專利名稱：：蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明發(fā)明涉及一種微生物的檢測方法，具體地說，涉及一種利用微生物的特異性酶對微生物進行快速檢測鑒定的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
："民以食為天"，食品食人類賴以生存的物質(zhì)基礎，食品安全是關(guān)系人類健康和社會發(fā)展的重大問題。近年來，國內(nèi)外食品安全的惡性事件不斷發(fā)生，尤其以沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌等引起的食源性疾病最為突出。據(jù)統(tǒng)計，發(fā)達國家每年約有1/3的人患食源性疾病，美國每年約有7600萬例食原性疾病患者，食源性疾病已成為國內(nèi)外普遍關(guān)心的問題。蠟樣芽孢桿菌是一種常見的食源性致病菌，自然界中分布甚廣，常存在于食品、海產(chǎn)品、空氣和水中，極易在食品加工、運輸、貯存、銷售過程中通過不衛(wèi)生的原料、用具和手污染。我國近兩年食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)的資料顯示，蠟樣芽孢桿菌是僅次于致病性大腸桿菌、沙門氏菌、副溶血性弧菌的又一重要致病菌。據(jù)調(diào)査，米飯、肉類制品、乳制品、蔬菜、水果的帶菌率高達20%—77%。蠟樣芽孢桿菌食物中毒在國外早有報道。近些年，我國各地也間有報道，并呈現(xiàn)上升趨勢，中毒事件以在學校集體食堂、家庭、飲食服務單位等地發(fā)生居多。目前認為蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒主要由該菌產(chǎn)生的腸毒素所致，其次是該菌感染，菌量和毒素量成正比。蠟樣芽孢桿菌有產(chǎn)毒素和不產(chǎn)毒素兩類，前者在適宜條件下會產(chǎn)生腸毒素，腸毒素又分為耐熱性嘔吐型和不耐熱性腹瀉型之分，前者主要在米飯類食品中形成，食后引起嘔吐型腸胃炎，后者則在各種食物中均可產(chǎn)生，食后致腹瀉型腸胃炎。我國引起食物中毒的食品大多與米飯或淀粉類制品有關(guān)，而在歐美一些國家大多由甜點心、肉餅、色拉等引起。嘔吐型腸胃炎潛伏期一般僅數(shù)小時，癥狀有惡心、嘔吐、頭暈等，腹瀉型腸胃炎一般發(fā)作在食后10_12小時，以腹痛、腹瀉癥狀為主，偶有嘔吐及發(fā)熱。蠟樣芽孢桿菌食物中毒有一定的季節(jié)性，以6—10月份居多，夏季最高，春秋次之。由于該菌污染食品后主要分解糖類，而食品沒有明顯的腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，除有時稍有發(fā)粘、口味不爽外，感觀基本正常，因此誤食中毒的幾率較大。在檢測手段上，目前國內(nèi)外檢測機構(gòu)仍主要采用FDA、AOAC、ISO、GB等標準對蠟樣進行檢測，包括甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定等多個步驟，整個過程一般需要3-5天，且操作復雜，己不能滿足微生物快速準確檢測的現(xiàn)實需要，且在MYP平板上蠟樣芽孢桿菌容易擴散影響計數(shù)，因此，迫切需要建立新的快速檢測技術(shù)和方法。近年來，聚合酶鏈反應(PCR)、免疫學等方法的應用，使蠟樣芽孢桿菌的快速檢測有了很大發(fā)展。但是這些技術(shù)也存在一定缺陷，比如技術(shù)要求較高，需要專業(yè)的技術(shù)人員進行操作，檢測費用昂貴等。PCR方法需要先進行細菌富集，不能區(qū)分活菌和死菌，容易產(chǎn)生假陽性；免疫學方法還需要制備高純度的抗體，因此這些技術(shù)很難滿足企業(yè)和政府監(jiān)管部門對大批食品樣本檢測需要。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對以上不足，從生物化學的角度出發(fā)，提出一種利用蠟樣芽孢桿菌特異性酶對其進行快速檢測的試劑盒及檢測方法。本發(fā)明在分析蠟樣芽孢桿菌特異性生化反應的基礎上，篩選出細菌特異性酶，然后通過在分離培養(yǎng)基上加入細菌特異性酶的顯色底物，研制出顯色培養(yǎng)基，直接根據(jù)菌落顏色就可對菌株作出鑒定，同時結(jié)合卨效的樣本前處理技術(shù)，由此開發(fā)出蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒及檢測方法，用于蠟樣芽孢桿菌的快速診斷和監(jiān)控，可人大節(jié)省檢測成本和時間，具有更廣泛的應用前景。