專利名稱：檢測乙型肝炎病毒DNA及其G₁₈₉₆A突變的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測野生型及G1896A突變型的乙型肝炎病毒DNA的方法，特 別是涉及一種使用鎖核酸(LNA， Locked Nucleic Acids)和分子信標探針結(jié)合的 技術(shù)進行實時PCR的檢測方法。本發(fā)明還進一步涉及用于該臨床檢測的試劑盒。
背景技術(shù)：
病毒性乙型肝炎(HB， hepatitis B)是一種世界性的傳染性疾病(Lok AS, Heathcote EJ, Hoofhagle JH. Gastroenterology 2001; 120:1828-1853)。我國是HBV 感染的高發(fā)區(qū)，約50-70%的人群受過HBV的感染，約8-12。/。的人群為慢性HBV 感染者。目前全世界每年約有120萬人死于HBV感染引起的疾病。乙型肝炎病 毒感染不僅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且還與肝硬化(liver cirrhosis, LC) 和肝細胞癌(hepatocellularcarcinoma, HCC)的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。
臨床上HBeAg轉(zhuǎn)陰以及HBeAb陽性常常被認為是HBV病毒復(fù)制減少、肝 損傷和肝癌危險性減輕以及治療可以終止的指標。然而近期發(fā)現(xiàn)，許多患者盡管 HBeAg是陰性的，但病毒仍大量復(fù)制，肝損傷程度也很嚴重(即所謂的HBeAg 陰性慢性乙型肝炎)。近年來的臨床與基礎(chǔ)研究均表明，HBeAg陰性慢性乙型肝 炎在慢性乙型肝炎患者中所占的比例逐年增大，其在臨床表現(xiàn)、預(yù)后、抗病毒治 療方案與應(yīng)答等諸多方面與HBeAg陽性慢性乙型肝炎存在著顯著差異。研究表 明，HBeAg陰性慢性乙型肝炎是由于HBV基因組發(fā)生變異引起的。
HBV基因組共含有4個基因區(qū)，分別為S， C， P， X基因區(qū)，每個基因 區(qū)構(gòu)成一個獨立的開放閱讀框(ORF， open reading frame)。 C基因區(qū)又包括兩 部分前C (pre-C)區(qū)和C區(qū)。HBeAg是C基因區(qū)的表達產(chǎn)物，該基因區(qū)的5' 端發(fā)生突變常導(dǎo)致HBeAg分泌量的減少，且最常見的突變有兩種 一是C基因 啟動子處的1762 (A—T， A1762T)和1764 (G— A， G1764A)雙突變(Okamoto H, Tsuda F， Akahane Y， Sugai Y, Yoshiba M, Moriy咖a K， et al. J Virol 1994; 68:
8102-8110)，該突變導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的改變(Buckwold VE， Xu Z, Chen M, Yen TS, Ou JH. J Virol 1996; 70: 5845-5851 and Li J， Buckwold VE, Hon MW， Ou JH. J. J Virol 1999; 73: 1239-1244.)，以至于前C區(qū)mRNA的減少，從而減少了 HBeAg的合成；二是前C (pre-C)區(qū)的1896位點(G—A， G1896A)發(fā)生的突 變，該突變導(dǎo)致該區(qū)第28個密碼子成為終止密碼子，使得HBeAg的翻譯提前終 止，從而也減少了HBeAg的合成。有證據(jù)表明，HBeAg陰性突變體的主要原因 (占60—80%)就是由于pre-C區(qū)的1896位點(G—A， G1896A)發(fā)生突變引起 的(Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, Karayiannis P, McGarvey MJ, Makris A， et al. Lancet 1989; 2: 588-591)。
近期研究又發(fā)現(xiàn)，pre-C區(qū)的G則6A突變主要發(fā)生在HBV的B、 C和D型 標本中，可能與急性肝炎的發(fā)生相關(guān)(Annie Pang， Man-Fung Yuen, He-Jun Yuan, Ching-Lung Lai, Yok-Lam Kwong, Journal of H印atology 2004; 40:1008-1017)。 又有證據(jù)證明pre-C區(qū)的G1896A突變是與HBV的持續(xù)性感染以及原發(fā)性肝癌的 發(fā)生有關(guān)。然而，不管G則6A突變是與急性肝炎的發(fā)生還是與HBV的持續(xù)性感 染相關(guān)，它的檢測在抗乙型肝炎病毒的診療、預(yù)后及病毒自然史的研究中都有著 十分重要的指導(dǎo)意義。
