專(zhuān)利名稱(chēng):一種骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域,是一種制備神經(jīng)修復(fù)移植用的種子細(xì)胞---骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù):
細(xì)胞移植的研究為神經(jīng)系統(tǒng)疾患如腦和脊髓的創(chuàng)傷、腦缺血、帕金森病等退行性疾病的治療以及周?chē)窠?jīng)的修復(fù)帶來(lái)了廣闊的前景,細(xì)胞移植以及組織工程周?chē)窠?jīng)的關(guān)鍵是種子細(xì)胞,目前研究的種子細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞等等。眾多的細(xì)胞中,神經(jīng)干細(xì)胞是最佳的選擇,神經(jīng)干細(xì)胞的主要來(lái)源為胚胎或成體中樞神經(jīng)組織,但胚胎組織的應(yīng)用涉及到倫理學(xué)和免疫排斥等問(wèn)題;而成體神經(jīng)干細(xì)胞的位置較深,取材困難,不易獲得,且從活體組織中獲得神經(jīng)干細(xì)胞具有一定的危險(xiǎn)性,用于移植的神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源受到了限制。
近年來(lái),也有學(xué)者利用化學(xué)誘導(dǎo)劑、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)節(jié)苷脂等將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為類(lèi)神經(jīng)細(xì)胞。由于誘導(dǎo)分化涉及到部分有毒的化學(xué)試劑,如β-巰基乙醇、二甲基亞砜等,已有學(xué)者對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化提出異議(J Neurosci Res,2004,77(2)174-191,192-204)。誘導(dǎo)分化對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了非生理狀態(tài)的干擾,誘導(dǎo)分化后細(xì)胞的穩(wěn)定性、安全性都是值得考慮的。
Kucia M等(Leukemia,2005,19(7)1118-11127.)的研究認(rèn)為骨髓中含有組織定向干細(xì)胞,并采用密度離心、免疫磁珠和熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)(fluorescence-activated cell sorting,F(xiàn)ACS)從小鼠骨髓中篩選出了神經(jīng)組織定向干細(xì)胞(neural tissue-committed stem cells,NTCSCs,詳見(jiàn)Leukemia,2006,20(1)18-28.)。此方法需首先從骨髓中分離單核細(xì)胞,在此基礎(chǔ)上通過(guò)免疫磁珠正選法篩選出Sca-1+的細(xì)胞,通過(guò)FACS技術(shù)再逐步篩選出Sca-1+/Lin-/CD45-的細(xì)胞,這一方法得到的NTCSCs在體外培養(yǎng)可以形成神經(jīng)球,細(xì)胞純度較高。NTCSCs作為種子細(xì)胞為腦、脊髓等神經(jīng)系統(tǒng)疾患和創(chuàng)傷的修復(fù)和治療提供了廣闊的應(yīng)用前景。但此方法需有專(zhuān)門(mén)的免疫磁珠離心儀、FACS儀,價(jià)格昂貴,國(guó)內(nèi)多數(shù)實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有這種條件;此方法操作程序復(fù)雜,易污染,且骨髓需要量大,這在臨床實(shí)際應(yīng)用中有一定的困難。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、骨髓需要量少、神經(jīng)組織定向干細(xì)胞得率高的培養(yǎng)方法。
本發(fā)明培養(yǎng)方法包括制備骨髓單核細(xì)胞,骨髓單核細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、增殖,以及骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選純化及增殖。其關(guān)鍵在于首先使混合在骨髓單核細(xì)胞中的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞在含15%~20%血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長(zhǎng)、增殖,然后在含2%B27、1%N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液中篩選純化、增殖培養(yǎng)。骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞在含2%B27、1%N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng),并形成細(xì)胞球。因此,只要選取細(xì)胞球進(jìn)行培養(yǎng),就能達(dá)到篩選、純化的目的。
具體培養(yǎng)方法如下1、制備骨髓單核細(xì)胞按常規(guī)從新鮮骨髓細(xì)胞中分離得到骨髓單核細(xì)胞。例如取清潔級(jí)SD大鼠雙側(cè)股骨及脛骨,按常規(guī)經(jīng)NycoPrepTM分離液分離單核細(xì)胞層,得骨髓單核細(xì)胞。
2、細(xì)胞的增殖培養(yǎng)采用含15%~20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將上述骨髓單核細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶中,在飽和濕度、37℃、5%CO2孵育培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7~10天,待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)至瓶底的80%~90%時(shí),用0.25%的胰酶消化,再用上述含血清的DMEM培養(yǎng)液終止其消化。
3、骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選、純化上述培養(yǎng)瓶中細(xì)胞經(jīng)15%~20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化后,換用含2%B27、1%N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液,機(jī)械吹打,制成細(xì)胞懸液,在飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5~6天后,見(jiàn)由4~16個(gè)數(shù)量不等的細(xì)胞形成的細(xì)胞球出現(xiàn),經(jīng)鑒定為骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞細(xì)胞球。待細(xì)胞球生長(zhǎng)到數(shù)十個(gè)細(xì)胞時(shí),在鏡下挑選其中一個(gè)較大的細(xì)胞球,用移液槍頭吸出機(jī)械吹打,用上述DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行單克隆培養(yǎng),待細(xì)胞再次形成較大的細(xì)胞球時(shí),機(jī)械吹打,反復(fù)多次進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增,并轉(zhuǎn)入較大的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),就可得到單克隆生長(zhǎng)的足量的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
實(shí)施例1制備大鼠骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞1、制備骨髓單核細(xì)胞清潔級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量200g,斷頭處死,取雙側(cè)股骨及脛骨,剔除表面肌肉,剪去雙側(cè)骨骺,DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,200目濾網(wǎng)過(guò)濾,在離心管中預(yù)置3mlNycoPrepTM分離液,將6ml的骨髓細(xì)胞濾液輕輕置于NycoPrepTM(AXIS·SHIE/D公司)分離液上,勿混合,以2600r/min離心20min,輕輕吸取分離液上方的單細(xì)胞層,加DMEM培養(yǎng)液5ml,以1700r/min離心10min,反復(fù)沖洗3次,得到的細(xì)胞沉淀即為骨髓單核細(xì)胞。
2、細(xì)胞的增殖培養(yǎng)將上述骨髓單核細(xì)胞用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3.5ml制成細(xì)胞懸液,以5.6×107/ml的細(xì)胞密度接種于25ml的塑料培養(yǎng)瓶中,在飽和濕度、37℃、5%CO2孵育培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10天后,貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)程度達(dá)90%,采用0.25%的胰酶消化1分鐘,用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。
