專利名稱：檢測生物樣品中的人乳頭瘤病毒的系統(tǒng)、方法和組合物的制作方法
檢測生物樣品中的人乳頭瘤病毒的系統(tǒng)、方法和組合物 相關申請的交叉參考
本申請要求2005年1月14日提交的美國臨時專利申請60/644,374的優(yōu)先權，該申請全文納入本文作為參考。授權信息
本發(fā)明的工作部分得到了 Michigan Life Sciences Corridor (MEDC-410)、 Michigan Tri-Technology Corridor、 NIH (R21 DK69877、 R21 DK070237、 CA104830 和CA94328)、 NIH Head/Neck Cancer SPORE (1 P50 CA97248)和MDRTC Cell and Molecular Biology Core (DK20572)資金的資助。政府對本發(fā)明享有一定權利。發(fā)明領域
本發(fā)明涉及檢測和管理生物樣品中的微生物制劑領域。 發(fā)明背景
最近的研究表明，人乳頭瘤病毒("HPV")與宮頸癌、頭/頸癌、肛門癌以 及血吸蟲病相關的膀胱癌有重要聯(lián)系。宮頸癌和肛門癌幾乎一律與HPV感染有關。 研究最近公布的報道發(fā)現，HPVDNA在頭和頸腫瘤中的普遍率達到35n/。。更最近， 一些研究者采用定量PCR( "QPCR")在253個腫瘤樣本的大量研究中證實了這些發(fā) 現，他們在25%的樣本中檢測到HPV DNA。 HPV也與肛門發(fā)育異常和癌癥有關。 其它研究者還發(fā)現，接近50%的血吸蟲病造成的膀胱癌通過原位雜交而具有HPV DNA。
HPV類型16和18屬于'高風險'病毒類型，因為它們的存在與腫瘤前損傷 和癌癥有關。相反，'低風險'類型通常是HPV類型6和11，它們通常與良性損傷有 關。HPV的致癌潛能主要是由于兩種病毒癌蛋白E6和E7。 HPV類型之間致癌潛能 的差異是由于E6和E7蛋白的種類特異性差異。致癌HPV毒株的E6蛋白顯示與p53 蛋白相互作用并促進其通過依賴于遍在蛋白的途徑降解。類似地，E7癌蛋白與視網
膜細胞瘤(Rb)蛋白復合并將其激活。p53和Rb都是重要的腫瘤抑制基因，它們的產 物調節(jié)細胞周期、管理DNA修復過程、并參與程序化細胞死亡或凋亡。HPV會破 壞這些腫瘤抑制蛋白，從而導致發(fā)生突變和細胞永生。
已經在研究檢測血清DNA以發(fā)現異常癌細胞基因組的技術以作為一種可 能的癌癥的分子檢測方法。盡管一些研究者發(fā)現TaqMan定量PCR法可檢測一些頭/ 頸癌和宮頸癌患者血清中的HPVDNA，但用這種技術檢測到的血清和其它生物部位 的HPVDNA的量不足以用作臨床工具用于大多數對象。
目前的限制的一個例子是與目前的標準HPV檢測法Digene檢驗[l]有關的 問題，其中包括
1.Digene檢驗與已知致病類型之外的HPV類型非特異性交叉反應[2]。因 此用Digene檢驗不可避免地會得到假陽性；
2. Digene檢驗要求至少數千個HPV分子以得出陽性結果[l]。因此當血清 和/或血液中存在小量分子時就無法進行篩檢；和
3. Digene檢驗不顯示宮頸ThinPrep中發(fā)現的是何種HPV類型。這點是重 要是，因為如果無法鑒別非致病類型HPV產生的信號則這種類型的HPV會產生假 陽性結果。
從這些限制以及本領域的其它缺點開來，仍舊需要檢測和鑒定用現有方法 無法檢測其水平的生物樣品中各種HPV的的系統(tǒng)、方法和組合物。發(fā)明概述
本發(fā)明包括但不限于為檢測、治療和/或管理癌癥和發(fā)育異常而檢測、鑒 定和定量生物樣品中低至單拷貝水平的HPV的系統(tǒng)、方法和組合物，所述生物樣品 包括但不限于哺乳動物體液和宮頸刮樣。在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括更 加靈敏的質譜技術，該技術可鑒定單個HPV序列、提高HPVDNA檢測的靈敏度、 并提供血清和/或外周血HPV-DNA與幾類腫瘤更頻繁相關的證據。因此，本發(fā)明包 括能夠從外周血和血清中篩檢作為HPV相關的殘余腫瘤和發(fā)育異常標志的HPV DNA的系統(tǒng)、方法和組合物。
精通本領域的技術人員通過閱讀下面的附圖和詳細描述將了解本發(fā)明的 其它方面。
附圖簡述
本發(fā)明現通過舉例方式參照附圖進行描述，圖中


圖1顯示了在一次如本發(fā)明所述反應中篩檢13種不同HPV類型的質譜結果。
圖2概括了本發(fā)明一些實施方案所述的流程圖，但不限于此。
圖3A-D分別顯示了腫瘤(3A)、 Pap-陽性標本(3B)、 HC2-陽性標本(3C)和 Pap-陰性標本(3D)中的HPV滴度。發(fā)明詳述
在一些實施方案中，本發(fā)明包括同時分析和測定腫瘤或發(fā)育異常組織中與 癌癥或發(fā)育異常相關的一種或多種類型的致病性HPV的系統(tǒng)、方法和組合物，但不 限于此。采用本發(fā)明，可對低至100個或更少的HPV拷貝數量進行這種分析和測定， 這種方法比美國食品藥品管理局("FDA")目前批準用于檢測HPV的需要1000-5000 個拷貝的測試法更加靈敏[l]。本發(fā)明還能檢索給定的HPV單個序列而提高了靈敏 度，能夠檢測低至laM(在一些實施方案中，5微升PCR體積中只有1個分子)。這 種高靈敏度能夠檢測包括血液和血清在內的其它生物樣品中的病理性HPV。
此外，本發(fā)明包括的系統(tǒng)、方法和組合物能以目前所用某些方法無法達到 的靈敏度、特異性和定量性能詳細描述與給定腫瘤相關的HPV類型[l]，目前的方法 檢測時采用許多探針的組合但不能定量。
在一些實施方案中， 一旦根據本發(fā)明確定了一種或多種HPV類型，本發(fā) 明還能靈敏且特異地篩檢生物樣品(包括但不限于哺乳動物的體液)中單拷貝水平的 HPV，但不限于此。這種單拷貝水平的靈敏且特異的篩檢之前是不可能做到的。本 發(fā)明揭示了一種之前未知的自然狀態(tài)，即血清和/或血液中存在HPV均與發(fā)育異?；?癌癥相關，而正常對象則不。這種篩檢沒有出現參考文獻[4]中所述的假陽性，從而 使得這種篩檢非常適合鑒定發(fā)育異?；虬┌Y。
在一些優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包括在一次檢測中測定生物樣品中存在 的致病性HPV的類型和數量的系統(tǒng)、方法和組合物，但不限于此。在一些實施方案 中，本發(fā)明包括構建用于質譜測定系統(tǒng)的檢測一種或多種高風險或中等風險HPV類 型的探針。可采用DigeneThinPrep檢驗[l]鑒定方法選擇這種高風險或中等風險HPV 類型，Digene ThinPrep檢驗是目前FDA批準用于分析宮頸刮樣中HPV的檢驗法。本發(fā)明的一些實施方案在Digene檢驗的13種HPV類型中增加了另外6種類型可引 起宮頸癌和肛門癌的高風險性HPV[5， 6]。這種檢測可在低至至少100aM(約300個 分子)時進行，其數量級比需要數千個HPV分子以得到陽性結果的目前的Digene法 靈敏許多[l]。此外，本發(fā)明能夠確定腫瘤或發(fā)育異常、或者外推至直接從腫瘤獲得 的材料(例如，宮頸ThinPrep)中存在何種類型的HPV。最后，本發(fā)明的一些實施方案 包括與已有的非定量檢測相比能進行定量分析的系統(tǒng)、方法和組合物，但不限于此。 將這種定量檢測法與本發(fā)明所述的確定HPV類型的方法聯(lián)用具有明顯的臨床效用 [6]，從而可通過不同解剖學部位的HPV拷貝數來反映臨床嚴重性。
根據一些實施方案，通過靈敏且特異的質譜測定檢測腫瘤或細胞提取物中 一種或多種類型的致病性HPV的存在，但不限于此([8-10];圖l)。通常，本發(fā)明的 質譜測定包括通過PCR擴增在HPV中發(fā)現的短核苷酸片段；消化引物和核苷酸；并 用合適的雙脫氧核苷酸延伸"嵌套式(nested)"質譜測定引物。這樣導致只有當給定 的HPV模板來自第一次PCR反應時才在質譜測定延伸序列中加入單個雙脫氧核苷 酸。
根據一些實施方案，進行篩檢的方式是，如果某給定的HPV類型為陽性， 則用能產生特征性信號的可鑒別探針單獨檢測每個樣品中一種或多種致病性HPV類 型， 一個例子是，19種致病性HPV類型之一。這使得我們能夠篩檢總共19種HPV 類型，表示為最初篩檢出13種核心類型(圖1; HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59和68[1])外加有可能致病的HPV類型23、 26、 53、 66、 73和 82[5]。
—些實施方案還包括所有人類基因組DNA單拷貝片段的探針(例如但不 限于e^5-2基因內含子單拷貝片段的探針)。除了在至少低至100阿摩爾(aM- 1(T18M) 的水平進行高靈敏度的篩檢，本發(fā)明能夠確定與給定的腫瘤或發(fā)育異常相關的HPV 的類型。此外，還可以確定HPV序列的拷貝數，這也可提供有用的預后數據[7]。
在一些實施方案中，如果上述第一次篩檢呈陽性，可僅用第一次篩檢中呈 陽性的HPV類型的探針通過更加靈敏的質譜測定檢測體液中HPV的存在。這可用 之前的篩檢方法完成，從而得到給定的腫瘤或發(fā)育異常中存在的HPV類型的細節(jié)。 用這種技術能夠通過檢測血液和/或血清篩檢腫瘤的復發(fā)。
在單拷貝水平對血清和/或血液中的HPV進行靈敏檢測得到了意想不到的 且之前無法得到的結果
1.根據本發(fā)明，可通過篩檢血清和/或血液來檢測宮頸發(fā)育異常。采用基 于ragM朋的技術以前未能證明這一點，但基于r"gM。w的技術會產生誤差，導致大 部分正常情況產生異常結果[4]。相反，本發(fā)明顯示了意想不到的且之前無法得到的 結果大多數宮頸發(fā)育異常情況與血清和/或血液中的HPV有關。為進行比較，正常 對照和成功治愈的宮頸發(fā)育異常的血清和血液樣品中不含這種HPV。在本發(fā)明之前， 無法正確評價血清和血液各自的信息資料。推測這是由于這些疾病有著不同的發(fā)病 機制；血清所含的HPV來自細胞裂解，而血液所含的HPV來自循環(huán)的完整腫瘤細 胞被吞噬的腫瘤細胞(不完全消化)；
2.根據本發(fā)明，出乎意料地發(fā)現血吸蟲病相關的膀胱癌均與HPV有關。 之前認為這些癌癥中只有一半是HPV導致的[ll]。采用本發(fā)明的單拷貝水平的更加 靈敏的分析還發(fā)現，血清(26/27)和尿沉積物(15/24)都可用于診斷。盡管27例中有26 例存在血清HPV，但不存在血液HPV;
3.采用本發(fā)明，還顯示血液和血清分析都可用于診斷和監(jiān)測由HPV造成 的頭/頸癌的治療。之前，雖然在腫瘤中常存在高水平的HPV時這種分析可行，但不 能檢測到較低水平使得血液和血清分析不能用于血清檢測呈陰性的大多數病例[3]。 相反，本發(fā)明的檢測顯示，大多數與HPV有關的腫瘤可在血清和/或血液中被檢測出。 這可延伸到各種致病性HPV類型，證明這種篩檢具有臨床價值，因為在臨床上沒有 意義的HPV類型不會干擾該分析；和
4.采用本發(fā)明，顯示所有檢測的正常對照呈陰性，其中包括所檢測的所有 40種正常尿沉積物、所有27種正常血清樣品、所有20種正常血液樣品和所有9種 胎盤。
