專(zhuān)利名稱(chēng)：：螺內(nèi)酰胺類(lèi)化合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用曲霉B-F-2(Aspe^Z^sp.B-F-2)(該菌株已于2005年12月16日保藏在武漢中國(guó)菌種保藏中心，保藏編號(hào)是:CCTCCM205148)制備新螺內(nèi)酰胺類(lèi)化合物的方法；本發(fā)明還涉及該類(lèi)化合物在制備細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。
背景技術(shù)：
：螺內(nèi)酰胺類(lèi)化合物已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，該類(lèi)化合物顯示了多種生物活性，如細(xì)胞分化誘導(dǎo)齊U(Komagata,D.;Fujita,S.;Yamashita，N.;Saito,S.;Morino,T.1996,49(9),958.)，抗菌抗腫瘤活性(Hayashi，Y.;Shoji'M.;Mukaiyama,T.;Gotoh,H.;Yamaguchi，S.;Nakata，H.;Osada,H.Org.Lett.2005,70，5643.)，以及抑制血管生成活性(Asami,Y.;Kakeya，H.;Onose，R.;Yoshida,A.;Matsuzaki,H.;Osada,H.Org.Left2002，4(17),2845)等。該類(lèi)化合物是一類(lèi)較常見(jiàn)的真菌代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)特征是都具有l(wèi)-0xa-7-azaSpir0[4,4]non-2-ene-4，6-dione的結(jié)構(gòu)母核，pseurotinA，synerazolandazaspirene都是該類(lèi)化合物的例子(Ando，O.;Satake，H.;Nakajima,M.;Sato,A.;Nakamura，T.;Ki腦hita，T.;Furuya,K,丄A打"砲.1991,44(4)，382.;Asami,Y.;Kakeya,H.;Onose,R.;Yoshida,A.;Matsuzaki,H.;Osada，H.Org.Leff.2002,4(17)，2845)。母豐亥上連接的側(cè)鏈常見(jiàn)為臨二醇或共軛雙鍵，而我們的化合物與母核相連的側(cè)鏈為乙基呋喃環(huán)，這是非常少見(jiàn)的。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)曲霉B-F-2(A平ergfflwsp.B-F-2)液體發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后的粗提物有很好的細(xì)胞壞死活性，遂對(duì)其活性成分進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的螺內(nèi)酰胺類(lèi)化合物具有抗腫瘤活性，目前尚未見(jiàn)對(duì)該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞增殖抑制活性的報(bào)道，因此市場(chǎng)上也尚未見(jiàn)有與此有關(guān)的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明旨在提供一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的具有細(xì)胞增殖抑制以及直接殺傷癌細(xì)胞等抗腫瘤活性的新化合物。本發(fā)明的目的還在于提供一類(lèi)新化合物的制備方法及其新化合物在制備腫瘤細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑中的用途。本發(fā)明首次從曲霉B-F-2(A印"g"/"ssp.B-F-2)(該菌株已于2005年12月16閂保藏在武漢中國(guó)菌種保藏中心，保藏編號(hào)是:CCTCCM205148)發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)新穎的新螺內(nèi)酰胺類(lèi)化合物，如式I所示R2式I其結(jié)構(gòu)特征是其中式IR,、R3,R4為氫、甲基、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2為氫、烴基、羥基或?；?。本發(fā)明的式I化合物優(yōu)選其中化合物為化合物1，其中^為甲基，R2為氫，R3為羥基，R4為甲氧基；或化合物2，其中R,為甲基，R2為氫，R3R4均為羥基。上述發(fā)明中最優(yōu)選的化合物是由海洋來(lái)源的曲霉B-F-2(A印wg"Ztwsp.B-F-2)的液體發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，氯仿-甲醇8:2的洗脫物，再經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮6:4洗脫產(chǎn)物再經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水60:40洗脫得式I化合物1，2。本發(fā)明采用MTT法測(cè)試了化合物1，2對(duì)P388，A-549,HL60和BEL-7402細(xì)胞株的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這2個(gè)化合物對(duì)這四種腫瘤細(xì)胞均有增殖抑制作用。因此本發(fā)明的式I化合物可用作細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑。式I化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗腫瘤藥物，用于腫瘤的治療。式I化合物還可作為抑制細(xì)胞增殖的低分子生物探針用于生命科學(xué)研究，作為探針應(yīng)用時(shí)，式I化合物可溶于甲醇、水或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含水溶液中加以應(yīng)用。