專利名稱：一個(gè)編碼冰緣植物冷誘導(dǎo)蛋白的基因及其在抗寒轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)編碼冰緣植物冷誘導(dǎo)蛋白的基因，特別是涉及一個(gè)編碼高山離子 芥冷誘導(dǎo)的DEAD-b0X RNA解旋酶的基因，及其在抗寒轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
DEAD-box RNA解旋酶存在于從原核的細(xì)菌到真核的動植物的絕大多數(shù)生物中。這 些蛋白能夠利用ATP水解釋放的能量改變RNA的次級結(jié)構(gòu)或者移走綁定的蛋白，從而幫助 RNA形成正確的折疊形式。DEAD-box RNA解旋酶參與很多的RNA代謝過程，包括轉(zhuǎn)錄，前體 RNA的剪切，核糖體生物發(fā)生，RNA出核運(yùn)輸，翻譯起始，細(xì)胞器基因表達(dá)，RNA降解等多種生 理過程(Rocak S andLinder P，2004，Nature Rev. Mol. Cell Biol.)。在模式植物擬南芥 中，DEAD-box RNA解旋酶基因組成一個(gè)含有58個(gè)成員的家族，即AtRHl_AtRH58 (Aubourg S,Kreis M, et al，1999，Nucleic Acides Research)。近年來，人們發(fā)現(xiàn) DEAD-box RNA 解 旋酶參與高等植物脅迫應(yīng)答，包括低溫脅迫，熱脅迫，鹽脅迫，滲透脅迫以及氧化脅迫。例如 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)擬南芥DEAD-boxRNA解旋酶FL2-5A4，PMH1，PMH2,以及大麥DEAD-box RNA解旋酶 HVD1在低溫脅迫下表達(dá)量增高，在煙草中過表達(dá)一個(gè)DEAD-box RNA解旋酶PDH45增強(qiáng)了 煙草的耐鹽性(Sanan-Mirshra N, Pham X H, Sopory S K, et al，2005，Proc. Natl Acad. Sci.) 0高山離子芥(Chorispora bungeana)是十字花科離子芥屬多年生植物，分布在高 海拔亞高山草甸和礫石質(zhì)山坡上。其生存環(huán)境的特點(diǎn)是氣候寒冷、土層反復(fù)凍融，空氣稀 薄、輻射強(qiáng)、勁風(fēng)。高山離子芥在外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和生態(tài)策略上沒有顯著的抗性特征，為了耐 受長期低溫、反復(fù)凍融，強(qiáng)紫外、大風(fēng)等不利的環(huán)境條件，勢必通過表達(dá)抗性基因來維持自 身的生理代謝和生長發(fā)育，以避免或減輕嚴(yán)酷的環(huán)境脅迫的危害。因此高山離子芥是理想 的研究植物抗性的的材料。為探索高山離子芥適應(yīng)低溫脅迫的內(nèi)在機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法， 分析高山離子芥在低溫脅迫(0°c )和常溫(20°C )下的蛋白表達(dá)差異。用TCA-丙酮法 分別提取無菌苗的總蛋白，進(jìn)行雙向電泳，對凝膠進(jìn)行膠體考染并脫色，利用PDQUEST8. 0 軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)蛋白在低溫脅迫下(0°C)積累量是正常條件 (20°C )的7倍，質(zhì)譜分析表明該蛋白屬于DEAD-box RNA解旋酶家族，我們將該蛋白命名為 CbDRH(Chorisporabungeana DRH, CbDRH)。我們利用 RACE 技術(shù)，獲得編碼 CbDRH 基因全 cds 區(qū)。序列比對分析表明CbDRH與擬南芥AtRH30同源性最高，達(dá)90%。目前，在擬南芥中還 未見到關(guān)于AtRH30功能的報(bào)道?？寺≡摶虿?yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物上對于培育抵抗低溫的 優(yōu)良作物具有一定的價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高山離子芥DRH冷誘導(dǎo)蛋白基因及其編碼產(chǎn)物。本發(fā)明的另一目的提供高山離子芥DRH冷誘導(dǎo)蛋白基因在抗凍轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。(a) 一種高山離子芥 DRH(Chorispora bungeana DRH,CbDRH)基因編碼序列，該基 因包含1452個(gè)核苷酸，編碼484個(gè)氨基酸，其分子量為52. 66KD。其核苷酸序列為序列表中 序列(a)所述，以下為核苷酸序列。ATGAGCTCCTATGATCGTAGATTTGCTGATCCGAATTCGTATCGCCAACGCTCTGGCGCCCCAGTTGGTCCATCTCAGCCAATGGATCCTTCTGCTGCACCGTACAATCCACGATACGGTGGTGGTGGTGGATATGGACCGTCTCCTGTAATGGCCGGTGATGGCTCCGGGTATAGTCGGTACCCAGCTTTCCAGCCACCTACTAGTGGTTTCTCCGTTGGTCGCGGCGGAGGAGGAGGAAGAGGCACATATGGTCAATACGGC
