專利名稱：通過(guò)降低rb與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的比率誘導(dǎo)惡性細(xì)胞中細(xì)胞程序性死亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在哺乳動(dòng)物如人中誘導(dǎo)惡性細(xì)胞的細(xì)胞死亡如細(xì)胞程序性死亡的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于轉(zhuǎn)移遺傳材料以實(shí)現(xiàn)惡性細(xì)胞中生長(zhǎng)停滯以及隨后的細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)的載體的用途。本發(fā)明也涉及將遺傳材料轉(zhuǎn)移入惡性細(xì)胞以通過(guò)細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的載體。
背景技術(shù)：
迄今為止，只有有限數(shù)量在臨床前模型中表現(xiàn)成功征兆的癌癥基因治療基本策略。兩個(gè)主要策略是細(xì)胞因子基因輔助的腫瘤接種疫苗和選擇性藥物前體活化。第一個(gè)策略依賴于相對(duì)小量的遺傳修飾的細(xì)胞毒性T細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)免疫刺激效應(yīng)，而第二種策略是基于通過(guò)編碼酶的基因?qū)⒎嵌拘运幬锴绑w轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物，其中由于所謂的旁觀者效應(yīng)，也在非轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂腫瘤細(xì)胞上發(fā)揮毒性效應(yīng)。選擇性地，可以設(shè)想通過(guò)使癌基因失活或重建失活的腫瘤抑制基因以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的惡性表型的策略。在兩種情況下，都需要導(dǎo)向腫瘤中細(xì)胞的高效基因轉(zhuǎn)移。盡管在某些情況下可以在體外甚至體內(nèi)得到高效基因轉(zhuǎn)移，但是通過(guò)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞中主要致癌變化以糾正惡性表型不可能產(chǎn)生正常細(xì)胞。因此，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡將是優(yōu)選的，發(fā)展產(chǎn)生這種誘導(dǎo)的方法具有重要意義。在正常細(xì)胞惡化前，不同癌基因或腫瘤抑制基因中必然發(fā)生幾種基因的改變。大多數(shù)癌基因或腫瘤抑制基因參與了一定比例腫瘤的發(fā)生，但是它們沒有任何一個(gè)參與了每種單個(gè)腫瘤的發(fā)生。目前有正在增加的證據(jù)表明僅存在非常有限的參與細(xì)胞命運(yùn)包括細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵決定的調(diào)控通路。多步驟致癌作用的共同特征是每一種通路的至少一種成分的取消。
隱性癌基因或腫瘤抑制物存在的想法首先通過(guò)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤易感基因(Rb1)的分離得到證實(shí)。這一發(fā)現(xiàn)大大促進(jìn)了腫瘤抑制物的尋找。自那以后，分離到了幾個(gè)其它的腫瘤抑制基因。Rb1基因產(chǎn)物pRb的功能與細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)緊密相關(guān)[Goodrich和Lee(1993)，Weiberg(1995)，Bartek等(1996)，Herwig和Strauss(1997)]。它在早G1期是非磷酸化的。非磷酸化的pRb與轉(zhuǎn)錄因子E2F形成復(fù)合物，E2F在晚G1期通過(guò)磷酸化從此復(fù)合物釋放出來(lái)，這表明其生長(zhǎng)抑制功能是基于E2F的結(jié)合，它可以導(dǎo)致在G0/G1期E2F依賴的基因活性抑制物的形成或?qū)е抡；罨腅2F的結(jié)合。當(dāng)前的觀點(diǎn)認(rèn)為兩種不同機(jī)制作用于不同的基因，或者甚至作用于一個(gè)相同的基因。
需要某些基因的順序活化以促進(jìn)從靜止期(G0)通過(guò)G1進(jìn)入DNA復(fù)制期(S)及隨后通過(guò)第二個(gè)間隙期(G2)進(jìn)入有絲分裂(M)的進(jìn)程[Pardee(1989)]。很明顯，細(xì)胞周期的每一期需要一套確定的基因的活性，這些基因只有在某一時(shí)期有活性。保證這種有序的事件級(jí)聯(lián)的一種機(jī)制是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的階段特異磷酸化和去磷酸化。這些階段特異的磷酸化是稱為細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶的酶(cdks)完成的。這些cdk的催化亞單位與稱為細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)亞單位形成復(fù)合物[Sherr(1993)]。細(xì)胞周期蛋白將cdk轉(zhuǎn)變成有活性的酶并通過(guò)與某些靶蛋白特異結(jié)合決定激酶的底物特異性。細(xì)胞周期蛋白是短壽命蛋白，其mRNA和/或蛋白水平在細(xì)胞周期的某一期積累。
最近，一類新的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物得到鑒定，它們是細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶的抑制劑(CKI)[Sherr和Roberts(1996)]。一組是CKI，激酶抑制蛋白(KIP蛋白)，包括p21KIP，p27KIP和p57KIP，可抑制幾種cdks，第二組(INK4蛋白)成員包括p15INK4，p16INK4，p18INK4和p19INK4，對(duì)cdk4/cdk6特異[Sherr和Roberts(1996)]。激酶的正調(diào)節(jié)物(細(xì)胞周期蛋白)和負(fù)調(diào)節(jié)物(CKI)看來(lái)以化學(xué)計(jì)量競(jìng)爭(zhēng)與cdks的結(jié)合，這一點(diǎn)至少對(duì)于cdk4/cdk6與細(xì)胞周期蛋白D或p16INK4的G1特異復(fù)合物是確實(shí)的[Parry等(1995)]。這證明細(xì)胞環(huán)境中生長(zhǎng)因子的平衡將決定cdk4/cdk6在與細(xì)胞周期蛋白D或p16INK4的復(fù)合物中的比例，由此決定pRb的磷酸化程度。另一腫瘤抑制物p53通過(guò)借助p21INK4的誘導(dǎo)抑制pRb磷酸化來(lái)發(fā)揮其至少一種功能[el Deiry等(1993)，Harper等(1993)，Dulic等(1994)]。這種對(duì)DNA破壞劑明確鑒定的反應(yīng)是晚G1期所謂的控制點(diǎn)的特征。因此，看來(lái)p53介導(dǎo)的生長(zhǎng)停滯的主要對(duì)象是pRb控制的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)機(jī)制。pRb作用為G1期進(jìn)程的主要已知抑制物[Pardee(1989)，Sherr(1993)，Sherr和Roberts(1996)]。
已表明編碼p16INK4的基因是腫瘤抑制物，它在某些腫瘤，甚至更普遍地在來(lái)自腫瘤的細(xì)胞系中高比率丟失[Kamb等(1994)，Nobori等(1994)]。p16INK4功能的丟失可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)生，包括點(diǎn)突變、刪除、也可通過(guò)由于超甲基化的沉默[Merlo等(1995)]。大多數(shù)最近的研究已表明Rb和p16INK4的丟失以相互排斥的方式發(fā)生，在幾乎每一個(gè)腫瘤細(xì)胞系都丟失了這兩個(gè)腫瘤抑制基因之一的功能[Otterson等(1994)，Okamoto等(1994)，Tam等(1994)，Lukas等(1995)]。
大多數(shù)分化組織持續(xù)不斷地更新自己一定比例的細(xì)胞。為了保持實(shí)體組織中細(xì)胞數(shù)目穩(wěn)定，需要細(xì)胞的同時(shí)死亡。這種編程性細(xì)胞死亡或細(xì)胞程序性死亡首先在肝臟中檢測(cè)到，后來(lái)在淋巴樣細(xì)胞中受到廣泛的研究。許多參與誘導(dǎo)或防止細(xì)胞程序性死亡的基因已經(jīng)得到鑒定[White(1994)]。在本文中研究最多的基因產(chǎn)物之一是腫瘤抑制物p53。此蛋白最初鑒定為與SV40 T-抗原復(fù)合的伴侶，SV40 T抗原也與pRb結(jié)合。SV40和其它DNA腫瘤病毒同時(shí)使pRb和p53失活被認(rèn)為是病毒誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化的唯一基礎(chǔ)[Hinds和Weinberg(1994)]。射線及其它破壞DNA的處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)p53的表達(dá)。p53依次誘導(dǎo)許多其它基因包括p21INK4的表達(dá)，已證明p21INK4是細(xì)胞周期蛋白依賴的蛋白激酶的主要抑制劑基因[el Deiry等(1993)]。因此，看來(lái)p53通過(guò)借助p21INK4介導(dǎo)的cdk4活性的封閉抑制pRb的磷酸化，在G1期發(fā)揮細(xì)胞周期抑制作用。然而，已證明p53也在晚G1期誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，這可能在DNA損傷不能正確修復(fù)時(shí)發(fā)生。另一方面，已證明p53不存在時(shí)的細(xì)胞程序性死亡，表明p53是細(xì)胞程序性死亡的誘導(dǎo)劑但可能不是細(xì)胞程序性死亡必需的，因此不是細(xì)胞程序性死亡機(jī)制的一部分[White(1996)]。p53的細(xì)胞程序性死亡作用可能是其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制最大的貢獻(xiàn)。盡管正常細(xì)胞對(duì)p53的反應(yīng)是細(xì)胞周期停滯，但是惡性細(xì)胞可能是對(duì)p53誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡更敏感。因此，p53陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞可能普遍對(duì)射線或化學(xué)治療誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡敏感。
