專利名稱：：用于結(jié)構(gòu)基因的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)表達(dá)的核酸構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含至少一種激活物序列、至少一種啟動(dòng)子組件(該組件包含結(jié)合E2F家族的蛋白質(zhì)和CDF-1家族的蛋白質(zhì)的核苷酸序列)以及至少一種結(jié)構(gòu)基因。在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)抑制中暗含的一個(gè)因子是E2F，該因子能通過(guò)與口袋蛋白質(zhì)相互作用形成DNA-結(jié)合抑制蛋白復(fù)合物，如pRb(Weintraub等，自然，358，259(1992)；Helin和Harlow，細(xì)胞生物學(xué)，3，43(1993)；Zamanian和LaThangue，分子生物細(xì)胞學(xué)，4，389(1993))。E2F是由E2F與DP多基因家族的成員組成的異二聚物轉(zhuǎn)錄因子(Nevins，科學(xué)，258，424(1992)；Müller，遺傳學(xué)趨勢(shì)，11，173(1995)；LaThangue，學(xué)報(bào)，24，54(1996))。另一個(gè)屬于E2F基因家族的轉(zhuǎn)錄因子是如E2F-5(WO96/25494)。在細(xì)胞周期期間通過(guò)pRb家族的口袋蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)通過(guò)E2F的轉(zhuǎn)錄活化。E2F在G0和早期G1被抑制，但是在細(xì)胞周期過(guò)程中，DP/E2F部分和有關(guān)的口袋蛋白質(zhì)由G1特異性細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶過(guò)磷酸化，導(dǎo)致抑制性三元復(fù)合物的解離(DeCaprio等，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)，89，1795(1992)；Fagan等，細(xì)胞，78，799(1994)；Hatakeyama等，基因發(fā)展，8，1759(1994)；Weinberg，細(xì)胞，81，323(1995))。該解離產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄活性的“游離E2F”并導(dǎo)致E2F-調(diào)節(jié)的基因的活化。因此，例如，包含編碼E2F調(diào)節(jié)物和/或E1A調(diào)節(jié)物的核酸的載體已經(jīng)用于轉(zhuǎn)染分化的誘導(dǎo)DNA合成的神經(jīng)元(WO95/16774)。在通過(guò)經(jīng)E2FBSs的轉(zhuǎn)錄抑制控制的啟動(dòng)子中有E2F-1、orc-1和B-myb(Lam和Watson，EMBO雜志，12，2705(1993)；Hsiao等，基因發(fā)展，8424，1526(1994)；Johnson等，基因發(fā)展，8424，1514(1994)；Ohtani等，分子細(xì)胞生物學(xué)，16，6977(1996))。然而，E2F的功能不是專一活化的。這首先顯示了鼠B-myb基因(Lam和Watson，EMBO雜志，12，2705(1993)；Lam等，EMBO雜志，13，871(1994)；Lam等，基因，160，277(1995)，Zwicker等，科學(xué)271，1595(1996))。在B-myb啟動(dòng)子的E2F結(jié)合位點(diǎn)(E2FBS)的突變導(dǎo)致了選擇性地在G0中急劇提高的活性以及隨后的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)作用的喪失。在本文中的其它例子是E2F、p107、組蛋白H2A和orcl啟動(dòng)子，其中所說(shuō)的E2FBSs的突變也除去了抑制與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)(Hsiao等，基因發(fā)展，8424，1526(1994)；Johnson等，基因發(fā)展，8424，1514(1994)；Zhu等，分子細(xì)胞生物學(xué)，15，3552(1995)；Ohtani等，分子細(xì)胞生物學(xué)，16，6977(1996)；Oswald等，分子細(xì)胞生物學(xué)，16，1889(1996))。對(duì)由E2FBSs抑制的幾個(gè)基因的鑒定暗示，E2F-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄的常見(jiàn)機(jī)制。然而，B-myb基因抑制的機(jī)制與所有為E2F的作用提出的模型不同，因?yàn)樗枰苯佣ㄎ辉贓2FBS的下游的第二個(gè)元件(Bennet等，致癌基因，13，1073(1996)；Zwicker等，科學(xué)，271，1595(1996))。此外，B-mybE2FBS在細(xì)胞中的存在是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)性的，并僅在抑制階段期間看見(jiàn)(Zwicker等，科學(xué)，271，1595(1996))。