專利名稱：一種檢測傷寒沙門菌的rt-lamp試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種檢測傷寒沙門菌的逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(RT-LAMP)試劑盒。
背景技術(shù)：
傷寒沙門菌(Salmonella Typhi)是引起傷寒的病原菌，傷寒是一種急性全身系統(tǒng)性傳染病。該病傳染性強，病程長，可反復(fù)發(fā)作，患者需住院隔離治療，使得個人和社會的疾病負擔(dān)很重，是我國《傳染病防治法》中規(guī)定報告的乙類傳染病之一，也是全球特別是發(fā)展中國家共同面臨的公共衛(wèi)生問題。目前，傷寒確診以從血液、骨髓或糞便標本中分離到傷寒沙門菌為依據(jù)，其中血培養(yǎng)是標準的檢測方法，陽性率可達60-80%。該檢查方法不但費時(3-5天)費力，且檢出率易受病程，采血量及患者是否服用抗生素等因素的影響。分離培養(yǎng)難以達到快速的要求，血清學(xué)診斷存在特異性、準確性差的問題，臨床上，單憑癥狀難以區(qū)分傷寒和副傷寒。因此有必要開發(fā)靈敏的早期檢測方法。目前，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用和病原體本身耐藥、變異等諸多因素的影響，近年傷寒的復(fù)發(fā)率增高，臨床表現(xiàn)很不典型，給早期臨床診斷和治療帶來很大的困難隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前已有多種PCR方法用于傷寒沙門菌的檢測，雖在靈敏度方面有所改進，但由于需要精密儀器的配套使用，同樣也無法滿足基層和現(xiàn)場檢測的需求。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴增技術(shù)(loop-mediatedisotherm amplification,LAMP)是由Notomi于2000年開發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴增方法，其原理是利用一種鏈置換DNA聚合酶(BstDNApolymerase)和兩對特殊的引物,特異地識別祀序列上的6個獨立區(qū)域,在等溫條件下(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)。近年來，國外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。Hong TC等人(2004)根據(jù)LAMP的原理設(shè)計了實時定量RT-LAMP方法，以快速檢測SARS-CoV，結(jié)果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(2007)建立了快速診斷H5N1禽流感病毒的RT-LAMP檢測體系。LAMP還可以檢測細菌、真菌等病原微生物，其靈敏度和特異性都有很好的體驗。但目前尚未見該方法在傷寒沙門菌檢測中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于檢測傷寒沙門菌(Salmonella Typhi)的特異性RT-LAMP引物組。本發(fā)明另一目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性操作簡單的LAMP檢測試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，通過對分離到的48株傷寒沙門菌STY1381基因和NCBI已報道、的STY1381基因序列比對，通過BLAST軟件進行序列同源性分析，找到特異性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測傷寒沙門菌的靶序列。進一步，本發(fā)明還提供用于特異性擴增上述靶序列的引物組合。本發(fā)明提供了一種用于檢測傷寒沙門菌的特異性RT-LAMP引物組合，包括以下6條引物F3 :5’ -GACTT GCCTTTAAAAGATACCA-3’ ；B3 :5， -AGAGTGCGTTTGAACACTT-3，；FIP :5’ -AACTTGCTGCTGAAGAGTTGGA-CCGAATGACTCGACCATC-3’ ；BIP :5’ -CCTGGGGCCAAATGGCATTA-TGCACTAAGTAAGGCTGG-3，；LF :5，-TCGGATGGCTTCGTTCCT-3，；LB :5，-CAAGGGTTTCAAGACTAAGTGGTTC-3，。本發(fā)明提供了上述引物組合在制備傷寒沙門菌的檢測試劑盒或檢測試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種含有上述6條引物的檢測試劑。本發(fā)明提供了一種含有上述6條引物的傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明的試劑盒還包含RT-LAMP反應(yīng)液，與RT-LAMP弓丨物共同構(gòu)成LAMP檢測體系；25iiL RT-LAMP檢測體系的具體配置為10 y M的F3、B3各0. 25 y L ;10 y M的FIP、BIP各 L ;10ii M 的 LF、LB 各 I ii L ;2X 反應(yīng)混合 buffer 12. L，其含 40mM Tris-HCl, pH