pre-C區(qū)突變常常是通過PCR擴增后測序確定，或者通過線性探針檢測 (Stuyver L, De Gendt S， Cadranel JF, Van Geyt C, Van Reybroeck G Dorent R, et al. Hepatology 1999; 29: 1876-1883);更近的方法有通過TaqMan-MGB探針來檢測 (Annie Pang, Man-Fung Yuen, He-Jun Yuan, Ching-Lung Lai， Yok-Lam Kwong. Journal ofHepatology 2004; 40: 1008-1017)。然而測序方法比較麻煩，而且對雜合 體的檢測靈敏度有很大的局限性(一般<20% )(Therese L. Waltz, Salvatore Marras, Gemma Rochford, John Nolan， Eugenia Lee， Margherita Melegari, and Henry Pollack, Journal of Clinical Microbiology 2005; 1:254-258);線性探針(如TaqMan探針) 用于SNPs(single nucleotide polymorphisms)的檢測特異性不太好(Marras S.A.E, Kramer F,R., Tyagi S. The Humana Press Inc. 2003; 212: 111-128);而TaqMan-MGB 探針的合成價格極其昂貴，而且合成該探針的廠家極少，探針合成來源受到限制。 分子信標探針則恰恰能彌補上面那些方法的不足，已被證明是一種新穎的可用于 檢測SNPs的好方法(Marras SA, Kramer FR, Tyagi S. Methods Mol. Biol. 2003; 212:
111-128)。盡管如此，本實驗室初步的實驗結(jié)果卻表明，常規(guī)的分子信標探針的
臂和環(huán)必須都相對較短才能使得它對野生型HBV DNA及其G1896A突變的檢測
特異性達到要求，而且這種相對較短的分子信標探針檢測時所采用的PCR程序
也必須與常規(guī)的實時PCR程序不同，它必須在低溫(比退火溫度低的溫度)下
檢測熒光。這就無形中延長了整個PCR程序的運行時間。
為了解決這個問題，我們采用了鎖核酸(LNA， Locked Nucleic Acids)技術(shù)。
鎖核酸(LNA， Locked Nucleic Acids) —詞是1998年Koshkin et al.首先提出來
的，它是指一種寡核苷酸衍生物，該衍生物中含有一個或幾個結(jié)構(gòu)特殊的核苷酸
單體，這種核苷酸單體是在核糖的2'-0與4'-C間通過不同的縮水作用形成氧亞
甲基橋、硫亞甲基橋或胺亞甲基橋，形成了剛性的縮合結(jié)構(gòu),增加了磷酸鹽骨架的
局部結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。與常規(guī)的寡核苷酸探針相比，鎖核酸探針與單鏈互補的靶
DNA或RNA的親和力更強；且探針的融解溫度(Tm)有相當程度的提高，這
樣就可以使用較短的探針在常規(guī)的溫度下檢測SNPs (Luis A. Ugozzoli, David
Latorra， Randi Pucket, Khalil Arar, and Keith Hamby, Analytical Biochemistry 2004;
324:143-152);而且鎖核酸探針對SNPs檢測的特異性也增強。所以，本發(fā)明利
用鎖核酸和分子信標探針結(jié)合的技術(shù)以及實時PCR方法，試圖靈敏且特異地檢
測出臨床血液標本中野生型及G1896A突變型的乙型肝炎病毒DNA。
發(fā)明目的
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測臨床血液標本中野生型及G朋6A突變型的 乙型肝炎病毒DNA的方法，特別是提供了一種使用鎖核酸和分子信標熒光探針 結(jié)合技術(shù)的實時PCR檢測方法。
本說明書中所使用的術(shù)語"G,896A突變"是指乙型肝炎病毒DNA序列的第 1896位點發(fā)生了堿基突變，從堿基G變成堿基A。
本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟(1)從待檢的血液標本中提取病毒DNA; (2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信標探針(該探針是鎖核酸LNA，即 Locked Nucleic Acids)，對提取的病毒DNA進行實時PCR以擴增包含1896位點 的耙DNA片段，并對野生型和G1896A突變型的乙型肝炎病毒DNA進行檢測； (3)根據(jù)實時PCR的擴增曲線，分析并判斷標本中乙型肝炎病毒DNA是野生 型的還是G1896A突變型的。該方法的特征在于聚合酶鏈反應(yīng)體系中使用的正向
和反向引物分別是-
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID N0:2)
并且實時PCR反應(yīng)中所用的野生型和G1896A突變型的分子信標探針(都屬于 LNA)分別是
