專利名稱：一種檢測多倍體植物基因單核苷酸點突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測多倍體植物在自然條件下所產(chǎn)生的基因內(nèi)單核苷酸點突變之領(lǐng)域，更具體涉及一種檢測具多基因系統(tǒng)(multigene system)的多倍體植物基因核苷酸點突變的方法。在開發(fā)DNA標(biāo)記時，對于能否迅速檢測出DNA變異是很重要的。但以往采用的多為DNA測序法，這不僅需要大量勞力，而且成本也很高。本發(fā)明可迅速檢測大量的SNP(Single Nucleotide Polymorphism)，還可以應(yīng)用于具多基因系統(tǒng)的多倍體品種的識別。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)外有一些檢測植物基因單核苷酸點突變的方法，例如PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP)、PCR-變性梯度凝膠電泳法(PCR-DGGE)、PCR-擴增特異的等位基因分析法(PCR-PASA)等。
PCR-SSCP分析技術(shù)根據(jù)形成不同構(gòu)象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化來檢測基因變異。當(dāng)DNA單鏈自發(fā)形成二級結(jié)構(gòu)時，其構(gòu)象又取決于DNA分子的一級結(jié)構(gòu)。通過放射性核素標(biāo)記自顯影或者銀染，根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳中不同構(gòu)象影響DNA片段的遷移率，來區(qū)分正?；蚺c突變基因。PCR-SSCP技術(shù)的缺點檢測存在假陽性，分析片段的大小受限，強烈依賴實驗條件之選擇，可能會漏檢突變。而本發(fā)明所是用雙色紅外螢光檢測技術(shù)來檢測CEL 1酶切產(chǎn)物，能夠有效排除假陽性條帶。PCR-DGGEDNA分子的穩(wěn)定性主要依靠配對堿基間的氫鍵維系，A-T間有2個氫鍵，G-C間有3個氫鍵。當(dāng)溫度升高到一定程度時，氫鍵斷裂，兩條單鏈分開，習(xí)慣上稱這一溫度范圍的中點為解鏈溫度(Tm)。不同的DNA分子由于堿基組成不同而有各自不同的Tm，當(dāng)一段DNA序列中發(fā)生點突變時其Tm也將隨之發(fā)生變化。PCR-DGGE技術(shù)正是利用了這一原理，在設(shè)計引物時使擴增的目的片段兩端具有不同的Tm值，一端較高，另一端相對較低。同時PCR產(chǎn)物分離所用的聚丙烯酰胺凝膠上事先加入變性劑，并形成由低到高的濃度梯度。當(dāng)PCR產(chǎn)物進行電泳時，不同的DNA片段在特定的濃度位置發(fā)生變性，由雙鏈解離成單鏈，導(dǎo)致片段的遷移率大幅度下降。這樣不同的片段變性時間不同，它們在凝膠中位置也就不同，據(jù)此就可以區(qū)別正常片段與異常片段。PCR-PASA的原理是根據(jù)DNA聚合酶，只有在寡聚核苷酸引物3′末端堿基與模板相應(yīng)堿基完全相配時，才能催化形成磷酸二酯鍵，使引物延伸。如果引物末端3′堿基位對應(yīng)的模板位堿基發(fā)生點突變，則PCR反應(yīng)將無法進行。這樣，通過設(shè)計不同長度的引物，以改變引物3′端堿基的位置，根據(jù)PCR反應(yīng)發(fā)生情況，得知對應(yīng)模板位堿基是否發(fā)生了點突變。
以上方法均存在有成本較高，費時，效率不及EcoTILLING法和本發(fā)明的SuperEcoTILLING法。
EcoTILLING法和本發(fā)明的SuperEcoTILLING法都具有成本低，效率高的特點，但如圖1和圖2所示，一般的EcoTILLING法需從野生型(wild type)植物和變異型(mutant type)植物中分別提取總DNA，然后將兩種DNA按1∶1進行混合；而本發(fā)明的SuperEcoTILLING法不需將來自不同植株的總DNA進行混合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測多倍體植物基因單核苷酸點突變的方法。