Rb缺失的細(xì)胞中，有丟失p53功能強(qiáng)烈傾向。沒有任何已知的腫瘤細(xì)胞系并且可能沒有腫瘤(除成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤以外)是Rb缺陷的又是p53陽(yáng)性的。G1期控制的丟失使得細(xì)胞可以增殖幾輪但可能會(huì)被識(shí)別為p53的嚴(yán)重反常，可能由于突變的積累并會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡。因?yàn)樵诩?xì)胞周期蛋白D過(guò)量表達(dá)或p16INK4丟失時(shí)Rb通路的反常不如Rb丟失時(shí)明顯，p53的失活很明顯對(duì)于前兩種情況不是必需的。
已表明野生型p53基因的異位表達(dá)體外抑制完全缺少p53或表達(dá)突變p53的人腫瘤細(xì)胞系的增殖[Baker等(1990)，Cheng等(1992)，Takahashi等(1992)]。p53基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞在裸鼠中致瘤性更低。氣管內(nèi)輸注攜帶p53基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體阻礙裸鼠中常位人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[Cai等(1993)]。球形骨針腫瘤中相似逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用表明此載體能夠滲透到內(nèi)部腫瘤團(tuán)中并且也誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞中顯著的程序性腫瘤細(xì)胞死亡[Fujiwara等(1993)]。肺癌以及食管上皮的惡性病變通常有突變的p53，表明這些惡性腫瘤是通過(guò)適當(dāng)載體輸注的p53基因轉(zhuǎn)移的主要目標(biāo)。因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒載體在體內(nèi)基因傳遞方面有幾個(gè)固有的困難，所以制備了帶有p53基因的腺病毒載體[Zhang等(1993)]。第一代含有在CMV啟動(dòng)子控制下的p53基因的E1缺陷性載體已被導(dǎo)入p53缺陷的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[Zhang等(1994)]。在50pfu/細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(m.o.i)時(shí)得到幾乎100％的基因轉(zhuǎn)移并檢測(cè)到高水平的p53蛋白表達(dá)。盡管p53缺陷的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，但是在p53基因沒有缺陷的細(xì)胞中幾乎沒有影響。p53載體的腫瘤抑制效應(yīng)在多種動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證[Wills等(1994)，Liu等(1994)]。最近，發(fā)表了p53基因轉(zhuǎn)移應(yīng)用的首次臨床試驗(yàn)[Roth等(1996)]。在這項(xiàng)研究中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于將p53基因傳遞到肺癌末期病人中，這些病人都在治療后幾周內(nèi)死亡。在某些病人中，可檢測(cè)到與細(xì)胞程序性死亡相關(guān)的腫瘤抑制的明顯征兆。然而，從這項(xiàng)研究很難評(píng)估腫瘤細(xì)胞死亡和腫瘤塊退化的程度。肺癌細(xì)胞不僅經(jīng)常是p53缺陷的，而且易于由過(guò)量表達(dá)的p53誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，使得這種腫瘤尤其適于p53基因治療。
p16INK4是(MTS1)真實(shí)的腫瘤抑制物。p16INK4基因的功能在多種腫瘤類型中丟失，相當(dāng)于約60％的所有腫瘤細(xì)胞，在胰腺腫瘤和黑色素瘤中達(dá)到80-90％的功能丟失[Kamb等(1994)，Nobori等(1994)，Merlo等(1995)，Otterson等(1994)，Okamoto等(1994)，Tam等(1994)，Hannon和Beach(1994)，Marx(1994)，Zhang等(1994)，Jen等(1994)，Washimi等(1995)，Hussussian等(1994)]。如上文所述，p16INK4基因產(chǎn)物特異地抑制cdk4，由此抑制pRb的磷酸化[Serrano等(1993)，Serrano等(1995)]。因此，它直接作用在pRb的上游[Lukas等(1993)，Koh等(1995)]。所以，pRb和p16INK4丟失是二者擇一的事件。Rb缺陷的腫瘤通常是p16INK4陽(yáng)性的，p16INK4缺陷的腫瘤有正常的Rb[Strauss等(1995)，White等(1996)]。因此，在腫瘤細(xì)胞中p16INK4功能的重建可以恢復(fù)正常的生長(zhǎng)控制[Lukas等(1995)]，但不一定導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)的抑制。最近含有p16INK4的腺病毒載體在裸鼠中的應(yīng)用表明腫瘤生長(zhǎng)的某些停滯。此結(jié)果證實(shí)了p16INK4的腫瘤抑制功能，也表明通過(guò)這個(gè)腫瘤抑制物不會(huì)得到顯著的腫瘤退化。
發(fā)明概述本發(fā)明的目標(biāo)在于基于抑制細(xì)胞增殖的腫瘤抑制物和細(xì)胞程序性死亡(apoptosis)誘導(dǎo)的聯(lián)合應(yīng)用的癌基因治療?，F(xiàn)有技術(shù)已表明多種腫瘤抑制物可以普遍抑制細(xì)胞增殖而不是特異性地針對(duì)腫瘤細(xì)胞。多種試劑可以誘導(dǎo)正常細(xì)胞中的細(xì)胞程序性死亡，但誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞程序性死亡難得多。對(duì)細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)劑反應(yīng)的能力主要依賴于正常p53基因的存在。這個(gè)基因的產(chǎn)物是主要的細(xì)胞程序性死亡內(nèi)源誘導(dǎo)劑。在大多數(shù)癌中p53功能失活。腫瘤生長(zhǎng)的速度主要依賴于細(xì)胞增殖增加和細(xì)胞程序性死亡之間的平衡。當(dāng)p53丟失時(shí)，不會(huì)發(fā)生自發(fā)的細(xì)胞程序性死亡而且化療誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡的效率很低。既然腫瘤治療的主要目標(biāo)不僅是腫瘤生長(zhǎng)抑制，而且是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，那么結(jié)合兩種原理尤其重要。已將功能性Rb的存在與細(xì)胞程序性死亡的阻礙聯(lián)系起來(lái)[Hass-Kogan等(1995)，Herwig和Strauss(1997)]。因此，看來(lái)細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡的調(diào)節(jié)通過(guò)pRb和p53緊密協(xié)調(diào)。兩種功能的丟失可能導(dǎo)致沒有細(xì)胞程序性死亡的無(wú)限制生長(zhǎng)。出現(xiàn)的問(wèn)題是一個(gè)或另一個(gè)腫瘤抑制物的重建是否能導(dǎo)致生長(zhǎng)調(diào)控的重建和/或細(xì)胞程序性死亡。
本發(fā)明是基于p16INK4基因的產(chǎn)物(也稱為MTS-1＝CDKI4＝CDKN2)[Hannon等(1994)]抑制所有具有功能性Rb1基因的細(xì)胞中的細(xì)胞增殖，并且在約85％的所有腫瘤中也是這種情況這一原始發(fā)現(xiàn)。通過(guò)多種方法將p16INK4基因轉(zhuǎn)入不同類型的腫瘤細(xì)胞可通過(guò)Rb蛋白磷酸化的抑制導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制，只要p16INK4蛋白從轉(zhuǎn)入的基因得到合成，這種抑制作用就存在。以后，細(xì)胞能從阻斷回復(fù)并恢復(fù)分裂。因此，細(xì)胞分裂的瞬間抑制對(duì)于腫瘤生長(zhǎng)的有效抑制和腫瘤退化是不夠的。關(guān)于p16INK4基因的異位表達(dá)，使用所選腺病毒載體過(guò)量表達(dá)p16INK4基因時(shí)，觀察到p53陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中某些程度的自發(fā)細(xì)胞程序性死亡(實(shí)施例2)。在p53缺陷的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中觀察不到細(xì)胞程序性死亡。p16INK4(Ad-p16-9)(ECACC注冊(cè)號(hào)V97021335)和p53的聯(lián)合過(guò)量表達(dá)在p53陽(yáng)性或陰性的腫瘤細(xì)胞中但令人驚奇地不在正常細(xì)胞中導(dǎo)致無(wú)前例的高度細(xì)胞程序性死亡(高達(dá)100％)(實(shí)施例3)。p16INK4過(guò)量表達(dá)的腫瘤細(xì)胞特異的細(xì)胞程序性死亡效應(yīng)這一驚人發(fā)現(xiàn)得到了更詳盡的研究。據(jù)觀察，p16INK4過(guò)量表達(dá)時(shí)，Rb蛋白(pRb)的水平在三天期間有很大程度的降低(實(shí)施例4)。此效應(yīng)可能是由于Rb1基因受到其非磷酸化產(chǎn)物pRb的自身抑制。因此，p16INK4的過(guò)量表達(dá)不僅阻斷了細(xì)胞分裂，而且隨后降低pRb的水平，繼而導(dǎo)致p53陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞程序性死亡的能力增加。后者可通過(guò)p53的同時(shí)過(guò)量表達(dá)顯著增加。
本發(fā)明非常重要的方面是不僅pRb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白如p53的絕對(duì)水平對(duì)細(xì)胞程序性死亡的誘導(dǎo)是重要的，而且這兩種蛋白的比率對(duì)細(xì)胞程序性死亡的誘導(dǎo)也是重要的(實(shí)施例5)。在不同細(xì)胞類型之間不同的pRb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的比率(若細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白是p53，比率在1∶1-1∶20之間)必須通過(guò)兩種途徑在細(xì)胞周期停滯后降低。首先，pRb水平必須降低至少5倍(在原始水平的20％以下)，優(yōu)選地至少10倍(10％以下)或甚至20倍(5％以下)。同時(shí)，p53的水平優(yōu)選地提高到原始水平的兩倍以上。對(duì)于在80-100％的惡性細(xì)胞中有效的細(xì)胞程序性死亡，只提高p53的水平而不降低pRb的水平是不夠的。p53和pRb水平變化的定量可以通過(guò)抽提來(lái)自診斷為腫瘤的組織及來(lái)自經(jīng)根據(jù)本發(fā)明所述的治療后同位置的組織并通過(guò)運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)如免疫印跡、ELISA或其它技術(shù)，使用對(duì)pRb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白特異的抗體比較組織樣品中Rb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的水平來(lái)進(jìn)行。一般地，pRb的總量包括磷酸化pRb和非磷酸化pRb將得到測(cè)量。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的觀點(diǎn)降低pRb的總量時(shí)，是非磷酸化pRb的水平降低，因?yàn)榻档椭辉趲缀鯖]有磷酸化的pRb存在時(shí)才發(fā)生。