本發(fā)明的式I化合物可通過(guò)微生物發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵物中分離純化而得到；也可由上述優(yōu)選化合物經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)修飾方法合成獲得。需要特別說(shuō)明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)該類(lèi)化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類(lèi)化合物的微生物均可作為生產(chǎn)菌用于制備式I化合物。本發(fā)明的實(shí)施例中列舉了利用曲霉B-F-2株制備優(yōu)選的本發(fā)明式I化合物的實(shí)例。需要特別說(shuō)明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I化合物的方法可采用其它任何能生產(chǎn)新螺內(nèi)酰胺類(lèi)化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類(lèi)化合物的微生物均可用作產(chǎn)素菌用于制備式I化合物。具體實(shí)施例方式在如下的實(shí)施例中所指的化合物1-2的化學(xué)結(jié)構(gòu)分別是(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯?dāng)?shù)字是化學(xué)結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位)式I式I中化合物1的R,為甲基，R2為氫，R3為羥基，R4為甲氧基；或化合物2的R,為甲基，R2為氫，R3R4均為羥基。實(shí)施例1化合物1-2的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)生產(chǎn)菌的發(fā)酵培養(yǎng)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取曲霉B-F-2(A^岬!7tosp.B-F-2)適量，接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。取斜面培養(yǎng)4天的曲霉B-F-2(A印wgZ/^sp.B-F-2)適量，接種到裝有120mL培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH7.0]的500mL錐型瓶中，在28°C、120轉(zhuǎn)/分鐘條件下?lián)u床培養(yǎng)48小時(shí)，獲得曲霉B-F-2G4印erg"/wsp.B-F-2)的種子培養(yǎng)液。將該種子培養(yǎng)液按10%接種量分別接種于裝有300毫升生產(chǎn)培養(yǎng)液[培養(yǎng)基組成(克/升)麥芽糖3.0，酵母膏3.0，蛋白胨5.0，葡萄糖20.0，pH7.0]的1000mL三角燒瓶中，進(jìn)行為期25天24。C的靜置生產(chǎn)發(fā)酵，獲得菌絲體和發(fā)酵液。2浸膏的獲得用棉布將菌絲體和發(fā)酵液分離。將菌絲體用丙酮浸提三次，減壓濃縮至不含丙酮，所得水層用等體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液減壓濃縮，得粗浸膏。發(fā)酵液減壓濃縮為四分之一體積后，用乙酸乙酯萃取三次，合并菌絲體和發(fā)酵液的浸膏，共15.0克。3化合物的分離精制浸膏(22.0克)用氯仿-甲醇(9:l)混合溶劑溶解后，加70克200-300目硅膠H(青島海洋化工集團(tuán)公司產(chǎn)品)拌樣，減壓除去溶劑后，用硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，分為16個(gè)流份。Fr-ll(2克，氯仿-甲醇8:2洗脫物)，再經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮6:4洗脫產(chǎn)物再經(jīng)HPLC，以甲醇-水6:4洗脫得化合物1(60mg)2(llmg)?；衔?黃色固體，分子式C22H21N07，HRESI-MSm/z:412.1380[M+H]+，計(jì)算值:412.1396.UVXmaxnminMeOH:337,284，253.IRvmaxcm-1(KBr):3479,3271,3137,2975，2936,1735'1684，1619，1568，1508，1412，1162,1108,803'754,691，667.'H及13CNMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表1?；衔?無(wú)色固體，分子式C21H19N07,HRESI-MSm/z:428.2434[M+H]+，計(jì)算值428.2437。IRvmaxcm-1(KBr):3190,2980，1727,1691，1604，1554,1494,1244,1096，807'790'689。及'SCNMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。表1600MHz'Hand150MHz13CNMRspectraldataof1inCDCl.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2600MHz'Hand150MHz13CNMRspectraldataof2inCDC13<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例2抗腫瘤活性的測(cè)試1實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法被測(cè)樣品溶液的配制測(cè)試樣品為上述實(shí)施例1中分離精制的純品化合物1-2。準(zhǔn)確稱(chēng)取適量樣品，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供活性測(cè)試。細(xì)胞系及細(xì)胞的繼代培養(yǎng)活性測(cè)試采用P388，A-549，HL-60和BEL-7402細(xì)胞系。各種細(xì)胞均用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37°C通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。