專利名稱：截短gst蛋白熱誘導(dǎo)融合表達(dá)質(zhì)粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用日本血吸蟲菲律賓株26 kDa谷胱甘肽 -S-轉(zhuǎn)移酶(Sj26GST)核心蛋白(188氨基酸組成)作為短肽(8肽 18肽)生物合成載體， 專供抗原表位作圖定位及其表位基序鑒定用的大腸桿菌熱誘導(dǎo)GST188重組表達(dá)質(zhì)粒 pXXGST-l和pXXGST-2及其制備方法。
技術(shù)背景蛋白分子上的線性B細(xì)胞表位(B cell epitope, BCE)是其抗原性的基礎(chǔ)。詳細(xì)地繪制 特定抗原的表位圖譜及精細(xì)鑒定其抗體識(shí)別基序，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究，對(duì)疾病的 診斷、定點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)分子以降低蛋白質(zhì)藥物的免疫原性、設(shè)計(jì)無毒副作用的合成肽疫苗， 特別是研制充分有效的多表位合成肽疫苗具有科學(xué)和應(yīng)用的意義。因此，對(duì)獲得其抗體的 已知蛋白進(jìn)行線性表位基序鑒定，或制備特異抗體對(duì)靶蛋白抗原線性表位掃描作圖 (Epitope mapping) —直是蛋白質(zhì)化學(xué)、醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)，特別是疫苗學(xué)領(lǐng)域內(nèi)重要研 究內(nèi)容之一。長期以來，抗原表位作圖或定位的技術(shù)一直在發(fā)展中。早期的表位鑒定主要用化學(xué)降 解或酶解蛋白質(zhì)的方法，或水解抗原-抗體復(fù)合物，然后對(duì)用不同生化方法收集的短肽片段 進(jìn)行蛋白印跡或ELESA檢測(cè)，也可進(jìn)行HPLC/質(zhì)譜分析或短肽氨基酸測(cè)序，最終確定表 位肽段或抗體結(jié)合位點(diǎn)。雖然有成功的實(shí)例，但它們操作十分繁瑣，影響結(jié)果判定的因素 也多，所以近年來很少采用。短肽化學(xué)合成技術(shù)的形成，特別是上世紀(jì)八十年代中期發(fā)展的聚苯乙烯針 (polypropylene pin)多肽合成技術(shù)(Gensen HM， et al. : Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single acid, Tfeti h""'園，81: 3998-4002， 1984)和聚苯乙烯網(wǎng)袋(polypropylene mesh bag)合 成技術(shù)(Houghten RA. : General method for the the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificith of antigen—antibody interaction at the level of individual amino acids, 尸roc 7VaW〃誠 82: 5131-5135， 1985)的建立，，使抗體識(shí)別表位的鑒定有了很大的進(jìn)展。前者的特點(diǎn)是肽合成過程大大簡化，后者的特點(diǎn)是該針洗滌完全，可重復(fù)使用，且針上的肽可直接轉(zhuǎn)入酶標(biāo)板中進(jìn)行ELESA測(cè) 定。這一化學(xué)合成肽探針掃描技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是可合成覆蓋全長蛋白序列前后片段互有9肽或10肽重疊的18肽或20肽進(jìn)行用ELESA方法的表位肽鑒定；在需精細(xì)BCE基序的場 合，則可合成覆蓋已鑒定的18肽的前后互有7個(gè)氨基酸殘基(aa)重疊的8肽片段，根 據(jù)與特異單抗反應(yīng)的肽片段數(shù)確定最小表位基序，也能以丙氨酸殘基逐一取代BCE基序中 的殘基，確定該表位的關(guān)鍵殘基。雖然用化學(xué)合成肽方法仍然是目前BCE掃描鑒定的經(jīng)典 方法，但由于肽合成費(fèi)用高，檢測(cè)需要特殊儀器設(shè)備，因而限制了其廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，八十年代中期也建立了基因亞克隆表位鑒定法(Mehra V， et al. : Efficient mapping of protein antigenic determinants, 尸roc ;Va〃 y4cac/ 5"cj' 〃W， 83: 7013-7017， 1986)，。該方法的要點(diǎn)是將靶基因用DNA酶隨機(jī)切割成200 1 000堿基大小不等的片段，并將它們亞克隆重組插入Xgtll表達(dá)載體，然后用特異的單抗 篩選免疫反應(yīng)陽性的克隆并進(jìn)行DNA測(cè)序，最后依據(jù)那些插入片段共有的核苷酸序列推斷 出該單抗識(shí)別的BCE基序。因?yàn)槊盖袟l件不易控制，不易獲得足以比較推斷的BCE基序的 不同長度片段亞克隆，操作也繁瑣，所以應(yīng)用該方法鑒定靶蛋白BCE的報(bào)道迄今屈指可數(shù)。至于表位掃描鑒定原理與化學(xué)合成肽法和基因亞克隆法相似的隨機(jī)化學(xué)合成肽庫法 (Jung G and Beck-Sickinger AG: Multiple peptide synthesis methods and their applications. *《，C力棚// t W 31: 367-486, 1992; Geysen HM and Mason TJ:Screening chemically synthesized peptide libraries for biologically-relevant molecules. Bioorg Med Chem Lett. 3: 397-404， 1993)和基因工程肽庫法/稱噬菌體表 位展示文庫法(Scott JK and Smith GP: Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 249: 386-390， 1990)，前者肽庫含有各種可能序列的短肽，方便用 單抗和多抗篩選，但結(jié)合肽需要測(cè)序分析；后者則是將編碼6肽/8肽的大量合成DNA片段 混合物重組插入噬菌體基因組，使之以融合蛋白形式表達(dá)在外殼蛋白的氨基端，再用生物 素或酶標(biāo)記的抗體篩選特異的噬菌體，挑取陽性斑擴(kuò)增后進(jìn)行DNA測(cè)序推斷出氨基酸序列。 