治療通常包括用包含p16INK4基因的優(yōu)選形式的載體，優(yōu)選地與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)基因結(jié)合轉(zhuǎn)染腫瘤組織，通常在開始治療后一周或兩周后抽提用于Rb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白定量的組織。
因此，本發(fā)明涉及包含遺傳材料的、用于制備治療惡性疾病的組合物的載體的用途，所述載體一旦施用給患惡性疾病的對(duì)象，就通過(guò)降低惡性細(xì)胞中Rb水平與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平的比率，通過(guò)降低pRb的水平并提高細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的水平，在通過(guò)此處誘導(dǎo)pRb蛋白磷酸化的抑制首次實(shí)現(xiàn)所述惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯之后，誘導(dǎo)惡性細(xì)胞中細(xì)胞程序性死亡。
本發(fā)明也涉及用于遺傳材料轉(zhuǎn)移的載體。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通常在幾小時(shí)或幾天時(shí)間以有順序的方式發(fā)生的幾個(gè)事件，開始是導(dǎo)致細(xì)胞分裂阻斷和隨后的pRb水平降低的基因過(guò)量表達(dá)(對(duì)于此基因，p16INK4是原型)，隨后是細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白如p53的過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。后者在可很好檢測(cè)到野生型p53表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中省略。Rb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的比率的降低是關(guān)鍵點(diǎn)。過(guò)量表達(dá)優(yōu)選地通過(guò)使用病毒載體，優(yōu)選地腺病毒載體實(shí)現(xiàn)。需要仔細(xì)選擇高表達(dá)者(在正常水平的5倍以上)。最有利的載體是可同時(shí)表達(dá)兩個(gè)基因的載體。
因此本發(fā)明優(yōu)選的工具是使p16INK4或其一種相關(guān)物和p53或其下游效應(yīng)物之一同時(shí)表達(dá)的腺病毒(或其它病毒)載體。因?yàn)閜16INK4和p53是某些通路的主要調(diào)節(jié)子，所以有幾個(gè)潛在的p16INK4和p53替代物，p16INK4可由p15INK4、p18INK4或p19INK4或選擇性地由p21KIP、p27KIP或p57KIP成功地替換。P53基因誘導(dǎo)許多前細(xì)胞程序性死亡基因如bax，bak，bcl-X，它們可替代p53用作治療載體的一部分。當(dāng)使用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白”時(shí)，涉及這些基因的蛋白產(chǎn)物。
本發(fā)明的方法用于在裸鼠中引起轉(zhuǎn)導(dǎo)前細(xì)胞的腫瘤發(fā)生的抑制(實(shí)施例6)并且通過(guò)將基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移到已存在的腫瘤中引起腫瘤生長(zhǎng)的抑制。數(shù)據(jù)清楚地表明，p16INK4或p53的單獨(dú)施用效果極小或沒有效果，而兩個(gè)基因的結(jié)合效果很強(qiáng)。聯(lián)合治療抑制大多數(shù)動(dòng)物中的腫瘤生長(zhǎng)，甚至其它的某些表現(xiàn)腫瘤的完全退化。因此，本發(fā)明方法的體內(nèi)應(yīng)用的結(jié)果主要依賴于載體向腫瘤組織的適當(dāng)傳遞。
關(guān)于本發(fā)明，運(yùn)用了基于p16INK4抑制生長(zhǎng)和p53誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡聯(lián)合效應(yīng)的腫瘤基因治療新策略。第一次表明，p16INK4過(guò)量表達(dá)誘導(dǎo)pRb蛋白合成的負(fù)調(diào)節(jié)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞程序性死亡刺激的敏感性提高。因此，只要能夠在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)，細(xì)胞周期蛋白D/cdk-pRb通路的有效阻斷就是對(duì)于生長(zhǎng)停滯和由于細(xì)胞程序性死亡的腫瘤退化的關(guān)鍵步驟。本發(fā)明首次講述了在活生物體中誘導(dǎo)大多數(shù)惡性細(xì)胞細(xì)胞程序性死亡的方法。因此，本發(fā)明滿足了有效抗腫瘤治療的長(zhǎng)期需要。
WO96/27008公開了包含在腺病毒載體中的編碼p16INK4的遺傳材料向細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以治療腫瘤和其它增生。本文件不公開或討論是否p16INK4的細(xì)胞表達(dá)的一定水平是必需的或優(yōu)選的。與此相反，本發(fā)明公開只有在p53蛋白存在的情況下，p16INK4蛋白的顯著過(guò)量表達(dá)才導(dǎo)致有效和廣泛的細(xì)胞死亡。
WO95/11301涉及通過(guò)提高p53蛋白的細(xì)胞水平或通過(guò)提高p53的活性以降低增殖哺乳動(dòng)物細(xì)胞如癌細(xì)胞存活率的方法。未討論或談及與腫瘤抑制有關(guān)的其它細(xì)胞蛋白。單獨(dú)使用p53與本發(fā)明所用的方法正好相反，在惡性細(xì)胞中表達(dá)或過(guò)量表達(dá)p53不足以通過(guò)細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(見實(shí)施例3)。
WO96/20207公開了用于治療多種病理生理細(xì)胞增殖疾病的pRb和p53蛋白的突變體。癌細(xì)胞用編碼上述兩種蛋白的核酸同時(shí)或連續(xù)治療。然而，未提及使細(xì)胞死亡需要的表達(dá)水平。也未討論這兩種蛋白的細(xì)胞比率的意義。而且，僅僅證明陽(yáng)性治療效果只在缺失p53或pRb的細(xì)胞系中得到。這不能說(shuō)明WO96/20207的方法普遍適于治療癌癥。
從WO96/27008可知p16INK4在多種腫瘤細(xì)胞中的異位表達(dá)可以抑制這些細(xì)胞的增殖。然而本發(fā)明表明，導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯的p16INK4的顯著過(guò)量表達(dá)對(duì)于表達(dá)p53的腫瘤細(xì)胞中通過(guò)pRb水平的負(fù)調(diào)節(jié)及p53水平的同時(shí)提高導(dǎo)致pRb蛋白與p53蛋白比率(pRb/p53)的降低，誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡是至關(guān)重要的。而且本發(fā)明已證明了幾種細(xì)胞中pRb和p53水平變化的真實(shí)數(shù)量。
本發(fā)明涉及包含遺傳材料的、用于制備治療惡性疾病的組合物的載體的用途，所述載體一旦施用給患惡性疾病的對(duì)象，就通過(guò)降低惡性細(xì)胞中Rb蛋白水平與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平的比率，通過(guò)降低pRb水平并提高細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平，在通過(guò)此處誘導(dǎo)pRb蛋白磷酸化的抑制首次實(shí)現(xiàn)所述惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯之后，誘導(dǎo)惡性細(xì)胞中細(xì)胞程序性死亡。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“生長(zhǎng)停滯”是指細(xì)胞分裂的基本上阻斷，應(yīng)理解為幾乎完全阻斷，通常至少90％。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，通過(guò)將降低pRb水平至少5倍(原始水平的20％以下)、至少10倍(原始水平的10％以下)或至少20倍(原始水平的5％以下)，并且優(yōu)選地將細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白如p53的水平提高至少兩倍來(lái)降低惡性細(xì)胞中pRb蛋白水平與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平的比率。
本發(fā)明人首次表明，在多種類型惡性細(xì)胞中，pRb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的比率決定首次實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)停滯之后通過(guò)細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的可能性。實(shí)際比率看來(lái)根據(jù)目的細(xì)胞類型而變動(dòng)。通過(guò)使用本發(fā)明的方法，本發(fā)明人已能夠誘導(dǎo)腫瘤中至少90％惡性細(xì)胞中的細(xì)胞程序性死亡。這個(gè)殺細(xì)胞百分?jǐn)?shù)空前地高，并且由此提供了癌癥治療方面的顯著進(jìn)步。
根據(jù)本發(fā)明，pRb蛋白水平與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平的比率(如pRb/p53)優(yōu)選地通過(guò)用特異抗體在同一塊膠上免疫印跡細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白(如p53)和pRb蛋白來(lái)定量。可檢測(cè)到的一級(jí)抗體的量例如通過(guò)通用的二級(jí)抗體和鏈親和素-POD反應(yīng)與各自靶蛋白的量(分子)大約一致來(lái)測(cè)定。因此，比率不能給出非常精確的摩爾比而是檢測(cè)到的免疫復(fù)合物的相對(duì)測(cè)定。因此，pRb水平降低及細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平升高的測(cè)定比這兩個(gè)蛋白摩爾比的測(cè)定更具重復(fù)性、更可靠。