(3) 5， -FAM-CAACGCTTT^GCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT|GGCCA0GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框標記的堿基是進行LNA化的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的待檢血液標本是指含有乙型肝炎 病毒DNA的血液標本。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的分子信標探針的特征是探針的 環(huán)部分含16個堿基，探針的臂部分含5個堿基。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的野生型的分子信標探針是用來檢 測血液標本中野生型的乙型肝炎病毒DNA;而所說的G1896A突變型的分子信標 探針則是用來檢測含G1896A突變的乙型肝炎病毒DNA， 二者都是經(jīng)LNA化的。 其中前者5'端標記有HEX熒光基團，3'端標記有DABCYL淬滅基團，而后 者的5'端則是標記FAM熒光基團，3'端也是標記DABCYL淬滅基團。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的實時PCR擴增所用的程序是 50°C 120秒(l個循環(huán))~~ 95°C 180秒(l個循環(huán))95°C 10秒，56°C 30秒(40個循環(huán))。其中56t:是檢測熒光的溫度。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測野生型及G則6A突變型的乙型肝炎病毒 DNA的試劑盒，該試劑盒包括(1)血液標本中乙型肝炎病毒DNA提取試劑；
(2)聚合酶鏈反應(yīng)混合液；(3)酶混合液；(4)突變型陽性對照；(5)野生型 陽性對照；(6)陰性對照。其特征在于聚合酶鏈反應(yīng)體系中使用的正向和反向引 物分別是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)
并且實時PCR反應(yīng)中所用的野生型和G1S96A突變的分子信標探針(都屬于LNA) 分別是 (3) 5， -FAM-CAACGCTTT^GCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5' -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框標記的堿基是進行LNA化的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的DNA提取試劑由提取液A、提 取液B和提取液C組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的聚合酶鏈反應(yīng)混合液由lOxPCR buffer、 dUTPs、正反向兩條引物、野生型和突變型分子信標探針等組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的酶混合液由普通Taq酶和UNG 酶組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的突變型陽性對照是是經(jīng)過測序確 認過的含G1896A突變的HBV DNA片段的質(zhì)粒；野生型對照是經(jīng)過測序確認過 的含1896位點不發(fā)生突變的野生型HBV DNA片段的質(zhì)粒；陰性對照是高壓滅 菌水。
根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中用于用于聚合酶鏈反應(yīng)的正向和反向
引物分別是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID NO:l)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)
并且實時PCR反應(yīng)中所用的野生型和G1896A突變型的分子信標探針(都屬于 LNA)分別是
(3) 5， -FAM-CAACGCTTT@}CCAgGGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCCA@GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框標記的堿基是進行LNA化的。
犮明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測野生型和Gi896A突變型的乙型肝炎病毒DNA的方法，特 別是提供了一種使用鎖核酸(LNA， Locked Nucleic Acids)和分子信標熒光探針 結(jié)合技術(shù)的實時PCR檢測方法。本發(fā)明還進一步提供了用于檢測臨床血液標本 中野生型和G1896A突變型的乙型肝炎病毒DNA的試劑盒。
為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一個適于檢測野生型和 G則6A突變型的乙型肝炎病毒DNA的方法，該方法包括(1)從待檢血液標本 中提取病毒DNA; (2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信標探針(該探針是 一種鎖核酸LNA，即Locked Nucleic Acids)，對提取的病毒DNA進行實時PCR 以擴增包含1896位點的靶DNA片段，并對野生型和G1896A突變型的乙型肝炎 病毒DNA進行檢測；(3)根據(jù)實時PCR的擴增曲線，分析并判斷標本中乙型肝 炎病毒DNA是野生型的還是G1896A突變型的。該方法的特征在于聚合酶鏈反應(yīng) 體系中使用的正向和反向引物分別是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID NO:l)