該方法簡便，它主要用于具有多基因系統(tǒng)的多倍體植物，其優(yōu)點是只需設(shè)計對多基因系統(tǒng)內(nèi)的某兩個目標(biāo)基因具有特異性的一對(兩條)引物進行PCR擴增。其效果很好，方法易行，實驗操作方便，具有百分之百的可重復(fù)性。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是TILLING(Targeting Induced Local Lesions IN Genomes，定向誘導(dǎo)基因組局部突變)法是一種全新的反向遺傳學(xué)(reverse genetics)方法。它將誘發(fā)產(chǎn)生高頻率點突變的化學(xué)誘變方法與PCR篩選技術(shù)和Li-Cor公司生產(chǎn)的4300DNA遺傳分析系統(tǒng)的雙色紅外螢光高通量檢測技術(shù)有效結(jié)合，快速有效地從化學(xué)誘變劑(EMS)誘變產(chǎn)生的突變?nèi)后w中鑒定出點突變，這一全新的，高通量，低成本的反向遺傳學(xué)研究方法大大地方便了植物基因組學(xué)的研究。另外，以自然條件下產(chǎn)生的遺傳變異個體為研究材料的則稱為EcoTILLING。
一般EcoTILLING法是先從野生型(wild type)植物和變異型(mutant type)植物中分別提取總DNA，然后將兩種DNA按1∶1進行混合，再用設(shè)計的一對(兩條)特異性引物進行PCR擴增(兩條引物分別用700nm和800nm螢光染色標(biāo)記)，而后將PCR擴增產(chǎn)物通過變性、退火，得到由野生型和突變型所形成的異源雙鏈核酸分子，再用特異識別并切割錯配堿基的核酸內(nèi)切酶(CEL 1)剪切異源雙鏈核酸分子，最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，分別得到700nm和800nm兩張圖。發(fā)生變異的泳道，在700nm的圖上可以在野生型條帶下方看到一個條帶，同時在800nm的圖上相同泳道也會有一個條帶，這兩條帶就是核酸內(nèi)切酶的剪切產(chǎn)物，兩條帶片段大小之和等于擴增片段的大小，從而很容易對擴增產(chǎn)物進行突變檢測。當(dāng)混合樣品檢測到變異后，要對混合樣品中的每個DNA樣品再次進行篩選，檢測出發(fā)生變異的DNA樣本，并對PCR產(chǎn)物進行測序驗證，再進行突變表型鑒定。
1.在多基因系統(tǒng)的多倍體植物中，具同一功能的基因常常存在有二個或二個以上。例如，在開發(fā)SuperEcoTILLING法時所使用的材料是異源四倍體的水田雜草鴨舌草Monochoria vaginalis(Burm.f.)Kunth，其乙酰乳酸合成酶基因(acetolactate synthase gene，ALS gene)就有四個，分別被命名為ALS1，ALS2，ALS3和ALS4。它們在合成纈氨酸，亮氨酸及異亮氨酸這些分枝氨基酸的途徑的初期反應(yīng)中起催化作用。纈氨酸，亮氨酸及異亮氨酸等分枝氨基酸在植物的細胞分裂過程中起著重要的作用，現(xiàn)在世界上農(nóng)田所使用的大部分除草劑為ALS阻礙劑(ALS inhibitor)，它們所攻擊(抑制)的靶酶就是ALS。一旦ALS遭到ALS阻礙劑的攻擊，分枝氨基酸就不能得以合成。分枝氨基酸不能得以合成就會影響到植物的細胞分裂。細胞分裂不能正常進行，植物最后就會死亡。但是，近年來，在世界各地，由于ALS阻礙劑除草劑的連年使用，已報導(dǎo)有許多雜草對ALS阻礙劑產(chǎn)生了抗性。根據(jù)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在具抗性的變異型鴨舌草中，雖然有四個ALS基因(ALS1，ALS2，ALS3和ALS4)，但其與抗性有關(guān)的點突變常常發(fā)生在ALS1或ALS3的保守部位(Domain A)。
本發(fā)明所采用的技術(shù)方案的第一步就是，首先要找出具有同一功能的兩個目標(biāo)基因，例如本發(fā)明所使用的兩個基因ALS1和ALS3；這兩個基因保守部位的堿基序列是一樣的，但是，當(dāng)該植物出現(xiàn)變異型時，則會在其基因的保守部位出現(xiàn)與野生型(這里所說的野生型是指還沒有發(fā)生變異的，對除草劑呈感受性的生物型)不同的點突變。而變異型是指對除草劑產(chǎn)生了抗性的生物型。