很顯然，它們的應(yīng)用也存在很大的局限性，因?yàn)閮烧呓◣煲蟾摺⒐ぷ髁看?、成本高且?位篩選鑒定麻煩，另外還需要肽庫質(zhì)譜儀/測(cè)序儀，購買商品化的合成肽庫或噬菌體表達(dá) 肽庫費(fèi)用也昂貴，所以這些因素均非普通實(shí)驗(yàn)室或課題組所能面對(duì)或承受。另外，也有不少實(shí)驗(yàn)室采用通過相關(guān)計(jì)算機(jī)軟件，分別從肽段親水性、分子接觸可及 性、肽鏈骨架可塑性以及電荷分步等角度預(yù)測(cè)抗原表位(H叩pTP， Woods KR: Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. /Voci\to/」ok/<Sci {778(6): 3824-8, 1981; Kyte J, Doolittle RP: A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol, 157(l):105-32， 1982; Welling GW， et al,: Prediction of sequential antigenic regions in proteins, f朋5"^e", 188(2) : 215-8, 1985; KarplusPA, Schultz GE: Prediction of chain flexibility in proteins. 7Viaft/rw/^"5r/za/加,72(2):212-213， 1985.)，然后根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果化學(xué)合成相應(yīng)肽段作為免疫原，繼而用免疫血清檢測(cè)其是否能 識(shí)別靶抗原。雖然預(yù)測(cè)合成肽能產(chǎn)生可識(shí)別天然抗原的抗血清，但已有資料表明該天然抗 原免疫血清未必一定存在可結(jié)合預(yù)測(cè)序列的抗體，換言之，計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的表位序列存在不 確定性，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。以上概述表明掃描鑒定抗原表位已有多種方法可供選擇，但由于這樣那樣的缺陷，或 存在技術(shù)和設(shè)備條件的限制，而且多數(shù)離不開需具備特異單克隆抗體(單抗)或抗天然抗 原多克隆抗體(多抗)的先決條件。因此，以上種種方法顯然都不適宜在一般實(shí)驗(yàn)室的廣 泛應(yīng)用。2004年為檢測(cè)抗hCG多表位嵌合肽抗血清中是否存在抗各嵌入BCE抗體，我們?cè)?jīng)構(gòu) 建了在Stv蛋白羧基端插入的人絨毛膜促性腺激素(hCG)卩亞基三個(gè)不同BCE單表位短肽 (short peptide, SP)的pTSA18/Stv_SP重組質(zhì)粒，結(jié)果IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的單表位融合蛋 白用Western blot檢測(cè)都能被它們的單抗或多抗特異識(shí)別，進(jìn)而提示可建立以一高表達(dá) 蛋白為載體的生物合成肽表位掃描鑒定技術(shù)[徐萬祥等.人絨毛膜促性腺激素(3亞基單一 B-細(xì)胞表位(p5、 p9或P8)融合蛋白的表達(dá)和純化.主激工^^學(xué)艱，20 (1): 49-53， 2004]。 隨后華榮虹等報(bào)道了利用IPTG誘導(dǎo)的pGEX-6P-l質(zhì)粒表達(dá)GST-SP融合蛋白法，掃描鑒定 了嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒S蛋白的BCE[華榮虹等.SARS冠狀病毒S蛋白 受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的表達(dá)及其表位作圖.生激眾學(xué)與主激#^^_^展，32 (11): 1030-1037， 2005]。根據(jù)我們多年實(shí)踐，無論是使用表達(dá)Stv或GST融合蛋白的pTSA18和PGEX_4T等重 組質(zhì)粒，不加IPTG誘導(dǎo)的場合都時(shí)常有"泄漏表達(dá)"(Leaky expression)現(xiàn)象，這一情 況顯然妨礙我們對(duì)SDS-PAGE凝膠上Stv-8肽融合蛋白是否表達(dá)的判定，那樣勢(shì)必先需要 通過插入片段的DNA測(cè)序，才能確定所挑取一組陽性克隆是否是含目的插入基因編碼片段 的重組質(zhì)?？寺?。因此為了節(jié)約測(cè)序所需的時(shí)間和費(fèi)用(鑒定表位基序后對(duì)產(chǎn)生印跡反應(yīng) 的克隆仍需要測(cè)序驗(yàn)證)，也為了進(jìn)一步檢驗(yàn)118個(gè)殘基組成的Stv核心蛋白(Stvll8)是 否是合適的短肽融合表達(dá)的載體，我們構(gòu)建了可表達(dá)融合短肽的熱誘導(dǎo)型pSY621/Stv-l 重組質(zhì)粒(命名為pXXStv-1)和可作為檢測(cè)對(duì)照(僅表達(dá)Stv118)的pXXStv-2重組質(zhì)粒 (已申請(qǐng)國家發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?00710043264.5)。