pRb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平變化的定量將優(yōu)選地通過(guò)抽提來(lái)自診斷為腫瘤的組織及來(lái)自經(jīng)根據(jù)本發(fā)明所述的治療后相同位置的組織并通過(guò)運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)如免疫印跡、ELISA或其它技術(shù)，使用對(duì)pRb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白特異的抗體比較組織樣品中Rb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的水平來(lái)進(jìn)行。使用分別對(duì)pRb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白免疫染色的來(lái)自腫瘤的組織的切片與來(lái)自經(jīng)根據(jù)本發(fā)明所述的治療后相同位置的組織切片相比較也是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明所述的治療將優(yōu)選地包括用有效量的包含p16INK4基因的優(yōu)選形式的載體，選擇性地與p53基因或p53前細(xì)胞程序性死亡的下游基因結(jié)合轉(zhuǎn)染腫瘤組織。用于對(duì)pRb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平定量的組織或組織切片優(yōu)選地在開始治療后至少一個(gè)星期，優(yōu)選地兩個(gè)星期分別提取或切出。如果Rb和細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平的比率沒有足夠降低，則可以重復(fù)治療。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，惡性細(xì)胞是p53陽(yáng)性的。術(shù)語(yǔ)“p53陽(yáng)性”是指正常(野生型)蛋白已表達(dá)并可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如免疫組織化學(xué)或免疫印跡檢測(cè)到。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，惡性腫瘤細(xì)胞是p53缺陷的。術(shù)語(yǔ)“p53缺陷”是指由于基因的總重排或刪除導(dǎo)致的表達(dá)缺乏。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，惡性細(xì)胞中的pRb水平降低。
根據(jù)本發(fā)明背后的中心觀點(diǎn)，pRb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白(如pRb/p53)的比率對(duì)于惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡至關(guān)重要。而且，本發(fā)明人已證明正常野生型pRb水平的降低是比率降低起始點(diǎn)必需的。同樣，p53的存在是必需的。因此，根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)控制pRb和p53的水平誘導(dǎo)p53陽(yáng)性的惡性細(xì)胞的細(xì)胞程序性死亡是可能。如果細(xì)胞是p53缺陷的，必需根據(jù)本發(fā)明使它們成為p53陽(yáng)性。
在本發(fā)明另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，惡性細(xì)胞中pRb水平與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白(如pRb/p53)水平的比率通過(guò)將遺傳材料轉(zhuǎn)入所述細(xì)胞降低pRb的水平并提高細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白如p53的水平而降低。
術(shù)語(yǔ)“遺傳材料”是指核酸。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，遺傳材料是選自由p16INK4、p15INK4、p18INK4、p19INK4、p21KIP、p27KIP、p57KIP和p53組成的群體的一個(gè)或多個(gè)基因。p16INK4基因的修飾形式，特別是只編碼p16INK4蛋白cdk結(jié)合區(qū)或此區(qū)的突變形式的p16INK4基因的修飾形式也是優(yōu)選的。
術(shù)語(yǔ)“修飾形式”是指通過(guò)在遺傳序列中刪除、添加或替換特定核酸從原始基因衍生的遺傳材料。
p16INK4和cdk4的相互作用產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的生長(zhǎng)停滯效應(yīng)，因此，得到盡可能強(qiáng)而有效的相互作用是有利的?？赏ㄟ^(guò)構(gòu)建p16INK4基因的修飾形式進(jìn)行，它一旦轉(zhuǎn)入細(xì)胞，就產(chǎn)生比正常p16INK4更強(qiáng)地與內(nèi)源性cdk4蛋白相互作用的p16INK4蛋白類型。
如實(shí)施例4所示，基因轉(zhuǎn)移及隨后的p16INK4基因在惡性細(xì)胞中的異位細(xì)胞表達(dá)將導(dǎo)致pRb的細(xì)胞水平降低。這種降低將導(dǎo)致該惡性細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，根據(jù)本發(fā)明，這是誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的前提條件。根據(jù)本發(fā)明，可能通過(guò)模擬惡性細(xì)胞中表達(dá)p16INK4的效應(yīng)的任何方法得到細(xì)胞程序性死亡后的生長(zhǎng)停滯。由p15INK4、p18INK4、p19INK4、p21KIP、p27KIP、p57KIP基因編碼的蛋白是p16INK4的相關(guān)物并能夠在細(xì)胞中以某種程度模擬p16INK4的效應(yīng)。因此根據(jù)本發(fā)明，可以將編碼這些蛋白的基因轉(zhuǎn)入惡性細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)停滯及隨后細(xì)胞程序性死亡的誘導(dǎo)。這同樣適用于經(jīng)修飾的但仍具有功能的p16INK4基因形式。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“p16INK4相關(guān)物”是指同樣認(rèn)可的INK4家族的基因如p15INK4、p18INK4和p19INK4。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，被轉(zhuǎn)移的遺傳材料是與p53基因結(jié)合的p16INK4基因。同樣優(yōu)選的是與p53前細(xì)胞程序性死亡下游基因結(jié)合的p16INK4的修飾形式。
術(shù)語(yǔ)“p53前細(xì)胞程序性死亡下游基因”是指在p53下游作用而在調(diào)控級(jí)聯(lián)反應(yīng)的前面的基因(如pRb)。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，P53活化和抑制許多基因，所有的這些基因都稱為下游基因。其中某些基因僅僅是細(xì)胞周期抑制子(如p21KIP)，其它的是前細(xì)胞程序性死亡的。p53前細(xì)胞程序性死亡下游基因的例子是bax、bak和bcl-X基因。
p16INK4和p53的聯(lián)合轉(zhuǎn)移使得在p53陽(yáng)性和p53缺陷的惡性細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)所需的生長(zhǎng)停滯效應(yīng)及隨后的細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)成為可能。實(shí)施例3表明這兩個(gè)基因同時(shí)轉(zhuǎn)移的協(xié)同效應(yīng)。在相似模式中，可以使用與p53下游基因結(jié)合的p16INK4基因的修飾形式。
在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，遺傳材料在載體中轉(zhuǎn)移。載體可以是非病毒載體或病毒載體。如果載體是病毒載體，根據(jù)本發(fā)明，選自由腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰疹病毒載體和雜合載體組成的群體的載體是優(yōu)選的。尤其優(yōu)選地，病毒載體是Ad-p16-9載體(ECACC注冊(cè)號(hào)V97021335)。
在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，得到被轉(zhuǎn)移的遺傳材料的高水平過(guò)量表達(dá)。優(yōu)選地，得到了2倍以上的過(guò)量表達(dá)，更優(yōu)選地4倍以上，進(jìn)一步更優(yōu)選地6倍以上，甚至更優(yōu)選地8倍以上，最優(yōu)選地得到10倍以上的過(guò)量表達(dá)。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“過(guò)量表達(dá)”是指超過(guò)正常細(xì)胞中水平的表達(dá)。
本發(fā)明人證明p16INK4基因的細(xì)胞過(guò)量表達(dá)對(duì)于實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明所述的生長(zhǎng)停滯和細(xì)胞程序性死亡的誘導(dǎo)是至關(guān)重要的。在本發(fā)明公開以前，還不知道p16INK4的異位表達(dá)本身就足以獲得效應(yīng)。因此，本發(fā)明通過(guò)公開過(guò)量表達(dá)，優(yōu)選地高水平的過(guò)量表達(dá)是必需的，首次提供了大多數(shù)惡性細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的基礎(chǔ)。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明使p53缺陷細(xì)胞變成p53陽(yáng)性。特別優(yōu)選地，通過(guò)轉(zhuǎn)移p53基因，將p53缺陷細(xì)胞變成p53陽(yáng)性。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明所述的用于治療惡性疾病的用途。優(yōu)選地，此惡性疾病是實(shí)體瘤。更優(yōu)選地，惡性疾病選自由結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、頭和頸癌、腎癌和黑色素瘤組成的群體。