在一些實施方案中，本發(fā)明包括一種足夠靈敏且特異的檢測低至單個分子 水平的兩(2)階段篩檢方法，但不限于此。第一階段包括篩檢具有一組所有19種致病 性HPV類型的腫瘤或發(fā)育異常細胞。 一旦已知HPV的類型，該類型可用來以更高 靈敏度篩檢相關體液，所述靈敏度高于同時釆用所有19種序列時的靈敏度。其結果 是，以升高的靈敏度和特異性篩檢體液提高了臨床效用。在這種篩檢中，血清和血 液獨立提供信息，反映出這些液體中產生HPV的發(fā)病機制不同。血清中存在的HPV 是由于攜帶有HPV的異常細胞裂解。血液中存在HPV是由于存在循環(huán)腫瘤細胞和/ 或異常細胞的吞噬作用，檢測到未完全消化的HPV序列可證明這一點。因此，有用 的信息來自對血液和血清的獨立檢測。本發(fā)明包括可用于所有體液(例如，尿液、腦脊液、汗液、精液、淚液等)的系統(tǒng)、方法和組合物。
實施例
提供了本發(fā)明一些實施方案的以下實施例，但本發(fā)明不僅限于這里所述的 那些實施方案。
根據一些優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明包括采用襯質輔助激光解吸電離-飛行 時間("MALDI-TOF")質譜("MS")來進行定性和定量基因表達分析，該方法組合 采用競爭性PCR、弓l物延伸反應和MALDI-TOF MS(通常見圖2)，但不限于此。在 被認為含有分離自生物樣品的HPV DNA的樣品中加入約100 nt長的合成的寡核苷 酸(競爭者)，競爭者的序列與感興趣HPV的DNA序列的一部分相同或基本匹配，但 大致位于感興趣序列中間的一個堿基除外。在一些實施方案中，以已知濃度加入競 爭者。在存在正向和反向引物時共同擴增競爭者和感興趣的DNA。 PCR之后用本領 域的一般技術人員已知的方法除去過量的dNTP和引物，這種方法的一個例子是酶消 化和適當洗滌，但不限于此。然后用延伸引物和不同ddNTP的組合(一個例子是G 和C)進行堿基延伸反應。延伸引物恰在突變位點之后雜交并在競爭者和DNA中有 區(qū)別地加入兩種ddNTP堿基中的至少一種，從而得到兩種具有不同分子量的寡核苷 酸產物。 一種典型的分子量窗約為5，000-8，500道爾頓(Da)，如果兩種寡核苷酸的差 別大于約20Da則MALDI-TOFMS可以方便地加以區(qū)分。根據本發(fā)明，這些差異延 伸產物的質量相同，例如，如果已知加入的競爭者序列的濃度，則可根據MALDI-TOF MS得到的它們的比例確定它們的濃度。在一些實施方案中，如文中進一步的描述， 通過根據需要在堿基延伸引物的5'末端附加間隔物分子可進一步獲得所需分子量間 隔，但不限于此。
制備樣品和DNA的定量。在進行腫瘤活檢時從癌癥患者分離腫瘤、血清、 外周血和尿沉積物樣品。血清和/或外周血分離自未接觸HPV的正常對照、從血吸蟲 病患者(發(fā)生或未發(fā)生膀胱癌)、從手術除去腫瘤的血吸蟲病相關的膀胱癌患者、從頭 /頸癌患者、以及從宮頸癌或肛門癌或宮頸發(fā)育異?；颊摺Ｄ虺练e物分離自血吸蟲病 相關的膀胱癌患者和未患膀胱腫瘤的對照對象。尿沉積物是將尿液中Beckman J2-21M離心機中以約8,000 rpm離心約IO分鐘后分離出的團塊。胎盤在正常出生后 獲得。用ZR基因組DNAI試劑盒(Zymo Research Corp， Orange， CA)分離組織、外 周血和尿沉積物的DNA。用ZR血清DNA分離試劑盒從約0.3-0.5 ml血清分離DNA。
宮頸樣品收集于ThinPr印PreservCyt溶液(Digene Corporation ， Gaithersburg, MD)。報告患者結果之后使樣本與患者的標識符無關，取出等份并通 過質譜PCR法檢驗。我們將約5 ml ThinPrep溶液與ZR血清DNA分離試劑盒中的 約10 fil Zymo珠一起旋轉以分離其中的DNA。將該珠加入樣品中并加入約4倍體積 的基因組裂解緩沖液(Zymo Research Corporation^混合物在約4"C翻轉過夜。按照制 造商的說明從所述珠制備DNA。最終得到小量(約20pl)洗脫緩沖液的懸浮液。然后 按照制造商的說明對樣品進行Digene HC2和Roche分析(包括反向線性印跡(reverse lineblotting))[l、 12]。然后按照本發(fā)明以盲試方式對樣品進行質譜分析。
為確定所給樣品中DNA的量，我們在Bio-Rad iCyder上對eW5-2基因中 的獨特內含子進行Tfl《M^7熒光QPCR[13]。我們采用的引物為 5，-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-3， (SEQ ID NO. 129) 禾口 5，-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3， (SEQ ID NO. 129) ， ragMaw探針為 5，-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-3， (SEQ ID NO. 130)。我們采用根據經驗得到的 值，即7.7><103個單倍體基因組等價物/^63-2探針的熒光單位。
構建簡并rfl^Afaw HPV DNA探針。在病毒的LI區(qū)構建簡并HPV DNA PCR探針[13]。 GP5+和GP6+引物來自RodaHusman等[15]。 MY18和MY1019引物 來自Nelson等[16]。為構建簡并r^Maw[13]組，我們將序列組合以產生含有2個外 部引物(基于GP5+和GP6+)和探針(基于MYI8和MY1019)的TagMa"組。解鏈溫度 (Tm)用 Qiagen 的寡核苷酸計算器(oligo calculator)獲得 (http:〃www.operon.com/oliqos/toolkit.php )。
引物1(GP5十類似物):將下述4種引物中的每一種等量組合以構建0 5+ 類似物GCACAGGGACATAATAAT (SEQ ID NO. 131) Tm = 53.8。C GCACAGGGTCATAATAAT (SEQ ID NO. 132) Tm.=. 53.8°C GCCCAGGGACATAAT (SEQ ID NO. 133) Tm.=. 53.8°CGCCCAGGG丁CATAAT (SEQ ID NO. 134) Tm.=. 53.8。C 。
引物2 (GP6 +類似物)GAATATGATTTACAGTTTATTTTTC (SEQ ID NO. 135)Tm = 53.1。C〖0041]探針將等體積的MY1019類似物1與MY1019類似物2混合以構建最 終的MY1019探針。最終的探針用等量的MY18類似物和MY1019最終類似物構建。
MY18類似物CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC (SEQ ID NO. 136)Tm = 62.8。C
MY1019最終類似物從1/1的下述混合物構建
MY1019類似物1: GTGGTAGATACCACACGCAGTA (SEQ ID NO. 137) Tm.=. 63.4。C
MY1019類似物2: GTGGTAGATACCACTCGCAG丁A (SEQ ID NO. 138) Tm.=. 63.4°C
由Biosearch按照我們的要求合成引物和探針。探針在5，-末端用熒光素 6-FAM標記，在3'-末端用Black Hole Quencher 1標記。我們檢測了分別攜帶HPV-16 或HPV-18序列(美國模式培養(yǎng)物保藏所)的質粒對簡并引物-探針的收集。采用簡并探 針，我們用任何一種質粒獲得了等量的擴增。
PCR擴增簡并TaqMan探針。盡管所有正常血清都含有少量正常的基因 組DNA[16]，我們用Tfl《Ma^ eA5-2基因組DNA探針證實血清DNA制備自所有樣 品[B]。用類似地方法，我們證實DNA分離自所使用的所有其它樣品。在約95。C變 性約5分鐘后，采用在約95'C變性約15秒并在約60'C退火約30秒的兩步驟過程對 進行40輪擴增。在約95。C變性約5分鐘后，我們采用的在Perkin-Elmer 7700 型機器上對HPV DNA進行QPCR擴增的條件被優(yōu)化為一兩步驟過程，即在約52°C 進行約60秒(以退火和延伸)并在約95'C變性約15秒，共40輪。我們還對許多樣品 進行這一過程約55輪以與質譜-PCR法最后的擴增步驟所用的55輪相匹配。比約52 t:的正常退火和延伸溫度低是因為我們采用的是簡并探針。為用簡并HPVDNA探針 進行r^7kfa"反應，各值重復4次。樣品在Perkin Elmer 7700型機器上通過ra《A/a" 法[13]分析。DNA測序由密歇根大學核心測序機構(University of Michigan Core sequencing facility)完成。
HC2法的應用。HC2反應包括與13種高風險HPV類型中每一種的DNA 互補的RNA探針。用靶向RNA:DNA雜合體的捕獲抗體檢測HPV DNA與任何互補 RNA探針之間的雜交[l]。在最初的檢測中，相對輕單位(RLU)截止率》10的樣本被 認為是陽性。RLU截止率<約0.8的樣本被認為是陰性。RLU截止率約為0.8-9.99的 樣本需要重新檢測。如果再次測得的RLU截止率》1，則認為樣品是陽性。再次檢 測不呈陽性的不確定的樣本被排除在該研究之外。將樣品分成2組(HC2(+)和 HC2(-));匿名并用MassARRAY技術研究過量的TMnPrep材料。
另一種分析HPV類型的方法。如文中所述，我們通過Roche法即反向線 性印跡分析區(qū)分所選樣品的HPV類型[12]。或者，我們采用HPV Ll區(qū)的簡并引物 來檢測可用這些簡并引物擴增的最豐富的HPV序列[15、 17]。這種方法對除HPV52 之外的所有13種致病性HPV類型有效(在我們的檢測中，HPV52和簡并引物之間的 差異過大而無法允許引物結合)。
測量人類基因組DNA。為確定所給樣品中DNA的量，我們在Bio-Rad iCycler上對eAS-2基因中的獨特內含子進行7^Ma"熒光QPCR[12]。引物為 5'-ACCTTCTCTTGACCTTTCAGAATATGT-3' (SEQ ID NO. 139) 禾口 5'-AGAGAGTCTTGGCCCTTTCCA-3' (SEQ ID NO. 140) ， r叫Ma"探針為 5，-AGAGGGCCCTCTGCCTGCTGC-3， (SEQ ID NO. 141)。我們得到的值為7.7><103 個單倍體基因組等價物/e^5-2探針的熒光單位。我們還將該內含子的探針摻入22 種探針的混合物，這22種探針通過質譜儀分析(表l)而不再需要在iCycler上進行單 獨分析。
分析PCR的定量質譜法。根據一些實施方案，本發(fā)明包括一多步驟過程， 該過程包括在載有基質的硅芯片陣列上進行實時競爭性PCR(rcPCR)、引物延伸和 MALDI-TOFMS分離產物，以檢測少至若干個最初的分子[8]，但不限于此。合成競 爭性核苷酸模板(例如，約100 nt)以與HPV靶序列相匹配以進行PCR，但競爭者中 的一個堿基突變除外，該突變是在合成期間引入的。然后可采用引物延伸反應并在 MALDI-TOF MS上通過質量(用道爾頓表示)區(qū)分產物以區(qū)分單個堿基變化和HPV耙 等位基因，如SNP基因分型所做的那樣[10]。優(yōu)選在PCR反應中加入已知量的競爭 性模板從而可通過滴定產生標準曲線以確定靶DNA的量，但不限于此。當靶等位基 因和競爭性模板等位基因的峰面積相等時，這兩種分子的濃度比約為1:1，代表了反 應中靶DNA的量。在這種示例性實施方案中，質譜分析非常特異，可以低至約20 道爾頓的分辨率鑒定給定的引物延伸產物。因此任何污染產物必需具有這種特定的 大小才會產生假陽性信號。存在的這種內標物(競爭性模板)也證實，PCR所需的酶發(fā) 揮了作用，且樣品被純化不含PCR抑制劑。