這些觀察十分類似于用其它啟動(dòng)子進(jìn)行的觀察，如cdc25C、cdc2和細(xì)胞周期蛋白A，它們是周期性地通過(guò)兩個(gè)合作元件即E2FBS樣的CDE和鄰近的CHR抑制(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄的機(jī)制通過(guò)在細(xì)胞周期的后期階段表達(dá)的基因的分析發(fā)現(xiàn)。當(dāng)通過(guò)體內(nèi)足跡和突變分析研究cdc25C啟動(dòng)子(它在后期S/G2中被正調(diào)節(jié))時(shí)，確定了新的抑制劑元件，“細(xì)胞周期依賴性元件”(CDE)(Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995))。CDE在G0-G1中占據(jù)，當(dāng)cdc25C表達(dá)時(shí)，它的占據(jù)就在G2中失去。CDE介導(dǎo)的抑制在調(diào)節(jié)其它啟動(dòng)子中起作用，并通過(guò)功能性的CDEs的存在在細(xì)胞周期蛋白A和cdc2啟動(dòng)子(它們?cè)诤笃贕1/S被抑制)中顯示(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。這些研究也導(dǎo)致與CDE鄰接的其它元件的發(fā)現(xiàn)，這在三個(gè)啟動(dòng)子中是相同的。該元件被稱為“細(xì)胞周期基因同源區(qū)”(CHR)(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。CDE或CHR在cdc25C，cdc2或細(xì)胞周期蛋白A啟動(dòng)子中的突變很大程度上除去了在G2期的抑制。這些功能性的數(shù)據(jù)通過(guò)G0-G1特異性蛋白質(zhì)在基因組足跡中結(jié)合到CDE和CHR上的顯示支持。有趣的是，當(dāng)結(jié)合到CHR發(fā)生于小溝中時(shí)，CDE與DNA的大溝接觸(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。在WO96/06943中已經(jīng)要求了CDE-CHR的核苷酸序列及其用于診斷、篩選以及基因治療的權(quán)利。CHR在啟動(dòng)子的抑制中與CDE合作的發(fā)現(xiàn)與在B-myb啟動(dòng)子中鄰近E2FBS的CHR樣序列的鑒定促進(jìn)了B-myb抑制機(jī)制的詳盡研究。這些研究顯示CHR樣區(qū)對(duì)于抑制是不可缺少的，并與E2FBS一道作為共抑制元件(Bennett等，致癌基因，13，1073(1996))。該區(qū)被稱為Bmyb-CHR(Bennett等，致癌基因，13，1073(1996))或DRS(Bennett等，致癌基因，13，1073(1996))。此外，基因組足跡清楚地顯示在中G1中失去E2F位點(diǎn)占據(jù)平行于B-myb的去阻遏(Zwicker等，科學(xué)，271，1595(1996))。這些觀察顯示E2F-CHR位點(diǎn)調(diào)節(jié)基因在晚G1中引起的轉(zhuǎn)錄，其方式類似于CDE-CHR位點(diǎn)在S或G2導(dǎo)致基因的去阻遏。另外，這些研究結(jié)果表明抑制E2F位點(diǎn)通過(guò)鄰接的CHR協(xié)阻遏物元件的缺乏不同于活化E2F位點(diǎn)。在細(xì)胞周期的不同階段，E2F與CDE介導(dǎo)的抑制共同作用依賴于啟動(dòng)子特異性的CHR元件(Liu，N.等，核酸研究，24，2905，15(1996))。CDE與E2FBS核心序列相同，如在B-myb啟動(dòng)子中的那些序列(GGCGG)(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))，但是仍然不了解什么決定了E2FBS與CDE的差異。此外，到目前為止還沒(méi)有確定CDE或CDE-CHR的結(jié)合活性，CDE結(jié)合因子與轉(zhuǎn)錄因子的E2F家族的關(guān)系不清楚。兩抑制劑組件抑制定位在E2FBS-Bmyb-CHR或CDE-CHR上游的活化序列。在早期(G0至中G1期)，Bmyb-CHR元件抑制了上游活化序列，CDE-CHR直到細(xì)胞周期的后期(G0至S期)才抑制。這個(gè)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了下述基因的構(gòu)建，這些基因包含非細(xì)胞特異性的、細(xì)胞特異性的、病毒特異性的和/或代謝特異性的激活物序列、控制激活物序列活化的細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子組件(如CDE-CHR或E2FBS-Bmyb-CHR)以及編碼治療蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。這樣的基因構(gòu)建體被要求用于各種各樣的疾病的基因治療(參見(jiàn)，例如，WO96/06943；D196.05274.2；D196.17851.7；WO96/06940；WO96/06938；WO96/06941；WO96/06939)。本發(fā)明的一個(gè)目的是發(fā)現(xiàn)具有不同的細(xì)胞周期依賴性基因表達(dá)的新的核酸構(gòu)建體。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)參與B-myb的抑制的因子與CDE-CHR調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子是不同的。通過(guò)E2F復(fù)合物與CHR結(jié)合因子綴合顯示出抑制B-myb基因，而cdc25C啟動(dòng)子受到在本發(fā)明中確定的、稱為CDE-CHR結(jié)合因子-1(CDF-1)的新的活性抑制。