本發(fā)明的重要方面是包含遺傳材料的、用于制備治療惡性疾病的組合物的載體的用途，所述載體一旦施用給患惡性疾病的對(duì)象，就通過(guò)降低惡性細(xì)胞中Rb蛋白水平與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平的比率，通過(guò)降低pRb水平并提高細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平，在通過(guò)此處誘導(dǎo)pRb蛋白磷酸化的抑制首次實(shí)現(xiàn)所述惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯之后，誘導(dǎo)惡性細(xì)胞死亡如細(xì)胞程序性死亡。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中的載體是非病毒載體。使用病毒載體，特別是腺病毒載體也是優(yōu)選的。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中病毒載體選自由腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰疹病毒載體和雜合載體組成的群體。尤其優(yōu)選的是根據(jù)本發(fā)明所述的Ad-p16-9載體(ECACC注冊(cè)號(hào)V97021335)的用途。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“雜合載體”是指通過(guò)結(jié)合不同載體的部分產(chǎn)生的載體。可以結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)病毒的不同部分，也可以結(jié)合病毒部分與非病毒成分。
在實(shí)施例1中，本發(fā)明人證明Ad-p16-9載體(ECACC注冊(cè)號(hào)V97021335)的使用確保了通過(guò)此載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞的基因的高水平細(xì)胞過(guò)量表達(dá)。既然根據(jù)本發(fā)明，這樣的過(guò)量表達(dá)水平是優(yōu)選的，那么公開的腺病毒載體代表了超過(guò)迄今為止公開的載體的重要優(yōu)點(diǎn)，那些載體已知不能介導(dǎo)它們轉(zhuǎn)移的基因的明顯過(guò)量表達(dá)。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中的遺傳材料是選自由p16INK4、p15INK4、p18INK4、p19INK4、p21KIP、p27KIP、p57KIP和p53組成的群體的一個(gè)或多個(gè)基因。特別優(yōu)選的是p16INK4基因的修飾形式或其多種衍生物的用途。更優(yōu)選的是只編碼p16INK4蛋白cdk結(jié)合區(qū)的p16INK4基因的修飾形式的用途。甚至更優(yōu)選的是與p53基因結(jié)合的p16INK4基因的用途。最優(yōu)選的是與p53前細(xì)胞程序性死亡下游基因結(jié)合的p16INK4基因的修飾形式。
本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中獲得了被轉(zhuǎn)移遺傳材料的高水平過(guò)量表達(dá)。優(yōu)選的是獲得所選基因2倍以上的過(guò)量表達(dá)。更優(yōu)選的是獲得所選基因4倍以上的過(guò)量表達(dá)。進(jìn)一步更優(yōu)選的是獲得所選基因6倍以上的過(guò)量表達(dá)。甚至更優(yōu)選的是獲得所選基因8倍以上的過(guò)量表達(dá)。最優(yōu)選的是獲得所選基因10倍以上的過(guò)量表達(dá)。
本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是根據(jù)本發(fā)明所述的用途，其中比率(pRb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白)是通過(guò)降低pRb水平至少5倍(原始水平的20％以下)，優(yōu)選地至少10倍(原始水平的10％以下)或甚至至少20倍(原始水平的5％以下)降低的。同時(shí)，p53水平應(yīng)升高到原始水平的至少兩倍。對(duì)于在80-100％的惡性細(xì)胞中有效的細(xì)胞程序性死亡，只提高細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白(如p53)的水平而不降低pRb的水平是不夠的。然而，只降低pRb的水平而不改變細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的水平可能是足夠的。因此，其中pRb降低而細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白如p53保持在相同水平的用途在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的重要方面涉及包含編碼p16INK4蛋白或其功能相當(dāng)物的核酸序列并且進(jìn)一步選擇性地包含編碼p53或其功能相當(dāng)物的核酸序列以及載體本身的遺傳元素的載體，所述本身的遺傳元素使所述基因明顯過(guò)量表達(dá)。
本發(fā)明的另一非常重要的方面涉及特定腺病毒載體Ad-p16-9，由Humboldt Universitat zu Berlin，Lehrstuhl MolekulareZellbiologie，Max-Delbruck-Haus，Robert-Rossle-Str.10，D-13122Berlin，德國(guó)，于1997年2月13日以注冊(cè)號(hào)V9702135保藏于歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC)。此保藏根據(jù)Budapest條約的條款進(jìn)行。
附圖簡(jiǎn)述

圖1此圖表示用載體Ad-p16-9進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移后p16INK4在IMR-90中的過(guò)量表達(dá)。用50m.o.i感染滴度感染1小時(shí)，48小時(shí)后洗滌并收集細(xì)胞，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。用抗p16INK4的單克隆抗體(DCS50)檢測(cè)p16INK4。右邊泳道內(nèi)上面的帶與在病毒感染細(xì)胞中被上調(diào)的內(nèi)源性p16INK4一致。下面的帶代表來(lái)自具有短的N-端截短的編碼序列的基因p16INK4的異位過(guò)量表達(dá)。
圖2此圖表示Ad-p16INK4基因轉(zhuǎn)移對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的影響。用PBS(上面欄)作為對(duì)照的兩個(gè)缺乏內(nèi)源性p16INK4表達(dá)的細(xì)胞系(HuH7，LOVO)和兩個(gè)Rb陰性細(xì)胞系(BT549，C33A)或用Ad-bg(中間欄)或分別以50、30、50和50m.o.i Ad-p16INK4腺病毒感染細(xì)胞。感染后48小時(shí)，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入溴脫氧尿苷(BrdU)。30分鐘后，用胰酶消化、固定細(xì)胞并通過(guò)流式光度術(shù)用碘化丙錠染色分析DNA的含量，用BrdU的攝入分析DNA的合成。在Ad-p16INK4處理的HuH7和LOVO中幾乎沒有增殖細(xì)胞的碎片，而此病毒對(duì)BT549和C33A沒有影響。在Ad-p16INK4處理的HuH7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了DNA含量少于G1細(xì)胞的部分細(xì)胞(G1峰的臂)(在兩種腫瘤細(xì)胞中的單個(gè)實(shí)驗(yàn)中此臂的存在與否有差異)。
圖3此圖表示p16INK4和p53基因同時(shí)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的餓細(xì)胞程序性死亡的刺激。碘化丙錠染色后通過(guò)流式光度術(shù)分析了HuH7、LOVO和IMR-90中的DNA含量。分析前，用PBS處理(-)或用Ad-p53和Ad-p16INK4腺病毒以25(HuH7)或15(LOVO)m.o.i處理96小時(shí)。以25(HuH7)和15(LOVO)m.o.i加入Adβgal病毒。Ad-p53或Ad-p16INK4病毒都以25(HuH7)和15(LOVO)m.o.i進(jìn)行兩次感染。在Ad-p53處理的細(xì)胞中，只有輕微的S期下降，細(xì)胞周期曲線保持正常，Ad-p16INK4感染的細(xì)胞中G1和G2峰變寬(典型實(shí)驗(yàn))。大多數(shù)兩次處理的HuH7和LOVO細(xì)胞的DNA含量顯著降低。沒有G1和G2峰。在IMR-90中未觀察到亞-G1(細(xì)胞程序性死亡的)DNA峰。
圖4此圖表示用Ad-p16INK4感染HuH7細(xì)胞后，pRb表達(dá)和磷酸化的時(shí)間進(jìn)程。以50m.o.i.進(jìn)行感染并在標(biāo)明的時(shí)間點(diǎn)制備提取物。按方法中所述對(duì)提取物進(jìn)行SDS-PAA電泳、Western印跡及免疫檢測(cè)pRb。
圖5此圖表示轉(zhuǎn)移及Ad-p16INK4和p53過(guò)量表達(dá)后pRb水平降低和p53水平升高的檢測(cè)。此圖表示用Ad-p16(15m.o.i.)和Ad-p53(15m.o.i.)在含有1mM MgCl2存在的磷酸緩沖鹽中進(jìn)行的1小時(shí)的腺病毒感染HuH7細(xì)胞。在37℃培養(yǎng)細(xì)胞3天，洗滌后用裂解緩沖液提取。在10％的聚丙烯酰胺-SDS凝膠上分離蛋白(50μg)，然后通過(guò)半干轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上并進(jìn)行免疫檢測(cè)。一級(jí)抗體是抗pRb的G3245(Pharmingen)和抗p53的Ab-2(Oncogene Sciences)。用生物素標(biāo)記的抗小鼠抗體和鏈親和素-POD偶聯(lián)物(ECL系統(tǒng)，Amersham)檢測(cè)特異的免疫復(fù)合物通過(guò)對(duì)X-光片曝光檢測(cè)化學(xué)發(fā)光。
圖6此圖表示用p53和p16INK4處理后腫瘤大小隨時(shí)間變化的函數(shù)。將3×106HuH7細(xì)胞注射到裸鼠的左側(cè)腹股溝區(qū)。15天后，當(dāng)長(zhǎng)出可見腫瘤時(shí)，將腺病毒載體(6×109，150μl)注射到腫瘤內(nèi)(第一天)。4天后重復(fù)注射。根據(jù)方法中所述測(cè)定腫瘤的大小。