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)所提出的蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒，包括有(1)顯色培養(yǎng)基基礎成分，其配方為蛋白胨8—12g，胰蛋白胨4一6g，酵母粉7—9g，磷酸鹽2.5—3.5g，丙酮酸鈉9llg，氯化鎂0.8—1.2g，顯色底物X-GLU0.350.55g,瓊脂ll~13g，Na2C03l~2g，pH7.0士0.2;(2)培養(yǎng)基增補劑Tween80;(3)抗生素溶液*.經(jīng)過膜過濾除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml,內(nèi)含100,000[U的硫酸多粘菌素B;(4)樣品稀釋液0.85%滅菌生理鹽水。使用上述的試劑盒進行蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測的方法如卜(1)配制顯色培養(yǎng)基稱取顯色培養(yǎng)基基礎成分43.65-58.25g，溶于1000ml蒸餾水，然后加入培養(yǎng)基增補劑Tween800.1-0.3ml，震蕩，混合均勻，121'C高壓滅菌15min,冷卻至4050'C，加入抗生素溶液，混勻后倒平板，備用；(2)按以下流程進行樣品檢測將25g樣品加到225ml樣品稀釋液中，配成l:10樣品檢測液，然后依次進行10倍梯度稀釋，配成10—2、l(T3濃度的樣品稀釋液，吸取10"-l(T33種濃度菌液各100ul，分別涂布顯色培養(yǎng)基，36il'C培養(yǎng)24h，觀察；(3)結(jié)果分析36士rC培養(yǎng)24h后，觀察顯色培養(yǎng)基上是否長山直徑3mm5mm、邊緣略整齊的藍綠色菌落，若有則樣品檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。本發(fā)明的技術(shù)可行試驗1、本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基特異性試驗按上述技術(shù)方案配制本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基，對比培養(yǎng)基為MYP;將近等比例混合蠟樣芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌，然后用0.85%滅菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，取1CT4—1(rScfu濃度的混合菌液lOOul,分別涂布于本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基和MYP，觀察。結(jié)果及分析將混合菌液涂布平板后，在本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基上，蠟樣芽孢桿菌呈現(xiàn)直徑3-5mm的藍綠色菌落；蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等或不顯色或被抑制；單增李斯特菌呈現(xiàn)直徑小于lmm的藍色菌落，但生長較差，且菌落形態(tài)和顏色與蠟樣芽孢桿菌有明顯區(qū)別；表明基礎對蠟樣芽孢桿菌具有較高的特異性。而混合菌液涂布MYP平板后，由于蠟樣芽孢桿菌和蕈狀芽孢桿菌形態(tài)和生化特點相似，二者無法區(qū)分，可見，本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基比傳統(tǒng)MYP的特異性好。2、本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基的靈敏度試驗將蠟樣芽孢桿菌復蘇后，用接種環(huán)挑取l環(huán)，加入到10ml0.85。/。滅菌生理鹽水中配成原液，然后依次進行10倍梯度稀釋，取10-4-10—6濃度菌液各100ul，分別涂布在本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基和MYP計數(shù)，每個平板重復3次，36士rC培養(yǎng)18-24h，比較兩種培養(yǎng)基的靈敏度。