用實時競爭性PCR和DNA的質譜分析確定HPV的類型和量。根據一些 實施方案，通過用Primer3軟件(http:〃frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3 www.cgi) 從各種HPV毒株的E6區(qū)首先衍生出PCR和延伸引物序列而設計了 13重(13-plex) HPV測定法，但不限于此。然后用這些序列來定義輸入序列的邊界以用于
MassARRAY測定法設計者軟件v3.0。 (Sequenom， Inc., San Diego， CA) [8]。采用 這種方法，我們能夠將13種單獨的高風險HPV類型各自加以區(qū)分(圖l)[l]。正向和 反向引物、延伸引物和競爭者序列描述于表2。 一些實施方案還包括采用為此目的定 制的我們詳細描述的不同軟件進行更加強的篩檢。采用這種軟件，我們構建了由22 種序列類型構成的探針，其中包括最初的13種HPV類型、6種額外的HPV類型、 能夠定量給定等分量中人DNA的量的基因組DNA單拷貝探針、以及淋病奈瑟菌 (A/Wwer/af go"orr/zoefl)禾口沙目艮衣原體(C7z/awycZ/a Zrac/zomato)的探針(參見例如表 1A-1C)。第一次PCR反應的溫度約為6(TC，第二次引物延伸反應的溫度約為58'C。
已經描述過PCR的多重rcPCR質譜分析的條件[18、 19]。反應開始于制 備96孔主平板，用MultiMek機器人從主平板建立384孔反應平板。對各HPV毒株 而言，4個孔中給定的競爭者的濃度為0 aM(阿摩爾=10—18M)， 4個孔中給定的競 爭物濃度為1 aM。然后定量測定對于給定的HPV序列呈陽性的反應物以得到各種陽 性HPV的量。我們用10 aM、 100 aM和1 fM (飛摩爾=10—15 M)競爭者定量反應物。 如果反應物的陽性過強而無法滴定，則將標本稀釋100倍并重新滴定。
由于MassARRAY不是一種均勻的(homogeneous)測定法，在建立反應物 時需要注意。我們用兩種機器人(最初的PCR之前和之后)來建立反應物并使污染程 度最小。每塊平板中的常規(guī)對照顯示，正常樣品呈陰性，證明這些技術可有效防止 污染。這里報告的所有值代表至少8個獨立數據點的分析結果。
對照樣品。我們檢測了組織、血清、外周血和尿沉積物的一系列對照。組 織對照為正常胎盤的DNA樣品。血清和外周血對照為從已知未接觸過HPV的匿名 對象的血清和外周血分離的DNA樣品。尿沉積物對照為正常志愿者的DNA樣品。 在這里報道的所有病例中，通過7b^kfa"與eAS-2對照探針的反應呈陽性，證實存 在QPCR質量的DNA。在所有4個孔中對照樣品對簡并HPVDNA探針通常呈陰性， 極少情況下在1/4的孔中呈陽性。因此，我們僅保守地將在》3/4的孔中反應的樣品 認為是陽性的。
采用上文在Perkin-Elmer7700型上分析樣品所作的定義，能與該簡并HPV DNA探針反應的正常尿沉積物為0/40、正常血清樣品為0/27、正常外周血樣品為 0/20、胎盤(正常組織樣品的對照)為0/9。此外，用質譜-PCR系統(tǒng)進行的更加靈敏的 分析還顯示，任何這些正常樣品中都不存在HPVDNA。
采用高度保守的反向引物(GP6 +類似物)作為DNA測序的起始引物，我測序確定HPVDNA的類型。以下是我們所觀察到的
在所有對照組織中簡并探針適當呈陰性；和
我們看見血吸蟲病相關的膀胱癌(表3)、頭/頸癌(表4)和宮頸癌(表5)中存 在HPVDNA的證據。這與提及這種關系的大量文獻相一致。
僅作為另一個實施例而非限制本發(fā)明可能的實施方案，在第一階段，用本 發(fā)明的質譜測定法就13種致病類型[l]中的一種篩檢腫瘤或宮頸ThinPrep以在一次反 應中單獨鑒定13種不同致病性HPV類型中的任何一種。產生HPV的E6區(qū)序列， 該序列是HPV轉化細胞所必需的。致癌HPV毒株的E6蛋白與p53蛋白相互作用而 促進其通過依賴于遍在蛋白的途徑降解[20]。產生導致人癌癥的13種HPV類型每一 種E6區(qū)的序歹U(http:〃hpv-web.lanl.gov/)，并通過至少一種已有方法一Digene篩檢法 了解該序列[l;表2]。
在一些實施方案中，對序列進行調節(jié)以獲得良好的分子量間隔，而無需不 適當改變引物的大小(這可能會導致改變PCR的最佳溫度)，但不限于此。我們采用 該方法用表1A-1C詳細描述的22種探針來進一步篩檢。在一些實施方案中，采用不 超過15個毗連堿基，并用"百搭"堿基脫氧肌苷代替脫氧鳥苷、脫氧腺嘌呤或脫氧 胸苷。這一概念源自與人類基因組大小的關系，因此，16種或更多堿基提供的置換 的數目(約416)大于人類基因組的大小。用這種實施方案，我們發(fā)現取代內部脫氧肌 苷對PCR條件或PCR測定的性能沒有影響。我們用于22種靶序列的引物列于表1。 因此，在這些實施方案中，我們未釆用>15個核苷酸的序列段，否則這會與人類基因 組中的給定序列有關(序列必需具有這種長度才能為人類基因組所特有)。因此，在一 些實施方案中，所用毗連序列太小而無法為人類基因組所特有。
此外，在一些實施方案中，也可按照需要在MassEXTEND引物(例如，表 1B和1D)的5'末端附加間隔物分子以獲得所需的分子量間隔，MassEXTEND引物是 用于所用質譜測定法的內部引物[8]，但不限于此。這樣可使我們的引物序列獲得所 需間隔而不對引物長度造成巨大改變(這會影響PCR條件)，從而使所有引物組的最 佳PCR條件維持在相同條件以使PCR最佳化?？偠灾?，如一些實施方案所用，采 用脫氧肌苷和修飾劑的方法產生了一組適用于這種方法的引物。
在一些實施方案中，對序列進行選擇以使與未延伸的引物、野生型基因、 以及19種不同HPV類型中每一種的內部競爭者相對應的序列間的分子量重疊都不 小于約20nt。我們還加入了沙眼衣原體和淋病奈瑟菌的探針，因此最終這種技術可檢測并定量19種HPV類型，得出要分析多少基因組DNA的標準，并確定是被衣原 體或淋病奈瑟菌感染?？傊?，這種系統(tǒng)將能區(qū)分3"2 = 66種不同峰中的每一種(通 過質譜區(qū)分的峰為未延伸的引物；未延伸的引物+野生型基因序列(未延伸的引物 + C或G，取決于基因的下一個核苷酸)；以及未延伸的引物+內部競爭者序列(未 延伸的引物+ 0或(:，取決于競爭者的下一個核苷酸)。這些區(qū)別依據質譜方法可區(qū) 分相差約20個道爾頓的兩種分子量的能力。
圖1顯示了按照本發(fā)明對13種致病性HPV類型進行質譜測定篩檢得到的 曲線，這13種致病性HPV類型是在Digene檢驗[l]中篩檢出的(HPV 16、 HPV 18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV39、 HPV45、 HPV51、 HPV52、 HPV56、 HPV58、 HPV59、 HPV68)。所顯示的13個不同的峰對應于13種不同高風險HPV類型(HPV 16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59和68[3])中每一種的MassEXTEND 引物[16]的分子量。沒有峰的線條表示此處為MassEXTEND競爭者和基因產物(表現 為總共可能有3><13 = 39個不重疊的峰；為簡單起見，只顯示了 13個未延伸的峰)。
圖1說明本發(fā)明能夠檢測和區(qū)分各種HPVDNA序列。在一些實施方案中， 我們對各個約100nt的HPVE6序列、基因組DNA標準、沙眼衣原體、以及淋病奈 瑟菌釆用了一組合適的外部引物和合適的未延伸的引物MassExtend序歹iJ(約20nt)。 合成了對應于各個約100nt序列的寡核苷酸，其中有一個堿基被改變(C—G，或G— C)。例如，用市售的寡核苷酸合成儀(例如，由Integrated DNA Technologies (IDT)提 供)完成合成。用與19種不同HPV類型、基因組DNA標準、沙眼衣原體以及淋病 奈瑟菌中每一種的內部競爭者序列相對應的序列合成長約100 nt的寡核苷酸。對于 這22種序列中的每一種，合成與這些約100nt長的寡核苷酸的右端和左端相對應的 約20 nt的引物(在引物上添加標簽以消除對圖1所示質譜曲線的干擾)。最后合成質 譜測定延伸引物，其中包含直接毗連C或G的序列(不同情況下內部競爭者導致分別 摻入G或C)，從而有可能用這一個核苷酸差異區(qū)分野生型基因序列和內部競爭者序 列。
在一些實施方案中，野生型基因序列和內部競爭者的引物序列相同。野生 型基因序列和內部競爭者之間的唯一差別是毗連未延伸的引物序列的一個核苷酸。 由于這種序列相同性，可以相同的功效擴增野生型基因序列和內部競爭者。其結果 是，本發(fā)明可用己知量的內部競爭者的擴增來確定擴增的野生型基因序列的量。
在一些實施方案中，未延伸的引物、未延伸的引物+鳥苷以及未延伸的
引物+胞嘧啶(3x22種引物=總共66種引物)的分子量都應在約5000-8500道爾頓 之間，且相互之間的最小間隔為約20道爾頓，但不限于此。同時，引物的長度受限 于對于它們在較小溫度范圍內結合和作為模板的要求，以使它們在相同溫度下都被 擴增。為實現這些目的，我們開發(fā)了將不同內部間隔物分子附加到未延伸的引物的5' 末端的新方法。
對于一些實施方案，用于第一次PCR擴增的擴增引物示于表1A，但不限 于此。用于PCR介導的延伸的引物示于表1B。競爭者的序列示于表1C。我們采用 的間隔物詳細描述于表1D。給出了HPV類型16、 18、 23、 26、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 73和82的引物序列。我們還包括用基因 erZ^-2的內含子測量所有輸入的基因組DNA，以及檢測2種婦科侵入感染(沙眼衣原 體和淋病奈瑟菌)。還對引物序列進行了檢測，發(fā)現可對它們進行操作。其結果是， 本發(fā)明包括同時篩檢19種HPV類型、測量總基因組DNA、并檢測是否被沙眼衣原 體和淋病奈瑟菌感染。
該實施方案的方法可與本文所述的本發(fā)明其它方面一起應用來測定血清 和/或血液中存在的包括但不限于導致腫瘤發(fā)生的HPV的種類和含量。由于當篩檢所 選HPV探針時篩檢血清和/或血液的技術最靈敏，因此可通過篩檢腫瘤和/或ThinPrep 來確定是否存在HPV，如果存在，是何種HPV類型。然后用該HPV類型以最大效 率篩檢血液和/或血清；如果存在幾種HPV類型，則可單獨篩檢各種類型。本發(fā)明的 該實施方案成功利用了腫瘤或ThinPrep中存在的濃度高于血清和/或血液的HPV。 一 旦確定了 HPV的類型則可以最大靈敏度篩檢血清和/或血液以確定腫瘤中發(fā)現的 HPV類型。
如上所述，Digene檢驗不能揭示宮頸ThinPrep中發(fā)現的HPV的類型。在 一些實施方案中，將本發(fā)明用于血液和/或血清時重要的是，當僅篩檢一種已知的致 病性HPV類型而非全面篩檢所有13種致病性HPV類型時的靈敏度最高。由于癌癥 和發(fā)育異常病例的血清和血液中通常只存在極少HPVDNA，使用者可能優(yōu)選一次僅 用一種HPV探針進行這種篩檢以提高靈敏度，即便是采用本發(fā)明的這種靈敏的質譜 測定分析[3]。
