專利名稱：：攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子微生物學(xué)，以及分子免疫和感染免疫領(lǐng)域。特別是利用分子生物學(xué)技術(shù)分子克隆設(shè)計(jì)和制備一種攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，由結(jié)核桿菌(Mycobacteroimtuberculosis，MTB)感染引起。據(jù)WHO估計(jì)，全球人口的1/3感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，每年新發(fā)病例數(shù)達(dá)800-1000萬(wàn)例，其中死亡約300萬(wàn)例，死于結(jié)核病的人數(shù)是其它傳染病死亡人數(shù)的總和[1]。中國(guó)是除印度外的世界第二大結(jié)核病重災(zāi)區(qū)，我國(guó)目前結(jié)核病例每年遞增已逾百萬(wàn)，年死亡人數(shù)達(dá)25萬(wàn)，約為其它傳染病總死亡人數(shù)的2倍。目前由于對(duì)多種藥物耐受的結(jié)核菌株正在不斷增多，以及結(jié)核分枝桿菌與艾滋病毒的聯(lián)合感染，使帶菌者發(fā)展成為結(jié)核病的危險(xiǎn)性增加等因素，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)把結(jié)核病與艾滋病、瘧疾一起列為人類的最主要?dú)⑹諿2，3]?？ń槊?BCG)用于預(yù)防結(jié)核病已有60多年的歷史，現(xiàn)行的BC6免疫保護(hù)效果不穩(wěn)定(0-80％)[4]，它雖可較好地預(yù)防幼兒粟粒性結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎，但卻不能有效地預(yù)防成人肺結(jié)核，而且也不能應(yīng)用于結(jié)核病的高危人群——艾滋病毒感染者[5]。尋找新型有效的預(yù)防、治療性疫苗已成為當(dāng)今抗結(jié)核疫苗研究領(lǐng)域急待解決的問(wèn)題。鑒于當(dāng)前TB流行的嚴(yán)重程度和BCG預(yù)防TB的缺陷，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已轉(zhuǎn)向減毒活疫苗、MTB亞單位疫苗與基因工程重組活疫苗及DNA疫苗等的開(kāi)發(fā)研究，以用于TB的防治[6，7]。在疫苗研究的發(fā)展中，減毒活疫苗的抗原成分多，免疫原性強(qiáng)，既能提供外源性抗原又能提供內(nèi)源性抗原，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答，具有良好的免疫保護(hù)作用，能誘發(fā)自身免疫性。傷寒桿菌是細(xì)胞內(nèi)侵襲性致病菌，通過(guò)腸道或上呼吸道粘膜感染，侵入粘膜相關(guān)淋巴組織內(nèi)，被抗原遞呈細(xì)胞，主要是樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞攝取，并在其中增殖，由于其感染的靶向性，減毒的傷寒桿菌可作為DNA疫苗的載體，含有病原體抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒的減毒傷寒桿菌將表達(dá)病原體的抗原蛋白，從而誘發(fā)機(jī)體對(duì)該蛋白的全面免疫應(yīng)答(包括細(xì)胞免疫，體液免疫和粘膜免疫)，達(dá)到對(duì)感染性疾病的預(yù)防作用。機(jī)體抗御結(jié)核桿菌的感染主要依靠細(xì)胞免疫[8]。能誘發(fā)保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)核桿菌蛋白大多存在于該菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的培養(yǎng)濾液中[9]。結(jié)核桿菌的DNA疫苗中迄今已有23種結(jié)核桿菌編碼蛋白的基因被用作研究，其中一些可在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)保護(hù)性免疫，包括特異性抗體的產(chǎn)生，Th1型和CD8+CTL介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能抵抗毒株的攻擊[10-12]。但至今還沒(méi)有任何一種的結(jié)核病DNA疫苗的免疫保護(hù)效果超過(guò)BCG[13]。Ag85B又稱MPB59，是結(jié)核桿菌主要分泌蛋白Ag85復(fù)合體(包括Ag85A，Ag85B和Ag85C組分)之一。目前，已知該復(fù)合體屬于分枝菌酸轉(zhuǎn)移酶，在結(jié)核桿菌細(xì)胞壁合成的晚期起關(guān)鍵作用。在結(jié)核桿菌眾多的分泌蛋白中，Ag85B含量最大。Ag85B具有多個(gè)T細(xì)胞表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞免疫。它可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，還可誘導(dǎo)PPD陽(yáng)性健康人群外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌高水平的IFN-γ[14，15]。