專利名稱：：一種粉虱座殼孢菌菌株及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種粉虱座殼孢菌/^c力erwm》"/q'raJ/jWebber，及其用于防治十字花科蔬菜上的煙粉虱、柑桔粉虱和蚜蟲等害蟲。
背景技術(shù)：
：在煙粉虱、柑桔粉虱、蚜蟲等害蟲的防治上，多采用傳統(tǒng)的化學防治方法，在生物農(nóng)藥防治方面未發(fā)現(xiàn)用于防治上述害蟲的粉虱座殼孢菌菌株。該菌是一種昆蟲病原真菌，作為一種活體生物農(nóng)藥，具有不同于現(xiàn)有化學殺蟲劑的全新的作用機理、對環(huán)境無污染、無殘留的特征，可以作為防治某些對蘇云金桿菌(Bt)產(chǎn)生抗藥性的昆蟲的替代防治藥物。
發(fā)明內(nèi)容為了防治煙粉虱、柑桔粉虱、蚜蟲等害蟲，本發(fā)明的首要目的在于提供一種粉虱座殼孢菌菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供上述粉虱座殼孢菌菌株的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實現(xiàn)一種粉虱座殼孢菌菌株，是從廣州地區(qū)被蟲生真菌自然侵染的柑桔粉虱蟲體上分離獲得，將野生菌株連續(xù)多次接于煙粉虱蟲體上復壯獲得粉虱座殼孢菌菌株，對該菌株采用單孢子分離獲得純化菌株。所述菌株為AA01-N8，菌株保藏號CCTCCNo:M207087，2007年6月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。所述粉虱座殼孢^化/26^o"^"/^yra^faWebber屬腔孢綱，座殼孢屬。所述粉虱座殼孢菌菌株的粉虱座殼孢的子座扁墊狀或盾狀、微被毛，白色至亮黃色，直徑1.01.5mm，高0.40.6mm，被基層包圍，基層半透明，白色，寬0.20.5mm，由菌絲密織而成.菌絲有時膨脹，透明，壁光滑，寬厚0.26.4pm，壁厚，0.82.2pm，分生孢子器嵌入子座，卵形或扁球形不規(guī)則，120280xl50320^im，有開敞孔口，圓形，孔口被橙色的粘孢團覆蓋。分生孢子紡錘形，有時彎曲，頂端尖，單孢，透明，壁光滑。分生孢子梗單生或二輪生，具25根管形輪生體。輪生體較細，纖弱，細圓柱形，未端平截，7.817.5(imxl.21.8(im，側(cè)絲從分生孢子梗中生出，絲狀，透明，長3010(Vm(少有350pm)，寬1.01.6(im。上述粉虱座殼孢菌菌株在制備防治煙粉虱、柑桔粉虱、蚜蟲等藥物中的應用。本發(fā)明的粉虱座殼孢菌對防治十字花科蔬菜上的煙粉虱、柑桔粉虱、蚜蟲等多種害蟲有效。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本菌株從廣東省廣州地區(qū)被侵染的柑桔粉虱蟲體上分離獲得，為中國本土的菌株，并非從國外引進，能適應本地的自然環(huán)境。本發(fā)明粉虱座殼孢菌菌株是一種昆蟲病原真菌，作為一種活體生物農(nóng)藥，具有不同于現(xiàn)有化學殺蟲劑的全新的作用機理、對環(huán)境無污染、無殘留的特征，適應了有機食品生產(chǎn)的要求。本發(fā)明的粉虱座殼孢菌對防治十字花科蔬菜上的煙粉虱、柑桔粉虱、蚜蟲等多種害蟲有效。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一歩詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例11.1材料來源在廣州地區(qū)的果樹柑桔上采集到一種被蟲真菌侵染的柑桔粉虱D/fl/owraJes蟲尸。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):將200g馬鈴薯煮熟取汁，然后在所取汁液中再加入20g葡萄糖+1720g瓊脂粉，加入水使總體積為1000ml煮沸。后經(jīng)高壓滅鍋滅菌(121°C，30min)。無菌操作條件所有器皿和用具均須經(jīng)高壓滅鍋滅菌(12rC，30min)，接種等操作在超凈工作臺內(nèi)進行。培養(yǎng)條件置于25。C光照(14L:10D)恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到PDA斜面，再轉(zhuǎn)入4"冰箱貯存。