其后，分析了在幾個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的基因中CDF-1與抑制元件的相互作用。采用體內(nèi)和體外DMS足跡法、啟動(dòng)子熒光素酶構(gòu)建體的EMSA和功能測(cè)定，有可能確定下列的CDF-1活性(a)CDF-1在cdc25C啟動(dòng)子中以協(xié)同方式與CDE和CHR相互作用，這與在細(xì)胞中看到的CDE的CHR依賴性占據(jù)相符合。(b)CDF-1與在CDE(大溝)中的G殘基和在CHR(小溝)中的A殘基相互作用。該保護(hù)模式與在體內(nèi)足跡法中發(fā)現(xiàn)的相同(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。(c)CDF-1結(jié)合到包含突變的CDE或CHR基元的序列上與在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的抑制中這樣的突變的元件的功能精確相關(guān)。(d)CDF-1以類似的效率結(jié)合到所有已知的CDE-CHR調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，即cdc25C、cdc2和細(xì)胞周期蛋白A上，但僅與B-myb微弱結(jié)合。(e)可以顯示出CDF-1以相似的高效率結(jié)合到包含cdc25C、cdc2和細(xì)胞周期蛋白A基因的啟動(dòng)子的CDE-CHR上，同時(shí)與B-myb啟動(dòng)子E2FBS-CHR組件的相互作用比較弱。(f)E2F不能經(jīng)由cdc25CCDE-CHR元件介導(dǎo)抑制，反之亦然，CDF-1不能經(jīng)由E2FBS-Bmyb-CHR介導(dǎo)抑制。CDF-1蛋白質(zhì)可通過(guò)高鹽提取法從HeLa懸浮培養(yǎng)物的核提取物中分離并在CDE-CHR序列基元的存在下通過(guò)親和色譜純化。因此，本發(fā)明的第一實(shí)施方案涉及可由下列步驟獲得的CDF-1蛋白質(zhì)(a)從HeLa細(xì)胞制備核提取物，和(b)在包含CDE-CHR序列基元的寡核苷酸的存在下，特別是在包含序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT的基元存在下，和特別是在包含序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGCTGGCGGAAGGTTTGAAT的基元存在下，通過(guò)親和色譜純化步驟(a)的提取物。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，把包含CDE-CHR序列基元的寡核苷酸與瓊脂糖，例如，通過(guò)鏈霉抗生物素蛋白偶聯(lián)。通常，步驟(a)的核提取物通過(guò)HeLa細(xì)胞的高鹽提取法(具體地說(shuō)通過(guò)如下的高鹽提取，例如按照Dignam，J.D.(1983)，核酸研究，11，1475-1489)制備。CDF-1蛋白質(zhì)可以通過(guò)逐步增加的鹽濃度(例如通過(guò)增加至1M的KCl鹽濃度)從色譜柱洗脫。CDF-1蛋白質(zhì)用于CDF-1的抑制劑或刺激劑的鑒別特別有用，特別是CDF-1的抑制功能的鑒別。CDF-1分離與功能定性的另一個(gè)結(jié)果是E2F/DP和CDF-1的結(jié)合與抑制功能所必須的核苷酸的鑒別。通常，結(jié)合依賴于CDE與CHR的完整形式的存在。CDE的共有序列可以定義為G/CGC/TGG/C(在cdc25C中的GGCGG；Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))，cdc25C的CHR序列可定義為序列TTTGAA。與該區(qū)中的核苷酸相對(duì)比，CDE和CHR之間的核苷酸(AAGG，參見(jiàn)表1、2)和CHR下游的核苷酸(TGG，參見(jiàn)表1、2)可以改變而對(duì)抑制功能沒(méi)有可檢測(cè)到的作用。類似的結(jié)合位點(diǎn)特異性相互作用模式可用部分純化的CDF-1觀察到。在B-myb的E2FBS和cdc25C的CDE中的核苷酸(對(duì)在E2F和CDF-1結(jié)合之間的區(qū)別起作用)是與E2FBS/CDE核心(GGCGG)直接鄰近的核苷酸。這樣，兩個(gè)核苷酸上游(在B-myb中的CT)和一個(gè)核苷酸下游(在B-myb中的G)一般造成E2F結(jié)合，但是不造成CDF-1結(jié)合?；谶@些發(fā)現(xiàn)，可能測(cè)定突變型B-myb啟動(dòng)子的功能，該啟動(dòng)子具有很強(qiáng)地減少的E2F結(jié)合，但具有正常的CDF-1相互作用，并可能顯示該構(gòu)建體的抑制被削弱。這些數(shù)據(jù)顯示與E2F的相互作用一般是必須的，并顯示出CDF-1的結(jié)合不足以賦與任何在B-myb啟動(dòng)子上的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。這種狀態(tài)非常不同于CDE-CHR抑制的cdc25C啟動(dòng)子。在這種情況下，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)對(duì)E2F的結(jié)合，與CDF-1強(qiáng)烈的相互作用一般依賴于CHR。這樣，E2F結(jié)合位點(diǎn)大于(即至少9個(gè)核苷酸)5-核苷酸CDE(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))，但是不包括CHR，而CDF-1結(jié)合位點(diǎn)是由5-核苷酸CDE和鄰接6-核苷酸CHR組成。