材料和方法重組腺病毒的構(gòu)建和制備p16INK4cDNA[Lukas等(1995)]與CMV聚腺苷酸化信號(hào)相連并被克隆至CMV立即早期啟動(dòng)子下游。完全的表達(dá)單位被插入腺病毒穿梭載體PdE1sp1A[Bett等(1994)]。用改良的Ca-PO4沉淀技術(shù)通過(guò)將此穿梭質(zhì)粒與pJM17共轉(zhuǎn)染入新近傳代的分會(huì)合培養(yǎng)的293細(xì)胞產(chǎn)生重組病毒[Lieber等(1995)]。病毒經(jīng)噬斑純化一次及限制酶切分析。一個(gè)噬斑產(chǎn)生Ad-p16-9。含有由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的p53基因的腺病毒由Wei-wei Zang(Houston)惠贈(zèng)，含有在RSV啟動(dòng)子控制下的β-半乳糖苷酶基因的腺病毒由Michel Perricaudet(Paris)提供。為了制備大的純化的病毒原種，以5m.o.i.感染293細(xì)胞并致細(xì)胞病變清晰可見后收集細(xì)胞(48小時(shí))。以含有0.2％NP40的PBS裂解細(xì)胞。將細(xì)胞碎片去除，病毒懸液進(jìn)行兩輪CsCl梯度離心[Kanegae等(1994)]。通過(guò)SephadexG25柱(PD25，Phmarcia)凝膠過(guò)濾除去CsCl，病毒液于含有159mMNaCl，3mMKCl，1mMMgCl2，10mMTis pH7.4及10％甘油的貯存緩沖液中貯存于-70℃。在293細(xì)胞上進(jìn)行噬斑分析確定滴度。細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染HuH7(人肝細(xì)胞癌)、BT549、MCF7(人乳腺癌)、IMR-90(正常人成纖維細(xì)胞)和293細(xì)胞(人初級(jí)胚腎)在含有10％FCS和2mM谷氨酰胺的Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中于5％CO2中培養(yǎng)。C33A(人宮頸癌)和LOVO細(xì)胞(結(jié)腸癌)在含有10％FCS的RPMI中培養(yǎng)。在感染前1天以8×105細(xì)胞/平板接種細(xì)胞，用存在于含有1mMMgCl2的PBS中腺病毒感染細(xì)胞60分鐘，m.o.i.分別是50(HuH7、BT549、C33A)、30(LOVO)、100(IMR-90)和300(MCF7)。導(dǎo)致100％細(xì)胞中表達(dá)而沒有可見毒性效應(yīng)的病毒的最佳濃度通過(guò)以不同劑量具有β-半乳糖苷酶表達(dá)的病毒感染細(xì)胞并且隨后用Xgal染色來(lái)確定。細(xì)胞周期分析為了脈沖標(biāo)記增殖的細(xì)胞，將溴脫氧尿苷以終濃度10mM加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后細(xì)胞在37℃培養(yǎng)30分鐘。用PBS洗滌細(xì)胞兩次，消化后以70％乙醇固定。通過(guò)在0.1MHCl/0.5％Triton×100中孵育30分鐘使DNA被變性、RNA降解。經(jīng)0.1MNa2B4O7中和后，依次用抗BrdU的小鼠單克隆抗體(Becton Dickinson)、FITC-偶聯(lián)的山羊抗小鼠抗體與細(xì)胞作用。為了檢測(cè)DNA含量，以5μg/ml終濃度的碘化丙錠加入到經(jīng)PBS洗滌的細(xì)胞中，用EPICS-MCL流式光度儀(Coulter)進(jìn)行流式光度術(shù)分析。實(shí)施例1載體Ad-p16-9過(guò)量表達(dá)p16INK4基因正常的人成纖維細(xì)胞(IMR-90，ATCC CCL186)與Ad-p16-9(ECACC注冊(cè)號(hào)V97021335)培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)，隨后在37℃培養(yǎng)兩天，收集感染的及對(duì)照細(xì)胞，洗滌后以裂解緩沖液提取細(xì)胞。在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離總蛋白(50μg)并將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。印跡與依次與抗p16INK4抗體、二級(jí)抗體孵育。結(jié)果示于圖1。掃描印跡以確定蛋白的相對(duì)量。實(shí)驗(yàn)表明，p16INK4蛋白的量增加了43倍。較低的帶相應(yīng)于由截短了的基因編碼的蛋白，而上面的帶表明內(nèi)源性的p16INK4基因也被基因轉(zhuǎn)移方法活化了。從較低的帶的強(qiáng)度計(jì)算得到的過(guò)量表達(dá)程度是38倍。實(shí)施例2 p16INK4過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞程序性死亡制備了含有截短的但有功能的、在CMV啟動(dòng)子控制下的p16INK4基因的腺病毒載體，并將其用于感染多種不同組織來(lái)源的各種癌細(xì)胞系。根據(jù)材料和方法所述，通過(guò)流式光度術(shù)分析確定p16INK4過(guò)量表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響。用含有LacZ基因(Ad-bg)的對(duì)照載體感染的所有細(xì)胞系沒有明顯的作用。在第二天，Rb陽(yáng)性的癌細(xì)胞系HuH7和LOVO(ATCCCCL229)到S1期的進(jìn)程完全被阻斷(圖3)。有趣地是，感染后2天，在HuH7細(xì)胞的DNA分布圖上可觀察到G1峰左側(cè)的臂。兩天后，在同一實(shí)驗(yàn)中，這個(gè)臂更加明顯但在其它實(shí)驗(yàn)中不存在(未顯示)。據(jù)猜測(cè)它反映了小部分的細(xì)胞程序性死亡。為了證明這一假設(shè)，進(jìn)行檢測(cè)少數(shù)細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞的TUNEL(未顯示)。10天中可觀察到完全的生長(zhǎng)停滯，僅僅偶然可以檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞中的的細(xì)胞程序性死亡而在正常二倍體成纖維細(xì)胞(IMR-90)中根本檢測(cè)不到(未顯示)。實(shí)施例3 p16INK4和p53對(duì)細(xì)胞程序性死亡的協(xié)同效應(yīng)因?yàn)閜16INK4過(guò)量表達(dá)不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯而且使Rb-陽(yáng)性的癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞程序性死亡刺激較敏感，有興趣探討p53基因的過(guò)量表達(dá)是否可有效誘導(dǎo)表達(dá)p16INK4細(xì)胞的細(xì)胞程序性死亡。用可比較的有限的感染復(fù)數(shù)的Ad-p16INK4和Ad-p53單獨(dú)或同時(shí)感染HuH7和LOVO細(xì)胞以及正常IMR-90細(xì)胞，三天后，以流式光度術(shù)分析DNA分布。結(jié)果示于圖3。在三種細(xì)胞類型中顯示，Ad-p53本身對(duì)細(xì)胞周期沒有明顯的影響，而在這些條件下，Ad-p16INK4可誘導(dǎo)所有細(xì)胞系的G1停滯。兩種病毒的聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致兩種腫瘤細(xì)胞系的DNA分布完全轉(zhuǎn)移至亞-G1位置，表明幾乎所有的細(xì)胞在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)入了細(xì)胞程序性死亡。在IMR-90細(xì)胞中未檢測(cè)到效應(yīng)(圖3)。在病毒感染后3天，通過(guò)TUNEL分析HuH7細(xì)胞中的細(xì)胞程序性死亡表明p53能夠誘導(dǎo)某些細(xì)胞的細(xì)胞程序性死亡，p16INK4過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致偶爾出現(xiàn)細(xì)胞程序性死亡，兩種基因的聯(lián)合誘導(dǎo)大多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞程序性死亡。在LOVO細(xì)胞中得到相似的結(jié)果，Ad-p53本身能夠誘導(dǎo)Rb缺失的BT549癌細(xì)胞有效的細(xì)胞程序性死亡(未顯示)。實(shí)施例4 p16INK4過(guò)量表達(dá)對(duì)pRb的時(shí)間效應(yīng)另人驚奇地是，p16INK4過(guò)量表達(dá)三天不僅導(dǎo)致磷酸化形式的pRb的消失而且使Rb蛋白總量顯著降低，這一點(diǎn)在肝細(xì)胞癌系HuH7中最為明顯。時(shí)間過(guò)程實(shí)驗(yàn)表明在5天中pRb水平漸漸降低(圖4)。免疫印跡用PBS洗滌細(xì)胞兩次，將其從培養(yǎng)板上刮下并用細(xì)胞裂解緩沖液裂解。以Braford法確定蛋白濃度。在8％(對(duì)于pRB)或10％(對(duì)于p53)或15％(p16INK4和p21)聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳分離50μg蛋白。通過(guò)半干印跡將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，并用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)ECL進(jìn)行免疫檢測(cè)。針對(duì)p16INK4、Rb(G3245，Pharmingen)、p53(Ab-2，Oncogene Sciences)和p21(DCS60)的小鼠單克隆抗體被用作一級(jí)抗體，生物素化的山羊抗小鼠抗體和鏈親和素-POD偶聯(lián)物(Amersham)被用為次級(jí)檢測(cè)。pRb的負(fù)調(diào)節(jié)和細(xì)胞程序性死亡結(jié)果表明腫瘤抑制基因產(chǎn)物p16INK4的過(guò)量表達(dá)不僅在G1阻斷細(xì)胞周期也可以誘導(dǎo)后來(lái)的pRb合成的退化。這依次使腫瘤細(xì)胞更容易對(duì)細(xì)胞程序性死亡的刺激的作用。這種刺激也許在培養(yǎng)物的延長(zhǎng)的生長(zhǎng)停滯條件下會(huì)出現(xiàn)。因?yàn)閜16INK4也誘導(dǎo)正常細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯但不導(dǎo)致隨后的細(xì)胞程序性死亡[Lukas等(1995)和本實(shí)施例]，這些數(shù)據(jù)暗示對(duì)持續(xù)的細(xì)胞周期停滯的細(xì)胞程序性死亡刺激是腫瘤細(xì)胞特有的。因此，細(xì)胞程序性死亡調(diào)控機(jī)制也許識(shí)別在腫瘤細(xì)胞發(fā)展過(guò)程中發(fā)生的其它變化。已知功能性p53的存在并不是誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡絕對(duì)必須的[White等(1996)，Bates等(1996)]，此觀念受到使用含有突變p53的HuH7細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)的一定程度上的支持。然而，在Ad-p16INK4轉(zhuǎn)導(dǎo)的p53-陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中更一致地觀察到低程度的細(xì)胞程序性死亡(LOVO，數(shù)據(jù)未顯示)。不過(guò)，在Rb途徑被p16INK4過(guò)量表達(dá)阻斷的野生型p53過(guò)量表達(dá)可大大加速細(xì)胞程序性死亡。盡管目前有關(guān)細(xì)胞程序性死亡調(diào)控的途徑的知識(shí)不足以完全解釋觀察到的協(xié)同作用，漸漸降低的pRb水平暗示了一種可能的場(chǎng)景(圖2)。