(2) 5'-AAGGCAAAAMGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)
并且實時PCR反應(yīng)中所用的野生型和Gi896A突變型的分子信標探針(都屬于
LNA)分別是
(3) 5' -FAM-CAACGCTTT0GCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5, -HEX-CAACGCTTT§GGCCA|gGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框標記的堿基是進行LNA化的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的待檢血液標本是指含有乙型肝炎 病毒DNA的血液標本。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的分子信標探針的特征是探針的 環(huán)部分為16個堿基，探針的臂部分為5個堿基。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的野生型的分子信標探針是用來檢 測血液標本中野生型的乙型肝炎病毒DNA;而所說的G1896A突變突變型的分子 信標探針則是用來檢測含G1896A突變的乙型肝炎病毒DNA， 二者都是經(jīng)LNA 化的。其中前者5'端標記有HEX熒光基團，3'端標記有DABCYL淬滅基團；而 后者的5'端則是標記FAM熒光基團，3'端也是標記DABCYL淬滅基團。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的實時PCR擴增所用的程序是 50°C 120秒(l個循環(huán))~~ 95°C 180秒(l個循環(huán))^ 95°C IO秒，56°C 30秒(40個循環(huán))。其中56'C是檢測熒光的溫度。
簡單地說，為了完成本發(fā)明的方法，首先提取待檢臨床血液標本中乙型肝炎 病毒DNA，然后以提取的DNA為模板，使用合成的正向和反向寡核苷酸引物進
行PCR擴增。擴增時以HEX和DABCYL修飾的野生型分子信標熒光探針檢測 野生型模板，同時以FAM和DABCYL修飾的G1896A突變型的分子信標熒光探 針檢測乙型肝炎病毒DNA的G1896A突變。最后再根據(jù)實時PCR的擴增曲線判 斷所檢測的血液標本是含野生型的乙型肝炎病毒DNA還是含G1896A突變型的乙 型肝炎病毒DNA?，F(xiàn)針對本發(fā)明的幾個主要步驟，分別詳述如下
1. 乙型肝炎病毒DNA的提取 本發(fā)明采用的是優(yōu)化后的乙型肝炎病毒DNA的提取方法。首先是在約50/il
的臨床血液標本中加入PEG8000以沉淀病毒，離心后去掉上清；再加入NaOH 并在95'C下使病毒完全裂解；最后再加入Tris-HCl以中和裂解液，離心后取5/xl 上清用于PCR擴增。
2. 引物的設(shè)計和合成
為了特異、高效地擴增待檢臨床血液標本中包含1896位點的乙型肝炎病毒的 靶DNA片段，我們從GeneBank中調(diào)出乙型肝炎病毒各亞型的盡可能多的全基 因組DNA序列，然后通過DNAStar軟件進行各亞型序列比較，并把序列比較后 的Consensus序列輸出。接著從Consensus序列中找出含1896位點左右長約200bp (1896位點約在中間)的一段序列用Beacon5.0軟件進行引物設(shè)計。最后再把 Beacon5.0軟件找好的引物序列到比較好的各亞型序列中去核對其保守性，若保 守就可發(fā)到引物合成公司(主要是上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)進行合 成。本發(fā)明中設(shè)計的一條正向和一條反向引物的序列分別是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID N0:2)
3. 探針的合成和標記 分析乙型肝炎病毒DNA1896位點上下游序列的保守性，我們合成了兩條分子
信標探針，它們的環(huán)均為16個堿基，臂都是5個堿基。其中一條探針的5'端標 記有FAM熒光基團，3'端標記有DABCYL淬滅基團，是用來檢測臨床血液標本 中含G1896A突變的的乙型肝炎病毒DNA。另一條探針的5'端標記有HEX熒光 基團，3'端也是標記有DABCYL淬滅基團，是用來檢測臨床血液標本中野生型 的乙型肝炎病毒DNA。這兩條探針都是經(jīng)過LNA化的，其中前者有3個堿基進 行LNA化，而后者只有兩個堿基進行LNA化。LNA化的探針使得試劑盒有良
好的的特異性和靈敏度。兩條探針的具體序列如下
(3) 5， -FAM-CAACGCm@GCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4)