因此，可能創(chuàng)造這樣的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有與E2F和CDF-1以高效率相互作用的能力，方法是通過(guò)把Bmyb-CHR改變成cdc25CCHR(B-C4，參見(jiàn)表2)或通過(guò)把cdc25CCDE側(cè)翼核苷酸改變成其B-myb對(duì)應(yīng)物(參見(jiàn)表2，C-B1，2)。令人感興趣的是，這些啟動(dòng)子顯示出在細(xì)胞周期期間相對(duì)于去阻遏的定時(shí)的新特性，其中在早中S-期，可以觀察到半最大活性比B-myb遲，但比cdc25C早。這些觀察顯示出E2F和CDF-1的不同結(jié)合是由于調(diào)節(jié)的定時(shí)。與此觀察相一致的是發(fā)現(xiàn)顯示出優(yōu)選和強(qiáng)烈的CDF-1結(jié)合的B-myb啟動(dòng)子突變型(參見(jiàn)表2，B-C-1、3、4)顯示出cdc25C樣的表達(dá)動(dòng)力學(xué)。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含a)至少一種激活物序列，b)至少一種嵌合啟動(dòng)子組件，該組件包含結(jié)合E2F家族的蛋白質(zhì)和CDF-1家族的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；和c)至少一種結(jié)構(gòu)基因，其中所說(shuō)的嵌合啟動(dòng)子組件引起細(xì)胞周期中基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)，它比B-myb啟動(dòng)子遲，但比cdc25C啟動(dòng)子早。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，激活物序列定位在嵌合啟動(dòng)子組件的上游。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)突變成ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(SEQIDNO1)的B-myb基因的E2FBS-Bmyb-CHR啟動(dòng)子組件(突變的位置下劃線)ACTTGGCGGGAGATAGGAAA(Zwicker等，科學(xué)，2711595(1996))包含高度親和性的E2F以及CDF-1結(jié)合位點(diǎn)。在體內(nèi)(在細(xì)胞內(nèi))E2F和CDF-1與核苷酸序列的結(jié)合局限在G0與G1期，并且在S、G2和M期檢測(cè)不到，在細(xì)胞周期的G0和G1期，核苷酸SEQIDNO1能夠強(qiáng)烈地抑制激活物序列(定位在SEQIDNO1的上游)的活性以活化結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄(定位在SEQIDNO1的下游)。同樣地發(fā)現(xiàn)突變成GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT(SEQIDNO2)的cdc25C基因的CDE-CHR啟動(dòng)子組件(突變的位置下劃線)GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT(EMBO雜志，14，4514(1995))包含高度親和性的CDF-1以及E2F結(jié)合位點(diǎn)。在體內(nèi)(在細(xì)胞內(nèi))CDF-1和E2F與核苷酸序列的結(jié)合局限在G0與G1期，并且在S、G和M期檢測(cè)不到，在細(xì)胞周期的G0和G1期，核苷酸SEQIDNO2能夠強(qiáng)烈地抑制激活物序列的活性(定位在SEQIDNO2的上游)以活化結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄(定位在SEQIDNO2的下游)。因此，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及具有嵌合啟動(dòng)子組件的核酸構(gòu)建體，該組件包含至少一種核苷酸序列，該核苷酸序列選自由ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(SEQIDNO1)和ACTTGGCGGGAGGTTTGAAT(SEQIDNO2)組成的組。通常，啟動(dòng)子組件與激活物序列相互作用，所說(shuō)的相互作用影響結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。激活物通常通過(guò)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的非特異的、細(xì)胞特異性的、病毒特異性的和/或代謝特異性的活化起作用。結(jié)構(gòu)基因通常以細(xì)胞周期特異性的、細(xì)胞特異性的和細(xì)胞周期依賴性的、病毒特異性的和細(xì)胞周期依賴性的和/或代謝特異性的和細(xì)胞周期依賴性的方式表達(dá)。按照本發(fā)明的核酸構(gòu)建體優(yōu)選地由DNA組成。本文所用的術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”是指能在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的人工核酸結(jié)構(gòu)。