由p16INK4導(dǎo)致的持續(xù)的G1阻斷產(chǎn)生的出乎意料的效應(yīng)也許是由對(duì)非磷酸化pRb積累和/或其水解產(chǎn)物反應(yīng)的RB-1基因表達(dá)[Gill等(1994)]自我抑制產(chǎn)生的[An和Dou(1996)]。當(dāng)pRb水平降低的足夠多時(shí)，Rb對(duì)細(xì)胞程序性死亡的保護(hù)作用不能再被保持。依次，其原因也許是在某些情況下可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡的[Qin等(1994)，Shan和Lee(1994)，Wu和Levins(1994)]轉(zhuǎn)錄因子E2F的釋放引起的[Weinberg(1995)，Nevins(1992)]。P53促進(jìn)功能的解釋為存在一種機(jī)制，其中被阻斷的Rb途徑(及隨后的pRb水平降低)與p53協(xié)同作用，如通過(guò)對(duì)下游效應(yīng)物協(xié)同作用。Bax基因產(chǎn)物[Oltvai等(1993)]是一個(gè)很好的候選效應(yīng)物因?yàn)橐延凶C據(jù)表明它被p53誘導(dǎo)[Oltvai等(1993)]并且E2F也參與其上行調(diào)節(jié)。某些腫瘤，尤其是缺乏p53和pRb的腫瘤很明顯地對(duì)只有p53的過(guò)量表達(dá)引起的細(xì)胞程序性死亡敏感[Yang等(1995)，Roth等(1996)]。在此實(shí)施例中的兩個(gè)Rb陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞(HuH7，LOVO)不很強(qiáng)地被p53過(guò)量表達(dá)停滯在G1期也不通過(guò)細(xì)胞程序性死亡作出反應(yīng)?？梢缘贸鼋Y(jié)論，至少在Rb陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞系中，通過(guò)Rb途徑阻斷和/或隨后的Rb水平負(fù)調(diào)控導(dǎo)致的G1期停滯是因?yàn)閜53過(guò)量表達(dá)加速的細(xì)胞程序性死亡的前提。因此，可以假設(shè)，低的pRb/p53比率是細(xì)胞程序性死亡必需的，單獨(dú)的G1期停滯不夠。接近正常水平的p16INK4表達(dá)足以導(dǎo)致G1期停滯但不支持依賴于p53的細(xì)胞程序性死亡[Lukas等(1995)及未發(fā)表結(jié)果]。重要的是，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)這種對(duì)細(xì)胞程序性死亡的協(xié)同作用未在正常IMR-90細(xì)胞中觀察到(圖4)。因此，在野生型p53過(guò)量表達(dá)時(shí)，依賴于pRb的下行調(diào)控只誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞程序性死亡，而正常細(xì)胞停滯于G1期。在p53存在時(shí)腫瘤細(xì)胞特異的pRb下行調(diào)控的分子基礎(chǔ)仍不清楚，但很可能是除了Rb途徑的無(wú)效之外的腫瘤發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)的原癌基因或腫瘤抑制基因的突變。在正常細(xì)胞中，G1期停滯后的pRb的下行調(diào)控也許是普遍的可作為分化刺激事件。實(shí)施例5 p16INK4和p53的共表達(dá)降低pRb/p53的比率并導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡感染前一天接種HuH7細(xì)胞(8×105細(xì)胞/10cm碟)。用Ad-p16INK4(15m.o.i.)和Ad-p53(15m.o.i.)在含有1mMMgCl2存在的磷酸緩沖鹽中進(jìn)行的1小時(shí)的腺病毒感染。病毒懸浮液被新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液取代，細(xì)胞在37℃培養(yǎng)細(xì)胞3天。之后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次并用裂解緩沖液提取。測(cè)定細(xì)胞濃度，在10％的聚丙烯酰胺-SDS凝膠上分離蛋白，每個(gè)泳道內(nèi)有50μg蛋白。然后通過(guò)半干轉(zhuǎn)印將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上并進(jìn)行免疫檢測(cè)。一級(jí)抗體是抗pRb的G3245(Pharmingen)和抗p53的Ab-2(Oncogene Sciences)。用生物素標(biāo)記的抗小鼠抗體和鏈親和素-POD偶聯(lián)物(ECL系統(tǒng)，Amersham)檢測(cè)特異的免疫復(fù)合物。如圖5所示，通過(guò)對(duì)X-光片曝光檢測(cè)化學(xué)發(fā)光。通過(guò)密度計(jì)掃描不同曝光以保證圖象的線形記錄帶的強(qiáng)度。掃描的圖5中pRb和p53特異帶的相對(duì)強(qiáng)度列于表1。表1
因此，這個(gè)處理將pRb/p53的比率降低了20多倍，是pRb降低5倍及伴隨的p53升高4倍的結(jié)果。按實(shí)施例2所述分析細(xì)胞周期分布，從流式光度術(shù)掃描圖的亞-G1峰上發(fā)現(xiàn)幾乎50％的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)入了細(xì)胞程序性死亡(未顯示)。用高量的Ad-p16INK4和Ad-p53(每種病毒為25m.o.i.)重復(fù)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致更低的pRb/p53比率并且?guī)缀?00％被誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。實(shí)施例6 p16INK4和p53抑制腫瘤發(fā)展調(diào)查了是否體外進(jìn)行用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)癌細(xì)胞將阻礙裸鼠中腫瘤生長(zhǎng)。為了達(dá)到這個(gè)目的，用Ad-p16INK4或Ad-p53，對(duì)照Adtk(m.o.i.為100)，或Ad-p16INK4或Ad-p53的混合物(每一種為50m.o.i.)感染HuH7細(xì)胞并通過(guò)皮下注射到裸鼠體內(nèi)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，使用半量的Ad-p16INK4或Ad-p53，添加Ad-βgal使總m.o.i.為100。六周后測(cè)量腫瘤大小。結(jié)果總結(jié)于表2。所有的對(duì)照動(dòng)物形成腫瘤，注射Ad-p16INK4感染的細(xì)胞或雙感染的兩組動(dòng)物10只中只有2只形成腫瘤。這些腫瘤大小不到對(duì)照動(dòng)物腫瘤的10％，與滴度無(wú)關(guān)。通過(guò)p53轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞得到的結(jié)果很強(qiáng)地依賴于滴度。高滴度有某些抑制生長(zhǎng)的作用，但不如由p16INK4得到的效應(yīng)明顯。裸鼠實(shí)驗(yàn)將HuH7細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中并長(zhǎng)至80％會(huì)合。以m.o.i.為100使用下文表2所列的腺病毒。在PBS中感染1.5小時(shí)后，使用培養(yǎng)基。另外7小時(shí)后，收獲細(xì)胞并將其以3×106細(xì)胞/動(dòng)物通過(guò)皮下注射裸鼠左腹股溝(實(shí)驗(yàn)#1中，雌性CD1-nu/nu，harles River(Sulzfeld，德國(guó))，實(shí)驗(yàn)#2中，雌性NMRI-I-nu/nu，在MDC雜交，柏林)。六周后，根據(jù)公式V＝a×b2/2[Carlsson等(1983)]測(cè)定腫瘤大小。
表2通過(guò)用p16INK4和p53基因轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制腫瘤生長(zhǎng)
用包含標(biāo)明的基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(HuH7)，隨后皮下注射到裸鼠內(nèi)。六周后測(cè)量腫瘤的大小。數(shù)字是經(jīng)處理每一群5只動(dòng)物中發(fā)展腫瘤的動(dòng)物數(shù)目。給出了腫瘤的平均大小及標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)#1中，Adtk，Ad-p16INK4或Ad-p53以每種100m.o.i.單獨(dú)使用或每種50m.o.i.聯(lián)合使用。實(shí)驗(yàn)#2中，如果單獨(dú)使用，Ad-p16INK4或Ad-p53的劑量為50m.o.i.，以Ad-βgal調(diào)節(jié)總病毒m.o.i.為100。實(shí)施例7p16INK4和p53抑制腫瘤生長(zhǎng)因?yàn)橄Ｍ貌《据d體預(yù)轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞具有增強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，在具有預(yù)先建立的腫瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，病毒載體被直接注射到從HuH7肝細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)展而來(lái)的腫瘤中。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列于圖6。數(shù)據(jù)顯示了聯(lián)合方法的威力。Ad-p16INK4具有某些效應(yīng)，Ad-p53具有微弱的生長(zhǎng)抑制作用，兩個(gè)基因的結(jié)合導(dǎo)致至少12天的腫瘤生長(zhǎng)幾乎完全的阻斷。在那時(shí)，一個(gè)腫瘤完全被消除。裸鼠實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，將3×105HuH7細(xì)胞經(jīng)皮下注射到裸鼠的左腹股溝。當(dāng)長(zhǎng)出可見的腫瘤時(shí)，切開皮膚，使腫瘤暴露并以150μl/動(dòng)物的量用腺病毒載體體積注射。4天后重復(fù)此過(guò)程。檢測(cè)18天腫瘤體積的發(fā)展情況。p16INK4和p53在腫瘤生長(zhǎng)抑制中協(xié)作本實(shí)施例已表明用腺病毒載體聯(lián)合轉(zhuǎn)移Ad-p16INK4和Ad-p53基因有效誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。這是通過(guò)p53自身在表達(dá)正常或突變p53的Rb陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞中不能實(shí)現(xiàn)的。將這兩個(gè)基因轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞癌細(xì)胞(HuH7)和結(jié)腸癌細(xì)胞(LOVO)完全裸鼠中發(fā)展出皮下腫瘤。在這些情況下，即使p16INK4本身也不足以導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制(表1)。將腺病毒載體體內(nèi)注射腫瘤導(dǎo)致幾種不同的結(jié)果。觀察到由p16INK4引起的某些生長(zhǎng)阻滯，p53幾乎沒有作用，兩種基因聯(lián)合使用可導(dǎo)致很強(qiáng)的腫瘤生長(zhǎng)抑制(圖6)。如Adβgal檢測(cè)的對(duì)照感染，即使是多次注射腫瘤也不能導(dǎo)致100％的感染。18天后腫瘤大小的緩慢增加也許反映了未感染細(xì)胞的快速生長(zhǎng)。