此專利申請(qǐng)中提供了用構(gòu)建的 pSY621/Stv-l質(zhì)粒表達(dá)系列短肽適用性，以及用抗重組靶蛋白多抗鑒定人卵透明帶蛋白線 性BCE基序可靠性的實(shí)例。相比前述目前應(yīng)用最多的化學(xué)合成肽法，此生物合成(融合表達(dá))肽表位鑒定法優(yōu)點(diǎn)明顯，如用抗重組蛋白多抗也能開展表位掃描作圖；鑒定費(fèi)用花費(fèi)少，1個(gè)殘基的DNA 正負(fù)鏈片段合成費(fèi)用僅約是1個(gè)殘基合成的1/20;操作相對(duì)更簡便，分子克隆、表達(dá)和蛋 白印跡鑒定等都是目前成熟的技術(shù)， 一般實(shí)驗(yàn)室都能開展；構(gòu)建的克隆能保存?zhèn)溆?，鑒定 結(jié)果明確且可重復(fù)檢驗(yàn)等。但生物合成肽表位鑒定法尚處于發(fā)展初期階段，仍然有許多需 要改進(jìn)的地方，如短肽生物合成載體的選擇及其截取長度的確定等。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種截短GST蛋白熱誘導(dǎo)融合表達(dá)質(zhì)粒及其制備方法，以便實(shí) 現(xiàn)短肽的生物合成。建立抗原表位鑒定原理或特征，與化學(xué)合成肽法和基因亞克隆法相似，但短肽合成花 費(fèi)大幅度降低且操作更方便，因而適宜在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用生物合成肽法，本發(fā)明選用由 188 aa組成的新型截短GST188蛋白為載體，在大腸桿菌熱誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)短肽融合蛋 白的pXXGST-l重組質(zhì)粒，以及用作表達(dá)對(duì)照的熱誘導(dǎo)型pXXGST-2重組質(zhì)粒，從而實(shí)現(xiàn)短 肽生物合成的目的，專供抗原線性表位掃描作圖定位以及表位基序鑒定用。本發(fā)明利用本專利申請(qǐng)人構(gòu)建的pSY621原核表達(dá)質(zhì)粒(圖1)和依據(jù)GST基因公開信 息，通過基因工程構(gòu)建熱誘導(dǎo)pXXGST-l和pXXGST-2重組質(zhì)粒，并用于進(jìn)行短肽融合表達(dá)， 并驗(yàn)證先前已鑒定的huZP3上一個(gè)線性BCE基序，它們的構(gòu)建(制備)具體步驟如下(1) 設(shè)計(jì)PCR引物，從pGEX-4T-質(zhì)粒中擴(kuò)增出編碼GST蛋白H88基因的大片段，該 大片斷在5'-和3'-端分別帶BamH I和Sal I的限制酶酶切位點(diǎn)；(2) 利用DNA重組技術(shù)，將目的GST基因擴(kuò)增片段插入用EcoR I和BamH I雙酶切 的pSY621質(zhì)粒，獲得的pSY621-GST重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，在加Amp的LB平板 上挑取它們的重組克隆，進(jìn)行DNA測(cè)序(上海聯(lián)合基因集團(tuán)公司)；(3) 合成兩端為Sal I和Pst I粘性末端中間帶TAATAG雙終止密碼子的二條互補(bǔ)DNA 片段，將之退火復(fù)性后重組插入基因測(cè)序正確并經(jīng)雙酶切的PSY621-GST中Sal I和Pst I 位點(diǎn)之間，連接液轉(zhuǎn)化TG1宿主菌，再次外送DNA測(cè)序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒，命名為pXXGST-l， 其核苷酸序列為SEQ. ID. N03;(4)以pXXGST-1質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的一對(duì)PCR引物擴(kuò)增在GST編碼基因3'-端后添 加TAA終止密碼子的GST188基因片段，用EcoR I和BamH I限制酶雙酶切的擴(kuò)增大片段， 被重組插入用同樣二個(gè)酶雙酶切的pSY621質(zhì)粒，測(cè)序正確重組質(zhì)粒被新命名為pXXGST-2; 其核苷酸序列為SEQ.ID.N04，具體為pXXGST-1質(zhì)粒的核苷酸的序列SEQ.ID.N03中GGATCCGTCGAC后|TAATAG l雙終止密碼子去除，但在GGATCCGTCGAC前插入一個(gè) TAA終止密碼子；(5)基于先前用pXXStv(118)-1鑒定出huZP3"""'肽段中存在一個(gè)基序?yàn)镋NWNAEK,184 的抗原表位結(jié)果(專利申請(qǐng)?zhí)?00710043264.5)，再將以前合成的huZP3177—19°的相互各重 疊7個(gè)殘基的系列8肽編碼基因片段，將之退火復(fù)性后分別重組插入pXXGST-l的BamH I 和Sal I位點(diǎn)，抽取轉(zhuǎn)化菌TG1的pXXGST-1/短肽質(zhì)粒，再次轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21宿主菌， 熱誘導(dǎo)后通過SDS-PAGE檢測(cè)各GST短肽融合表達(dá)，以此確認(rèn)pXXGST-1/短肽重組子和各 GST-短肽的表達(dá)，最后用兔抗huZP3'77—348抗血清和兔抗huZP3172"87合成肽抗血清進(jìn)行 Western blot試驗(yàn)，確認(rèn)先前表位鑒定結(jié)果和pXXGST-1用于短肽生物合成和抗原表位鑒 定的適用性。