GGCGGAGGAGGCGGCGGCAGTGGTGGGAATTGGGGAGGACGTGGTGGTGGATCGAATAAAAGAGAGCTAGATAATGTTTCGCTTCCGAAGCAGAATTTTGGGAATCTTGTCCATTTCGAGAAGAATTTCTACGTGGAAAGCCCCGATGTGCAGGCGATGACAGAACAGGATGTTGCGATGTATAGAACCGGGAGGGATATATCCGTTGAAGGTCGTGATGTTCCTAAGCCGATTAGGATGTTCCAAGATGCTAACTTCCCAGATAATATTCTCGAAGCGATTGCTAAGTTGGGATTCACTGAGCCAACACCGATACAATCTCAGGGATGGCCAATGGCTTTGAAGGGTAGGGATCTGATTGGTATTGCTGAGACTGGCTCTGGTAAGACATTAGCTTACTTGTTACCAGCGTTGGTCCACGTAAGCGCACAACCTCGATTGAGTCAAGATGATGGCCCCATTGTGTTAATATTAGCGCCCACTAGAGAATTAGCTGTTCAGATTCAAGAGGAATCAAGGAAATTCGGTCTGCGATCTGGTGTTAGAAGCACTTGTATCTATGGTGGTGCTCCTAAAGGACCTCAGATTCGCGATCTTAGAAGAGGTGTTGAGATTGTAATTGCTACACCTGGTCGTTTGATCGATATGTTGGAGTGTCAACATACTAATTTGAGGAGAGTAACTTACCTCGTGTTAGATGAAGCTGACCGAATGTTAGACATGGGATTTGAACCCCAAATTAGAAAGATTGTATCTCAGATCCGACCTGATAGACAGACGCTGCTTTGGAGT6CAACATGGCCACGAGAGGTTGAATCTCTTGCCAGGCAGTTTCTACGAGATCCATATAAGGCCATTATTGGATCAGCAGATCTAAAAGCTAACCAGTCTATTAATCAAGTAATCGAGATTGTACCAACGCCAGAGAAATACGCCAGGCTTCTTGCACTGCTTAAACAGTTAATGGATGGGAGTAAAATCCTAATATTCGTGGAGACAAAGAGAGGGTGTGATCAAGTGACTAGACAATTGAGAATGGATGGATGGCCAGCTCTAGCCATACACGGTGACAAGAACCAATCGGAAAGAGATCGAGTCTTGTCAGAATTTAAGAGCGGAAGAAGCCCGATAATGACTGCCACTGATGTAGCAGCAAGGGGACTTGGTAGGACAACTGTAACACAATAG(b) 一種高山離子芥DEAD-box RNA解旋酶(CbDRH)蛋白的氨基酸序列，該氨基酸 序列包含DEAD-box蛋白家族特征性的八個(gè)保守基序，因此屬于DEAD-box蛋白家族成員。 CbDRH氨基酸序列如序列表中序列2所述，以下為氨基酸序列。MSSYDRRFADPNSYRQRSGAPVGPSQPMDPSAAPYNPRYGGGGGYGPSPVMAGDGSGYSRYPAFQPPTSGFSVGRGGGGGRGTYGQYGGGGGGGSGGNWGGRGGGSNKRELDNVSLPKQNFGNLVHFEKNFYVESPDVQAMTEQDVAMYRTGRDISVEGRDVPKPIRMFQDANFPDNILEAIAKLGFTEPTPIQSQGWPMALKGRDLIGIAETGSGKTLAYLLPALVHVSAQPRLSQDDGPIVLILAPTRELAVQIQEESRKFGLRSGVRSTCIYGGAPKGPQIRDLRRGVEIVIATPGRLIDMLECQHTNLRRVTYLVLDEADRMLDMGFEPQIRKIVSQIRPDRQTLLWSATWPREVESLARQFLRDPYKAIIGSADLKANQSINQVIEIVPTPEKYARLLALLKQLMDGSKILIFVETKRGCDQVTRQLRMDGWPALAIHGDKNQSERDRVLSEFKSGRSPIMTATDVAARGLGRTTVTQ.本發(fā)明中的cbDRH基因和擬南芥AtRH30的DNA序列具有90%同源性，推測編碼相 似功能蛋白質(zhì)，蛋白序列的同源性也為90%。