8.8,20mM KCl, 16mM MgSO4, 20mM(NH4) 2S04,0. 2 % Tween20，I. 6M 甜菜堿和 2. 8mM dNTPs,I ill的Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合物，5 u L的模板RNA。所述試劑盒的檢測反應(yīng)條件為65°C恒溫lh，然后終止反應(yīng)。本發(fā)明還提供了一種檢測傷寒沙門菌(Salmonella Typhi)的方法,用上述6條RT-LAMP引物進行RT-LAMP反應(yīng)，將比濁度彡0. I的擴增結(jié)果判定為RT-LAMP反應(yīng)陽性。其中，所述RT-LAMP反應(yīng)條件為65°C恒溫Ih。結(jié)果判定方法為對于比濁度彡0. I的擴增結(jié)果判定為RT-LAMP反應(yīng)陽性。本發(fā)明的傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測試劑盒利用35個血清型的純培養(yǎng)甲型副傷寒和非傷寒沙門菌菌株、常見非沙門致腹瀉病原菌以及發(fā)熱為主要癥狀常見病原菌RNA評價該方法的特異性及敏感性，同時對傷寒沙門菌全血模擬標本及糞便模擬標本進行檢測下限確定。結(jié)果顯示，利用該方法檢測48株傷寒沙門菌均陽性，其余34種非傷寒沙門菌血清型、致腹瀉的其他5種腸道致病菌以及發(fā)熱為主要癥狀的8種常見非沙門菌均擴增陰性，說明該方法的特異性良好，達100 %。在對純菌總RNA檢測中，RT-LAMP的最低檢測限為5pg/反應(yīng)，約為1800個拷貝/反應(yīng)。在以全血模擬樣品提取核酸為模板的檢測中，最低檢測限達70cfu/mL。對糞便模擬標本的檢測中，對增菌前樣品即原始樣品檢測下限為lOOOcfu/g;增菌后樣品檢測下限為I. 7cfu/g，說明本發(fā)明的檢測試劑盒具有很高的靈敏度。本發(fā)明RT-LAMP檢測試劑盒檢測傷寒沙門菌整個試驗只需要Ih左右即可，相對于常規(guī)PCR反應(yīng)要4 5h才能完成檢測，大大縮短了檢測時間；在特異性和重復(fù)性檢驗中，該方法有很高的可靠性，并且操作簡單。利用發(fā)明的傷寒沙門菌RT-LAMP快速檢測試劑盒對傷寒沙門菌進行了檢測，檢測陽性率達到100%，在設(shè)計引物時候特別選取了傷寒沙門菌STY1381基因的保守區(qū)，所以該試劑盒可快速、靈敏地檢測出傷寒沙門菌，其操作簡單，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及臨床標本的檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。


圖I為不同引物濃度下RT-LAMP擴增曲線圖；其中a :F3和B3各5pmol，F(xiàn)IP和BIP各 40pmol ；b F3 和 B3 各 5pmol，F(xiàn)IP 和 BIP 各 20pmol ；c F3 和 B3 各 IOpmol，F(xiàn)IP 和 BIP 各40pmol ；d F3 和 B3 各 IOpmol，F(xiàn)IP 和 BIP 各 20pmol ；NC :陰性對照。圖2為RT-LAMP檢測純菌RNA擴增曲線圖；b_f :模板濃度分別為5，0. 5,0. 05， 0.005,0. 0005/反應(yīng)；a :陽性對照；NC :陰性對照。圖3為RT-LAMP檢測模擬血標本RNA擴增曲線圖；a_e :樣品對應(yīng)的菌液濃度為7000、700、70、7、0. 7cfu/ml ；NC :陰性對照。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所用的菌種沙門菌屬菌株、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌均為本實驗室保存，其中傷寒沙門菌48株，甲型、乙型和丙型副傷寒沙門菌以及其他31種非傷寒沙門菌血清型共57株(表I),所有血清型均使用丹麥SSI (Statens Serum Institut)沙門菌抗血清(購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司)進行血清型鑒定。另外，其他腸道常見病原菌及引起發(fā)熱并可在血液標本中分離到的肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團菌、腦膜炎奈瑟菌、立克次體、布魯氏菌等菌株作為檢測傷寒沙門菌的特異性及敏感性評價對比菌株，來自中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所。實施例I引物的設(shè)計I、特異性DNA序列查找從GenBank檢索獲得多株傷寒沙門菌基因組序列，通過BLAST軟件進行序列同源性分析即找到STY1381基因的特異性的保守靶序列進行RT-LAMP引物設(shè)計，該特異性保守靶序列如SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列。2、引物的設(shè)計針對靶序列設(shè)計六條引物，包括兩條內(nèi)引物(FIP和BIP)和兩條外引物(F3和B3)和兩條環(huán)引物(LF和LB)，其核苷酸序列如下F3 :5’ -GACTTGCCTTTAAAAGATACCA-3’ ；B3 :5， -AGAGTGCGTTTGAACACTT-3，；FIP :5’ -AACTTGCTGCTGAAGAGTTGGA-CCGAATGACTCGACCATC-3，；