本發(fā)明提供的表達(dá)短肽融合蛋白的pXXGSG-1重組質(zhì)粒和pXXGST-2重組質(zhì)粒具有如下 特點(diǎn)1、 作為融合表達(dá)載體，在GST188羧基端連接不同8 18個(gè)殘基短肽，都能恒定高表 達(dá)(短肽融合蛋白表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的10%左右，適合進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn))；2、 在未進(jìn)行熱誘導(dǎo)的情況下，SDS-PAGE檢測(cè)基本上看不到細(xì)菌總蛋白中目的短肽融 合蛋白的泄漏表達(dá)現(xiàn)象；3、 在使用抗重組靶蛋白抗血清的情況下，產(chǎn)生的短肽(8肽或18肽)融合蛋白印跡 帶位于大腸桿菌二條分子量分別約為18 kDa和32 kDa的強(qiáng)抗原印跡帶之間，因而不會(huì)影 響印跡結(jié)果判斷；4、 同時(shí)使用僅表達(dá)GST188蛋白的pXXGST-2重組質(zhì)粒，大規(guī)模進(jìn)行抗原表位作圖和 表位基序精細(xì)鑒定的場合，可進(jìn)一步降低抗原表位鑒定費(fèi)用，即，構(gòu)建好GST-短肽重組質(zhì) 粒后，無需都進(jìn)行DNA測(cè)序篩選重組子，可先挑選加氨芐青霉素LB平板上生長克隆進(jìn)行 熱誘導(dǎo)表達(dá)，然后通過SDS-PAGE檢測(cè)它們是否表達(dá)了短肽融合蛋白(相對(duì)GST188對(duì)照 條帶，觀察8肽或18肽有無約大于1 kDa或2 kDa的特異條帶存在)，進(jìn)而進(jìn)行蛋白印跡 試驗(yàn)。最終只需將產(chǎn)生印跡的克隆或特異表達(dá)條帶位置有疑問的克隆送測(cè)序。很顯然，如 此也節(jié)省系統(tǒng)表位掃描鑒定的時(shí)間和工作量。本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)一步具體描述如下本發(fā)明提供能在大腸桿菌宿主菌中高表達(dá)GST-SP融合蛋白的熱誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒 pXXGST-l (圖2)，供抗原表位掃描鑒定選擇使用。pXXGST-l特點(diǎn)如下為了克服IPTG誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)常常發(fā)生目的蛋白或融合蛋白"泄 漏表達(dá)"的情況，以利于挑取克隆經(jīng)熱誘導(dǎo)后細(xì)菌總蛋白的SDS-PAGE初步鑒定，即便于 判定在氨芐青霉素(Amp) LB平板上挑取的克隆是非載體質(zhì)粒自連產(chǎn)物，同時(shí)在免疫印跡 試驗(yàn)中避免出現(xiàn)陰性對(duì)照也產(chǎn)生陽性結(jié)果，本發(fā)明選用了己經(jīng)構(gòu)建且能高表達(dá)外源蛋白的pSY621質(zhì)粒(圖1)[沈蕓，應(yīng)康，徐萬祥，謝毅大腸桿菌高效表達(dá)載體pSY621的構(gòu)建. 學(xué)叛(^^^^^^)，39(3):313 - 317, 2000]作為新構(gòu)建重組pXXStv-l的載體質(zhì)粒。 依據(jù)GST基因公開信息[Henkle KJ， et al. : Comparison of the cloned genes of the 26- and 28-kilodalton glutathione S-transferases of Schistosoma japonic咖and Schistosoma mansoni. 5ioc/ e/z/尸arasiZ^, 40(1): 23 — 34， 1990.]，〈乍為失豆月太融 合表達(dá)載體重組插入pSY621質(zhì)粒的GST蛋白長度適宜，即，我們合成的GST核心蛋白基 因(編碼188 aa，包括N端增加的1個(gè)起始密碼子編碼的甲硫氨酸殘基)連同其C端BamH I酶切位點(diǎn)編碼片段編碼的甘氨酸和絲氨酸2個(gè)殘基，熱誘導(dǎo)后在SDS-PAGE凝膠上顯示約 22kDa分子量的短肽蛋白條帶(圖7，圖8)。如圖6所示，在誘導(dǎo)菌總蛋白的SDS-PAGE染 色凝膠上，連接分別相差1個(gè)殘基的7個(gè)系列重組克隆都穩(wěn)定地高表達(dá)了 GST-8肽融合蛋 白(約占細(xì)菌總蛋白的10%)，而它們未熱誘導(dǎo)的克隆則都未見"泄漏表達(dá)"條帶。圖7 則表明GST-huZP3'77—'"和GST-huZP3'78—185被印跡的條帶正好位于兩條大腸桿菌蛋白印跡特征 條帶(約20kDa和31 kDa，用抗重組huZP3b蛋白抗血清的場合一般都會(huì)產(chǎn)生)之間，結(jié) 果易判斷。顯然在此位置，GST連接18肽(約增加l kDa)的印跡結(jié)果判斷也不會(huì)受到其 前后二條大腸桿菌特征帶的干擾。用抗huZP3172—187合成肽抗血清則無此問題，背景清晰(圖 8)。以上構(gòu)建的pXXGST-1質(zhì)粒另一特點(diǎn)是，在載體蛋白GST18編碼基因3'-端的Sal I - Pst I克隆位點(diǎn)后插入了 TAATAG終止密碼子，以避免生物合成的靶短肽后續(xù)過多殘基對(duì)特定抗 原抗體反應(yīng)可能產(chǎn)生的干擾(若欲排除Sal I堿基編碼的Val和Asp兩個(gè)殘基，可將TAA 或TAG加在所合成靶短肽編碼基因片段3'-端后Sal I位點(diǎn)前，略增加6個(gè)DNA堿基合成 費(fèi)用)。在懷疑8肽前BamH I堿基編碼的Gly和Ser殘基是否對(duì)鑒定的Gly-Ser后8肽表 位基序有影響(如圖7的情況)，可在8肽編碼片段的5'-端增加2或3個(gè)丙氨酸編碼堿基 加以驗(yàn)證。本發(fā)明還提供一個(gè)在GST188蛋白編碼基因3'-端尾BamH I前接上TAA終止密碼子而 形成的熱誘導(dǎo)型pXXGST-2質(zhì)粒(圖3)。在掃描鑒定靶抗原表位的場合，它們表達(dá)的分子 量約22 kDa的GST188蛋白，可先用于確認(rèn)所選用單抗、多抗或抗重組蛋白多抗與之有無 交叉反應(yīng)；也可用作通過SDS-PAGE鑒定pXXGST-1是否表達(dá)GST-8肽融合蛋白(分子量相 差1 kDa，在電泳后染色凝膠上可清楚辨別)的對(duì)照。通過此方法鑒定陽性重組克隆，隨 后直接進(jìn)行Western blot檢驗(yàn)，以節(jié)約DNA測(cè)序費(fèi)用和時(shí)間。