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種新型的攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗，以便為當(dāng)今抗結(jié)核疫苗研究領(lǐng)域急待尋找新型有效的預(yù)防、治療性疫苗作出有力的貢獻(xiàn)。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用以下的技術(shù)方案本發(fā)明提供的攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗，由包括以下步驟的方法制得(1)原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Ag85B的制備利用PCR方法對(duì)目的基因即Ag85B的BX842578基因序列中的121-975位進(jìn)行擴(kuò)增，再提取原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG，并經(jīng)酶切回收及鑒定，獲得pGEX-Ag85B；(2)真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Ag85B的構(gòu)建將鑒定成功的原核重組質(zhì)粒pGEX-KG-Ag85B轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliBL21，經(jīng)培養(yǎng)、陽(yáng)性克隆和酶切鑒定后，使含有重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21在LB(Amp+)培養(yǎng)液中培養(yǎng)、接種和誘導(dǎo)培養(yǎng)，再經(jīng)離心收集菌體及超聲碎菌后，提取融合蛋白，然后經(jīng)純化和鑒定分析，即得到真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Ag85B；(3)攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗的制備將鑒定正確的pVAX-1-Ag85B電轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌LB5000及SL7207菌株，并通過(guò)抗生素陽(yáng)性克隆篩選及提取質(zhì)粒酶切鑒定；再經(jīng)動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗的免疫保護(hù)效力，即得到所述疫苗。(按規(guī)定，上述三個(gè)步驟應(yīng)該同權(quán)利要求1；加之后增加的內(nèi)容已經(jīng)在具體實(shí)施方式闡述，沒(méi)有必要在此重復(fù)描述)本發(fā)明之所以選擇能表達(dá)GST融合蛋白的原核載體pGEX-KG，是從純化和應(yīng)用方面考慮的GST蛋白既可作為鑒定的標(biāo)簽，又可方便蛋白純化。另外，真核表達(dá)質(zhì)粒選擇為DNA疫苗的發(fā)展應(yīng)用專門設(shè)計(jì)的pVAX-1，來(lái)源于pcDNA3.1。pVAX-1是已得到美國(guó)食品與藥品管理局FDA認(rèn)可的可用于臨床的載體。美國(guó)食品與藥品管理局1996年12月22日的文件指出pVAX-1作為預(yù)防傳染性疾病的DNA疫苗載體質(zhì)粒，其具有以下特點(diǎn)①可將染色體整合的可能性最小化；②卡那霉素(kan)抗性代替安芐霉素(Amp)抗性，能避免Amp帶來(lái)的某些個(gè)體的過(guò)敏反應(yīng)，在臨床應(yīng)用上更有優(yōu)勢(shì)；③重組蛋白的表達(dá)水平可與pcDNA3.1相比；④pVAX-1載體片段小，僅3kbp，多個(gè)單一克隆位點(diǎn)，能接納更大的插入片段。本發(fā)明運(yùn)用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將鑒定正確的真核重組表達(dá)Ag85B質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門桿菌SL7207菌株中，通過(guò)抗生素陽(yáng)性篩選出正確克隆并提取質(zhì)粒DNA酶切鑒定，制備攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B減毒傷寒桿菌載體疫苗，作為有實(shí)用潛力的新型結(jié)核分支桿菌疫苗。發(fā)現(xiàn)并證實(shí)結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗經(jīng)口服后可誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫保護(hù)力，并能在小鼠體內(nèi)抵抗毒性結(jié)核桿菌的感染。本發(fā)明首次運(yùn)用了以減毒鼠傷寒桿菌為載體的結(jié)核Ag85B疫苗的有效應(yīng)用研究，開(kāi)辟了一種新型有效的結(jié)核疫苗的途徑。本發(fā)明提供了一種有發(fā)展?jié)摿Φ慕Y(jié)核桿菌減毒細(xì)菌載體疫苗。減毒的傷寒桿菌作為DNA疫苗的載體，將攜帶外源性基因的真核表達(dá)質(zhì)粒傳遞給抗原遞呈細(xì)胞，刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答。