建立了癌基因治療的有效載體和生物原理，但需要發(fā)展好的方法以在堅(jiān)韌的實(shí)體腫瘤組織中分散載體。關(guān)于這一點(diǎn)，用表面電極進(jìn)行電脈沖可能會(huì)有所幫助(Rols，M.P.等，1998)。傳統(tǒng)的化療和自殺基因治療也需要有效的分布，其中內(nèi)部瘤組織的接觸是腫瘤中的主要問(wèn)題，否則對(duì)治療無(wú)反應(yīng)。然而，所述的基因治療策略的具有對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性的優(yōu)勢(shì)，并且可適用于大多數(shù)人類惡性疾病。此處陳述的數(shù)據(jù)指出了對(duì)于特定腫瘤的細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)途徑諸如p53和Rb途徑的了解在選擇合適治療方案中的重要性。診斷和將來(lái)的治療都會(huì)從對(duì)目前對(duì)于細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞程序性死亡[White(1996)]的基本機(jī)制了解中受益[Weinberg等(1995)，Strauss等(1995)，Sherr和Roberts(1995)]。對(duì)于兩種機(jī)制的聯(lián)合了解有助于進(jìn)一步改進(jìn)針對(duì)選擇性清除腫瘤細(xì)胞的策略。
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權(quán)利要求
1.一種包含遺傳材料的、用于制備治療惡性疾病的組合物的載體的用途，所述載體一旦施用給患惡性疾病的對(duì)象，就通過(guò)降低惡性細(xì)胞中Rb蛋白水平與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平的比率，通過(guò)降低pRb水平并提高細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平，在通過(guò)此處誘導(dǎo)pRb蛋白磷酸化的抑制首次實(shí)現(xiàn)所述惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯之后，誘導(dǎo)惡性細(xì)胞中細(xì)胞程序性死亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中載體是非病毒載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中載體是病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中載體是選自由腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、皰疹病毒載體和雜合載體組成的群體的病毒載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中載體的ECACC注冊(cè)號(hào)是V97021335。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中遺傳材料是選自由p16INK4、p15INK4、p18INK4、p19INK4、p21KIP、p27KIP、p57KIP、p53、bax、bak和bcl-X組成群體的一個(gè)或多個(gè)基因。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的用途，其中惡性細(xì)胞是細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白如p53陽(yáng)性的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中遺傳材料是p16INK4基因的修飾形式。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中遺傳材料是只編碼p16INK4蛋白cdk結(jié)合區(qū)的p16INK4基因的修飾形式。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的用途，其中細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白缺失的惡性細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)移選自由p53、bax、bak和bcl-X組成的群體的一個(gè)或多個(gè)基因形成細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白陽(yáng)性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中遺傳材料是p16INK4與編碼細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的基因的組合。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中遺傳材料是只編碼p16INK4蛋白cdk-結(jié)合區(qū)的p16INK4基因的修飾形式與編碼細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的基因的組合。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的用途，其中實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)移遺傳材料的高水平過(guò)量表達(dá)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中實(shí)現(xiàn)了所選基因的2倍以上的過(guò)量表達(dá)水平。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中實(shí)現(xiàn)了所選基因的4倍以上的過(guò)量表達(dá)水平。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中實(shí)現(xiàn)了所選基因的6倍以上的過(guò)量表達(dá)水平。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中實(shí)現(xiàn)了所選基因的8倍以上的過(guò)量表達(dá)水平。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中實(shí)現(xiàn)了所選基因的10倍以上的過(guò)量表達(dá)水平。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的用途，其中比率(pRb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白)降低至0.4以下。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的用途，其中比率(pRb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白)是通過(guò)降低pRb水平至少5倍并增加細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平至少兩倍而降低的。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中比率(pRb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白)是通過(guò)降低pRb水平至少10倍并增加細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平至少兩倍而降低的。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中比率(pRb/細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白)是通過(guò)降低pRb水平至少20倍并增加細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平至少兩倍而降低的。
23.根據(jù)前述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)所述的用途，其中惡性疾病是實(shí)體腫瘤。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的用途，其中惡性疾病是選自由結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、頭和頸癌、腎癌和黑色素瘤組成的群體。
25.一種載體，包含編碼p16INK4蛋白或其功能相當(dāng)物的核酸序列，并且進(jìn)一步選擇性地包含編碼細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白的核酸序列，以及載體本身的遺傳元素，所述本身的遺傳元素使所述基因序列顯著過(guò)量表達(dá)。
26.載體Ad-p16-9(ECACC注冊(cè)號(hào)為V97021335)。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含遺傳材料的、用于制備治療惡性疾病的組合物的載體的用途,所述載體一旦施用給患惡性疾病的對(duì)象,就通過(guò)降低惡性細(xì)胞中Rb蛋白水平與細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平的比率,通過(guò)降低pRb水平并提高細(xì)胞程序性死亡誘導(dǎo)蛋白水平,在通過(guò)此處誘導(dǎo)pRb蛋白磷酸化的抑制首次實(shí)現(xiàn)所述惡性細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯之后,誘導(dǎo)惡性細(xì)胞中細(xì)胞程序性死亡。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于有效轉(zhuǎn)移的特異載體。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1248290SQ98802680
公開日2000年3月22日 申請(qǐng)日期1998年2月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月20日
發(fā)明者M·施特勞斯, V·桑迪格, J·巴泰克, J·盧卡斯 申請(qǐng)人:赫帕維科基因治療股份公司