本發(fā)明提供的熱誘導(dǎo)型pXXGST-1和pXXGST-2質(zhì)粒，在它們的EcoR I和BaraH I或其 后其他克隆位點(diǎn)重組插入帶ATG起始密碼子的外源基因，可熱誘導(dǎo)直接表達(dá)其他目的蛋白。PXXGST-1質(zhì)粒也可誘導(dǎo)表達(dá)與GST118融合的其他目的蛋白。另外，在無特異單抗或多抗 的情況下，以上GST熱誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒也為靶蛋白表位掃描作圖提供了便利和實(shí)施可能性， 即可先通過PCR分段擴(kuò)增2 3個(gè)靶蛋白編碼基因大片段，分別重組插入GST188質(zhì)粒進(jìn) 行融合蛋白表達(dá)，電泳割膠回收(干燥研磨或電洗脫后)直接免疫動(dòng)物。此外，以Stvl08 或Stvll8蛋白為載體(己另外申請(qǐng)發(fā)明專利)構(gòu)建對(duì)應(yīng)的2 3個(gè)靶蛋白編碼基因大片 段(表達(dá)產(chǎn)物用作檢測(cè)抗GST融合蛋白抗血清抗體滴度時(shí)的抗原)，并構(gòu)建表達(dá)相鄰互有9 aa重疊的系列Stv-18肽融合蛋白，繼而用收集確認(rèn)的抗GST-靶大片段抗血清，進(jìn)行覆蓋 大片段蛋白序列的表位掃描作圖。必要的話，就確定的表位肽構(gòu)建相鄰互有7 aa重疊的 系列Stv-8肽，作進(jìn)一步最小BCE基序鑒定。(若選用Stv蛋白作為載體，融合表達(dá)靶蛋 白大片段后制備抗血清，抗體滴度測(cè)定和表位掃描鑒定則需要使用GST蛋白為融合表達(dá)載 體。這也就是為什么需要另外構(gòu)建GST熱誘導(dǎo)融合表達(dá)的原因。)本發(fā)明也提供了借助PXXGST-1質(zhì)粒驗(yàn)證一 BCE基序的應(yīng)用實(shí)例，g卩，用之表達(dá)相鄰 片段均重疊7 aa的系列GST-8肽融合蛋白，并用兔抗重組人卵透明帶-3(human zona pellucida-3， huZP3)蛋白177_348抗血清和兔抗huZP3172—187合成肽抗血清，確證了先前用 Stvl18-SPs鑒定的huZP3上一個(gè)線性BCE基序(EENWNAE178—184 )。


圖1為pSY621原核熱誘導(dǎo)質(zhì)粒示意圖。 圖2為構(gòu)建的pXXGST-l質(zhì)粒示意圖。注圖中BamH I和Sal I為目的短肽編碼基因片段的重組插入克隆位點(diǎn)。 圖3為構(gòu)建的pXXGST-2質(zhì)粒示意圖。注與pXXGST-1質(zhì)粒比較，不同點(diǎn)僅是Sal I位點(diǎn)后無TAATAG終止密碼子，并在GST188 編碼基因3'-端尾BamH I位點(diǎn)前增加一個(gè)TAA終止密碼子。圖4為huZP3m—19°系列GST188-8肽表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)圖。1，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 15，未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)的MEENWNAE177—184、 EE雨NAEK178—1S5、 E麗NAEKR》186、麗NAEKRS18。-187、 WNAEKRSP18'—188、 NAEKRSPT182-189和AEKRSPTF,柳誘導(dǎo)菌總蛋白。注圖中箭頭分別指示各表達(dá)的8肽融合蛋白。在細(xì)菌總蛋白上樣量基本一致的情況 下，未熱誘導(dǎo)對(duì)照欄都未見目的短肽融合蛋白明顯泄漏表達(dá)，熱誘導(dǎo)欄都能看到表達(dá)量基 本一致的靶短肽融合蛋白高表達(dá)。圖5為huZP3177—^系列GST-8肽表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)(A)和用抗重組huZP3177—348抗 血清的免疫印跡(B)圖。1，未誘導(dǎo)的GST-MEE麗NAE177—184工程菌總蛋白；2，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；3 9，誘導(dǎo)的GST-MEENWNAE177-184、 -EENWNAEK178-185、 -ENWNAEKR179-186、-隨NAEKRS18?！?87、 -WNAEKRSP"、 NAEKRSPT182—189和AEKRSPTF183—'9°工程菌總蛋白；10，誘導(dǎo)的GST188工程菌總蛋白。注圖5A中箭頭分別指示各表達(dá)的8肽融合蛋白。圖5B中在各目的8肽融合蛋白上 方均存在大腸桿菌抗原特征印跡條帶，在特征印跡條帶的下方，唯見3和4欄中箭頭指示 的MEENWNAE177—184和EENWNAEK'78—185融合蛋白與兔抗重組huZP3肽"，抗血清產(chǎn)生清晰的印跡 條帶，依據(jù)兩者共有殘基順序，可判定EENWNAE178—w基序?yàn)閔uZP3蛋白的一個(gè)線性BCE。圖6為huZP3'77—19°系列GST-8肽表達(dá)的SDS-PAGE檢測(cè)(A)和用抗huZP3172—187合成肽 抗血清的免疫印跡(B)圖。注各欄上樣蛋白樣品同圖5標(biāo)注。表位鑒定結(jié)果與圖5的一致，但背景清晰，無 大腸桿菌抗原特征印跡條帶。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而 非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照常規(guī)條件以及[美]J.薩姆布魯克和D. W.拉塞爾編著黃培堂等譯的第三版《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(科學(xué)出版社，2002)和[美]E.哈洛和.