本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案通過以下幾點克服了 Digene反應的缺點，但不限于此
1.利用了質譜測定篩檢的多種功能；
2.準確診斷，由于各種HPV類型特異性反應產物的分子量精確地相差士 20道爾頓而不會與相關HPV序列發(fā)生交叉反應，因此對某給定HPV類型的序列具 有特異性。事實上，本發(fā)明的質譜測定檢測能區(qū)分Digene篩檢可檢測的13種致病性 HPV類型中的每一種，而不會與其它HPV病毒發(fā)生交叉反應(圖1);
3.在低至一個分子水平(此水平上我們可看到預期的泊松變化(Poissonian variation))時本發(fā)明的質譜測定呈陽性；以及
4.本發(fā)明的質譜測定反應能夠區(qū)分宮頸ThinPrep中存在何種HPV類型。 由于當篩檢所選HPV探針時篩檢血清和/或血液的技術最靈敏，因此可通過篩檢腫瘤 和/或ThinPrep來確定是否存在HPV，如果存在，是何種HPV類型。然后用這種特 定類型的HPV以最大效率篩檢血液和/或血清。這種篩檢成功利用了宮頸刮樣 ThinPrep或腫瘤中存在的濃度高于血清和/或血液的HPV。 一旦確定了 ThinPrep或腫 瘤中HPV的類型則可以最大靈敏度篩檢血清和/或血液以確定腫瘤中發(fā)現的HPV類 型。
在一些優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明的第二階段(階段2)， 一旦鑒定了 HPV 的類型，則可用在階段1中鑒定的HPV類型篩檢體液(如血清和血液)或復發(fā)腫瘤或 重復ThinPrep，但不限于此。可繼續(xù)進行這些研究以確定HPV的類型和持續(xù)是否可 用于預后， 一個例子是確定之前就該疾病進行過治療的個體中是否存在殘余的腫瘤， 但不限于此。如果沒有本發(fā)明就不能進行這種研究，因為即便采用7b^kfa"技術進行 分析，對血清和/或血液中HPV的分析也不夠靈敏或特異[3]。相反，我們目前的研 究證明用本發(fā)明的這種靈敏且特異的質譜測定技術研究血清和血液方便易行。
另一個實施例是，在一些包括質譜測定系統(tǒng)的實施方案中，在所有24種 血吸蟲病相關的膀胱腫瘤中檢測到了HPV16DNA(表3的右欄)，但不限于此。在所 有這些樣品中，除了一個樣品，匹配的血清呈陽性。在另外3例未能得到腫瘤DNA 的病例中，血清對HPV 16 DNA呈陽性。在大多數但不是所有血吸蟲病相關的膀胱 癌病例的尿沉積物中檢測到HPV 16DNA。這些數據表明血吸蟲病相關的膀胱癌中存 在HPV16感染。比較看來， 一些實施方案中實時ra《Mfl"QPCR(表3的左欄)不如質 譜測定分析(表3的右欄)靈敏。這些病例的血液(棕黃層)在實時QPCR和質譜測定中 均呈陰性(數據未顯示)。證明存在HPVDNA的異常讀數用黑體表示。阿摩爾(aM)-10—18M;飛摩爾(fM)二10"SM;我們用于PCR的體積為5nl， laM相當于約3個分 子。將本發(fā)明的質譜測定結果(表3的右欄)與之前的原位雜交數據[10]以及標 準的40輪ra^kfa"數據(表3的左欄)進行比較，顯示本發(fā)明比原位雜交或7l^W^7 QPCR更加靈敏。表3左欄的數據缺乏再現性(數據未顯示)，說明操作&^1^"技術 時受限于其靈敏度且不夠精確。此外，r^Ma"技術不能定量區(qū)分腫瘤、血清和尿沉 積物。也試用了 55輪的Ta《Ma" RT-QPCR能否模擬一些實施方案的質譜測定方法。 但觀察到信噪比沒有改善，這更加說明了 7i^M"M技術的局限性。相反，本發(fā)明得到 的表3右欄所示的數值與預期的發(fā)現相符，即腫瘤(樣品)陽性比血清和/或尿沉積物 (樣品)的陽性更強。
該實施例中，本發(fā)明的質譜測定實施方案保持了特異性和靈敏度。采用本 發(fā)明，在所檢測的所有血吸蟲病相關膀胱腫瘤樣品(24/24)、這些病例的幾乎所有血 清樣品(26/27)以及這些病例的大多數尿沉積物樣品(15/24)中檢測到了 HPV 16 DNA。 但這些病例的血液不含可檢測的HPVDNA(數據未顯示)。
在相關實施例中，顯示存在HPV DNA不僅僅是血吸蟲病。檢測了10例有血吸蟲病同時有一些在臨床上無法證實的膀胱癌的病例。這些病例中的8例血清中沒發(fā)現HPV 16或HPV 18 DNA; 2例發(fā)現了 HPV 16 DNA。這說明HPV DNA與血吸蟲病本身無關，而與患膀胱癌的血吸蟲病病例中腫瘤的發(fā)展有關。還說明，采 用本發(fā)明有助于臨床數據提示有但無法確診的可疑病例的診斷。
還發(fā)現血清HPV 16 DNA在腫瘤切除后迅速消失。檢測了手術切除膀胱 癌后2周內7名血吸蟲病對象的血清。在所有7個病例血清中都未檢測到HPV 16 DNA。雖然未獲得手術前的血清，但腫瘤的HPV 16均呈陽性特征(表3)表明，HPV 有可能存在但已被手術根除。
還研究了在診斷頭/頸癌時獲得的相匹配腫瘤、血液和血清樣品中是否存 在HPVDNA。各份樣品的原發(fā)性腫瘤位置是已知的。也嘗試了用T^Mm熒光QPCR 擴增分析但未能檢測到血液和血清中含有HPVDNA，這與其它學者發(fā)現ra《iWa"技 術在臨床應用上不夠靈敏[3， 21]相符。相反，本發(fā)明的質譜測定分析產生的數據總 結于表4。證明存在HPV16DNA的讀數用黑體表示。
腫瘤、血清和血液分離自頭/頸癌病例(所有對象不一定能獲得所有的樣品 類型；所缺的樣品用空白表示)。對這些腫瘤、血液和血清樣品進行質譜測定以確定 是否存在HPV16DNA;用HPV18DNA探針沒有樣品呈陽性，雖然我們做的DNA 測序顯示另一例頭/頸腫瘤樣品為HPV 18 DNA陽性。證明存在HPV DNA的異常讀數用黑體表示。阿摩爾(aM)二 1(T18M;飛摩爾(04)= 10—15M。
對于頭/頸通道前部(例如，舌、扁桃體)的腫瘤和后部(例如，喉、聲門上 區(qū))的腫瘤存在著強烈偏差，前者對于HPV呈陽性，而后者呈陰性。這與之前的報道 相一致[22-29]。我們發(fā)現只有3例口腔腫瘤(3/16)對HPV 16 DNA和HPV 18 DNA呈 陰性(陰性口腔腫瘤仍可能為其它HPV類型陽性)。在IO例(咽下部腫瘤)中我們僅發(fā) 現1例腫瘤位于口腔后并對HPV 16呈陽性。在腫瘤呈陽性并可分析血液和血清的9 個樣品中，有腫瘤對HPVDNA呈陽性的情況，其中所述HPV DNA僅存在于血清中、 僅存在于血液中、或同時存在于血清和血液中。
宮頸癌幾乎一律與HPV有關[16， 22]。用本發(fā)明的質譜測定來檢測宮頸 腫瘤和發(fā)育異常中的13種高風險人乳頭瘤病毒(HPV)序列，我們發(fā)現
1.實際上，所有腫瘤都具有13種致病性HPV類型中的一種，且致病性 HPV類型的含量持續(xù)降至0。在發(fā)育異常但實質上不存在腫瘤的病例中發(fā)現了非致 病性HPV，這支持只有有限的HPV類型才引起宮頸癌。質譜測定獨有的鑒定低至幾 個病毒水平的能力使我們能夠檢測其它方法無法實現的甚至很低水平的病理性HPV 類型；
2.在宮頸腫瘤中，HPV滴度通常低于1HPV分子/單倍體腫瘤基因組，比 在發(fā)育異常中看到的最高值低好幾個數量級。這與"襲擊并逃離(hit and run)"模型 一致，因此HPV感染是產生發(fā)育異常所必需的，但不足以造成腫瘤發(fā)生；
3.實際上，所有病理異常性(CIN1或2)宮頸發(fā)育異常都顯示13種致病性 HPV類型中的一種。我們通常發(fā)現不同滴度的多種致病性HPV類型。被多種致病性 HPV感染在病理異常性發(fā)育異常中比在腫瘤中更加常見(72。/。比17%)。此外，采用其 它方法，我們在發(fā)育異常中經常檢測到以較高滴度存在的其它HPV類型。然而，我 們在腫瘤中未檢測到這些類型，說明腫瘤發(fā)生是由一組通過我們的質譜測定發(fā)現的 有限的HPV類型導致的；和
4.通過目前臨床上釆用的Digene HC2法檢測其它HPV類型會產生假陽 性。所述質譜測定減輕了這一問題。
目前檢測宮頸疾病的方法主要取決于以下兩種方法1.用Dr. G. N. Papanicolaou開發(fā)的'Pap'涂片檢測剝落的宮頸細胞的細胞學異常[30];和2.檢測 HPV感染[l]。細胞學的主要缺點是觀察者間(inter-observer)可靠性有問題、靈敏度有 限(《85%)以及依賴于經過高級訓練的個體來進行檢驗[30， 31]。實際上，只有通過
重復篩檢才認為Pap涂片的靈敏度適用于臨床目的。因此，定期隨訪個體的流失以及甚至不能重復用細胞學Pap檢驗來檢測所有宮頸發(fā)育異常的個體都影響到篩檢人群中宮頸癌的發(fā)病率判斷。
另一種細胞學方法是直接檢測HPV， HPV是實際上造成所有宮頸癌的直 接原因[l ， 5， 32]。目前通過FDA批準的HC2檢驗TM(Digene Corporation, Ga他ersburg， MD) [l]或Roche的一套診斷試驗[35]檢測HPV，前者使用種類特異性雜交探針的混 合物來檢測與宮頸惡性腫瘤有關的13種高風險HPV類型以及采用簡并寡核苷酸的 PCR[15， 33， 34]，后者檢測HPV然后測定存在的HPV的類型[l]。這些方法的主要 缺點是靈敏度、特異性和定量能力有限。靈敏度受到限制是因為若要用這些檢測方 法檢測必須有約102-103個分子[1， 13]。特異性受到限制是由于HC2與非高風險HPV 毒株的交叉反應。約10%的情況是由于與非高風險HPV毒株交叉反應[2][2， 36]。 此外，HC2檢驗不易于準確定量。HC2的定量區(qū)分受到限制是由于很少標準化成總 細胞含量，檢測的可變性受到限制，且當存在多個HPV序列時無法確定造成所觀察 到的信號的HPV類型的量。采用Roche的技術來解決這些限制要求多種類型的檢測， 這這使得檢測非常難以進行。由于這些困難，定量變得非常復雜且很少進行。
相反，我們公開的發(fā)明包括一種監(jiān)測宮頸發(fā)育異常的基于質譜測定的方 法，從而種類特異性區(qū)分及宮頸HPV的定量最終可與血液和血清檢測相結合。在我 們的一些工作中，我們采用與FDA批準的2法所檢測的相同的13種HPV類型作為 高風險毒株(HPV16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59和68)[1]。引 物序列和分子量以及競爭者序列示于表2。
采用一些實施方案的質譜測定，當用13種HPV類型的探針進行研究時， 我們發(fā)現35種血液對照樣品中完全不存在HPV(數據未顯示)。這證明這種高度靈敏 的技術不會產生假陽性背景。我們的數據說明以下幾點首先，我們觀察到樣品具 有13種致病性HPV類型中唯一的一種，因此在質譜測定中HPV類型之間不會發(fā)生 交叉反應。當存在多種HPV類型時沒有發(fā)現與其它HPV類型一致的HPV類型也支 持了這一點。第二，在這些最低水平觀察到的泊松變化證實，質譜測定達到的靈敏 度在單個分子水平。第三，相比1^2陽性損傷(32% = 36/113)和腫瘤(17%= 13/78)， 在具有CIN MI的發(fā)育異常中更常見的是被這13種類型中的多種HPV感染(72% = 70/97)。第四，每個細胞的病毒滴度在發(fā)育異常中高于腫瘤中(腫瘤的值一律為每個 單倍體基因組等價物小于1個HPV拷貝(圖3A)，而在Pap陽性發(fā)育異常中該值為每