在鼠傷寒模型中，減毒鼠傷寒桿菌已被用來(lái)作為傳遞外源性抗原的載體，這些鼠傷寒桿菌經(jīng)自然途徑(如口服途徑)感染，可引起系統(tǒng)和粘膜免疫應(yīng)答，用它傳遞外源性抗原有很多優(yōu)點(diǎn)①經(jīng)口免疫即可誘導(dǎo)粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答；②通常一次免疫即可誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答；③操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)有效。也就是說(shuō)，減毒傷寒桿菌作為載體運(yùn)用于疫苗研究具有自身的優(yōu)勢(shì)，其最大的優(yōu)點(diǎn)是改良DNA疫苗肌肉注射的進(jìn)入途徑，提供更好的臨床實(shí)用性。其口服的給藥途徑更適宜臨床接受，并且疫苗的免疫效力，實(shí)驗(yàn)證明并沒(méi)有受到影響，而且采用服用方式比采用注射疫苗方式更適于患者；其次選擇的優(yōu)勢(shì)載體優(yōu)勢(shì)性載體，更有利于避免少數(shù)個(gè)體的過(guò)敏反應(yīng)，也增強(qiáng)其臨床實(shí)用性；選擇最具有優(yōu)勢(shì)的結(jié)核桿菌分泌蛋白編碼基因作為目的基因，有利于提高結(jié)核桿菌疫苗本身的免疫保護(hù)效力。且動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)，通過(guò)半數(shù)生存時(shí)間，病理切片及肺臟菌落計(jì)數(shù)結(jié)果表明攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗具有一定的免疫效力。本發(fā)明提供的疫苗與現(xiàn)有技術(shù)相比，還具有以下的主要優(yōu)點(diǎn)其一.可以刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答；通過(guò)傷寒桿菌對(duì)粘膜組織的感染，從而還可提高粘膜免疫組織的合成IgA的能力。其二.與結(jié)核Ag85BDNA疫苗相比制備成本低，細(xì)菌易繁殖，通常一次免疫即可誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答，并具有安全、高效、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。圖1Ag85B基因片段PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳鑒定。其中編號(hào)1為PCR產(chǎn)物；編號(hào)2為DNA標(biāo)記。圖2重組質(zhì)粒pGEX-Ag85B的酶切鑒定。其中編號(hào)1為pGEX-Ag85B/EcoRI+HindIII；編號(hào)2為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn).圖3A圖為GST-Ag85B融合蛋白的SDS-PAGE分析，其中編號(hào)1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；編號(hào)2為GST-Ag85B融合蛋白；編號(hào)3為GST蛋白。圖3B圖為GST-Ag85B融合蛋白的WesternBlot分析。其中編號(hào)1和2為GST-Ag85Bfusionprotein。圖4重組質(zhì)粒pVAX-1-Ag85B的酶切鑒定。其中編號(hào)1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；編號(hào)2為pVAX1-Ag85B/BamHI+EcoRI；編號(hào)3為pVAX-1空載；編號(hào)4為L(zhǎng)B5000(pVAX1-Ag85B)/BamHI+EcoRI；編號(hào)5為SL7207(pVAX1-Ag85B)/BamHI+EcoRI。圖5間接ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)。血清抗體效價(jià)是指當(dāng)陽(yáng)性血清OD植等于陰性對(duì)照血清OD值2倍時(shí)的稀釋倍數(shù)。pVAX1-Ag85B和SL(Ag85B)的血清效價(jià)與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*p＜0.05)。圖6脾細(xì)胞顆粒酶釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，減毒傷寒桿菌SL7207(pVAX1-Ag85B)組釋放顆粒酶最高(6.6％)，其比pVAX1-Ag85B(5.2％)、減毒傷寒桿菌SL7207對(duì)照組(37％)、pVAX-1空載對(duì)照組(3.7％)、生理鹽水組(N.S)(0.6％)和BCG組(5.9％)均高。圖7感染小鼠肺臟病理切片HE染色。其中a為生理鹽水感染組；b為鏈霉素治療組；c為pVAX-1質(zhì)?？蛰d組；d為pV-Ag85BDNA疫苗組；e為SL7207空載組；f為SL(Ag85B)疫苗組。圖8感染小鼠肺臟病理切片抗酸染色。其中a為生理鹽水感染組；b為鏈霉素治療組；c為pVAX-1質(zhì)?？蛰d組；d為pV-Ag85BDNA疫苗組；e為SL7207空載組；f為SL(Ag85B)疫苗組。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗，由包括以下步驟的方法制得1.