這樣的構(gòu)建體可以插入到載體中?？梢岳梅遣《据d體(如質(zhì)粒載體)或病毒載體。這種載體和按照本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的插入技術(shù)是技術(shù)人員所知道的。按照本發(fā)明的核酸構(gòu)建體不以本發(fā)明描述的排列方式天然存在。換句話說(shuō)，核酸構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)基因不天然地與激活物序列和嵌合啟動(dòng)子組件組合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體的細(xì)胞。按照本發(fā)明的核酸構(gòu)建體使結(jié)構(gòu)基因經(jīng)歷細(xì)胞周期特異性表達(dá)或細(xì)胞和細(xì)胞周期特異性表達(dá)、或病毒和細(xì)胞周期特異性或代謝和細(xì)胞周期特異性表達(dá)成為可能。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)基因是編碼病理活性物質(zhì)的基因。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)基因編碼把藥物非活性前體裂解成活性藥物(“前體藥物”裂解成藥物)的酶。這樣的藥物前體裂解成藥物的例子由Sedlacek等，Contrib.toOncol.43，KargerVerlag(1992)；Hay等，未來(lái)藥物，21，917(1996)描述。“激活物序列”(指這樣的核苷酸序列，該核苷酸序列是基因的一部分，所謂的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)蛋白能夠與其結(jié)合)作為結(jié)合的結(jié)果活化定位在下游的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。被稱作“下游”序列的區(qū)是定位在轉(zhuǎn)錄方向的區(qū)域，而安排在相反方向的序列被稱作“上游”序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，激活物序列可以是非特異的、細(xì)胞特異性的或病毒特異的或代謝特異性的。用于本說(shuō)明書的“細(xì)胞特異性的”是指激活物序列選自編碼這樣的蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)在給定的細(xì)胞中特異性地表達(dá)；“病毒特異性的”是指激活物序列選自病毒基因；“代謝特異的”是指激活物序列選自編碼這樣的蛋白質(zhì)的基因，該蛋白質(zhì)在所限定的代謝條件下特異性表達(dá)。這樣，在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，激活物序列選自在下列細(xì)胞中活化轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子的組內(nèi)皮細(xì)胞、漿膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、生血細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白血病細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或角化細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，或選自病毒HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、CMV、SV40或HIV的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列。細(xì)胞特異性的、病毒特異性的和代謝特異性的激活物序列的例子在WO96/06940；WO96/06938；WO96/06941和WO96/05994中描述。激活物序列可以是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。按照本發(fā)明的嵌合啟動(dòng)子組件包含E2F家族以及CDF-1家族的蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)。這樣的啟動(dòng)子組件的例子是SEQIDNO1和SEQIDNO2。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這種嵌合啟動(dòng)子組件定位在活化序列的下游。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子組件可以按照在D196.17851.7中的描述的技術(shù)與激活物序列結(jié)合。在本專利申請(qǐng)中，描述了結(jié)合幾個(gè)啟動(dòng)子的幾個(gè)例子。一個(gè)例子是激活物響應(yīng)的啟動(dòng)子單位。它由兩個(gè)不同的激活物亞單位A和B組成。A和B的表達(dá)產(chǎn)物融合在一起并通過(guò)其形成活化激活物響應(yīng)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子。激活物亞單位A和B的表達(dá)處于A的啟動(dòng)子和B的啟動(dòng)子的控制之下。這些啟動(dòng)子可以相同或不同。