個單倍體基因組等價物約1(^個HPV拷貝(圖3B)，在HC2陽性發(fā)育異常中為每個單 倍體基因組等價物約1(^個HPV拷貝(圖3C))。因此，樣品中最豐富HPV序列的中 值為，對HC2陽性樣品約為8,4x10°，對CIN I/II樣品約為3.0x10",對腫瘤約為 2.9xl(T2。因此，腫瘤中的HPV滴度中值比發(fā)育異常中低l-2個數量級。相比，大多 數具有正常P叩涂片的女性樣品不具有HPV或僅有較低HPV滴度(圖3D)。第四， 實際上所有宮頸腫瘤中存在13種致病性HPV類型中的一種(81/82;表5)。在所有病 例中，致病性HPV的量連續(xù)改變降至0拷貝/單倍體基因組。
這包括只有質譜測定才足夠靈敏以檢測最低滴度的HPV類型的腫瘤樣 品。我們通過質譜測定檢測了非常低量(低至約laM=單個分子)的HPV，這用其它 靈敏度稍低的技術是不可能的。通過由材料和方法(表5)中所述的簡并引物引導的 DNA測序證實，實際上所有腫瘤都攜帶13種致病性HPV類型中的一種。除了由于 用于DNA測序的分子數不夠而導致DNA測序失敗，我們通常證實的質譜測定結果 中，相關HPV類型為13種高風險HPV類型中的一種。
通過質譜測定檢測的HPV類型和通過簡并DNA測序檢測的類型之間有 極好的一致性。由于這兩種技術的目標不同因此而有分歧， 一些不同之處是可以預 期的。 一例中，用質譜測定結果僅有約2 aM HPV 31時，用DNA測序檢測到HPV 73， 則是一種在13種致病性HPV類型中未發(fā)現的類型(但在我們新篩檢的19種HPV類 型當中)。因此，這種腫瘤具有兩種HPV類型，而致病性HPV 31低于DNA測序的 檢測限。還有3例中質譜測定和DNA測序結果不一致，但在每例中通過DNA測序 只鑒定出屬于13種致病性HPV類型的HPV類型。
對病理性宮頸發(fā)育異常進行質譜測定、反向線性印跡和簡并DNA測序。 我們比較了質譜測定和反向線性印跡的結果[12]以確定病理異常樣品的發(fā)育異常階 段是處于宮頸上皮內瘤CINI或CINII。對于49個樣品，當質譜測定技術證實13種 致病性HPV類型中的一種以至少約40 aM的濃度存在時，質譜測定和反向線性印跡 結果完全一致(數據未顯示)。然而，當HPV量較低時這種一致性被打破了(表6)。質 譜測定分析能夠檢測含量小于約40 aM的13種致病性HPV類型中的一種，而此時 DNA測序和反向線性印跡法都無法檢測13種高致病性HPV類型中的一種或檢測其 它類型的HPV(表6)。我們通過簡并DNA測序證實了該結果，簡并DNA測序顯示 了反向線性印跡可看見的HPV類型或不同的非致病性HPV類型(反向線性印跡和 DNA測序測得的HPV類型的譜線僅部分重疊，這就解釋了為什么這兩種技術可得
到不同的答案；然而，這兩種技術可用于所有13種致病性HPV類型(但不能用簡并 測序法良好擴增的HPV52除外))。注意，與對照血液樣品(不存在HPV)或Pap陰性 樣品(大多少樣品中不存在HPV(圖3D))不同，用其它不十分靈敏的方法無法得到這 種低滴度結果。這強烈說明了這些之前未重視的低滴度致病性HPV的重要性，它們 可能代表了以前曾經顯著但現在正在消失的HPV感染的逐漸消失痕跡。這與大多數 HPV感染在6個月至2年后被清除的觀察結果一致?？傊@說明了獲得縱向滴度 的重要性，如果可以在時間上跟蹤它們，則可以避免許多對自身已局限化腫瘤病灶 實施根治性外科手術。
HC2陽性發(fā)育異常的質譜測定、反向線性印跡和簡并DNA測序。對于病 理異常性宮頸發(fā)育異常樣品，質譜測定比反向線性印跡、簡并DNA測序HC2更加 靈敏。當鑒別出的致病性HPV類型至少有約50個拷貝時，質譜測定和反向線性印 跡法之間有極好的一致性，當鑒別出的致病性HPV類型至少有約500個拷貝時，質 譜測定和簡并DNA測序法之間有極好的一致性，而當鑒別出的致病性HPV類型至 少有約5000個拷貝時，HC2和質譜測定之間有極好的一致性。在125例通過質譜測 定分析的拷貝數大于約5000的HC2陽性樣品中，有98例中所有這三種技術有良好 的一致性(表7)。在剩余的27例致病性HPV滴度小于約5000個拷貝的HC2(+)病例 中，反向線性印跡和/或簡并DNA測序法檢測的HPV類型不同于通過我們的質譜測 定檢測的13種高致病類型(表8)。通過HC2鑒定的發(fā)育異常中可能有很大比例為假 陽性[2， 36]。
通過DNA測序未檢測出HPV的樣品可能是含有濃度相似的多種HPV 類型從而無法獲得單一 HPV類型的DNA序列的樣品，含有的HPV類型與引物差別 太大而無法用簡并引物擴增的樣品，和/或所含的HPV量不足以產生擴增產物的樣!=1叩o
我們發(fā)現，在18例宮頸腫瘤中具有可檢測的HPV 16 DNA的病例中有17 例在血清和/或血液中也有可檢測的HPV 16 DNA。在腫瘤對HPV 16 DNA和HPV 18 DNA呈陰性的3例中均未在血清和/或血液中檢測到HPV 16 DNA或HPV 18 DNA。 與我們在頭/頸癌中所觀察到的相同，在大多數宮頸癌病例中血液和血清結果不同。 在腫瘤中呈陽性的18個樣品中8個在血清和血液中均呈陽性；5個在血清中呈陽 性但在血液中呈陰性；4個在血液中呈陽性但在血清中呈陰性；l個在血清和血液中 均呈陰性。
然后根據本發(fā)明檢測宮頸發(fā)育異常女性的血清和血液樣品。通過采用簡并探針的ra Ma"分析在這些女性的血清或血液中均為檢測到HPVDNA。相反，采 用質譜測定分析的一些實施方案在一小部分宮頸癌(表9)或高度發(fā)育異常(表IO)個體 的血清和/或血液中檢測到小量HPV 16 DNA。5例高度宮頸發(fā)育異常中有4例對HPV 16DNA呈陽性。還在1名具有不明意義的非典型鱗狀上皮細胞的對象和另一名被診 斷有I級外陰上皮內瘤和低度宮頸發(fā)育異常的對象的血清中檢測到HPV 16 DNA。在 沒有活動性病灶的個體血液或血清中未觀察到HPV16DNA。此外，在成功切除先前 高度發(fā)育異常或原位癌后血清或血液HPV16DNA的質譜測定檢測一直為陰性(病例 4、 5、 6、 15、 16、 17、 22、 24、 27、 44)。這些病例在切除發(fā)育異常宮頸前沒有獲得 樣品?；几叨葘m頸發(fā)育異常但血清或血液無HPV DNA的1名對象(病例l)可能已感 染了我們那時所用的HPV 16或HPV 18探針無法檢測的其它HPV類型。
我們然后延伸了這些發(fā)現以確保我們可以測定宮頸發(fā)育異常個體血液和 /或血清中除16或18外的其它HPV類型。如表11所示，當宮頸發(fā)育異常中存在病 毒時大部分血液和/或血清樣品對HPV呈陽性。這包括一些HPV類型不是16或18 的病例。這強調了臨床上應采用能檢測低至單個分子水平的高靈敏技術監(jiān)測血液和/ 或血清。
這說明了包括本發(fā)明一些實施方案但不限于該實施方案可能范圍的靈 敏、特異性定量質譜測定的用途。我們的工作證明了以下重要觀點，即腫瘤中存在 的HPV少于發(fā)育異常，在不存在HPV或者可能存在其它不大致病或非致病性HPV 類型的許多腫瘤和發(fā)育異常中可能存在小量致病HVP。具體地說，基本上在所有腫 瘤中都發(fā)現了致病性HPV，其含量繼續(xù)演變降至0，這支持了以下假說，即一組有 限的致病性HPV類型受另一類型HPV的損害而導致腫瘤生長非常緩慢。最后，只 有采用這種靈敏的技術才能檢測到血液和/或血清中非常低滴度的HPV。因為這種發(fā) 現只發(fā)生在發(fā)育異?；虬┌Y人群中，當切除發(fā)育異常宮頸后隨之消失，應該說這代 表了一種檢測這些病灶和/或監(jiān)測切除這些病灶的技術的治療效果的極佳方法。
根據本發(fā)明的一些實施方案，實現在這種HPV水平洞察力的技術發(fā)展包 括能以高度靈敏且特異的方式檢測不豐富的HPV序列，但不限于此。因此，本發(fā)明 實現了診斷單個HPV拷貝所需的靈敏度和特異性，這是第一次。因此，本發(fā)明包括 達到這種靈敏度和特異性水平的系統(tǒng)、組合物和/或方法，并能夠檢測之前無法完成 的事件，包括發(fā)現宮頸發(fā)育異常與血液和/或血清中可檢測的HPV相關，而通常情況
下沒發(fā)現與血液和/或血清中可檢測的HPV相關。這就避免了采用不當的rfl^kfaw技術，該技術如用于檢測血清HPV常產生假陽性[4]和假陰性(我們未公開的結果)。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點是可定量、靈敏和特異性，從而能夠測定腫瘤負荷， 因為很多或大多數侵襲性腫瘤推測可能與較高的HPV負荷有關，而較高的HPV負 荷反映為在宮頸樣品(按總DNA標準化后)[7]、血清和/或血液中有較高水平的HPV。 此外，確定血清和/或血液是否有病毒感染在臨床上有益。例如，腫瘤發(fā)生血源播散 可能與血液中的病毒增加有關，而腫瘤裂解增加可能與血清中病毒增加有關?？傊?， 質譜測定技術更加靈敏，同時能提供全部特異性?？蓪⑦@種用途擴展到許多處于發(fā) 生這些腫瘤風險的人群，和以前曾診斷為腫瘤且目前正在觀察中的個體。
優(yōu)選的本發(fā)明的實施方案包括通過以下過程檢測人類患者中上述癌癥的 系統(tǒng)、方法和組合物獲得所述患者的生物樣品，所述生物樣品例如但不限于血液、 血清或尿液樣品以及其中兩種或多種的組合；按照技術檢測樣品中HPV基因組的拷 貝數，所述技術包括但不限于這里所述的那些檢測靈敏度低于任何目前批準的檢驗 法如Digene檢驗的技術；并計算已知體積或其它濃度值的樣品中HPV基因組的拷貝 數，如本發(fā)明所述，樣品中存在低至單拷貝水平的HPV表明該患者可能患有癌癥。 一個例子是，雖然Digene檢驗不能檢測每份低于5000個拷貝的血清樣品，而本發(fā)明 能檢測低至單拷貝水平，但不限于此。
本發(fā)明包括在非常靈敏的水平進行檢測以完成這里所述的之前不可能的 觀察的系統(tǒng)、組合物和/或方法。因此，本發(fā)明包括發(fā)現體液中的小量HPV與癌癥或 發(fā)育異常相關，這種相關性然后可通過除去腫瘤或發(fā)育異常而消除。實際上，發(fā)現 宮頸發(fā)育異常會在血清和血液中產生可檢測的異常，但正常對照的血清和血液呈陰 性，這是全新的概念。根據本發(fā)明，測定血液診斷頭/頸癌和宮頸腫瘤的想法也是新 的發(fā)現，以前的權利要求采用的篩檢血液技術靈敏度不夠高而不能避免假陰性，和/ 或特異性不夠高而不能避免假陽性。以前檢測血清HPV所用的技術不夠靈敏和/或不 夠特異。釆用本發(fā)明更加靈敏且特異的質譜測定系統(tǒng)現在可以檢測大多數血吸蟲病 相關的膀胱腫瘤、宮頸腫瘤和頭/頸腫瘤中的HPV，這些腫瘤都與有限而可檢測的血 清HPV水平有關。
本發(fā)明包括以下發(fā)現，即當采用足夠靈敏且特異的檢測低至單拷貝水平 的分析方法對尿沉積物、血清和/或血液進行非常靈敏且特異的分析時會發(fā)現，宮頸 癌和發(fā)育異常中HPV呈陽性(盡管在非常低數量時由于泊松分布固有的不確定性會帶來不可避免的限制；但進行多次分析可克服)。此外，在宮頸發(fā)育異常病例中可在 血清和/或血液中檢測到HPV;當發(fā)育異常被根除后HPV也隨之消失。總之，本發(fā) 明能夠測定處于發(fā)育異常或癌癥危險期或正在接受治療的對象中是否存在HPV相關 的癌癥。