細(xì)胞增殖抑制活性測(cè)試方法(MTT法)本發(fā)明采用MTT法，測(cè)試評(píng)價(jià)了被測(cè)試樣品對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制活性?；罴?xì)胞線(xiàn)粒體中脫氫酶能夠代謝還原黃色的溴化3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑?yàn)樗{(lán)紫色的不溶于水的formazan,formazan的多少可通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定其吸收度求得。由于formazan的量與活細(xì)胞數(shù)成正比，所以可根據(jù)吸收度求出活細(xì)胞的數(shù)目，從而了解藥物抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞的能力?；钚詼y(cè)試時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P388，A-549,HL-60和BEL-7402細(xì)胞，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升5xl0"個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔200微升接種于96孔板中，在37。C下培養(yǎng)24小時(shí)后，每孔加入2微升不同濃度的樣品溶液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。然后加入2C^L含MTT的IPMI-1640溶液(5mg/L),再培養(yǎng)4小時(shí)，移出15(HiL培養(yǎng)液后加入150nLDMSO溶解formazan，在540nm處測(cè)定其吸收度。按照IR%=(OD如對(duì)照-OD附,,)/OD如對(duì)照X1009fc式計(jì)算每個(gè)濃度下的細(xì)胞增殖抑制率(IR%)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果化合物1-2的細(xì)胞增殖抑制活性表3.化合物1-2對(duì)P388，A-549,HL-60和BEL-7402細(xì)胞的抑制率12<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3結(jié)論化合物l-2對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物來(lái)源的癌細(xì)胞具有抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明的式I化合物可作為抗腫瘤劑(即抗腫瘤藥物)用于腫瘤的治療，也可作為細(xì)胞增殖抑制的低分子生物探針用于探索生命現(xiàn)象本質(zhì)的生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中。權(quán)利要求1.式I或式II化合物式I其中式IR1、R3、R4為氫、甲基、氨基、羥基、烷氧基、酰氧基或酰氨基；R2為氫、烴基、羥基或?；?.權(quán)利要求1所述的式I化合物，其中式I化合物為化合物1，其中R,為甲基，R2為氫，R3為羥基，R4為甲氧基；或化合物2，其中R,為甲基，R2為氫，&114均為羥基。3.權(quán)利要求2所述式I化合物的制備方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)曲霉B-F-2C4，^ksp.B-F-2),獲取含有上述式I化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分離純化出式I化合物1和化合物2。4.權(quán)利要求3所述的制備方法，其中將所述發(fā)酵物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿-甲醇為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，氯仿-甲醇8:2的洗脫物，再經(jīng)正相硅膠柱層析，石油醚-丙酮6:4洗脫產(chǎn)物再經(jīng)制備HPLC分離純化，以甲醇-水60:40洗脫得式I化合物1，2。5.權(quán)利要求1所述的式I化合物在制備抗腫瘤藥物中的用途。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述抗腫瘤藥物是指所述的式I化合物在制備細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑中的用途。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述抗腫瘤藥物是指所述的式I化合物在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖藥物中的用途。1.式I或式II化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>全文摘要本發(fā)明涉及新螺內(nèi)酰胺類(lèi)化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明用從海洋樣品中分離得到的曲霉B-F-2(Aspergillussp.B-F-2)生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)新穎的上述類(lèi)型的化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類(lèi)化合物可作為細(xì)胞增殖抑制劑或抗腫瘤劑。文檔編號(hào)C12R1/66GK101113151SQ20061010365公開(kāi)日2008年1月30日申請(qǐng)日期2006年7月26日優(yōu)先權(quán)日2006年7月26日發(fā)明者睿劉,方玉春,朱偉明,朱天驕,顧謙群申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué);中國(guó)大洋礦產(chǎn)資源研究開(kāi)發(fā)協(xié)會(huì)