本發(fā)明序列(a)的DNA序列有1452個(gè)堿基組成，編碼序列表中由483個(gè)氨基酸殘 基組成的蛋白質(zhì)序列(b)。雙向電泳檢測到CbDRH蛋白在低溫脅迫下(0°C)積累量是正常 條件(20°C )的7倍。含有本發(fā)明基因CbDRH的表達(dá)載體及細(xì)胞系也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。利用 PCR技術(shù)得到CbDRH基因全cds區(qū)，并在兩端分別引入Smal和Xbal酶切位點(diǎn)，連接到克隆載 體PMD18-T上，用Smal和Xbal在37°C酶切過夜，回收目的基因片段。將帶有35s啟動子的 PBI121質(zhì)粒用同樣的方法酶切過夜，并回收酶切產(chǎn)物。將回收的目的基因與回收的PBI121 載體用T4 DNA連接酶于20°C連接過夜，次日將連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5_a，菌落PCR篩選 陽性克隆并送去測序，經(jīng)測序鑒定正確的克隆為含有真核表達(dá)載體PBI121-35s-CbDRH的 克隆。提取質(zhì)粒PBI121-35s-CbDRH，通過轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404即得到含有該表達(dá)載體的農(nóng) 桿菌菌株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草，經(jīng)過篩選獲得組成型表達(dá)CbDRH 基因的轉(zhuǎn)基因煙草。檢測轉(zhuǎn)基因植株的抗低溫能力，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的抗低溫能力遠(yuǎn) 大于野生型。在冷脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量高于對照，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草比對照積 累更多的脯氨酸；在短時(shí)間凍脅迫(_4°C處理12小時(shí))下，轉(zhuǎn)基因煙草的質(zhì)膜滲漏率小于 對照。


圖1示低溫處理前后轉(zhuǎn)CbDRH基因煙草TL3和野生型對照生長狀態(tài)。a為25°C生 長狀態(tài)，b為_4°C，處理12hours后生長狀態(tài)。WT 野生型對照；TL3 轉(zhuǎn)基因植株。圖1顯 示轉(zhuǎn)入CbDRH基因的煙草在低溫下生長狀態(tài)明顯好于野生型對照。-4°C處理12hours，野生 型對照煙草已經(jīng)萎蔫，而轉(zhuǎn)基因植株生長狀態(tài)良好。圖2示低溫處理前后轉(zhuǎn)CbDRH基因植株TL3和野生型對照的質(zhì)膜離子滲漏率變 化。WT 野生型對照；TL3 轉(zhuǎn)基因植株。25°C下轉(zhuǎn)基因TL3植株的質(zhì)膜離子滲漏率與野生型 無明顯變化；4°C處理3天轉(zhuǎn)基因植株TL3的質(zhì)膜離子滲漏率與野生型亦無明顯變化；_4°C 處理12hoUrs后，野生型對照植株的質(zhì)膜離子滲漏率是轉(zhuǎn)基因植株TL3的3倍。顯示-4°C 低溫下野生型對照植株受到的傷害遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)基因植株。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，所用的實(shí)驗(yàn)材料為高山離子芥(Chorisporabungeana) 禾口煙草(Nicotiana tabacum)。實(shí)施例1高山離子芥CbDRH基因克隆1.高山離子芥CbDRH基因3，端擴(kuò)增1.1.利用Trizol法分離0°C處理一周的高山離子芥葉片中總RNA，其具體方 法是將高山離子芥葉片0. 05g放入研缽，加液氮覆蓋材料，迅速用力研成粉末，加入 lml Trizol，研磨至溶化，轉(zhuǎn)移到滅菌的印管中。12000gX5min，4°C離心。取上清，轉(zhuǎn) 移到新的印管中，加五分之一體積的氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置lOmin，待其分層。 12000gX 15min，4°C。用槍從表面慢慢往下吸，取上層水相轉(zhuǎn)移至另一新的印管中，一般取300-400ul足夠(切勿碰到下層)，用槍從表面慢慢往下吸，最后應(yīng)距下層0. 4cm左右。在ep 管加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20min，12000gX10min，4°C。棄上清，加冰浴的75% 乙醇(用DEPC水配)lml，輕輕吹懸吹散。10000gX8min，4°C。