蠟樣芽孢桿菌純菌液涂布各平板結(jié)果如表1，對30—300之間的菌落數(shù)進行方差分析(P>0.05),表明本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基和MYP平板上生長的菌落數(shù)沒有顯著差異，兩種培養(yǎng)基可以達到相同的檢測限和靈敏度。表1蠟樣芽孢桿菌在各培養(yǎng)基上的菌落數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>3、本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測方法(以下簡稱"顯色檢測法")與傳統(tǒng)檢測方法的比較試驗(1)從食堂、超市和市場采集畜禽肉、蔬菜等實際樣品62份，采用傳統(tǒng)方法和本發(fā)明的蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測方法兩種不同的檢測過程進行蠟樣芽孢桿菌檢測，檢測結(jié)果為陽性的樣本用法國生物梅里埃細菌鑒定系統(tǒng)-API50CHB生化試劑條進行驗證。國標法樣本~0.85%生理鹽水稀釋一涂布MYP平板一粉紅色帶暈環(huán)菌落一菌落純化一生化鑒定。顯色檢測法樣本一0.85%生理鹽水稀釋一涂布顯色培養(yǎng)基一直徑3-5mm的藍綠色菌落。分別挑取顯色培養(yǎng)基上的藍色菌落和MYP平板上的粉紅色暈環(huán)菌落，接種到50CHB/E培養(yǎng)液中，震蕩混勻，配成濃度為2麥氏單位的菌懸液，然后接種到50CHB鑒定條中(包括50個生化反應管，每管加50ul菌液)，37。C培養(yǎng)24-48h,觀察結(jié)果。結(jié)果分析62份實際樣品中，兩種方法都檢出了2份疑似樣品(牛肉和涼拌腐竹)，用法國生物梅里埃細菌鑒定系統(tǒng)-API50CHB生化試劑條對疑似的菌落進行最終鑒定，結(jié)果表明，兩種方法分離出的疑似菌落均為蠟樣芽孢桿菌，顯色檢測法與國標法檢測結(jié)果一致。以下為API試劑條的驗證結(jié)果。①牛肉樣品顯色培養(yǎng)基上的藍綠色菌落和MYP平板上的粉紅色暈環(huán)菌落經(jīng)API50CHB生化試劑條驗證結(jié)果表2所示表2API生化試劑條讀取結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注兩種培養(yǎng)基上分離的疑似菌落生化反應基本一致，在細菌鑒定系統(tǒng)的讀取結(jié)果鑒定都是蠟樣芽孢桿菌(符合率94.3%)。②涼拌腐竹涼拌腐竹通過兩種方法檢測，在顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的藍綠色菌落，同時在MYP平板上呈現(xiàn)的粉紅色暈環(huán)菌落，經(jīng)API50CHB生化試劑條驗證結(jié)果表3所示表3API生化試劑條讀取結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注兩種培養(yǎng)基卜.分離的疑似菌落生化反應也是一致的，在細菌鑒定系統(tǒng)的讀取結(jié)果鑒定都是蠟樣芽孢桿菌(符合率93%)。以上的試驗結(jié)果表明，兩種方法檢出的蠟樣芽孢桿菌是一致的，說明使用蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測方法對實際樣品中的蠟樣芽孢桿菌進行檢測是可行的。而且，相比而言，顯色試劑盒法的檢測時間更短，整個檢測確證過程可在24-40h內(nèi)報告結(jié)果；而傳統(tǒng)MYP平板上由于蠟樣芽孢桿菌和其它芽孢桿菌顏色都呈現(xiàn)粉色帶暈環(huán)，因此還要對疑似菌落進一步純化和生化鑒定，整個檢測過程至少需要3-5天。本發(fā)明的有益技術(shù)效果本發(fā)明通過篩選蠟樣芽孢桿菌特異性酶及顯色底物，開發(fā)出蠟樣芽孢桿菌的顯色培養(yǎng)基，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)時間長的缺點；在此基礎上建立了蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒以及以該試劑盒為基礎的一套系統(tǒng)的蠟樣芽孢桿菌顯色生化快速檢測方法，提高了檢測效率；所建立的蠟樣芽孢桿菌顯色生化快速檢測方法和試劑盒，可對食品和環(huán)境中蠟樣芽孢桿菌進行全面、系統(tǒng)、準確的檢測和鑒定，為微生物快速檢測提供了新的途徑。