1.2病原菌的分離、鑒定(一)病原菌的分離與純化(1)分離從采回的被蟲生真菌感染的柑桔粉虱蟲尸樣品上分離病原菌。利用5%的次氯酸鈉溶液對樣品進行表面消毒，消毒后的樣品在滅菌水中洗滌3次，并放入PDA平板中，倒置于25t:恒溫箱中培養(yǎng)，待菌落形成后，轉(zhuǎn)移到PDA斜面，再轉(zhuǎn)入4'C冰箱貯存。(2)復壯將分離到的菌株在PDA平板上培養(yǎng)15d，待形成菌落后加入0.3%吐溫一80的滅菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，用小型手動噴霧器將稀釋成lxio包子/ml的孢子懸浮液均勻地噴于帶有煙粉虱的黃瓜葉片上，保溫卯％以上。15d后挑取被感染的煙粉虱，按前面所述的方法分離到A分離株。(3)純化將A分離株分別在PDA平板上培養(yǎng)15d，待形成橙色孢子座后，挑取分生孢子制成lxl()S孢子/ml濃度的孢子懸液，將懸液滴于放有蓋玻片的載玻片上，在生物顯微鏡下觀察，將一個液滴中只有一個分生孢子的玻片插入PDA培養(yǎng)基上，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得B、C、D、E、F共5個分離株。(4)病原菌的鑒定根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀、菌絲、分生孢子和產(chǎn)孢器的形態(tài)進行初步鑒定。1、菌落形態(tài)描述將獲得的5個分離株接種到PDA平板上，在25'C條件下培養(yǎng)，35天可長出白色菌絲，第7天左右開始形成孢子，菌落顏色逐漸由白色變成橙黃色，并形成粘孢團，第15天左右呈橙黃色孢子座層；單菌落呈圓形，邊緣整齊、呈一白圈，中間隆起，上有許多乳頭狀突起，為橙黃色。2、菌絲和孢子形態(tài)描述菌絲白色，有時膨脹、透明，壁光滑，寬厚3.26.4pm，壁厚，0.82.2pm，分生孢子器嵌入子座、卵形或扁球形、不規(guī)則，120280xl50320jum，有開敞孔口、圓形，孔口被橙色的粘孢團覆蓋。分生孢子紡錘形，有時彎曲、頂端尖，單孢、透明、壁光滑。分生孢子梗單生或二輪生，具25根管形輪生體。輪生體較細，纖弱，細圓柱形，未端平截，7.817.5^imxl.2l.^im，側(cè)絲從分生孢子梗中生出，絲狀，透明，長30100pm，(少有350pm)，寬1.01.6|im。(二)粉虱座殼孢分離株的篩選蟲生真菌在遺傳、生態(tài)及生物學等方面具有多樣性，又存在有準性生殖現(xiàn)象，同種真菌的不同菌株對目標害蟲的致病力差異顯著，菌株不同，其LD,LT5。可相差數(shù)倍至數(shù)十倍。高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株的篩選與獲得是取得較好防治效果的首要前提。菌株篩選常用的4個指標分別為致病力、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、菌落生長速率。本發(fā)明以這些指標為依據(jù)，篩選優(yōu)良的粉虱座殼孢菌株。(1)供試菌株的處理經(jīng)純化后獲得的粉虱座殼孢菌B、C、D、E、F共5個分離株，采用PDA平板，于25土0.5"的恒溫箱(14L:10D)中培養(yǎng)。(2)供試昆蟲與寄主植物煙粉虱，將網(wǎng)室中伺養(yǎng)在黃瓜上的煙粉虱成蟲，接種到無蟲的黃瓜幼苗上，產(chǎn)卵12h后，清除成蟲，將黃瓜幼苗置于25i0.5"C的光照培養(yǎng)箱中，待煙粉虱發(fā)育至2齡若蟲時待用。黃瓜0^ww^^^vwL.，品種為萬吉青瓜，購自廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，試驗苗均采用23片展開葉的盆栽苗。(3)菌落生長速率和產(chǎn)孢量的測定將5個分離株分別配制成lxloq包子/ml濃度的分生孢子懸液，分別取lml懸液滴入PDA培養(yǎng)基上，用三角玻璃棒涂勻，待45d長出菌絲后用直徑為13mm的打孔器取新鮮菌落，接種于PDA平板上，然后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(L:D=14:10)。每個菌株5次重復。