萊恩編著沈關(guān)心等譯的《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》(科 學(xué)出版社，2002)中所述的步驟，或按照生產(chǎn)銷售商所建議的條件進(jìn)行。 材料和方法1. 熱誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒pSY621(圖1)和大腸桿菌BL21 (DE3)菌株由復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國 家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。2. 含GST (Sj26)編碼基因的pGEX-4T-2質(zhì)粒購自Amersham Pharmacia Biotech公司。3. 限制性內(nèi)切酶EcoR I、 BamH I、 Sal I和Pst I以及T4DNA連接酶購自日本TaKaRa Biotecchnology公司，Taq I DNA聚合酶為復(fù)旦大學(xué)遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品，氨芐 青霉素(Amp)預(yù)染蛋白質(zhì)低分子量標(biāo)準(zhǔn)、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(IgG /HRP)、 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和硝酸纖維素膜購自華美生物工程公司產(chǎn)品。4. QIApr印spin minipr印Kit質(zhì)粒抽提試劑盒、QIAquick PCR產(chǎn)物純化試劑盒和 quick凝膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司。5. 兔抗huZP3a和huZP3b抗血清由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所制備(徐萬樣，何亞 萍，洪愛真，季朝能，錢吉，王曙，謝毅.人卵透明帶蛋白huZP3a22—176和huZP3"，肽段 在大腸桿菌中的表達(dá)及其純化.4—遭^"_^^, 24:143-148, 2004;宋力雯,汪玉寶，倪崖,何 亞萍，洪愛真，Hinsch E， Hinsch KD,周思暢，袁玉英，石其賢，徐萬祥.人卵透明帶蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其其抗血清體外研制人精子-半透明帶結(jié)合.主;^^j乾57: 682 - 688， 2005)和保藏。用與KLH載體蛋白偶聯(lián)的ZPC172—187合成肽免疫新西蘭白兔，制 備了兔抗ZPC172—187合成肽抗血清。PXXGST-1和pXXGST-2重組質(zhì)粒制備的具體步驟如下1. GST118基因片段擴(kuò)增GST188核心蛋白編碼核苷酸順序序列見SEQ ID NO: 1。對(duì)應(yīng)的GST核心蛋白的氨基 酸順序序列見SEQ ID NO. 2。先在計(jì)算機(jī)輔助下設(shè)計(jì)擴(kuò)增GST'—188編碼基因的二條正負(fù)鏈PCR引物，然后以pGEX-4T-2 質(zhì)粒為模板，用二條合成引物PCR擴(kuò)增(在94。C預(yù)變性3 min， 94"變性35 sec, 55°。退 火35 see,完成35個(gè)循環(huán)后72。C延伸60 sec)兩端帶EcoR I和BamH I的GST188 (564 bp) cDNA片段，經(jīng)15%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后，用EcoR I和BamH I限制酶酶切上述 PCR擴(kuò)增片段，走15%瓊脂糖凝膠電泳后割膠過柱回收備用；2. pSY621_GST188 (pXXGST-1)重組質(zhì)粒構(gòu)建 重組質(zhì)粒pXXGST-1的核苷酸順序序列見SEQ ID NO. 3。第一步，用EcoR I和BamH I先后酶切pSY621，將雙酶切回收的GST188片段重組插 入pSY621質(zhì)粒，連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)TGI宿主菌，挑抗Amp陽性克隆送DNA測(cè)序，繼而在3 ml的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增培養(yǎng)測(cè)序正確的克隆，收集菌體抽提它的重組子質(zhì)粒，用Sal I和 Pst I雙酶切備用；第二步，將在Sal I和Pst I粘性末端中間添加TAATAG雙終止密碼子的正負(fù)鏈合成 短片段退火復(fù)性，重組插入上述雙酶切質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)TGl宿主菌后挑抗Amp陽性克隆 送DNA測(cè)序，繼而在3 ml的LB培養(yǎng)液中擴(kuò)增培養(yǎng)測(cè)序正確的克隆，收集菌體抽提命名為 pXXGST-1的質(zhì)粒，作為本發(fā)明制品放置于-20'C冰箱備用；3. pSY621-GST188 (pXXGST-2)重組質(zhì)粒構(gòu)建再次合成在GST188編碼基因3'-端引入TAA終止密碼子的一條負(fù)鏈PCR引物，借用前 述的目的基因擴(kuò)增5'-端引物，PCR (條件同前)擴(kuò)增以pXXGST-l為模板的兩端為EcoR I 和BamH I的GST188編碼基因片段，通過T4 DNA連接酶重組插入用EcoR I和BamH I雙 酶切的pSY621，連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)TGI宿主菌，在LB平板上挑取Amp抗性克隆送DNA測(cè) 序，分別轉(zhuǎn)接測(cè)序正確的克隆于含A即的3 ml LB液中擴(kuò)增培養(yǎng)，抽取命名為pXXGST-2 重組質(zhì)粒，作為本發(fā)明制品放置于-20'C冰箱備用；4. 