法。
      文檔編號(hào)C12N15/82GK1904049SQ200610089190
      公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2006年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日
      發(fā)明者夏蘭芹, 楊燕, 何中虎, 陳新民 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
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