其中加框標記的堿基是進行LNA化的。
4. 核酸擴增體系的優(yōu)化
為了增強PCR擴增的效果(主要是曲線的光滑度和熒光強度)，并且提高試劑 盒檢測的靈敏度和特異性，我們首先對PCR擴增程序的各個參數(shù)(主要是退火 溫度和時間以及檢測溫度和時間)進行優(yōu)化，最終選擇的PCR運行程序是50°C 120秒(1個循環(huán))一~^95。C 180秒(1個循環(huán))^ 95°C 10秒，56'C 30秒 (40個循環(huán))。其中檢測熒光的溫度是56'C。然后在這個PCR擴增程序的基礎(chǔ) 上再對MgCl2濃度、Taq酶、dUTPs、 Tris-HCl、 KC1、引物和探針的用量進 行優(yōu)化。
5. 擴增結(jié)果的分析和判斷
熒光明顯比熒光域值(在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在 熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍)高，擴增曲線光滑且明顯呈S型趨勢的 才能判斷為陽性；否則為陰性。每個實驗的突變型陽性對照和野生型陽性對照的 擴增結(jié)果都應(yīng)確定是陽性，而陰性對照的擴增結(jié)果都應(yīng)是確定的陰性才可以。
如前所述，由于本發(fā)明采用了 LNA化的分子信標熒光探針，使得野生型和 G1896A突變型的乙型肝炎病毒DNA檢測的靈敏度和特異性都完全可以符合臨床 需求。另外，本發(fā)明對MgCl2濃度、酶、dUTPs、 Tris-HCl、 KC1、引物和探 針的用量進行優(yōu)化，使得實時PCR的擴增曲線更加美觀和穩(wěn)定，從而使得檢測 結(jié)果更加可靠。此外，本發(fā)明檢測兩種最通用的熒光^FAM和HEX熒光，適 用于市場上大部分熒光PCR儀檢測，而且也大大減少了檢測成本，利于推廣應(yīng) 用。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測野生型和G^6A突變型的乙型肝炎病毒 DNA的試劑盒，該試劑盒包括(1)血液標本中乙型肝炎病毒DNA提取試劑； (2)聚合酶鏈反應(yīng)混合液；(3)酶混合液；(4)突變型陽性對照；(5)野生型 陽性對照；(6)陰性對照。其特征在于聚合酶鏈反應(yīng)體系中使用的正向和反向引 物分別是
(1) 5, -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID N0:2)
并且實時PCR反應(yīng)中所用的野生型和G1896A突變型的分子信標探針(都屬于 LNA)序列分別是
(3) 5' -FAM-CAACGCTTT0GCCA|GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT|GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框標記的堿基是進行LNA化的。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的DNA提取試劑由提取液A (40 %PEG8000)、提取液B (0.25MNaOH)和提取液C (0.4MTris-HCl， pH6.4)組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的聚合酶鏈反應(yīng)混合液(每人份) 由2.5^1 lOxPCR buffer (850mMKCl， 400 mM Tris-Cl， pH8.9' 50。/。v/v甘油)、 0.2^1 dUTPs (dATP、 dUTP、 dGTP、 dCTP各25mM)、正反向兩條引物(都是 100/xM)各O.lpd、野生型和突變型分子信標探針(100 /AM)各O.lpl、 1.5/xl MgCl2 (25mM)等組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的酶混合液由普通Taq酶(5U爾1) 和UNG酶(lU/pl)按v/v-5:l組成。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的其中所說的突變型陽性對照是 經(jīng)過測序確認過的含G1896A突變的HBV DNA片段的質(zhì)粒；野生型陽性對照是 經(jīng)過測序確認過的含1896位點不發(fā)生突變的野生型HBV DNA片段的質(zhì)粒；陰 性對照是高壓滅菌水。
根據(jù)本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中用于聚合酶鏈反應(yīng)的正向和反向引物
分別是
(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID NO:l)
(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3， (SEQ ID NO:2) 并且實時PCR反應(yīng)中所用的野生型和01896八突變的分子信標探針(都屬于
LNA)分別是