第10d測定菌落直徑并收集分生孢子用血球計數(shù)板測定產(chǎn)孢量。具體操作如下用直尺測量菌落直徑，并用直徑為5mm的滅菌打孔器在培養(yǎng)皿中菌絲生長相對均勻一致的位置取菌塊，然后放入加有20ml0.3%吐溫一80滅菌水中，在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，使孢子充分分散，制成孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)并測定產(chǎn)孢量。5個分離株的菌落擴展直徑和產(chǎn)孢量見表1，各分離株之間菌落擴展直徑差異不顯著。生長10d后，分離株C、D與B、E的產(chǎn)孢量差異顯著，其中D分離株的產(chǎn)孢量最高。表1粉虱座殼孢5個分離株生長速率和產(chǎn)孢量(10d)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(4)孢子萌發(fā)率的測定將5個分離株分別培養(yǎng)10d后，用無菌水收集孢子并制成懸液，用載玻片萌發(fā)法試驗。將孢子懸液滴在無菌載玻片上，置于底部鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，在皿內(nèi)滴加34滴滅菌水保濕(100%,RH)，培養(yǎng)24h后鏡檢。每處理3個重復。5個分離株中，C、D分離株與其它分離株之間的分生孢子萌發(fā)率差異顯著(見表2)。其中D分離株的孢子平均萌發(fā)率最高，B分離株的孢子萌發(fā)率最低。表2粉虱座殼孢5個分離株分生孢子萌發(fā)率(24h)<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(5)分離株對煙粉虱2齡若蟲的致病力測定將5個分離株培養(yǎng)10d后，用無菌水收集孢子，配制成濃度為5><106分生孢子/mL的孢子懸液。將帶有2齡煙粉虱若蟲的黃瓜葉片浸入懸液中，對照浸入含0.3%吐溫一80的無菌水中，20s后取出，自然晾干。每處理為34片葉，每葉50100頭若蟲，3次重復。摘下處理過的葉片，插入盛有無菌水的花泥中，置于透明的保鮮盒內(nèi)。再置于25土0.5。C的光照培養(yǎng)箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續(xù)觀察8d。致病性研究結(jié)果表明，所有分離株的侵染率與對照相比差異顯著。5個分離株在第4d開始表現(xiàn)出侵染癥狀，從第4d的侵染率可看出C、D、F分離株間的侵染率差異顯著，第8d時E分離株與其它分離株的侵染率差異顯著。從總體而言，分離株C的致病力較強，平均為95.57%(7d)，E分離株的侵染率較低，為86.14%(8d)(表3)。表3粉虱座殼孢5個分離株的致病性<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。(6)粉虱座殼孢分離株的篩選在篩選優(yōu)良分離株時，致病力和產(chǎn)孢量是重要的參考指標，孢子萌發(fā)率和菌落生長速率次之。在本發(fā)明中，各分離株之間的菌落擴展直徑差異不顯著。C、D與其它分離株之間分生孢子萌發(fā)率差異顯著。從產(chǎn)孢量和致病力上看，分離株C和D較為優(yōu)良，具有致病性強、產(chǎn)孢量高等特點(表l、表3)。綜合比較各方面的因素，C分離株為最佳菌株，將其命名為AA01-N8菌株。經(jīng)貴州大學劉愛英教授鑒定為粉虱座殼孢/^c/7e^ora》a/e_yracfeWebber，其菌株保藏號CCTCCNo:M207087，2007年6月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。該粉虱座殼孢^sc/2eMow'aa/e)'ra^feWebber屬腔孢綱，座殼孢屬。該粉虱座殼孢菌菌株的粉虱座殼孢子座扁墊狀或盾狀、微被毛，白色到亮黃色，直徑1.01.5mm，高0.40.6mm，被基層包圍，基層半透明，白色，寬0.20.5mm，由菌絲密織而成.菌絲有時膨脹，透明，壁光滑，寬厚0.26.4(im，壁厚，0.82.2pm，分生孢子器嵌入子座，卵形或扁球形不規(guī)則，120280xl50320|im，有開敞孔口，圓形，孔口被橙色的粘孢團覆蓋。