2.從水田雜草鴨舌草的野生型或變異型中提取總DNA，設(shè)計對其多基因系統(tǒng)(ALS1，ALS2，ALS3和ALS4)內(nèi)的兩個目標(biāo)基因(ALS1和ALS3)具有特異性的一對(兩條)引物進行PCR擴增(兩條引物分別用700nm和800nm螢光染色標(biāo)記，其標(biāo)記序列分別為gctacggactgacctcggac和ctgacgtgatgctcctgacg)。一般的EcoTILLING法是把從野生型植物和變異型植物中分別提取的總DNA，按1∶1(例如10μl的野生型植物總DNA+10μl變異型植物的總DNA)進行混合，再用設(shè)計的對ALS1或ALS3一個基因具特異性的一對(兩條)引物進行PCR擴增，而本發(fā)明的SuperEcoTILLING法是用設(shè)計的對同一植物體內(nèi)的多基因系統(tǒng)中的兩個目標(biāo)基因具特異性的一對(兩條)引物(TCTGCATCGCCACCT CG和TGAAGCAGATGGAGGGCAGG)進行PCR擴增。
3.接著將PCR擴增產(chǎn)物通過變性、退火，得到由ALS1和ALS3這兩個基因序列所形成的異源雙鏈核酸分子，再用特異識別并切割錯配堿基的核酸內(nèi)切酶(CEL 1)剪切異源雙鏈核酸分子，最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，分別得到700nm和800nm兩張圖。如果從ALS1和ALS3兩個基因的PCR擴增產(chǎn)物的保守部位檢測到變異，那么說明該個體為變異型，其后要分別設(shè)計僅對兩基因中的一個基因(ALS1或ALS3)具特異性的引物，再次進行篩選，檢測出發(fā)生變異的基因，并對PCR產(chǎn)物進行測序驗證。如果從ALS1和ALS3兩個基因的PCR擴增產(chǎn)物的保守部位沒有檢測到變異，那么說明該個體為野生型，即是還沒有發(fā)生變異的，對除草劑呈感受性的生物型。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果與現(xiàn)有技術(shù)EcoTILLING法相比，本發(fā)明(SuperEcoTILLING法)的優(yōu)點是只需設(shè)計對多基因系統(tǒng)(ALS1，ALS2，ALS3和ALS4)內(nèi)的兩個目標(biāo)基因(ALS1和ALS3)具有特異性的一對(兩條)引物進行PCR擴增。而現(xiàn)有的EcoTILLING法沒有考慮到這一點，它是用分別從野生型植物和變異型植物中提取的總DNA按1∶1進行混合，再用設(shè)計的只對一個基因，ALS1或ALS3，具特異性的一對(兩條)引物來進行PCR擴增。
本發(fā)明的SuperEcoTILLING法具有較好的檢測點突變的效果，方法易行，操作簡便，按照本發(fā)明所記載的內(nèi)容，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員均可百分之百的可重復(fù)性。


圖1為一般EcoTILLING法的示意圖。
一般EcoTILLING法是先從野生型(wild type，在圖1中表示為reference)植物和變異型(mutant type，在圖1中表示為accessions)植物中分別提取總DNA，然后將兩種DNA按1∶1進行混合，再用設(shè)計的一對(兩條)特異性引物進行PCR擴增(兩條引物分別用700nm和800nm螢光染色標(biāo)記)，而后將PCR擴增產(chǎn)物通過變性、退火，得到由野生型和突變型所形成的異源雙鏈核酸分子，再用特異識別并切割錯配堿基的核酸內(nèi)切酶(CEL 1)剪切異源雙鏈核酸分子，最后變性處理后采用雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，分別得到700nm和800nm兩張圖。
圖2為本發(fā)明的SuperEcoTILLING法示意圖本發(fā)明的SuperEcoTILLING法是從水田雜草鴨舌草的野生型或變異型中提取總DNA，設(shè)計對其多基因系統(tǒng)(ALS1，ALS2，ALS3和ALS4)內(nèi)的兩個目標(biāo)基因(ALS1和ALS3)具有特異性的一對(兩條)引物進行PCR擴增(兩條引物分別用700nm和800nm螢光染色標(biāo)記)。在PCR擴增之前不用將總DNA進行混合。這是不同于一般EcoTILLING法(圖1)的重要區(qū)別點。