BIP :5’ -CCTGGGGCCAAATGGCATTA-TGCACTAAGTAAGGCTGG-3，；LF:5，-TCGGATGGCTTCGTTCCT-3，；LB :5，-CAAGGGTTTCAAGACTAAGTGGTTC-3，。 實施例2傷寒沙門菌RT-LAMP檢測方法的建立I、血模擬標本的制備及RNA提取取新鮮培養(yǎng)4-6小時細菌(最終菌落計數(shù)為3. 5X108cfu/ml)，10倍梯度系列稀釋為IO6 IO1CfuAil,取各稀釋度菌液3. 3毫升分別與同體積新鮮人抗凝血混勻，室溫 放置30分鐘后，作為全血模擬標本。利用QIAamp UCP PurePathogen Blood fieldtestKit(QIAGEN公司)對上述模擬標本進行傷寒沙門菌RNA的提取，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。同時以不加菌的血液作為陰性對照平行進行RNA提取。最終提取的RNA溶解到50 ill不含RNase的無菌純水中，取其中5 U I作模板，進行RT-LAMP反應(yīng)。同時，取系列稀釋菌液進行菌落計數(shù)，測定模擬標本中準確細菌含量。2、糞便模擬標本制備及RNA提取2. I取新鮮培養(yǎng)4-6小時細菌(最終菌落計數(shù)為3. 5 X 108cfu/ml)，梯度系列稀釋為IO4 10^5,1,0. 5,0. 25,0. 125cfu/ml。然后取以上菌液各500ul與3g健康人糞便混勻。2. 2 取 2. I 項中的混合樣品 0. 2g，加入 200ul TElOmmol/LTris-HCl (pH 8. 0)，lmmol/L EDTA (pH 8. 0),蝸旋震蕩，IOOOrpm離心I分鐘,去掉沉淀,上清8000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀用Iml TE重懸，震蕩，8000rpm 5分鐘，棄上清，保留沉淀，用IOOuITE懸菌，水煮10分鐘，8000rpm 5分鐘，保留上清，去沉淀。此上清為增菌前樣品粗提核酸。2. 3在2. I項中的樣品中各加入SC增菌液(亞硒酸鹽增菌液)5ml，混勻，37°C培養(yǎng)過夜。第2天取增菌后樣品1ml，如步驟2. 2中，制備增菌后樣品核酸粗提品。3、純培養(yǎng)細菌RNA提取純菌RNA提取使用RNeasy Minikit (QIAGEN公司)，操作步驟均嚴格按照說明書進行。4、RT-LAMP 反應(yīng)分別在不同的溫度(61°C至65°C)反應(yīng)lh，最終通過擴增陽性結(jié)果出現(xiàn)的時間，獲得最佳反應(yīng)參數(shù)。由于在65°C反應(yīng)Ih的條件下擴增最快，優(yōu)選在此條件下進行反應(yīng)。在65°C反應(yīng)Ih對不同濃度的內(nèi)外引物的反應(yīng)體系進行優(yōu)化反應(yīng)，通過擴增陽性結(jié)果出現(xiàn)的時間作為反應(yīng)的最終濃度，結(jié)果兩條外引物F3、B3濃度各為5pmoI，兩條內(nèi)引物FIP、BIP濃度各為40pmol的條件下，擴增最快。可參見圖I。因此，得到優(yōu)化的檢測體系(25 U L)如下IOuM 的 F3、B3 各 0. 25 y L ; 10 y M 的 FIP、BIP 各 L ;10iiM 的 LF、LB 各
IU L ；2X 反應(yīng)混合 buffer 12. 5 y L，其含 40mM Tris-HCl, pH8. 8,20mM KCl, 16mM MgSO4,20mM(NH4)2SO4jO. 2% Tween20,1. 6M 甜菜堿和 2. 8mM dNTPs, I ii I 的 Bst DNA 聚合酶和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合物，5 u L的模板RNA I ii L酶，5 ii L模板。檢測反應(yīng)條件65°C恒溫Ih,終止反應(yīng)。使用Loopamp RNA Amplification Kit (日本榮研公司)試劑進行 RT-LAMP反應(yīng)體系的設(shè)立，總反應(yīng)體系為25 Ii I,其中2Xreaction mix buffer 12. 5 u I (含40mMTris-HCl [pH 8. 8], 20mM KCl, 16mMMgS04, 20mM(NH4) 2S04,0.2% Tween20，I. 6M 甜菜堿和