分生孢子紡錘形，有時彎曲，頂端尖，單孢，透明，壁光滑。分生孢子梗單生或二輪生，具25根管形輪生體。輪生體較細，纖弱，細圓柱形，未端平截，7.817.5pmxl.21.8|im，側(cè)絲從分生孢子梗中生出，絲狀，透明，長30100|im(少有350pm)，寬1.01.6(im。上述所有試驗數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。實施例2粉虱座殼孢對煙粉虱的致病力測定生物測定是檢測蟲生真菌對目標害蟲的致死程度和致死速率的有效手段之一，能為綜合評價該真菌的生物防治潛力提供參考重要的依據(jù)。本發(fā)明就粉虱座殼孢AA01-N8菌株對煙粉虱的致病力進行測定，以篩選出在防治時所用的最佳濃度。供試昆蟲與寄主植物煙粉虱，將溫室中飼養(yǎng)在黃瓜上的煙粉虱成蟲，接種到無蟲的黃瓜幼苗上，產(chǎn)卵12h后，清除成蟲，將黃瓜幼苗置于25i0.5'C的光照培養(yǎng)箱中，待煙粉虱發(fā)育至2齡若蟲時待用。黃瓜Cwc,&m^wL.，品種為萬吉青瓜，購自廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，試驗苗均采用23片展開葉的盆栽苗。(1)供試菌株的處理經(jīng)純化后獲得的粉虱座殼孢AA01-N8菌株，在PDA平板上于25士0.5。C的恒溫箱(14L:10D)中培養(yǎng)10天，加入0.3%吐溫一80的無菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，待孢子被打散均勻后，用醫(yī)用紗布過濾去雜質(zhì)，獲得孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)確定孢子濃度后，再配成lx103、lxio4、lxi05、lxio6、lxl()7孢子/ml5個濃度梯度待用。(2)AA01-N8菌株對煙粉虱若蟲的致病力測定將帶有煙粉虱2齡若蟲的黃瓜葉片浸入5個梯度的孢子懸浮液中，對照(CK)浸入含0.3%吐溫一80的滅菌水中，20s后取出，自然晾干。每處理為34片葉，每葉50100頭若蟲，3次重復。處理過的葉片連同黃瓜苗一起放置于25士0.5"C的光照培養(yǎng)箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，連續(xù)觀察14d。上述所有試驗數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。(3)粉虱座殼孢AA01-N8菌株對煙粉虱各齡若蟲的累計死亡率接種后的第23d，各處理區(qū)的若蟲開始表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，如煙粉虱的體色由透明逐漸變?yōu)椴煌该鞯陌咨虺赛S色，蟲體表面可見白色的菌絲和橙黃色子座。表4為粉虱座殼孢處理后若蟲第10d的累計死亡率，結(jié)果表明隨著濃度的增加煙粉虱2齡的死亡率也增加，同一濃度下隨著時間的增加，煙粉虱2齡的死亡率也增加。其中1"06和1><107處理區(qū)，煙粉虱的累計死亡率差異不顯著。表4粉虱座殼孢AA01-N8菌株對煙粉虱各齡若蟲的累計死亡率(10d)(%)濃度lxl03lx104_lxl05_lxl06_lxl07l齡16.41士1.43b29.04士0.87a58.68士2.89a84.89士1.13a96.55士1.33a2齡18.06土0.73a32.31土0.76a62.59土1.08a87.27士1.98a97.34士0.95a3齡15.34士1.52b26.78士2.18b56.41士0.45a81.24士0.64a96.73士1.18a4齡13.06士1.03b25.86士1.15b51.13士0.67b56.63士0.85b68.81士2.86b"蛹"11.84土2.87c23.33士2.12b41.78土1.89b45.78士2.31c48.78士2.65cCK9.38士1.26d9.38士1.26c9.38土1.26c9.38士1.26d9.38士1.26d注表中同列數(shù)字后字母相同者表示差異不顯著(DMRT法)。上述所有試驗數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。