棄乙醇，吸干，殘余的微量乙 醇空氣干燥(不能太干，否則不易溶解)。用20-30ulDEPC水溶解。少量用于電泳檢測，其 余-80°C保存。1. 2根據(jù)生物信息學(xué)提供的序列資料設(shè)計(jì)以下特異性引物Outer primer 5' -GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3，；Inner Primer 5' -CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3，1. 3根據(jù)TaKaRa的RACE試劑盒設(shè)計(jì)程序，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增步驟如下
(1)Outer PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為，模板，2ul ;1 X cDNA dilution bufferll,8ul ；Gene specific outer primer(lOuM),2ul ；3' RACE outer primer(lOuM),2ul ； 10XLA PCR Buffer II (Mg2+free) ,4ul ；MgCl2 (25mM), 3ul ；LA Taq (5U/ul)，0. 25ul ；ddH20，28. 75ul ；反 應(yīng)條件為，94°C，3min ；94°C，30s ；55°C，30s 72°C，lmin(30 循環(huán))；72°C，10min ；4°C保存。
(2)Inner PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為，Outer PCR 產(chǎn)物，lul ;dNTPmixture (2. 5mM each) ,8ul ； 10XLA PCR Buffer II (Mg2+free), 5ul ；MgCl2 (25mM), 5ul ；LA Taq (5U/ul), 0. 5ul ；Gene specific innerprimer(lOuM),2ul ；3' RACE inner primer(lOuM),2ul ;ddH20, 26. 5ul。反 應(yīng)條件為，94°C，3min ；94°C，30sec ；55°C，30s ；72°C，lmin(30 循環(huán))，72°C lOmin ；4°C保存。2.高山離子芥DRH基因5，端擴(kuò)增2. 1去磷酸化處理按下列組分配制去磷酸化反應(yīng)Total RNA(lug/ul) 2ul ； RNase inhibitor(40U/ul) :lul ；lOXAlkaline phosphatasebuffer(MgCl2 free) :5ul ; Alkaline phosphatase (calfintestine)(16U/ul),0. 6ul ；RNase free ddH20 :up to 50ul ； 50°C反應(yīng)1小時(shí)。向上述反應(yīng)液中加入20ul的3M CH3C00Na(PH5. 2)，130ul的RNasefree ddH20后，充分混勻。加入200ul的苯酚/氯仿/異戊醇(體積比為25 24 1)，充分混 勻后13000Xg室溫離心5min。將上層水相轉(zhuǎn)移到新的Microtube中。加入200ul的氯仿， 充分混勻后13000Xg室溫離心5min。將上層水相轉(zhuǎn)移到新的Microtube中。加入2ul的 NAcarrier后均勻混合。加入200ul的異丙醇，充分混勻后，冰上冷卻lOmin。13000Xg 4°C 離心20min，棄上清。加入500ul的70%冷乙醇(RNase free ddH20配制)漂洗，離心5min， 棄上清后干燥。加入7ul的RNase free ddH20溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。2. 2 “去帽子”反應(yīng)配制“去帽子”反應(yīng)液CIAP-treated RNA :7ul ； RNase inhibitor(40U/ul) lul ；10 X Tap reaction buffer :lul ；Tobaccoacid pyrophosphatase (0. 5U/ul) :lul。37°C反應(yīng) 1 小時(shí)此反應(yīng)液中 CIAP/TAP-treated RNA，取 5ul用于5’ RACE-Adaptor連接反應(yīng)，剩余的5ul保存于_80°C。2.3 5，RACE-Adaptor 的連接。配溶液。CIAP/TAP-treated RNA :5ul ； 5，RACE-Adaptor (15ul) :lul ；RNase free ddH20 :4ul ；65°C保溫 5min 后冰上放 2min，然后 加入下列試劑RNase inhibitor (40U/ul) :lul ；5XRNA Ligation buffer :8ul ；40% PEG 6000 :20ul ；T4 DNA ligase(40U/ul) :lul。