本發(fā)明提供的顯色生化檢測方法和試劑盒配置簡單，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，檢測靈敏，周期短、可操作性強，適用于處理大通量的樣本，可以廣泛應用到食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。圖1顯示顯色培養(yǎng)基的特異性測試結(jié)果。圖中，蠟樣芽孢桿菌呈現(xiàn)直徑3-5mm左右的藍色菌落，其他菌株呈現(xiàn)無色菌落或幾乎不能生長。圖2、圖3分別顯示顯色培養(yǎng)基的靈敏度測試結(jié)果中蠟樣芽孢桿菌在顯色培養(yǎng)基和MYP平板上的生長狀況。具體實施方式實施例1顯色生化快速檢測試劑盒檢測米飯中的蠟樣芽孢桿菌。1.檢測試劑盒組成(1)顯色培養(yǎng)基基礎成分蛋白胨8g,胰蛋白胨4g,酵母粉7g，磷酸鹽2.5g，丙酮酸鈉9g，氯化鎂0.8g，顯色底X-GLU0.35g,瓊脂llg，Na2C03lg，pH7.0士0.2;(2)培養(yǎng)基增補劑Tween80;(3)抗生素溶液經(jīng)過膜過濾除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml:內(nèi)含硫酸多粘菌素B(IOO，OOOIU);(4)樣品稀釋液0.85%滅菌生理鹽水。2.配制顯色培養(yǎng)基稱取顯色培養(yǎng)基基礎成分43.65g,溶于1000ml蒸餾水，然后加入Tween80O.lml，震蕩，混合均勻。12rC高壓滅菌15min，冷卻至405(TC，加入抗生素溶液，混勻后倒平板，備用。3.人工污染樣品從集體食堂收集剩米飯，稱取25g米飯樣品，將100—1000cfu蠟樣芽孢桿菌加入25g樣品中，模擬實際樣品混合2h。4.樣品檢測流程用移液管吸取100ml樣品稀釋液，涂布HKBcereus,36il'C培養(yǎng)18—24h，計數(shù)，觀察記錄菌落大小、顏色和形態(tài)。5.結(jié)果分析人工污染米飯樣品檢測結(jié)果表明，涂布顯色平板培養(yǎng)18—24h，蠟樣芽孢桿菌在顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)邊緣略整齊、直徑3-5mm藍綠色菌落。顯色培養(yǎng)基可以檢出l-10cfu蠟樣芽孢桿菌。實施例2顯色生化快速檢測試劑盒檢測市場豬肉樣品。1.試劑盒組成(1)顯色培養(yǎng)基基礎成分蛋白胨10g，胰蛋白胨5g，酵母粉8g，磷酸鹽3g，丙酮酸鈉10g，氯化鎂lg，顯色底X-GLU0.4g，瓊脂12g，Na2C031.5g，pH7.0士0.2;(2)培養(yǎng)基增補劑Tween80;(3)抗生素溶液經(jīng)過膜過濾除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml:內(nèi)含硫酸多粘菌素B(100，000IU);(4)樣品稀釋液0.85%滅菌生理鹽水。2.配制顯色培養(yǎng)基稱取顯色培養(yǎng)基干粉50.9g，溶于1000ml蒸餾水，然后加入Tween800.2ml，震蕩，混合均勻。121°C高壓滅菌15min，冷卻至4050'C，加入抗生素溶液，混勻后倒平板，備用。3.樣品檢測過程無菌稱取25g豬肉，剪碎，加入到盛有225ml0.85%生理鹽水的三角瓶中，配成10^樣品稀釋液。按IO倍梯度稀釋法，依次制備10—2、10—3濃度樣品稀釋液。用移液管分別吸取10—\10—2、10_3濃度樣品稀釋液各100ul，涂布顯色培養(yǎng)基HKBcereus，36士rC培養(yǎng)18—24h，觀察記錄菌落顏色和形態(tài)。4.結(jié)果分析36土rC培養(yǎng)18—24h后，在HKBcereus上未長出邊緣略整齊、直徑3mm-5mm的藍綠色菌落。豬肉樣品中未檢出蠟樣芽孢桿菌，因此，樣品檢測的陰性結(jié)果可以在24h報告出。實施例3顯色生化快速檢測方法檢測超市涼拌菜(腐竹)。1.試劑盒組成(1)顯色培養(yǎng)基基礎成分蛋白胨12g,胰蛋白胨6g，酵母粉9g，磷酸鹽3.5g，丙酮酸鈉llg，氯化鎂1.2g，顯色底X-GLU0.55g，瓊脂13g，Na2C032g，pH7.0土0.2;(2)培養(yǎng)基增補劑Tween80;(3)抗生素溶液經(jīng)過膜過濾除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml:內(nèi)含硫酸多粘菌素B(IOO，OOOIU);(4)樣品稀釋液0.85%滅菌生理鹽水。2.