用pXXGST-1和pXXGST-2質(zhì)粒的短肽融合表達(dá)法的一個(gè)線性抗原表位的鑒定 如前所述，我們?cè)谏暾?qǐng)?zhí)枮?00710043264. 5的發(fā)明專利申請(qǐng)書中，已用pXXStv(118) -1鑒定出huZP3172—'81肽段中存在一個(gè)基序?yàn)镋NWNAEK178—184的抗原表位。在此利用先前合成的 覆蓋huZP3177—19°序列相鄰肽段重疊7 aa的8肽編碼基因片段(7對(duì)共14條正負(fù)鏈)，分別 兩兩退火復(fù)性，重組插入pXXGST-l質(zhì)粒，以檢驗(yàn)各GST188-短肽熱誘導(dǎo)高表達(dá)融合蛋白的 穩(wěn)定性。同時(shí)用兔抗重組huZP3"7，蛋白和抗huZP3172—187合成肽抗血清，檢驗(yàn)了以截短 GST188蛋白為載體，通過短肽生物合成進(jìn)行線性抗原表位鑒定的可行性和可靠性。第一步，先將1或2個(gè)0D的互補(bǔ)正負(fù)鏈片段(兩端設(shè)計(jì)為BamH I和Sal I粘性末端) 用ddH20溶解成20 nmol/Vl儲(chǔ)存液(根據(jù)DNA合成報(bào)告單數(shù)據(jù))；各取10 pl儲(chǔ)存液和20 ddH20于1. 5 ml Eppendorf管中，94。C水浴加熱5 min,自然降至室溫后，在15 pi反應(yīng)體 積中吸入2 pi退火片段、1 pi約200 ng/^il經(jīng)BamH I和Sal I雙酶切的pXXGST-1質(zhì)粒、 1 pi T4 DNA連接酶和其1.5 ial連接緩沖液，于16匸保溫瓶中連接過夜；第二步，翌日連接液轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21 (DE3)宿主菌(也可轉(zhuǎn)化效率高的TG1宿主菌)， 涂布含Amp的LB平板上，于37'C培養(yǎng)過夜；第二天挑取氨芐LB平板上長出的單克隆，轉(zhuǎn) 接平板或擴(kuò)增培養(yǎng)抽提質(zhì)粒后外送進(jìn)行DNA測(cè)序(此步可省略，只在蛋白印跡后，送相關(guān) 克隆進(jìn)行DNA測(cè)序)，或于翌日晚各挑取二個(gè)克隆于含Amp的3 ml LB液中30'C振蕩培養(yǎng)過夜，翌日晨按 1/50比例再分別轉(zhuǎn)接于3 ml加Amp的LB液中振蕩培養(yǎng)，待菌體0D值達(dá)到約0. 5時(shí)，將 培養(yǎng)溫度調(diào)高至42。C熱誘導(dǎo)表達(dá)4 h，離心收集的菌體加上樣裂解液煮沸5 min，用于15 %SDS-PAGE檢測(cè)。以pXXGST-2克隆誘導(dǎo)表達(dá)的GST188條帶為對(duì)照，目的克隆表達(dá)條帶在 后且兩者相差約l kDa的，即可判斷其為GST-短肽重組克隆(特異表達(dá)條帶明顯大于約3 kDa的，可能是合成片段中少合成l bp，以致TAA讀框移碼)；第三步通過SDS-PAGE檢測(cè)或DNA測(cè)序確定GST-短肽重組克隆后，誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌 蛋白樣品上樣10 15pl (盡可能保持目的短肽表達(dá)量一致，以利印跡結(jié)果判斷)，同時(shí)走 15%SDS-PAGE，電泳結(jié)束后， 一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色(結(jié)果見圖5A)， 一塊進(jìn)行硝酸 纖維素膜電轉(zhuǎn)移約1.5 2 h (100 mA)，用麗春紅染轉(zhuǎn)印膜2 h，在目的短肽融合蛋白條 帶處用針頭打孔標(biāo)記，然后用水沖洗掉麗春紅染色；第四步印跡膜用PBS緩沖液反復(fù)洗滌四次，用5%脫脂奶粉封閉過夜，PBS緩沖液 洗滌四次，分別在8 10 ml反應(yīng)液中加入30pl兔抗重組huZP3b177—348抗血清(一抗)， 室溫反應(yīng)2 h， PBS緩沖液洗膜后加入10 |il羊抗兔IgG /服P (二抗)，室溫反應(yīng)1 h，用 PBS緩沖液洗滌四次后進(jìn)行DAB顯色(結(jié)果見圖7B)。重復(fù)以上第三和第四步操作，用2 pl兔抗huZP3m"^合成肽抗血清進(jìn)行的免疫印跡 試驗(yàn)(結(jié)果見圖5)。很顯然，以上可專供短肽生物合成的pXXGST-l質(zhì)粒的構(gòu)建，特別是用它再次驗(yàn)證huZP3 一個(gè)已鑒定線性BCE基序的應(yīng)用，為今后蛋白抗原表位的掃描鑒定提供了經(jīng)濟(jì)、操作相對(duì) 方便，可利用抗重組蛋白或其片段多抗進(jìn)行表位作圖，因而易在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室開展的可選 擇研究方法和實(shí)驗(yàn)材料，也進(jìn)而為抗原表位鑒定生物合成肽法的廣泛應(yīng)用奠定了良好的基 礎(chǔ)。盡管本發(fā)明描述了抗原表位鑒定的具體應(yīng)用例子，然而有一點(diǎn)對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域研究技術(shù) 人員來說是顯而易見的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可對(duì)本發(fā)明制品作各 種變化改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。