16°C反應(yīng) 1 小時(shí)。向上述反應(yīng)液中加入 20ul 的 3M CH3C00Na (PH5. 2)，140ul 的 RNase free ddH20 后，充分混勻。加入 200ul 的苯酚 / 氯 仿/異戊醇(25 24 1)，充分混勻后13000Xg室溫離心5min。將上層水相轉(zhuǎn)移到新的 Microtube中。加入200ul的氯仿，充分混勻后13000Xg室溫離心5min。將上層水相轉(zhuǎn)移
7到新的Microtube中。加入2ul的NAcarrier后均勻混合。加入200ul的異丙醇，充分混勻 后，冰上冷卻lOmin。13000Xg 4°C離心20min，棄上清。加入500ul的70%冷乙醇(RNase free ddH20配制)漂洗，離心5min，棄上清后干燥。再加入6ul的RNase free ddH20溶解 沉淀，得到ligated RNA。2. 4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為ligated RNA，6ul ；Random primer (50uM),0. 5ul ； 5XM-MLV Buffer, 2ul ；dNTP mixture (lOmM each), 1 U 1 ；RNase inhibitor (40U/ul), 0. 25ul ；Reverse transcriptase M-MLV(RNaseH-) (200U/ul)，0. 25ul。反應(yīng)條件為30°C， lOmin ；42°C, 1 小時(shí)；70°C，15min。保存于 _20°C。2. 5PCR反應(yīng)。根據(jù)3，端測序結(jié)果，用Primer Premier軟件設(shè)計(jì)5，端特異引 物。(l)Outer PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系為5，特異性 out primer (10uM), 2ul ；5' RACE out primer (lOuM)，2ul ;cDNA 模板，lul;10XLA PCR Bufferll (Mg2+free), 5ul ；LA Taq(5U/ ul) ,0. 5ul ；MgCl2 (25mM), 5ul ；dNTP (2. 5mM) ,8ul ；ddH20，26. 5ul。反應(yīng)條件為 94 °C, 2min ； 94°C，30s ；72°C，2min (5 循環(huán))；94°C，30s ；70°C，2min (5 循環(huán))；94°C，30s ；66°C，30s ；70°C 2min(30 循環(huán))；68°C，lOmin ;4°C 保存。(2) Inner PCR 反應(yīng)。5’特異性 inner primer (lOuM), 2ul ；5' RACE Inner primer (lOuM), 2ul ；Outer PCR 反應(yīng)液，lul ;LA Taq (5U/ul), 0. 5ul ； dNTP (2. 5mM) ,8ul ； 10 X LA PCR Buffer II (Mg2+free)，5ul ;MgCl2 (25mM)，5ul ;ddH20， 26. 5ul。反應(yīng)條件為:94°C,30s ；65°C，30s ；68°C，2min(30 循環(huán))；68°C，5min ；4°C保存。3.基因拼接3，端基因測序結(jié)果與5，端基因測序結(jié)果通過DNA MAN軟件拼接，得到基因cDNA 序列全長。4.基因全長cDNA序列擴(kuò)增利用cDNA為模板，引物如下CbDRH-上 CCATGGAAATGAGCTCCTATGATCGTAGAT，CbDRH-下 CTCGAGTTGTGTTACAGTTGTCCTACCAAGT。PCR 反應(yīng)體系為CbDRH-上，lul ；CbDRH-下，lul ； 10 X Taq buffer, 2. 5ul ； cDNA 模板，lul ；dNTP，2ul ；Taq, lul ；MgCl2 (25mM), 2ul ；ddH20，14. 5ul。PCR 反應(yīng)條件為95°C， 3min ；95°C，40s ；60°C，40s ；72°C 2min (30 循環(huán))；4°C，⑴。擴(kuò)增得到的CbDRH基因自起始密碼子至終止密碼子總長1452個(gè)堿基，編碼483個(gè)