所有參考文獻通過引用全文納入本文，這就如同在本文中全文列出。
盡管已經具體展示了本發(fā)明并參考上述優(yōu)選實施方案和其它實施方案進 行了描述，但精通本領域的技術人員應該理解，在實踐本發(fā)明時可對這里所述的本 發(fā)明的實施方案進行各種改變而不背離如以下權利要求所定義的本發(fā)明的精神和范 圍。本發(fā)明的描述應理解為包括這里所述要素的所有新的和非顯而易見的組合，且 權利要求可以這些要素的任何新的和非顯而易見的組合的形式出現在本申請或之后 的申請中。上述實施方案是示例性的，對于在該申請或之后的申請中可能被要求權 利的所有可能的組合而言，沒有一個特征或要素是必需的。當權利要求提及"一個" 或"第一"要素或其等價表述形式時，這種權利要求應理解為包括一個或多個這種 要素的組合，不一定也不排除是兩個或多個這種要素。以下權利要求定義了本發(fā)明 的范圍以及落入這些權利要求及其等價物范圍內的系統(tǒng)、方法和組合物。1. OBISO ， R.禾口 A. LORINCZ ， D/GE7VE COi 尸OiM77CW(Z^e"e 公眾/ PHARMACOGENOMICS， 2004. 5(1): P. 129-32.2. POLJAK， M.等，T/FBi /D C4尸7I/i^T/尸K 7ESr D五7ECrS爿r Z^」Sr 75 //t/M^iVCOCX7]4JXf染f沐薪獲////尸1^試發(fā)檢漱至少75摔不包教^^森賓^澄叛#/"潔會激^游乂^ 義i^諒毒募茵孟，J CLIN VIROL， 2002, 25增刊3: P. S89-97.3. CAPONE， R.B.等，Z^T^CTYOAM/ZD gC^TVr/T^TYCWOFT/WW^V/^/ViZOM^r/^WS (7W」Z)AC4 /7V 7Tffi促7M OF /Mr層re附77/ /W-腐OC"r五D //M) H)愿CX Sg[^MOf/S C￡ZZ C4i C/iVOM4「檢W定畫H尸F源關絲^"_#錄擾潘^^#:^#虛獰^游乂 ^義i^瘋奉f7/尸P9Z)ACi). CLIN CANCER RES， 2000. 6(11): R 4171-5.4. 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權利要求
1.一種檢測、鑒定和/或定量哺乳動物生物樣品中的HPV DNA的方法，所述方法包括以下步驟提取哺乳動物生物樣品的DNA；在存在至少一種競爭者序列時通過PCR對至少部分提取的DNA進行第一次擴增，所述競爭者序列包含與已知HPV類型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多核苷酸，所述競爭者序列具有所述HPV DNA序列中不存在的核苷酸取代；在存在至少一種所述已知HPV類型的延伸引物和至少兩種不同雙脫氧核苷酸時通過PCR進行第二次擴增；和通過質譜測定任何擴增的所述已知HPV類型的延伸引物的水平。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物生物樣品是體液或組織 樣品。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述測定步驟包括檢測濃度低至約 200阿摩爾的任何擴增的延伸引物。
4. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括存在多種競爭者 序列類型，各競爭者序列包含與不同已知HPV類型的DNA序列中的多核苷酸基本 同源的多核苷酸，所述競爭者序列類型具有所述相應HPVDNA序列中不存在的核苷 酸取代，且其中所述第二次擴增包括存在多種各不同已知HPV類型的外部引物類型。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述多種已知HPV類型包括HPV類 型16、 18、 23、 26、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 73 和82中的兩種或多種。
6. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述多種已知HPV類型包括HPV類 型16、 18、 23、 26、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 73 和82中的至少一種。
7. 如權利要求4所述的方法，所述方法還包括在存在至少一種競爭者序列時通過PCR對至少部分提取的DNA進行第一次擴 增，所述競爭者序列包含與淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的DNA序列中的多核苷酸基本 同源的多核苷酸，所述競爭者序列具有所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原體DNA序列中不 存在的核苷酸取代； 在存在至少一種所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的延伸引物和至少兩種不同雙脫 氧核苷酸時通過PCR進行第二次擴增；和通過質譜測定任何擴增的淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的延伸引物的水平。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括存在至少一種競爭者序列，所述競爭者序列包含與基因eAS-2的DNA序列中的多核苷酸基本同源 的多核苷酸，所述競爭者序列類型具有所述基因e^5-2中不存在的核苷酸取代。
9. 如權利要求1所述的方法，包括在所述測定步驟之后診斷、監(jiān)測或評價哺乳動 物的宮頸癌、宮頸發(fā)育異常、宮頸上皮內瘤、肛門癌、肛門上皮內瘤、頭/頸癌、血 吸蟲病相關的膀胱癌或乳頭狀瘤的額外步驟。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，至少一種競爭者序列選自SEQIDNo. 67、 SEQIDNo. 68、 SEQIDNo. 69、 SEQIDNo. 70、 SEQIDNo. 71、 SEQIDNo. 72、 SEQ ID No. 73、 SEQ ID No. 74、 SEQ ID No. 75、 SEQ ID No. 76、 SEQ ID No. 77、 SEQ ID No. 78、 SEQ ID No. 79、 SEQ ID No. 80、 SEQ ID No. 81、 SEQ ID No. 82、 SEQ ID No. 83 、 SEQ ID No. 84或SEQ ID No. 85 。
11. 如權利要求lO所述的方法，還包括，至少一種競爭者序列選自SEQIDNo. 86、 87或88。
12. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括至少一組相匹 配的所述已知HPV類型的正向和反向引物序列，所述組由以下序列構成SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 23 ， SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 24， SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 25， SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 26， SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 27， SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 28， SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 29， SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 30， SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 31 ， SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 32， SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 33， SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 34， SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 35， SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 36， SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 37， SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 38， SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 39， SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO-AO, 以及SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 41。
13. 如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增還包括至少一組相 匹配的正向和反向引物序列，所述組選自SEQ ID No. 20和SEQ ID No. 42， SEQ ID No. 21和SEQ ID No. 43，以及SEQ ID No. 22和SEQ ID No. 44。
14. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種延伸引物選自SEQ ID NO. 45、 SEQ ID NO. 46、 SEQ ID NO. 47 SEQ ID NO. 48、 SEQ ID NO. 49、 SEQ ID NO. 50、 SEQ ID NO. 51、 SEQ ID NO. 52、 SEQ ID NO. 53、 SEQ ID NO. 54、 SEQ ID NO. 55、 SEQ ID NO. 56、 SEQ ID NO. 57、 SEQ ID NO. 58、 SEQ ID NO. 59、 SEQ ID NO-GO, SEQ ID NO. 61、 SEQ ID NO. 62或SEQ ID NO. 63。
15. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述第二次擴增也包括至少一種選 自SEQ ID NO. 64、 SEQ ID NO. 65或SEQ ID NO. 66的延伸引物。
16. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括至少一組相匹 配的所述已知HPV類型的正向和反向引物序列，這種序列各自包含至少一個肌苷堿基。
17. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述至少一種延伸引物包含至少一 個肌苷堿基。
18. —種檢測、鑒定和/或定量哺乳動物體液非細胞組分中的HPVDNA的方法， 所述方法包括以下步驟提取哺乳動物體液非細胞組分中的DNA;在存在至少一種競爭者序列時通過PCR對至少部分提取的DNA進行第一次擴 增，所述競爭者序列包含與已知HPV類型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多 核苷酸，所述競爭者序列具有所述HPVDNA序列中不存在的核苷酸取代；在存在至少一種所述已知HPV類型的延伸引物和至少兩種不同雙脫氧核苷酸時 通過PCR進行第二次擴增；和通過質譜測定任何擴增的所述已知HPV類型的延伸引物的水平。
19. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述體液是血漿、血清、尿液、腦 脊液、汗液、唾液、痰液或淚液。
20. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述測定步驟包括檢測濃度低至約 200阿摩爾的任何擴增的延伸引物。
21. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括存在多種競爭 者序列類型，各競爭者序列包含與不同已知HPV類型的DNA序列中的多核苷酸基 本同源的多核苷酸，所述競爭者序列類型具有所述相應HPV DNA序列中不存在的核 苷酸取代，且其中所述第二次擴增包括存在多種各不同已知HPV類型的外部引物類 型。
22. 如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述多種已知HPV類型包括HPV 類型16、 18、 23、 26、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 73和82中的兩種或多種。
23. 如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述多種已知HPV類型包括HPV 類型16、 18、 23、 26、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 73和82中的至少一種。
24. 如權利要求21所述的方法，所述方法還包括在存在至少一種競爭者序列時通過PCR對至少部分提取的DNA進行第一次擴 增，所述競爭者序列包含與淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的DNA序列中的多核苷酸基本 同源的多核苷酸，所述競爭者序列具有所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原體DNA序列中不 存在的核苷酸取代；在存在至少一種所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的延伸引物和至少兩種不同雙脫 氧核苷酸時通過PCR進行第二次擴增；和通過質譜測定任何擴增的淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的延伸引物的水平。
25. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括存在至少一種 競爭者序列，所述競爭者序列包含與基因w65-2的DNA序列中的多核苷酸基本同 源的多核苷酸，所述競爭者序列類型具有所述基因e^5-2中不存在的核苷酸取代。
26. 如權利要求18所述的方法，包括在所述測定步驟之后診斷、監(jiān)測或評價哺乳 動物的宮頸癌、宮頸發(fā)育異常、宮頸上皮內瘤、肛門癌、肛門上皮內瘤、頭/頸癌、 血吸蟲病相關的膀胱癌或乳頭狀瘤的額外步驟。
27. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，至少一種競爭者序列選自SEQID No. 67、 SEQIDNo. 68、 SEQIDNo. 69、 SEQIDNo. 70、 SEQIDNo, 71、 SEQIDNo. 72、 SEQ ID No. 73、 SEQ ID No. 74、 SEQ ID No. 75、 SEQ ID No. 76、 SEQ ID No. 77、 SEQ ID No. 78、 SEQ ID No. 79、 SEQ ID No. 80、 SEQ ID No. 81 、 SEQ ID No. 82、 SEQ ID No. 83 、 SEQ ID No. 84或SEQ ID No. 85 。
28. 如權利要求27所述的方法，還包括，至少一種競爭者序列選自SEQ ID No. 86、 87或88。
29. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括至少一組相匹 配的所述已知HPV類型的正向和反向引物序列，所述組由以下序列構成SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 23 ， SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 24， SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 25 ， SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 26， SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 27， SEQ ID NO.6禾口 SEQ ID NO. 28， SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 29， SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 30， SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 31 ， SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 32， SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 33 ， SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 34， SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 35， SEQ ID NO. 14和SEQ ID NO. 36， SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 37， SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 38， SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 39， SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 40，以及SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 41。
30. 如權利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括至少一組相匹 配的正向和反向引物序列，所述組選自SEQ ID No. 20和SEQ ID No. 42， SEQ ID No. 21和SEQ ID No. 43 ，以及SEQ ID No. 22和SEQ ID No. 44。
31. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述至少一種延伸引物選自SEQ ID NO. 45、 SEQ ID NO. 46、 SEQ ID NO. 47 SEQ ID NO. 48、 SEQ ID NO. 49、 SEQ ID NO. 50、 SEQ ID NO. 51、 SEQ ID NO. 52、 SEQ ID NO. 53、 SEQ ID NO. 54、 SEQ ID NO. 55、 SEQ ID NO. 56、 SEQ ID NO. 57、 SEQ ID NO. 58、 SEQ ID NO. 59、 SEQ ID NO. 60、 SEQ ID NO. 61、 SEQ ID NO. 62或SEQ ID NO. 63。
32. 如權利要求31所述的方法，其特征在于，所述第二次擴增還包括至少一種選 自SEQ ID NO. 64、 SEQ ID NO. 65或SEQ ID NO. 66的延伸引物。
33. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括至少一組相匹 配的所述已知HPV類型的正向和反向引物序列，這種序列各自包含至少一個肌苷堿 基。
34. 如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述至少一種延伸引物包含至少一 個肌苷堿基。
35. —種檢測、鑒定和/或定量哺乳動物生物樣品中的HPVDNA的方法，所述方 法包括以下步驟提取哺乳動物生物樣品中的DNA;在存在至少一種競爭者序列時通過PCR對至少部分提取的DNA進行第一次擴 增，所述競爭者序列包含與已知HPV類型的DNA序列中的多核苷酸基本同源的多 核苷酸，所述競爭者序列具有所述HPVDNA序列中不存在的核苷酸取代；在存在至少一種所述已知HPV類型的延伸引物和至少兩種不同雙脫氧核苷酸時 通過PCR進行第二次擴增；和通過質譜測定任何擴增的所述己知HPV類型的延伸引物的水平；其中，所述第一次擴增包括至少一組相匹配的已知HPV類型的正向和反向引物序列，該已知HPV類型與至少一種競爭者序列相匹配，且其中所述至少一種延伸引 物與相同的已知HPV類型相關。
36. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，至少一種競爭者序列選自SEQ ID No. 67、 SEQ ID No. 68、 SEQ ID No. 69、 SEQ ID No. 70、 SEQ ID No. 71、 SEQ ID No. 72、 SEQ ID No. 73、 SEQ ID No. 74、 SEQ ID No. 75、 SEQ ID No. 76、 SEQ ID No. 77、 SEQ ID No. 78、 SEQ ID No. 79、 SEQ ID No. 80、 SEQ ID No. 81、 SEQ ID No. 82、 SEQ ID No. 83、 SEQ ID No. 84或SEQ ID No. 85;至少一組相匹配的正向和反向引物序列選自SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 23， SEQ ID NO. 2禾卩SEQ ID NO. 24， SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 25， SEQ ID NO. 4和 SEQ ID NO. 26， SEQ ID NO. 5禾卩SEQ ID NO. 27， SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 28， SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 29， SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 30， SEQ ID NO. 9和 SEQ ID NO. 31， SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 32， SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 33， SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 34， SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 35， SEQ ID NO. 14 和SEQ ID NO. 36， SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 37， SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 38， SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 39， SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 40，以及SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 41;禾口至少一種延伸引物選自SEQIDN0.45、 SEQ ID NO. 46、 SEQ ID NO. 47 SEQ ID NO. 48、 SEQ ID NO. 49、 SEQ ID NO. 50、 SEQ ID NO. 51、 SEQ ID NO. 52、 SEQ ID NO. 53、 SEQ ID NO. 54、 SEQ ID NO. 55、 SEQ ID NO. 56、 SEQ ID NO. 57、 SEQ ID NO. 58、 SEQ ID NO. 59、 SEQ ID NO. 60、 SEQ ID NO. 61 、 SEQ ID NO. 62或SEQ ID NO. 63。
37. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括至少一組相匹 配的所述己知HPV類型的正向和反向引物序列，這種序列各自包含至少一個肌苷堿 基。
38. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述至少一種延伸引物包含至少一 個肌苷堿基。
39. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述測定步驟包括檢測濃度低至約 200阿摩爾的任何擴增的延伸引物。
40. 如權利要求35所述的方法，包括在所述測定步驟之后診斷、監(jiān)測或評價哺乳動物的宮頸癌、宮頸發(fā)育異常、宮頸上皮內瘤、肛門癌、肛門上皮內瘤、頭/頸癌、 血吸蟲病相關的膀胱癌或乳頭狀瘤的額外步驟。
41. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括存在多種競爭 者序列類型，各競爭者序列包含與不同已知HPV類型的DNA序列中的多核苷酸基 本同源的多核苷酸，所述競爭者序列類型具有所述相應HPV DNA序列中不存在的核 苷酸取代，且其中所述第二次擴增包括存在多種各不同已知HPV類型的外部引物類 型。
42. 如權利要求41所述的方法，其特征在于，所述多種已知HPV類型包括HPV 類型16、 18、 23、 26、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 73和82中的兩種或多種。
43. 如權利要求41所述的方法，其特征在于，所述多種已知HPV類型包括HPV 類型16、 18、 23、 26、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 73和82中的至少一種。
44. 如權利要求41所述的方法，所述方法還包括在存在至少一種競爭者序列時通過PCR對至少部分提取的DNA進行第一次擴 增，所述競爭者序列包含與淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的DNA序列中的多核苷酸基本 同源的多核苷酸，所述競爭者序列具有所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原體DNA序列中不 存在的核苷酸取代；在存在至少一種所述淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的延伸引物和至少兩種不同雙脫 氧核苷酸時通過PCR進行第二次擴增；和通過質譜測定任何擴增的淋病奈瑟菌或沙眼衣原體的延伸引物的水平。
45. 如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述第一次擴增包括存在至少一種 競爭者序列，所述競爭者序列包含與基因e^5-2的DNA序列中的多核苷酸基本同 源的多核苷酸，所述競爭者序列類型具有所述基因"65-2中不存在的核苷酸取代。
46. 如權利要求35所述的方法，其特征在于所述第一次擴增包括至少一種選自SEQ ID No. 86、 SEQ ID No. 87或SEQ ID No. 88的競爭者序列和至少一組選自SEQ ID No. 20和SEQ ID No. 42， SEQ ID No. 21和 SEQ ID No. 43，以及SEQIDNo.22和SEQ ID No. 44的相匹配的正向和反向引物序 列;禾口所述第二次擴增包括至少一種選自SEQ ID NO. 64、 SEQ ID NO. 65或SEQ ID NO. 66的延伸引物。
47. —種包含競爭者序列以檢測、鑒定和/或定量生物樣品中的微生物DNA的合 成的多核苷酸，所述競爭者序列選自SEQ ID No. 67、 SEQ ID No. 68、 SEQ ID No. 69、 SEQIDNo. 70、 SEQ ID No. 71、 SEQIDNo. 72、 SEQIDNo. 73、 SEQIDNo. 74、 SEQ ID No. 75、 SEQIDNo. 76、 SEQIDNo. 77、 SEQIDNo. 78、 SEQ ID No. 79、 SEQ ID No. 80、 SEQIDNo. 81、 SEQIDNo. 82、 SEQIDNo. 83、 SEQIDNo. 84、 SEQIDNo. 85、 SEQIDNo. 86、 SEQ ID No. 87和SEQ ID No. 88。
48. —對包含正向和反向引物以檢測、鑒定和/或定量生物樣品中的微生物DNA 的合成的多核苷酸，所述正向和反向引物選自SEQIDNO. 1和SEQ ID NO. 23， SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 24， SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 25， SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 26， SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 27， SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 28， SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 29， SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 30， SEQ ID NO. 9和SEQ IDN0.31，SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 32， SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 33， SEQ ID NO. 12和SEQ ID NO. 34， SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 35， SEQ ID NO. 14和 SEQ ID NO. 36， SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 37， SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 38， SEQ ID NO. 17禾口 SEQ ID NO. 39 ， SEQ ID NO. 18和SEQ ID NO. 40 ， SEQ ID NO. 19 和SEQ ID NO. 41 ， SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 42， SEQ ID NO. 21禾卩SEQ ID NO. 43，以及SEQIDNO. 22和SEQ ID NO. 44。
49. 一種包含延伸引物以檢測、鑒定和/或定量生物樣品中的微生物DNA的合成 的多核苷酸，所述延伸引物選自SEQ ID NO. 45、 SEQ ID NO. 46、 SEQ ID NO. 47 SEQ ID NO. 48、 SEQ ID NO. 49、 SEQIDNO. 50、 S即DN0.51、 SEQIDNO. 52、 SEQ ID NO. 53、 SEQIDNO. 54、 SEQIDNO. 55、 SEQ ID NO. 56、 SEQIDNO. 57、 SEQ ID NO. 58、 SEQIDNO. 59、 SEQIDNO. 60、 SEQIDNO. 61、 SEQIDNO. 62、 SEQ ID NO. 63、 SEQIDNO. 64、 SEQ ID NO. 65和SEQ ID NO. 66。
50. —種檢測生物樣品中的微生物DNA的試劑盒，所述試劑盒包含一容器和一 種或多種如47、 48和49所述的合成的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明包括但不限于為檢測、治療和/或管理癌癥和發(fā)育異常而檢測、鑒定和定量生物樣品中低至單拷貝水平的人乳頭瘤病毒(HPV)的系統(tǒng)、方法和組合物，所述生物樣品包括但不限于哺乳動物體液和宮頸刮樣。
文檔編號C12Q1/70GK101151379SQ200680006955
公開日2008年3月26日 申請日期2006年1月16日 優(yōu)先權日2005年1月14日
發(fā)明者D·M·庫爾尼特, M·D·凱恩 申請人:密執(zhí)安州立大學董事會