2.8mMdNTPs)，兩條外引物F3、B3各5pmol，兩條內(nèi)引物FIP、BIP各40pmol，兩條環(huán)引物各20pmol, Iul的酶混合物,5 V- I的模板RNA。在日本榮研公司的Realtime Turbidimeter LA-320C儀器上進行等溫擴增反應(yīng)并記錄結(jié)果，本研究傷寒沙門菌RT-LAMP反應(yīng)條件為65°C，60分鐘，對于比濁度> 0. I的擴增結(jié)果判定為RT-LAMP反應(yīng)陽性。實施例3RT-LAMP檢測試劑盒特性評價I、RT-LAMP擴增特異性和敏感性利用本發(fā)明的試劑盒共進行了 48種136株細菌的RT-LAMP檢測(見表I)，其中48株傷寒沙門菌均陽性。沙門菌屬其他34種血清型均擴增陰性。對其他常見腹瀉病原(霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀菌、致瀉性大腸埃希菌)亦擴增陰性。而且，臨床其他常見發(fā)熱病原菌包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、嗜肺軍團菌、腦膜炎奈瑟氏菌、立克次體、布魯氏菌均擴增陰性，說明本研究篩選到的RT-LAMP引物以及由這些引物組裝的檢測試劑盒具有較高的菌種和血清型特異性及敏感性，均達100%。
表I傷寒沙門菌RT-LAMP特異性及敏感性檢測
權(quán)利要求
1.一種用于檢測傷寒沙門菌(Salmonella Typhi)的靶序列，其具有SEQ ID NO. 7所示的序列或其特異性片段。
2.用于擴增權(quán)利要求2所述靶序列的特異性引物組合。
3.一種用于檢測傷寒沙門菌(Salmonella Typhi)的特異性RT-LAMP引物組合，包括以下6條引物F3 :5’ -GACTTGCCTTTAAAAGATACCA-3’ ；B3 :5’ -AGAGTGCGTTTGAACACTT-3’ ；FIP :5’ -AACTTGCTGCTGAAGAGTTGGA-CCGAATGACTCGACCATC-3’ ；BIP :5’ -CCTGGGGCCAAATGGCATTA-TGCACTAAGTAAGGCTGG-3，；LF :5，-TCGGATGGCTTCGTTCCT-3，；LB :5’ -CAAGGGTTTCAAGACTAAGTGGTTC-3’。
4.權(quán)利要求3所述的引物組合在制備傷寒沙門菌的檢測試劑盒或檢測試劑中的應(yīng)用。
5.一種含有權(quán)利要求3所述引物組合的檢測試劑。
6.一種含有權(quán)利要求3所述引物組合的傷寒沙門菌的RT-LAMP檢測試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包含RT-LAMP反應(yīng)液，與RT-LAMP引物共同構(gòu)成LAMP檢測體系；25 u L RT-LAMP檢測體系的具體配置為25 u L RT-LAMP檢測體系的具體配置為 10 ii M 的 F3、B3 各 0. 25 ii L ;10 ii M 的 FIP,BIP 各 2 y L ; 10 y M 的 LF、LB 各I U L ；2X 反應(yīng)混合 buffer 12. 5 y L，其含 40mM Tris-HCl, pH 8. 8,20mMKCl, 16mM MgSO4,20mM(NH4)2SO4jO. 2% Tween20,1. 6M 甜菜堿和 2. 8mM dNTPs, I ii I 的 Bst DNA 聚合酶和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合物，5 u L的模板RNA。
8.—種檢測傷寒沙門菌(Salmonella Typhi)的方法,其特征在于,用權(quán)利要求3所述的引物組合進行RT-LAMP反應(yīng)，將比濁度彡0. I的擴增結(jié)果判定為RT-LAMP反應(yīng)陽性。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測方法，其特征在于，RT-LAMP反應(yīng)條件為65°C恒溫lh。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測傷寒沙門菌(Salmonella Typhi)的RT-LAMP試劑盒，所述試劑盒包含有六條RT-LAMP引物，與RT-LAMP反應(yīng)液一起構(gòu)成檢測體系，本發(fā)明的六條RT-LAMP引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-6所示。本發(fā)明的試劑盒可快速、靈敏地檢測目前流行的傷寒沙門菌，在對純菌總RNA檢測中，本發(fā)明試劑盒的最低檢測限為5pg/反應(yīng)。其操作簡單，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及臨床標本的檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N15/11GK102643902SQ20121009340
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者樊粉霞, 閆梅英, 闞飆 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所