原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Ag85B的制備及蛋白表達(dá)鑒定利用PCR方法對(duì)目的基因即Ag85B的BX842578基因序列中的121-975位進(jìn)行擴(kuò)增，先去掉Ag85B的BX842578基因序列中的1-120位編碼產(chǎn)物及最后3位終止密碼TGA，再對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增；PCR所用的上游引物p1、下游引物p2分別具有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，即上游引物p15’-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3’，含有EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物p25’-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3’，含有HindIII酶切位點(diǎn)。再提取原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG，并經(jīng)酶切回收連接鑒定，而獲得所述pGEX-Ag85B。將鑒定成功的原核重組質(zhì)粒pGEX-Ag85B轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliBL21，經(jīng)培養(yǎng)、陽(yáng)性克隆和酶切鑒定后，使含有重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21在LB(Amp+)培養(yǎng)液中培養(yǎng)、接種和誘導(dǎo)培養(yǎng)，再經(jīng)離心收集菌體及超聲碎菌后，提取融合蛋白，然后經(jīng)純化和鑒定分析。以質(zhì)粒pMD-Ag85B為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲產(chǎn)物在10g/L瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，在紫外燈下觀察到1條約860bp的帶，同預(yù)期的目的片段的大小相符(圖1)。將原核重組質(zhì)粒pGEX-KG-Ag85B用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切，pGEX-KG的大小為5.0kb，擴(kuò)增產(chǎn)物Ag85B基因的大小約為0.8kb，pGEX-KG-Ag85B經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切后，分成5.0kb和0.8kb兩個(gè)片段，同預(yù)期值相符，表明目的基因已正確插入pGEX-KG載體中(圖2)。GST-Ag85B融合蛋白的表達(dá)與分析培養(yǎng)含有重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21，用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后用SDS-PAGE分析.結(jié)核分枝桿菌Ag85B蛋白分子量為30kD，GST蛋白分子量為29kD，GST-Ag85B融合蛋白分子量為59kD，結(jié)果表明，在Mr59kD處有1條明亮條帶，29kD處為GST蛋白，均與預(yù)期的分子量相符(圖3A)。表達(dá)蛋白的WesternBlot分析純化的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用結(jié)核病人血清檢測(cè)，在Mr59kD處有1條明亮條帶，(圖3B)。GST-Ag85B融合蛋白與預(yù)期的分子量相同，說(shuō)明得到了正確表達(dá)。2.真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Ag85B的構(gòu)建由質(zhì)粒pMD-Ag85B用BamHI和EcoRI酶切下Ag85B片段，真核表達(dá)載體pVAX-1用BamHI和EcoRI酶切回收，T4DNA連接酶作用下定向?qū)g85B基因片段與pVAX-1連接，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在LB(kan+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，即得到真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Ag85B。將真核重組質(zhì)粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，pVAX-1的大小為3.0kb，擴(kuò)增產(chǎn)物Ag85B基因的大小約為0.8kb，pVAX-1-Ag85B經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切后，分成3.0kb和0.8kb兩個(gè)片段，同預(yù)期值相符，表明目的基因已正確插入pVAX-1載體中(圖4)。將電轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌LB5000中的真核重組質(zhì)粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后，分成3.0kb和0.8kb兩個(gè)片段，同預(yù)期值相符，表明目的基因已轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌LB5000中(圖4)。