(3) 5, -FAM-CAACGCTTT^GCCA0GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)
(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4)
其中藍色標記的堿基是進行LNA化的。 本發(fā)明的試劑盒不但能特異地區(qū)分野生型的和G1896A突變的乙型肝炎病毒 DNA ，而且其檢測靈敏度遠大于測序方法，能檢測到野生型和突變型雜合模板 中大于等于5%以上的突變型模板和10%以上的野生型模板(雜合模板的乙型肝 炎病毒DNA的濃度是1.0xl07copies/ml);弓l物和探針序列都非常保守，所以試 劑盒檢測的準確性極高，幾乎無漏檢現(xiàn)象。所以本發(fā)明的方法和試劑盒特別適用 于臨床血液標本中野生型和G1896A突變型的乙型肝炎病毒DNA的鑒定和區(qū)分。


圖1顯示乙型肝炎病毒DNAG則6A突變的靈敏度檢測結(jié)果。所用的模板都是 經(jīng)過測序確認過的含G1896A突變的HBVDNA片段的質(zhì)粒，其中濃度最高的模 板約為1.0xl06copies/ml，濃度最低的模板約為1.0xl02copies/ml。
圖2顯示FAM標記的&896八突變型探針的特異性檢測結(jié)果。所用的模板都是 經(jīng)過測序確認過的1896位點不發(fā)生突變的野生型乙型肝炎病毒DNA。
圖3顯示野生型乙型肝炎病毒DNA的靈敏度檢測結(jié)果。所用的模板都是經(jīng)過 測序確認過的1896位點不發(fā)生突變的HBV DNA片段的質(zhì)粒，其中濃度最高的 模板約為1.0xl06copies/ml，濃度最低的模板約為1.0xl02copies/ml。
圖4顯示HEX標記的野生型探針的特異性檢測結(jié)果。所用的模板都是經(jīng)過測 序確認過的含G1896A突變的乙型肝炎病毒DNA。
圖5顯示野生型和G則6A突變型乙型肝炎病毒DNA雜合模板中突變模板的靈 敏度檢測結(jié)果。所用的雜合模板是把血清中乙型肝炎病毒DNA濃度都為 1.0xl07copies/ml的G1896A突變的模板和1896位點不發(fā)生突變的野生型模板按 v/v分別為100:0、 50:50、 25:75、 10:90、和5:95的比例混合而成，各雜合比例 的模板擴增曲線依次是圖中按從左到右順序排列。
圖6顯示野生型和Gi896A突變型乙型肝炎病毒DNA雜合模板中野生模板的靈 敏度檢測結(jié)果。所用的雜合模板是把血清中乙型肝炎病毒DNA濃度都為 1.0xl07cOpieS/ml的1896位點不發(fā)生突變的野生型模板和G1896A突變的模板按
v/v分別為100:0、 50:50、 25:75和10:90比例混合而成，各雜合比例的模板擴增
曲線依次是圖中按從左到右順序排列。 圖7顯示33例含乙型肝炎病毒DNA的臨床血清的G1896A突變的熒光PCR檢
測結(jié)果和測序結(jié)果的比較。所用血清的HBVDNA拷貝數(shù)是用英科新創(chuàng)(廈門)
科技有限公司的HBV DNA熒光PCR定量檢測試劑盒定量的。具體拷貝數(shù)如
"3.65E+08"實際上是指被檢標本中含3.65xl08copies/ml的HBVDNA。
發(fā)明的
具體實施例方式
實施例1:臨床血液標本中乙型肝炎病毒DNA的提取
從臨床血液標本中取出50/xl血清到一高壓過的1.5ml的離心管中，加入25pl 提取液A (40%PEG-8000)，振蕩混勻5s， 12，500g離心5min;棄上清，加25/il 提取液B (0.25MNaOH)，振蕩15s，使沉淀盡量溶解，96'C裂解10min;加提 取液C (0.4MTris-HCl緩沖液，pH6.4) 25pd，混勻，96°C 10min; 12，500g離 心15min，取5/il上清進行PCR擴增。
實施例2:靶核酸的PCR擴增
在一 PCR反應(yīng)管中加入單人份的PCR反應(yīng)混合液，再加入0.2/il的酶混合液， 最后再加入5/xl模板(待檢模板或陰陽性對照品)，充分混勻后稍稍離心(約5 秒)。然后將反應(yīng)管放入熒光PCR儀(能檢測到FAM和HEX的PCR儀)，按下 列條件擴增50°C 120秒(1個循環(huán))~~ 95°C 180秒(1個循環(huán))~~ 95°C 10秒，56'C30秒(40個循環(huán))，其中56'C是檢測熒光的溫度。
所使用的PCR擴增體系中包括2.5jd 10xPCRbuffer (850mMKCl， 400mM Tris-Cl, pH8.9， 50。/。v/v甘油)、0.2/il酶混合液、0.2/nl dUTPs (含dATP、 dUTP、 dGTP、dCTP各25mM)、正反向兩條引物(SEQIDNO:l和SEQ IDN0:2， 100/iM) 各0.1/xl、野生型和突變型分子信標探針(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4， 100pM) 各0.1/a1、 25mMMgCl2 1.5/il和5/il模板，最后補水到25/il。
實施例3:乙型肝炎病毒DNAG1896A突變的靈敏度和特異性檢測
以含G1896A突變的乙型肝炎病毒DNA片段的質(zhì)粒 (1.0xl06copies/ml-1.0xl02copies/ml)為模板，使用本發(fā)明的試劑對乙型肝炎