實施例3粉虱座殼孢對蚜蟲的致病力測定供試昆蟲與寄主植物蚜蟲，將網(wǎng)室中飼養(yǎng)在小白菜上的蚜蟲，接種到無蟲的小白菜幼苗上，產(chǎn)卵12h后，清除成蟲，將小白菜幼苗置于25土0.5t:的光照培養(yǎng)箱中，待蚜蟲發(fā)育至2齡幼蟲時待用。小白菜Srow/cflc"wpeWn、L.ssp.chinensis，購自廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所，試驗苗均采用68片展開葉的盆栽苗。(1)供試菌株的處理經(jīng)純化后獲得的粉虱座殼孢AA01-N8菌株，在PDA平板上于25i0.5'C的恒溫箱(14L:10D)中培養(yǎng)10天，加入0.3%吐溫一80的滅菌水收集孢子，將孢子懸浮液在磁力攪拌器上攪拌20分鐘，待孢子被打散均勻后，用醫(yī)用紗布過濾去雜質(zhì)，獲得孢子懸浮液，用血球記數(shù)板記數(shù)確定孢子濃度后，再配成lx103、lx104、lx105、lx106、lxl()7孢子/ml5個濃度梯度待用。(2)分離株對蚜蟲的致病力測定將帶有蚜蟲的小白菜葉片浸入5個梯度的孢子懸浮液中，對照浸入含0.3%吐溫一80的無菌水中，20s后取出，自然晾干。每處理為34片葉，每葉IO頭若蟲，3次重復。處理過的葉片放入滅菌的托盤中(25cmx35cm)，并放置于25士0.5t:的光照培養(yǎng)箱中(L:D=14:10)。每日鏡檢并記錄感染死亡率，并更換新鮮的白菜時片，連續(xù)觀察10d。粉虱座殼孢AA01-N8菌株能侵染蚜蟲，在第10d的累計死亡率為86%。說明粉虱座殼孢對蚜蟲有好的效果。上述所有試驗數(shù)據(jù)均在數(shù)據(jù)處理軟件SAS系統(tǒng)上處理完成。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種粉虱座殼孢菌菌株，其特征在于所述粉虱座殼孢菌菌株為AA01-N8，菌株保藏號CCTCCNoM207087，2007年6月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉虱座殼孢菌菌株，其特征在于所述粉虱座殼孢菌菌株為屬腔孢綱，座殼孢屬。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉虱座殼孢菌菌株，其特征在于所述粉虱座殼孢菌菌株的子座扁墊狀或盾狀、微被毛，白色到亮黃色，直徑1.01.5mm，高0.40.6mm，被基層包圍，基層半透明，白色，寬0.20.5mm，由菌絲密織而成.菌絲有時膨脹，透明，壁光滑，寬厚0.26.4pm，壁厚，0.82.2)im，分生孢子器嵌入子座，卵形或扁球形不規(guī)則，120280xl50320nm，有開敞孔口，圓形，孔口被橙色的粘孢團覆蓋；分生孢子紡錘形，有時彎曲，頂端尖，單孢，透明，壁光滑。分生孢子梗單生或二輪生，具25根管形輪生體。輪生體較細，纖弱，細圓柱形，未端平截，7.817.5)imxL21.8pim，側(cè)絲從分生孢子梗中生出，絲狀，透明，長30100(im，寬L01.6(im。4、權(quán)利要求l所述的粉虱座殼孢菌菌株在制備防治煙粉虱、柑桔粉虱或蚜蟲藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明公開了一種粉虱座殼孢菌菌株及其應用。該粉虱座殼孢菌菌株是從廣州地區(qū)被蟲生真菌自然侵染的煙粉虱蟲體上分離獲得的菌野生菌株，將野生菌株多次接于煙粉虱蟲體上復壯獲得粉虱座殼孢菌菌株，對該菌株采用單孢子分離獲得純化菌株。該粉虱座殼孢菌菌株為AA01-N8，菌株保藏號CCTCCNoM207087，2007年6月27日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。經(jīng)長期的侵染生物學研究和室內(nèi)生物測定，粉虱座殼孢對粉虱、蚜蟲等多種刺吸式口器害蟲具有很強的侵染殺蟲效果。文檔編號C12N1/14GK101182467SQ20071003151公開日2008年5月21日申請日期2007年11月20日優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日發(fā)明者任順祥,振黃申請人:華南農(nóng)業(yè)大學