將電轉(zhuǎn)入SL7207中的真核重組質(zhì)粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后，分成3.0kb和0.8kb兩個(gè)片段，同預(yù)期值相符，表明目的基因已轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌SL7207中(圖4)。3.攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗的制備將鑒定正確的真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Ag85B電轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌LB5000及SL7207菌株(趙平，等，Enhancementbyaninvivo-activatedpromoterofimmunogenicityofrecombinantattenuatedSalmonellatyphimuriumexpressinghepatitisCviruscoreantigen，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，2003，35(3)266-70)中，并通過(guò)抗生素陽(yáng)性克隆篩選及提取質(zhì)粒酶切鑒定。將電轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌LB5000中的真核重組質(zhì)粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后，分成3.0kb和0.8kb兩個(gè)片段，同預(yù)期值相符，表明目的基因已轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌LB5000中(圖4)。將電轉(zhuǎn)入SL7207中的真核重組質(zhì)粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切后，分成3.0kb和0.8kb兩個(gè)片段，同預(yù)期值相符，表明目的基因已轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌SL7207中(圖4)。4.動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗免疫保護(hù)效力實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)設(shè)置空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組，每隔兩周免疫一次，共免疫三次，末次免疫兩周后，實(shí)驗(yàn)小鼠在ABSL-3(AnimalBiosafetyLevel-3Laboratory)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人型結(jié)核桿菌H37Rv株攻毒實(shí)驗(yàn)，分別觀察各組小鼠生存時(shí)間，于攻毒后第70天處死小鼠，作肺臟及脾臟菌落計(jì)數(shù)(CFU)，肺臟、脾臟、肝臟組織作病理切片，HE及抗酸染色觀察病理變化。小鼠初次免疫兩周后，取小鼠尾靜脈血，分離血清，用間接ELISA檢測(cè)特異性抗體效價(jià)(圖5)。效價(jià)結(jié)果顯示，質(zhì)粒組pVAX-1-Ag85B及減毒傷寒桿菌SL7207(pVAX1-Ag85B)組均比各自空載對(duì)照組有明顯的上升(*p＜0.05)。每隔兩周免疫一次，共免疫三次，末次免疫后處死部分小鼠，制備脾細(xì)胞懸液，檢測(cè)顆粒酶釋放程度反應(yīng)其細(xì)胞免疫水平，結(jié)果顯示，pVAX1-Ag85B及減毒傷寒桿菌SL7207(pVAX1-Ag85B)組均比各自空載對(duì)照組有明顯的上升，且SL7207(pVAX1-Ag85B)組略微高于BCG組(如圖6)。術(shù)次免疫兩周后小鼠H37Rv株攻毒實(shí)驗(yàn)，分別觀察各組小鼠生存時(shí)間(表1)，于攻毒后第70天處死小鼠，作肺臟及脾臟菌落計(jì)數(shù)(CFU)(表2)，肺臟、脾臟、肝臟組織作病理切片，再用HE(圖7)及抗酸染色(圖8)觀察病理變化。本發(fā)明提供的疫苗可為口服劑型產(chǎn)品。為口服劑型疫苗時(shí)，其服用方法建議為濃度2×108菌/ml，每次0.5ml。疫苗經(jīng)口服后可誘導(dǎo)較強(qiáng)的抗結(jié)核的特異性抗體，并能抵抗毒性結(jié)核桿菌對(duì)機(jī)體的感染。下面再對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不限定本發(fā)明。一.重組質(zhì)粒的構(gòu)建鑒定根據(jù)GenebankAg85B基因序列(BX842578)Ag85B的基因序列共978bp，其中1-120位編碼產(chǎn)物為信號(hào)肽，最后3位TGA為終止密碼，去掉信號(hào)肽及終止密碼，因此，Ag85B的擴(kuò)增區(qū)段位于121-975位。設(shè)計(jì)引物，上游引物為5’-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3’含有EcoRI酶切位點(diǎn)下游引物為5’-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3’含有HindIII酶切位點(diǎn)。