氨基酸。實(shí)施例2.轉(zhuǎn)基因煙草的獲得構(gòu)建真核表達(dá)載體PBI121-35S_CbDRH，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙 草。具體方法如下從平板上挑取含有目的基因的單菌落，接種到3ml YEP液體培養(yǎng)基 中(Rif 40u g/ml, Kan 100 u g/ml)于恒溫?fù)u床上 28 °C，180rpm 暗培過夜至 0D 600 為 0. 6-0. 8。搖培過夜的菌液按-2%的比例，轉(zhuǎn)入新配置的含有相應(yīng)抗生素的YEP培養(yǎng) 基中，在與上述相同的條件下培養(yǎng)6h左右，0D600為0. 5左右。5000rpm離心十分鐘收 集菌沉淀，用50mlYEP液體培養(yǎng)基重懸沉淀。取野生型煙草無菌苗的幼嫩葉片，去主脈， 將葉片剪成0. 5cm2的小塊，放入菌液中，浸泡lOmin(其間不斷搖動菌液使其侵染充分)。 取出葉片置于無菌濾紙上吸去附著的菌液。將侵染后的煙草葉片接種在MS+KT(2.0ug/ml)+IAA(1.0ug/ml)固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)三天。將黑暗中共培養(yǎng)2_4天的煙草葉片 轉(zhuǎn)移到 MS+KT(2. Oug/ml)+IAA(l. Oug/ml) +Kan (lOOug/ml) +Cef (200ug/ml)中，用封 口膜封 好培養(yǎng)皿，在光照為30001uX、28°C、16h/8h光暗條件下選擇培養(yǎng)。約2_3周后，待不定芽長 到1cm左右時(shí)，切下不定芽并轉(zhuǎn)移到MS+Kan(200ug/ml)+Cef (200ug/ml)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，
獲得完整植株。提取轉(zhuǎn)化煙草的總DNA，PCR檢測CbDRH基因是否轉(zhuǎn)入，對擴(kuò)增出合適條帶的植株 進(jìn)一步提取總RNA，獲得cDNA，以cDNA為模板進(jìn)一步進(jìn)行PCR檢測，鑒定轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基因 植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T2，T3，T6，T8，T13為轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因煙草的抗寒性檢測選取轉(zhuǎn)基因植株TL3，作為抗寒性檢測的對象(野生型作為對照)，將其置于_4°C 處理12h，觀察植株生長狀態(tài)，并測定質(zhì)膜離子滲漏率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型在處理后明顯萎 蔫，而轉(zhuǎn)基因植株尚保持較好的生活力(圖1)，轉(zhuǎn)基因植株的質(zhì)膜滲漏明顯小于野生型(圖 2)。表明轉(zhuǎn)基因煙草的抗低溫能力高于野生型。
權(quán)利要求
一種高山離子芥冷誘導(dǎo)基因CbDRH，其核苷酸序列如序列表中序列1所示1)序列表中序列1的DNA序列；ATGAGCTCCTATGATCGTAGATTTGCTGATCCGAATTCGTATCGCCAACGCTCTGGCGCCCCAGTTGGTCCATCTCAGCCAATGGATCCTTCTGCTGCACCGTACAATCCACGATACGGTGGTGGTGGTGGATATGGACCGTCTCCTGTAATGGCCGGTGATGGCTCCGGGTATAGTCGGTACCCAGCTTTCCAGCCACCTACTAGTGGTTTCTCCGTTGGTCGCGGCGGAGGAGGAGGAAGAGGCACATATGGTCAATACGGCGGCGGAGGAGGCGGCGGCAGTGGTGGGAATTGGGGAGGACGTGGTGGTGGATCGAATAAAAGAGAGCTAGATAATGTTTCGCTTCCGAAGCAGAATTTTGGGAATCTTGTCCATTTCGAGAAGAATTTCTACGTGGAAAGCCCCGATGTGCAGGCGATGACAGAACAGGATGTTGCGATGTATAGAACCGGGAGGGATATATCCGTTGAAGGTCGTGATGTTCCTAAGCCGATTAGGATGTTCCAAGATGCTAACTTCCCAGALAATATTCTCGAAGCGATTGCTAAGTTGGGATTCACTGAGCCAACACCGATACAATCTCAGGGATGGCCAATGGCTTTGAAGGGTAGGGATCTGATTGGTATTGCTGAGACTGGCTCTGGTAAGACATTAGCTTACTTGTTACCAGCGTTGGTCCACGTAAGCGCACAACCTCGATTGAGTCAAGATGATGGCCCCATTGTGTTAATATTAGCGCCCACTAGAGAATTAGCTGTTCAGATTCAAGAGGAATCAAGGAAATTCGGTCTGCGATCTGGTGTTAGAAGCACTTGTATCTATGGTGGTGCTCCTAAAGGACCTCAGATTCGCGATCTTAGAAGAGGTGTTGAGATTGTAATTGCTACACCTGGTCGTTTGATCGATATGTTGGAGTGTCAACATACTAATTTGAGGAGAGTAACTTACCTCGTGTTAGATGAAGCTGACCGAATGTTAGACATGGGATTTGAACCCCAAATTAGAAAGATTGTATCTCAGATCCGACCTGATAGACAGACGCTGCTTTGGAGTGCAACATGGCCACGAGAGGTTGAATCTCTTGCCAGGCAGTTTCTACGAGATCCATATAAGGCCATTATTGGATCAGCAGATCTAAAAGCTAACCAGTCTATTAATCAAGTAATCGAGATTGTACCAACGCCAGAGAAATACGCCAGGCTTCTTGCACTGCTTAAACAGTTAATGGATGGGAGTAAAATCCTAATATTCGTGGAGACAAAGAGAGGGTGTGATCAAGTGACTAGACAATTGAGAATGGATGGATGGCCAGCTCTAGCCATACACGGTGACAAGAACCAATCGGAAAGAGATCGAGTCTTGTCAGAATTTAAGAGCGGAAGAAGCCCGATAATGACTGCCACTGATGTAGCAGCAAGGGGACTTGGTAGGACAACTGTAACACAATAG2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；3)該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第1到第1452位堿基。
2.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高山離子芥冷誘導(dǎo)基因CbDRH，其特征在于所述與植物抗寒 有關(guān)的基因CbDRH，具有序列表中序列1的DNA序列。
4.一種由序列表中序列1的DNA序列所述的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸殘 基序列如序列表中序列2所示序列表中序列2所述氨基酸序列MSSYDRRFADPNSYRQRSGAPVGPSQPMDPSAAPYNPRYGGGGGYGPSPVMAGDGSGYSRYPAFQP PTSGFSVGRGGGGGRGTYGQYGGGGGGGSGGNWGGRGGGSNKRELDNVSLPKQNFGNLVHFEKNF YVESPDVQAMTEQDVAMYRTGRDISVEGRDVPKPIRMFQDANFPDNILEAIAKLGFTEPTPIQSQGffP MALKGRDLIGIAETGSGKTLAYLLPALVHVSAQPRLSQDDGPIVLILAPTRELAVQIQEESRKFGLRSG VRSTCIYGGAPKGPQIRDLRRGVEIVIATPGRLIDMLECQHTNLRRVTYLVLDEADRMLDMGFEPQIRKIVSQIRPDRQTLLWSATWPREVESLARQFLRDPYKAIIGSADLKANQSINQVIEIVPTPEKYARLLALLKQLMDGSKILIFVETKRGCDQVTRQLRMDGWPALAIHGDKNQSERDRVLSEFKSGRSPIMTATDVAARGLGRTTVTQ。
5.將含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體PBI121-35S-CbDRH轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草。其在煙草抗寒育種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個(gè)高山離子芥冷誘導(dǎo)基因CbDRH，編碼產(chǎn)物及其在抗寒轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。高山離子芥冷誘導(dǎo)的基因CbDRH是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。由上述基因CbDRH編碼的蛋白質(zhì)，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。該基因在低溫下蛋白水平上調(diào)了7倍，轉(zhuǎn)入CbDRH基因的轉(zhuǎn)基因煙草在低溫下比野生型煙草具有更高的抗寒性。這對于培育抗低溫的優(yōu)良作物具有重要的理論及實(shí)際意義。
文檔編號C12N9/00GK101979582SQ20101023498
公開日2011年2月23日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者關(guān)淼, 向云, 孫正龍, 安黎哲, 張華 , 楊玉, 白慕群, 盛紅梅, 陳書燕 申請人:蘭州大學(xué)