配制顯色培養(yǎng)基稱取顯色培養(yǎng)基干粉58.25g,溶于1000ml蒸餾水，然后加入Tween800.3ml，震蕩，混合均勻，調(diào)節(jié)pH7.0士0.2，12rC高壓滅菌15min，冷卻至405(TC，加入抗生素溶液，混勻后倒平板，備用。3.樣品檢測過程無菌稱取25g涼拌腐竹，剪碎，加入到盛有225ml0.85。/。生理鹽水的三角瓶中，配成10—4羊品稀釋液。按10倍梯度稀釋法，依次制備10—2、10—3濃度樣品稀釋液。用移液管分別吸取10—、10—2、10_3濃度樣品稀釋液各100ul，涂布接種顯色培養(yǎng)基HKBcereus，36士rC培養(yǎng)18—24h,觀察記錄菌落顏色和形態(tài)。4.結(jié)果分析36士rC培養(yǎng)18—24h后，在HKBcereus呈現(xiàn)直徑3mm-5mm的藍綠色菌落，經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢、卵黃分解試驗判定為蠟樣芽孢桿菌。用50CHB/E培養(yǎng)液將藍色菌落配成2麥氏單位的菌懸液后，接種50CHB生化試劑條，37'C培養(yǎng)2448h，后觀察生化反應結(jié)果，并將數(shù)據(jù)輸入細菌鑒定系統(tǒng)中讀取結(jié)果，結(jié)果表明，該菌為蠟樣芽孢桿菌，符合率為93%(前面已有生化反應結(jié)果)。由此可以看出，用此顯色快速檢測試劑盒檢測實際樣品后，陽性樣品的結(jié)果可以在40h報告出。權(quán)利要求1.一種蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒，其特征在于包括有(1)顯色培養(yǎng)基基礎成分，其配方為蛋白胨8-12g，胰蛋白胨4-6g，酵母粉7-9g，磷酸鹽2.5-3.5g，丙酮酸鈉9～11g，氯化鎂0.8-1.2g，顯色底物X-GLU0.35～0.55g，瓊脂11～13g，Na2CO31～2g，pH7.0±0.2；(2)培養(yǎng)基增補劑Tween80；(3)抗生素溶液經(jīng)過膜過濾除菌的硫酸多粘菌素溶液10ml，內(nèi)含100,000IU的硫酸多粘菌素B；(4)樣品稀釋液0.85％滅菌生理鹽水。2.一種使用權(quán)利要求1所述的試劑盒的蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測方法，其特征在于包括下列步驟(1)配制顯色培養(yǎng)基稱取顯色培養(yǎng)基基礎成分43.65-58.25g，溶于1000ml蒸餾水，然后加入培養(yǎng)基增補劑Tween800.1-0.3ml，震蕩，混合均勻，121'C高壓滅菌15min，冷卻至4050'C，加入抗生素溶液，混勻后倒平板，備用；(2)按以下流程進行樣品檢測將25g樣品加到225ml樣品稀釋液中，配成1:10樣品檢測液，然后依次進行10倍梯度稀釋，配成10—2、10—3濃度的樣品稀釋液，吸取10"-10—33種濃度的菌液各100ul，分別涂布顯色培養(yǎng)基，36土rc培養(yǎng)24h，觀察；(3)結(jié)果分析36+/-rC培養(yǎng)24h后，觀察顯色培養(yǎng)基上是否長出直徑3mm5mm、邊緣略整齊的藍綠色菌落，若有則樣品檢測結(jié)果為陽性，否則為陰性。全文摘要本發(fā)明提供一種蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測試劑盒及檢測方法，涉及利用微生物的特異性酶對微生物進行檢測鑒定的方法。所述的試劑盒，包括有顯色培養(yǎng)基基礎成分，培養(yǎng)基增補劑，抗生素溶液和樣品稀釋液。使用該試劑盒進行蠟樣芽孢桿菌特異性顯色生化快速檢測的方法包括用試劑盒中的成分配制顯色培養(yǎng)基，現(xiàn)按規(guī)定流程將樣品涂布在顯色培養(yǎng)基上，觀察，再進行結(jié)果分析。本發(fā)明提供的顯色生化檢測方法和試劑盒可對食品和環(huán)境中蠟樣芽孢桿菌進行全面、系統(tǒng)、準確的檢測和鑒定，檢測靈敏，周期短、可操作性強，適用于處理大通量的樣本，可以廣泛應用到食品衛(wèi)生、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。文檔編號C12Q1/04GK101215597SQ20071003283公開日2008年7月9日申請日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者吳清平,張淑紅,張菊梅,郭偉鵬申請人:廣東省微生物研究所