引物由上海生工合成。擴(kuò)增反應(yīng)的條件為95℃預(yù)變性3min，以95℃變性50s，57℃退火36s，72℃延伸2min，29個(gè)循環(huán)后，再于72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。將目的條帶切下，用DNA回收試劑盒回收并純化。將純化的PCR產(chǎn)物和載體pGEX-KG用EcoRI和HindIII雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物，在T4DNA連接酶作用下定向?qū)g85B基因片段與pGEX-KG連接，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在LB(Amp+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，用EcoRI和HindIII雙酶切篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒。真核重組質(zhì)粒構(gòu)建方法同上，將鑒定成功的真核重組質(zhì)粒pVAX-1-Ag85B電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌減毒傷寒桿菌LB5000，在LB(kan+及SM+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，用雙酶切鑒定，將鑒定正確的在LB5000中甲基化修飾的真核重組質(zhì)粒pVAX-1-Ag85B再次電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌減毒傷寒桿菌SL7207中，在LB(kan+及SM+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，用雙酶切鑒定。二.原核重組質(zhì)粒pGEX-KGAg85B在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定1.重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定成功的原核重組質(zhì)粒pGEX-KG-Ag85B轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliBL21，在LB(Amp+)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，用EcoRI和HindIII雙酶切鑒定，將含有重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21在LB(Amp+)培養(yǎng)液中，于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。以1％接種于LB(Amp+)培養(yǎng)液中，于37℃培養(yǎng)至OD600nm約為0.6時(shí)，加入終濃度為1mM的IPTG，于30℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4h.離心收集菌體，經(jīng)超聲碎菌后，提取融合蛋白，經(jīng)Glutathione-Sepharose4B親和層析柱進(jìn)行純化。2.SDS-PAGE分析將純化的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE(濃縮膠濃度為5％，分離膠濃度為12％)分析，經(jīng)SDS-PAGE后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色4h，甲醇-冰醋酸脫色液脫色并觀察結(jié)果。3.WesternBlot分析將表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用封閉液(含50g/L脫脂奶粉的TBST)室溫震蕩封閉2h，加入結(jié)核病人血清(1∶500)室溫反應(yīng)1h，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗人IgG，室溫反應(yīng)1h，用二氨基聯(lián)苯氨(DAB)底物液顯色后，觀察結(jié)果。三.人型結(jié)核桿菌H37Rv株攻毒實(shí)驗(yàn)將構(gòu)建正確的減毒傷寒桿菌載體疫苗SL7202(pVAX1-Ag85B)、DNA疫苗pVAX1-Ag85B及陰性、空白對(duì)照，分別免疫實(shí)驗(yàn)小鼠，減毒傷寒桿菌載體疫苗組菌液濃度調(diào)整為2×108/ml，每只小鼠行灌胃500μl，DNA疫苗pVAX1-Ag85B組DNA濃度調(diào)整為100ug/μl，分別于小鼠左右股四頭肌肌肉注射50μl。以減毒傷寒桿菌SL7202空載及空載pVAX-1作為陰性對(duì)照，生理鹽水組作為空白對(duì)照，BCG組及鏈霉素治療組作為陽(yáng)性對(duì)照組。每隔兩周免疫一次，共免疫三次，分別在每次免疫后兩周取小鼠尾靜脈血，末次免疫后兩周處死部分小鼠進(jìn)行體液免疫及細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)，ELISA法檢測(cè)每次免疫后血清中特異性抗體的效價(jià)，顆粒酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞免疫水平的變化。