本發(fā)明涉及的序列SEQ.ID.NO.l:重組插入的GST188的DNA正鏈序列 5，-ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTC GACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGT TGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTT TAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAA-3，SEQ.ID.N0.2: GST188核心蛋白一字簡寫的氨基酸序列M-S-P誦I-L隱G-Y-W誦K-I-K-G誦L-V隱Q-P誦T-R-L-L墨L-E-Y-L誦E-E-K-Y-E-E-H誦L-Y-E-R-D-E-G -D-K-W-R-N-K-K-F-E-L-G-L-E-F-P-N-L隱P-Y-Y小D隱G-D-V-K隱L-T-Q-S-M-A-I小R-Y-I-A-D-K-H-N-M-L-G-G-C-P國K-E-R-A-E-I-S-M-L-E-G-A-V國L-D-I-R誦Y-G-V-S-R誦I誦A-Y-SK-D-F-E-T-L-K_VDF_L-SK_L_PE_M-L-K_M-F-E-DR-L-C-HK-T-Y-L-N-G-D-H-V-T-H-P-D-F誦M-L-Y-D-A-L-D國V-V-L墨Y-M-D-P隱M-C-L誦D隱A國F-P-K誦L-V-C-F-KK-R-I-E-A誦I-P-0SEQ.ID.N0.3:重組質(zhì)粒pXXGST-l的DNA正鏈序列(4196bp)<formula>formula see original document page 14</formula> <formula>formula see original document page 15</formula>GAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ.ID.N0.4:重組質(zhì)粒pXXGST-2的DNA正鏈序列(4193 bp)，是將pXXGST-l正鏈序列SEQ.N03中GGATCCGTCGAC后^TAATAG l雙終止密碼子去除，但在GGATCCGTCGAC 前插入一個(gè)TAA終止密碼子，其序列不再單獨(dú)列出。
權(quán)利要求
1、一種截短GST蛋白熱誘導(dǎo)融合表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于具有SEQ.ID.NO.3所示核苷酸序列，記為pXXGST-1。
2、 一種截短GST蛋白熱誘導(dǎo)融合表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于具有SEQ. ID. NO. 4所示核苷 酸序列，記為pXXGST-2。
3、 一種如權(quán)利要求1所述的截短GST蛋白熱誘導(dǎo)融合表達(dá)質(zhì)粒的制備方法，其特征 在于具體步驟如下(1) 設(shè)計(jì)PCR引物，從pGEX-4T-質(zhì)粒中擴(kuò)增出編碼GST蛋白188基因的大片段，該 大片斷在5'-和3'-端分別帶BamH I和Sal I的限制酶酶切位點(diǎn)；(2) 利用DNA重組技術(shù)，將目的GST基因擴(kuò)增片段插入用EcoR I和BamH I雙酶切 的pSY621質(zhì)粒，獲得的pSY621-GST重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌，在加Amp的LB平板 上挑取它們的重組克隆，進(jìn)行DNA測(cè)序；(3) 合成兩端為Sal I和Pst I粘性末端中間帶TAATAG雙終止密碼子的二條互補(bǔ)DNA 片段，將之退火復(fù)性后重組插入基因測(cè)序正確并經(jīng)雙酶切的pSY621-GST中Sal I和Pst I 位點(diǎn)之間，連接液轉(zhuǎn)化TG1宿主菌，再次外送DNA測(cè)序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒，命名為pXXGST-l， 其核苷酸序列為SEQ. ID. N03。
4、 一種如權(quán)利要求2所述的截短GST蛋白熱誘導(dǎo)融合表達(dá)質(zhì)粒的制備方法，其特征在 于具體步驟如下以權(quán)利要求3所述方法制備的pXXGST-1重組質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的一 對(duì)PCR引物擴(kuò)增在GST編碼基因3'-端后添加TAA終止密碼子的GST188基因片段，用EcoR I和BamH I限制酶雙酶切的擴(kuò)增大片段，被重組插入用同樣二個(gè)酶雙酶切的pSY621質(zhì)粒， 測(cè)序正確重組質(zhì)粒被新命名為pXXGST-2;其核苷酸序列為SEQ. ID. N04。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種截短GST蛋白熱誘導(dǎo)融合表達(dá)重組質(zhì)粒及其制備方法。本發(fā)明選用由188aa組成的新型截短GST188蛋白為載體，在大腸桿菌熱誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)短肽融合蛋白的pXXGST-1重組質(zhì)粒，以及用作表達(dá)對(duì)照的熱誘導(dǎo)型pXXGST-2重組質(zhì)粒，從而實(shí)現(xiàn)短肽生物合成的目的，專供抗原線性表位掃描作圖定位以及表位基序鑒定用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明GST188核心蛋白作為短肽生物表達(dá)載體以及在抗原表位掃描鑒定方面，特別是使用抗重組靶蛋白抗血清進(jìn)行表位基序鑒定的適用性和應(yīng)用性。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101215573SQ20071017330
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2007年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者何亞萍, 唐海平, 季朝能, 徐萬祥, 毅 謝, 顧少華 申請(qǐng)人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所;復(fù)旦大學(xué);上海科學(xué)院