病
毒DNAG化96A突變的靈敏度進行檢測，檢測結(jié)果參見圖l。從圖l的結(jié)果可 以看出，本發(fā)明的方法和試劑盒至少可以檢測到模板濃度僅為1.0xl02COpieS/ml 的G^6A突變的乙型肝炎病毒DNA。換句話說，就是本發(fā)明的靈敏度完全可以 符合臨床的需求。
再以16個1896位點不發(fā)生突變的野生型的乙型肝炎病毒DNA (約 1.0xl06cOpieS/ml)為模板，使用本發(fā)明的試劑對FAM標記的突變型探針的特異 性進行檢測，檢測結(jié)果參見圖2。從圖2的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的方法和試劑 盒中的FAM熒光標記的突變型探針對1896位點不發(fā)生突變的野生型乙型肝炎 病毒DNA的檢測結(jié)果均為陰性。也就是說，本發(fā)明中FAM標記的突變型探針 的特異性可以符合臨床的需求。
實施例4:野生型乙型肝炎病毒DNA的靈敏度和特異性檢測 以1896位點不發(fā)生突變的乙型肝炎病毒DNA片段的質(zhì)粒 (1.0xl06copies/ml-1.0xl02copies/ml)為模板，使用本發(fā)明的試劑對野生型乙型 肝炎病毒DNA的靈敏度進行檢測，檢測結(jié)果參見圖3。從圖3的結(jié)果可以看出， 本發(fā)明的方法和試劑盒至少可以檢測到模板濃度僅為1.0xl02CopieS/ml的野生型 乙型肝炎病毒DNA。換句話說，就是本發(fā)明的靈敏度完全可以符合臨床的需求。 再以16個G^96A突變的乙型肝炎病毒DNA (約1.0x106copies/ml)為模板， 使用本發(fā)明的試劑對HEX標記的野生型探針的特異性進行檢測，檢測結(jié)果參見 附圖4。從圖4的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的方法和試劑盒對Gw6A突變的乙型肝 炎病毒DNA的檢測結(jié)果均為陰性。也就是說，本發(fā)明中HEX標記的野生型探 針的特異性可以符合臨床的需求。
實施例5:野生型和突變型雜合模板的靈敏度檢測
把血清中乙型肝炎病毒DNA濃度都為1.0xl07copies/ml的G1896A突變的模 板和1896位點不發(fā)生突變的野生型模板按v/v分別為100:0、50:50、25:75、 10:90、 和5:95的比例混合而成，再以各比例的混合好的標本為模板，用本發(fā)明的試劑 進行雜合模板中突變模板的靈敏度檢測，檢測結(jié)果參見圖5。
再把臨床血清中乙型肝炎病毒DNA濃度都為1.0xl07copies/ml的1896位點 不發(fā)生突變的野生型模板和G1896A突變的模板按v/v分別為100:0、 50:50、 25:75 和10:90比例混合而成，再以各比例的混合好的標本為模板，用本發(fā)明的試劑進 行雜合模板中野生模板的靈敏度檢測，檢測結(jié)果參見圖6。
從圖5和圖6的結(jié)果可以看出，本發(fā)明的方法和試劑盒至少可檢測到野生和 突變雜合模板中只占5%01896八突變或10%野生的模板，靈敏度遠大于測序(測 序?qū)﹄s合模板的檢測靈敏度一般是20%以上)。
實施例6:臨床血清標本的檢測
使用本發(fā)明的方法和試劑盒，對33份含乙型肝炎病毒DNA的臨床血清標本 進行檢測，其中8例為純合突變，19例為純合野生，6例為雜合體。為了進一步 證實本發(fā)明方法的準確性，我們對上面33份標本的PCR產(chǎn)物進行序列測定，結(jié) 果表明，使用本發(fā)明的試劑盒對純合模板的檢測結(jié)果和測序結(jié)果完全吻合；而對 雜合模板的檢測結(jié)果更完美，因為它能把野生和突變擴增結(jié)果都顯示出來，而測 序只能顯示雜合模板中的一種結(jié)果(具體結(jié)果參照圖7)?？梢姳景l(fā)明的方法和 試劑盒完全可以滿足臨床檢測的需要。
序列表
<110>英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司
<120>檢測乙型肝炎病毒DNA及其G1896A突變的方法及試劑盒
<140> <141> <160>2 <210> 1 <211>19 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 1
TCCAAGCTGT GCCTTGGGT
<210> 2 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。 <400> 2
AAGGCAAAAA AGAGAGTAAC TCCACA
<210> 3 <211>24 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 <400> 3
CAACGCTTTA GGCCATGGAC GTTG
<210> 4 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 <400> 4
CAACGCTTTG GGCCATGGAC GTTG
權(quán)利要求