末次免疫兩周后小鼠在ABSL-3(AnimalBiosafetyLevel-3Laboratory)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人型結(jié)核桿菌H37Rv株攻毒實(shí)驗(yàn)，用生理鹽水配置成均懸液1mg/ml.經(jīng)尾靜脈每只小鼠注射同等劑量的菌懸液400μl(相當(dāng)于濕菌0.4mg/只)，分別觀察各組小鼠生存時(shí)間，于攻毒后第70天處死小鼠，作肺臟及脾臟菌落計(jì)數(shù)(CFU)，肺臟、脾臟、肝臟組織作病理切片，HE及抗酸染色觀察病理變化。附表表1.感染BALB/C小鼠半數(shù)死亡時(shí)間(T50)及死亡率比較表1中*p＜0.01，*表示與生理鹽水攻毒組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表2.不同疫苗免疫后，小鼠感染結(jié)核的肺、脾臟菌落計(jì)數(shù)比較表2中a表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差；*p＜0.05，*表示與生理鹽水攻毒組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。參考文獻(xiàn)1.DyeC，WattCJ，BleedD.Lowaccesstoahighlyeffectivetherapyachallengeforinternationaltuberculosiscontrol.BullWorldHealthOrgan，2002；80(6)437-444.2.Telenti，Amalio，Iseman，Michael.Drug-resistanttuberculosiswhatdowedonow.Drug，2000；59(2)171-179.3.WHOvaccinepreventabledisease-2000globalsummary.4.FinePE.VariationinprotectionbyBCGimplicationofandforheterologousimmunity.Lancet，1995；3461339-1345.5.RochePW，TriccasJA，WinterN.BCGvaccinationagainsttuberculosispastdisappointmentsandfuturehopes.TrendsMicrobiol.1995，3(10)397-401.6.McMurrayDN.Recentprogressinthedevelopmentandtestingofvaccinesagainsthumantuberculosis.IntJParasitol，2003；33(5-6)547-554.7.DouglasBY，GrahamRS.Tuberculosisvaccine.BritishMedicalBulletion，2002；6273-78.8.KaufmannSH，AndersenP.ImmunitytoMycobacteriaforrationaldesignofeffectivetuberculosisvacine.ChemImmunol.1998；70(1)21-59.9.HorwitzMA，LeeBW，DillonBJ，etal.ProtectiveimmunityagainsttuberculosisinducedbyvaccinationwithmajorextracellularproteinsofMycobacteriumtuberculosis.ProcNatlAcadSciUSA，1995；92(5)1530-1534.10.DenisO，TangheA，PalflietK，etal，.VaccinationwithplasmidDNAencodingmycobacteriualantigen85AstimulatesaCD4+andCD8+T-cellepitopicrepretoirebroaderthanthatstimulatedbyM.TuberculosisH37Rvinfection.InfectImmunol.1998；66(11)1527-1533.11.LozesE，HuygenK，ContentJ，etal.ImmunogenicityandefficacyofatuberculosisDNAvaccineencodingthecomponentsofthesecretedantigen85complex.Vaccine.1997；15(8)830-83312.BonatoVL，LimaVM，TasconRE，etal.IndentificationandcharacterizationofprotectionTcellsinhsp65DNA-vaccinatedandMycobacteriumtuberculosis-infectmice.InfectImmun，1998；66(1)169-175.13.MontgomeryDL，HuygenK，YawmanAM，etal.InductionofhumoralandcellularimmuneresponsesbyvaccinaionwithM.Tuberculosisantigen85DNA.CellMolBiol.1997；43(3)285-292.14.SinhaRK，Verma1，KhullerGk.Immunobiologicalpropertiesofa30KDsecretoryproteinofMycobacteriumtuberculosisH37Rv.Vaccine，1997；15689-699.15.SinhaRK，KhullerGK.Theprotectiveefficacyofaliposomalencapsulated30KDsecretoryproteinofMycobacteriumtuberculosisH37Raagainsttuberculosisinmice.ImmunolCellBiol，1997；75461-466.