具體實施例方式
一種檢測多倍體植物基因單核苷酸點突變的方法，其具體步驟如下1.所用材料為具多基因系統(tǒng)的水田雜草鴨舌草。用DNA提取試劑盒(QIAGEN-DNeasy Plant Mini Kit)從具多基因系統(tǒng)的多倍體雜草鴨舌草中提取總DNA；2.設(shè)計對其多基因系統(tǒng)(ALS1，ALS2，ALS3和ALS4，根據(jù)Wang et al.，Discovery of single-nucleotide mutations in acetolactate synthase genes byEcoTILLING，Pestic.Biochem.Physiol.(2006)，doi10.1016/j.pestbp.2006.10.006得到)內(nèi)的兩個目標(biāo)基因(ALS1和ALS3)具有特異性的一對(兩條)引物(其序列分別為TCTGCATCGCCACCTCG和TGAAGCAGATGGAGG GCAGG)進行FirstPCR擴增(兩條引物分別用700nm和800nm螢光染色標(biāo)記，其標(biāo)記序列分別為gctacggactgacctcggac和ctgacgtgatgctcctgacg)。即，順向引物序列為gctacggactgacctcggacTCTGCATCGCCACCTCG，反向引物序列為ctgacgtgatgctcctgacgTGAAGCAGATGGAGGGCAGG。
First PCR反應(yīng)液的組成如下10×EX Buffer 2.0μl2.5mM dNTP mix1.6μlEX Taq0.08μlSterile water 12.12μlPrimer 1(10μM) 0.6μlPrimer 2(10μM) 0.6μlDNA(0.5ng/μl)3.0μlTotal 20.0μlFirst PCR反應(yīng)條件如下1Cycle 95℃ 2分35Cycles95℃ 1分60℃ 1分72℃ 1分1Cycle 72℃ 7分Final 4℃3.由于所設(shè)計的引物是對兩個目標(biāo)基因(ALS1和ALS3)具有特異性的，所以擴增到的PCR產(chǎn)物中既有ALS1基因也有ALS3基因；4.First PCR反應(yīng)完成后，往各PCR管內(nèi)加90μl滅菌蒸溜水與PCR產(chǎn)物混合，然后將PCR管內(nèi)的混合物全部轉(zhuǎn)入到密理博96孔濾膜板(MILLIPORE multi screen plate)內(nèi)，在室溫(20-25℃)條件下抽真空干燥。抽干后再加120μl滅菌蒸溜水到密理博96孔濾膜板的各孔內(nèi)，再次抽真空干燥。最后再加30μl滅菌蒸溜水到各個孔內(nèi)，置搖蕩器上搖蕩一分鐘左右。
5.將以上純化了的PCR產(chǎn)物稀釋1/20倍(5μl純化后的PCR產(chǎn)物+95μl滅菌蒸溜水)，用做Second PCR的Template DNA。
6.緊接著進行Second PCR，由于螢光引物被使用，在操作過程中應(yīng)避免光照。
Second PCR反應(yīng)液的組成如下10×EX Buffer 1.0μl2.5mM dNTP mix 0.8μlEX Taq 0.04μlSterile water 5.76μlPrimer 1(1μM) 0.2μl(序列g(shù)ctacggactgacctcggac)Primer 2(1μM) 0.2μl(序列ctgacgtgatgctcctgacg)DNA 2.0μlTotal 10.0μlSecond PCR反應(yīng)條件如下1Cycle 95℃ 2分35Cycles95℃ 1分60℃ 1分72℃ 1分1Cycle 72℃ 7分1Cycle 99℃ 10分70Cycles70℃ 20秒(-0.3℃ per cycle)Final 4℃7.接著將PCR擴增產(chǎn)物通過變性、退火，得到由兩個目標(biāo)基因(即ALS1基因和ALS3基因)序列所形成的異源雙鏈核酸分子；再用特異識別并切割錯配堿基的核酸內(nèi)切酶(CEL1)剪切異源雙鏈核酸分子；8.變性處理后采用Li-Cor公司生產(chǎn)的4300DNA遺傳分析系統(tǒng)進行雙色聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，分別得到700nm和800nm兩張圖(見圖2)；如果在保守部位檢測到變異，那么說明該個體為變異型，其后要分別設(shè)計僅對兩個目標(biāo)基因中的一個基因(ALS1或ALS3)具特異性的引物，再次進行篩選，檢測出發(fā)生變異的基因，并對PCR產(chǎn)物進行測序驗證，以確認(rèn)變異是發(fā)生在ALS1基因上還是發(fā)生在ALS3基因上。