1.一種利用鎖核酸和分子信標結(jié)合的技術(shù)來檢測臨床血液標本中野生型和G1896A突變型乙型肝炎病毒DNA的方法。該方法包括以下步驟(1)從待檢血液標本中提取病毒DNA；(2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信標探針(探針都屬于鎖核酸LNA，即Locked Nucleic Acids)，對提取的病毒DNA進行實時PCR以擴增包含1896位點的靶DNA片段，并對野生型和G1896A突變型的乙型肝炎病毒DNA進行檢測；(3)根據(jù)實時PCR的擴增曲線，分析并判斷標本中乙型肝炎病毒DNA是野生型的還是G1896A突變型的。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中待檢DNA擴增所用的正向和反向引物分別是(1) 5' -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID NO:l)(2) 5'-AAGGCAAMAAGAGAGTMCTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)并且實時PCR反應(yīng)中所用的野生型和Gi896A突變型的分子信標探針(都屬于LNA)分別是(3) 5， -FAM-CAACGCTTT@GCCAgGGACGTTG-DABCYL-3' (SEQ ID NO:3)(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:4)其中加框標記的堿基是進行LNA化的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所說的實時PCR擴增所用的程序是50°C 120 秒(1個循環(huán))~~ 95°C 180秒(1個循環(huán))^ 95°C 10秒，56°C 30 秒(40個循環(huán))。其中56-C是檢測熒光的溫度。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的待檢血液標本是指含有乙型肝炎病毒DNA的血液標本。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所說的野生型分子信標探針是用來檢測血液標 本中野生型的乙型肝炎病毒DNA，而突變的分子信標探針是用來檢測血液標 本中G朋6A突變的乙型肝炎病毒DNA。因為野生型和突變型探針中都有堿基 是進行LNA化的，從而使得本發(fā)明的方法檢測的靈敏度和特異性比常規(guī)的實 時PCR都相對有所增強。其中前者5'端標記有F細熒光基團，3'端標記有 DABCYL淬滅基團；而后者的5'端則是標記HEX熒光基團，3'端也是標記 DABCYL淬滅基團。
6. —種利用鎖核酸和分子信標結(jié)合的技術(shù)來檢測野生型及G朋6A突變型的乙型 肝炎病毒DNA的試劑盒，該試劑盒包括(1)血液標本中乙型肝炎病毒DNA提取試劑；(2)聚合酶鏈反應(yīng)混合液；(3)酶混合液；(4)突變型陽性對照；(5)野生型陽性對照；(6)陰性對照。其中(1)由提取液A、提取液B和 提取液C組成；(2)由10XPCR buffer、 dUTPs、正反向兩條引物、野生型 和突變型分子信標探針等組成；(3)由普通T叫酶和UNG酶組成；(4)是經(jīng) 過測序確認過的含G^6A突變的HBVDNA片段的質(zhì)粒；(5)是經(jīng)過測序確認 過的含1896位點不發(fā)生突變的野生型HBVDNA片段的質(zhì)粒；(6)是高壓滅菌 水。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中用于聚合酶鏈反應(yīng)的正向和反向引物分別是(1) 5， -TCCAAGCTGTGCCTTGGGT-3' (SEQ ID N0:1)(2) 5'-AAGGCAAAAAAGAGAGTAACTCCACA-3' (SEQ ID NO:2)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6的試劑盒，其中用于聚合酶鏈反應(yīng)的野生型和突變型分子信 標探針分別是(3) 5， -FAM-CAACGCTTT@GCCA@GGACGTTG-DABCYL-3， (SEQ ID NO:3)(4) 5， -HEX-CAACGCTTT§GGCC#GACGTTG-MBCYL-3， (SEQ ID NO:4) 其中加框標記的堿基是進行LNA化的。
全文摘要
本發(fā)明涉及野生型和G₁₈₉₆A突變型的乙型肝炎病毒DNA的檢測方法和試劑盒，特別是涉及使用鎖核酸(LNA，Locked Nucleic Acids)和分子信標探針結(jié)合的技術(shù)以及實時PCR方法來檢測野生型和G₁₈₉₆A突變型的乙型肝炎病毒DNA的方法及用于完成該檢測的試劑盒。本發(fā)明的方法可以特異且靈敏地檢測出臨床血液標本中的野生型和G₁₈₉₆A突變型的乙型肝炎病毒DNA。
文檔編號C12Q1/70GK101338343SQ20071012956
公開日2009年1月7日 申請日期2007年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月3日
發(fā)明者宋慶濤, 蔡劍英 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司