3、骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選、純化上述培養(yǎng)瓶中細(xì)胞經(jīng)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化后,換用含2%B27(GIBCO公司)、1%N2(GIBCO公司)、20ng/mlbFGF(CytoLab公司)、20ng/mlEGF(GIBCO公司)的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液5ml,機(jī)械吹打貼壁細(xì)胞,使細(xì)胞重懸,細(xì)胞密度為8.6×106個(gè)/ml,在飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6天后出現(xiàn)細(xì)胞球,經(jīng)鑒定為骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。待細(xì)胞球生長(zhǎng)到數(shù)十個(gè)細(xì)胞時(shí),在鏡下挑選其中一個(gè)較大的細(xì)胞球,用10μl的移液槍頭吸出放入培養(yǎng)皿中,機(jī)械吹打,用上述的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行單克隆培養(yǎng),待再次形成的各細(xì)胞球較大時(shí),機(jī)械吹打,反復(fù)3次擴(kuò)增細(xì)胞,3周后轉(zhuǎn)入25ml的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),得到單克隆生長(zhǎng)的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的鑒定方法按常規(guī)經(jīng)免疫組織化學(xué)法(詳見(jiàn)朱長(zhǎng)庚主編,《神經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)》)檢測(cè),細(xì)胞球呈CXCR4(Santa Cruz公司)陽(yáng)性、Nestin(Santa Cruz公司)陽(yáng)性、CD45(Santa Cruz公司)陰性,將細(xì)胞球置入6孔培養(yǎng)板中,加入0.8ml含2%B27(GIBCO公司)、1%N2(GIBCO公司)、20ng/mlBDNF(GIBCO公司)的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液,細(xì)胞球貼壁、分化,細(xì)胞呈多突起樣、7天后檢測(cè)分化的細(xì)胞,神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白NSE、NF-200(SantaCruz公司)陽(yáng)性,確認(rèn)此細(xì)胞球即為骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞球。
本發(fā)明培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便,成本低廉,只需取少量骨髓就可以培養(yǎng)得到足夠量的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞,細(xì)胞可來(lái)源于自體,避免了免疫排斥和倫理學(xué)等問(wèn)題。且培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)有毒試劑,不僅有利于環(huán)保,也有利于干細(xì)胞的穩(wěn)定及移植的安全。本發(fā)明為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的細(xì)胞移植治療及周?chē)窠?jīng)的修復(fù)提供了一種移植用種子細(xì)胞的來(lái)源途徑。
權(quán)利要求
1.一種骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,包括制備骨髓單核細(xì)胞,骨髓單核細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、增殖,以及骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選純化及增殖;其特征在于骨髓單核細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)、增殖采用的是含15%~20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選純化、增殖采用的是含2%B27、1%N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液;骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞在含2%B27、1%N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng),并形成細(xì)胞球,選取細(xì)胞球進(jìn)行增殖培養(yǎng),即得所需的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
2.按權(quán)利要求1所述的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法,其特征在于具體步驟如下(1)制備骨髓單核細(xì)胞按常規(guī)從新鮮骨髓細(xì)胞中分離得到骨髓單核細(xì)胞;(2)細(xì)胞的增殖培養(yǎng)將上述骨髓單核細(xì)胞,用含15%~20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶中,在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底時(shí),用0.25%的胰酶消化,再用上述含血清的DMEM培養(yǎng)液終止其消化;(3)骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的篩選、純化上述培養(yǎng)瓶中細(xì)胞經(jīng)15%~20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化后,換用含2%B27、1%N2、20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,在5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞球出現(xiàn),取一個(gè)較大的細(xì)胞球,用上述DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液繼續(xù)培養(yǎng),待形成眾多的細(xì)胞球時(shí),按上述方法將細(xì)胞球再次制備成細(xì)胞懸液,如此反復(fù),骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞得以增殖,即可得到足夠量的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1或2所述培養(yǎng)方法得到的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。
4.權(quán)利要求3所述骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞在制備神經(jīng)修復(fù)制劑或組織工程神經(jīng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物組織工程技術(shù)領(lǐng)域,是一種制備神經(jīng)修復(fù)移植用種子細(xì)胞——骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。本發(fā)明只需少量骨髓,分離到骨髓單核細(xì)胞后經(jīng)增殖培養(yǎng),再用含2%B27、1%N2、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF的DMEM/F12無(wú)血清培養(yǎng)液進(jìn)行篩選、純化、培養(yǎng)就可制得足夠量的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便、成本低廉,得到的骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞穩(wěn)定、安全,且可來(lái)源于自體,避免了免疫排斥和倫理學(xué)等問(wèn)題。本發(fā)明為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的細(xì)胞移植治療及周?chē)窠?jīng)的修復(fù)提供了一種移植用種子細(xì)胞的來(lái)源途徑。
文檔編號(hào)C12N5/08GK1974764SQ20061011943
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月12日
發(fā)明者張志英, 張傳森, 任叢莉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)