9.如果在保守部位沒有檢測到變異，那么說明該個體為野生型。
權(quán)利要求
1.一種檢測多倍體植物基因單核苷酸點突變的方法，包括下列步驟A、所用材料為多基因系統(tǒng)的水田雜草鴨舌草，用DNA提取試劑盒從鴨舌草中提取總DNA；B、設(shè)計對基因系統(tǒng)/ALS1、ALS2、ALS3和ALS4內(nèi)的兩個目標(biāo)基因/LS1和ALS3具特異性的一對引物，其序列分別為TCTGCATCGCCACCTCG和TGAAGCAGATGGAGG GCAGG，行First PCR擴增/兩條引物分別用700nm和800nm螢光染色標(biāo)記，其標(biāo)記序列分別為gctacggactgacctcggac和ctgacgtgatgctcctgacg，順向引物序列為gctacggactgacctcggacTCTGCATCGCCACCTCG，反向引物序列為ctgacgtgatgctcctgacgTGAAGCAGATGGAGGGCAGG；C、所設(shè)計的引物僅對兩個目標(biāo)基因/ALS1和ALS3具特異性，擴增到的PCR產(chǎn)物中既有ALS1基因也有ALS3基因；D、First PCR反應(yīng)完成后，往PCR管內(nèi)加90μl滅菌蒸溜水與PCR產(chǎn)物混合，然后將PCR管內(nèi)的混合物全部轉(zhuǎn)入到密理博96孔濾膜板內(nèi)，在室溫條件下抽真空干燥，抽干后再加120μl滅菌蒸溜水到密理博96孔濾膜板的各孔內(nèi)，再次抽真空干燥，最后再加30μl滅菌蒸溜水到各個孔內(nèi)，置搖蕩器上搖蕩；E、將以上純化了的PCR產(chǎn)物稀釋1/20倍/5μl純化后的PCR產(chǎn)物+95μl滅菌蒸溜水，用做Second PCR的Template DNA；F、接著進行Second PCR，螢光引物被使用，在操作過程中避免光照；G、接著將PCR擴增產(chǎn)物通過變性、退火，得到由兩個目標(biāo)基因/ALS1基因和ALS3基因序列所形成的異源雙鏈核酸分子；再用特異識別并切割錯配堿基的核酸內(nèi)切酶剪切異源雙鏈核酸分子；H、變性處理后采用DNA遺傳分析系統(tǒng)進行雙色聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別得到700nm和800nm兩張圖；其后分別設(shè)計兩個目標(biāo)基因中的一個基因/ALS1或ALS3具特異性的引物，再次進行篩選，檢測出發(fā)生變異的基因，并對PCR產(chǎn)物進行測序驗證，以確認(rèn)變異是發(fā)生在ALS1基因上還是發(fā)生在ALS3基因上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測多倍體植物基因單核苷酸點突變的方法，其步驟是首先所用材料為具多基因系統(tǒng)的水田雜草鴨舌草；第二是選擇ALS1基因和ALS3基因；第三是提取總DNA后，用僅對兩個目標(biāo)基因/ALS1和ALS3具特異性的引物，進行PCR擴增；第四是將PCR擴增產(chǎn)物通過變性、退火，得到異源雙鏈核酸分子；第五是用特異識別并切割錯配堿基的核酸內(nèi)切酶剪切異源雙鏈核酸分子；第六是變性處理后用遺傳分析系統(tǒng)進行雙色聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別得到兩張圖；第七是該個體為變異型時，設(shè)計引物，進行篩選，檢測發(fā)生變異的基因，并進行測序驗證；第八是沒有檢測到變異，為野生型。本發(fā)明方法易行，操作簡便，且有較好的檢測點突變的效果，具有百分之百的可重復(fù)性。
文檔編號C12Q1/68GK101054602SQ200710051668
公開日2007年10月17日 申請日期2007年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月15日
發(fā)明者汪光熙, 李偉 申請人:中國科學(xué)院武漢植物園