序列表<110>武漢大學(xué)<120>攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗<140><141><160>1<170><210>1<211><212>DNA<213>人工序列<220><221><222>(1)...(26)<223>PCR上游引物(p1)<400>15’-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3’<210>2<211><212>DNA<213>人工序列<220><221><222>(1)...(24)<223>PCR下游引物(p2)<400>25’-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3’權(quán)利要求1.一種減毒傷寒桿菌載體疫苗，其特征是一種攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗，該疫苗由包括以下步驟的方法制得(1)原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-Ag85B的制備利用PCR方法對(duì)目的基因即Ag85B的BX842578基因序列中的121-975位進(jìn)行擴(kuò)增，再提取原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG，并經(jīng)酶切回收及鑒定，獲得pGEX-Ag85B；(2)真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Ag85B的構(gòu)建將鑒定成功的原核重組質(zhì)粒pGEX-KG-Ag85B轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌E.coliBL21，經(jīng)培養(yǎng)、陽(yáng)性克隆和酶切鑒定后，使含有重組表達(dá)質(zhì)粒的E.coliBL21在LB(Amp+)培養(yǎng)液中培養(yǎng)、接種和誘導(dǎo)培養(yǎng)，再經(jīng)離心收集菌體及超聲碎菌后，提取融合蛋白，然后經(jīng)純化和鑒定分析，即得到真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-Ag85B；(3)攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗的制備將鑒定正確的pVAX-1-Ag85B電轉(zhuǎn)入減毒傷寒桿菌LB5000及SL7207菌株，并通過(guò)抗生素陽(yáng)性克隆篩選及提取質(zhì)粒酶切鑒定；再經(jīng)動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)疫苗的免疫保護(hù)效力，即得到所述疫苗。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征是在采用PCR方法擴(kuò)增時(shí)，先去掉Ag85B的BX842578基因序列中的1-120位編碼產(chǎn)物及最后3位終止密碼TGA，再對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增；PCR所用的上游引物p1、下游引物p2分別具有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，即上游引物p15’-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3’，含有EcoRI酶切位點(diǎn)，下游引物p25’-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3’，含有HindIII酶切位點(diǎn)。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗，其特征是為口服劑型的抗結(jié)核疫苗。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種攜帶結(jié)核分支桿菌Ag85B的減毒傷寒桿菌載體疫苗，其由包括原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX－Ag85B的制備、真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1－Ag85B的構(gòu)建以及所述抗結(jié)核的減毒傷寒桿菌載體疫苗的制備步驟的方法制得。本發(fā)明首次運(yùn)用了以減毒鼠傷寒桿菌為載體的結(jié)核Ag85B疫苗的有效應(yīng)用研究，開(kāi)辟了一種新型有效的結(jié)核疫苗的途徑；與DNA疫苗等相比的優(yōu)點(diǎn)是，本疫苗能口服，臨床實(shí)用性強(qiáng)，制備簡(jiǎn)易、成本低，通常一次免疫即可誘發(fā)有效抵抗結(jié)核感染的免疫應(yīng)答，并具有安全、高效、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N15/63GK101049508SQ20071005215公開(kāi)日2007年10月10日申請(qǐng)日期2007年5月11日優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日發(fā)明者章曉聯(lián),王坤申請(qǐng)人:武漢大學(xué)