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌合啟動(dòng)子組件可以與從一系列啟動(dòng)子中選擇的第二啟動(dòng)子結(jié)合，這些啟動(dòng)子包括強(qiáng)烈的非特異性的可活化的啟動(dòng)子(如RNA聚合酶III的啟動(dòng)子、RNA聚合酶II的啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和增強(qiáng)子和/或SV40啟動(dòng)子)；或病毒啟動(dòng)子和/或激活物序列(如HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV和/或HIV的激活物序列)；或代謝可活化的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(例如，可由缺氧誘導(dǎo)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)；或另一個(gè)細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子(例如cdc25C基因、細(xì)胞周期蛋白A基因、cdc2基因、B-myb基因、DHFR-基因或F2F-1基因的啟動(dòng)子)；或四環(huán)素可活化的啟動(dòng)子(例如，與相應(yīng)的抑制劑相結(jié)合的四環(huán)素操縱子)；或細(xì)胞特異性可活化啟動(dòng)子；這些啟動(dòng)子包括這樣的基因的上游活化序列，該基因編碼主要或?qū)Ｒ辉谒x擇的細(xì)胞類型中表達(dá)的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可用于遺傳工程；具體地說(shuō)用于基因治療。在基因治療中，把旨在于身體中表達(dá)的基因引入身體。這些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)對(duì)于基因治療的治療效果來(lái)說(shuō)是重要的。因此，本發(fā)明也涉及可用于基因治療的核酸構(gòu)建體。基因治療的技術(shù)對(duì)熟練技術(shù)人員是熟知的。例如，WO93/24640和WO95/11984公開了用于在體內(nèi)基因治療中用非病毒或病毒載體技術(shù)的方法和組合物。在另一個(gè)例子中，WO95/06743公開了這樣的方法，通過(guò)該方法把治療核酸構(gòu)建體引入患者的分離的呼吸道上皮細(xì)胞(通過(guò)以包含構(gòu)建體的病毒(AAV)載體轉(zhuǎn)化)。然后把轉(zhuǎn)化的細(xì)胞施用于患者。此外，F(xiàn)R2735789公開了包含重組腺病毒的藥物組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員同樣熟知用于各種非病毒載體的技術(shù)，該非病毒載體可用作用于本發(fā)明的構(gòu)建體的載體，并在體外運(yùn)用于細(xì)胞或體內(nèi)注射或運(yùn)用于患者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體可用于至少一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的細(xì)胞特異性的和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體可用于至少一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的病毒特異性的和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體可用于至少一個(gè)結(jié)構(gòu)基因的代謝特異性的和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的表達(dá)。按照本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或細(xì)胞優(yōu)選地用于治療病癥，該病癥的特征在于細(xì)胞增殖或與細(xì)胞增殖有關(guān)。這樣的處理包含，例如把所說(shuō)的核酸構(gòu)建體引入靶細(xì)胞。病癥(其特征在于細(xì)胞增殖或與細(xì)胞增殖有關(guān))的例子是腫瘤疾病、白血病、心血管疾病、炎癥反應(yīng)、自身免疫反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、移植器官的即將發(fā)生的排斥、CNS破壞、傳染病、血液凝固病癥和慢性病毒感染。這樣的病癥可通過(guò)全身或局部施用本發(fā)明的構(gòu)建體或細(xì)胞來(lái)治療。這樣的構(gòu)建體在各增殖的細(xì)胞群體中的表達(dá)受細(xì)胞特異性的、代謝特異性的或病毒特異性的激活物序列以及細(xì)胞周期特異性啟動(dòng)子組件控制。本發(fā)明的構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)物可直接或間接地抑制細(xì)胞增殖或殺死增殖細(xì)胞。借助于構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)，它可以在細(xì)胞增殖階段期間表達(dá)。為了治療其它病癥，選擇在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或細(xì)胞中的活化序列和活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因取決于利用目的。通常，結(jié)構(gòu)基因編碼這樣的物質(zhì)，該物質(zhì)選自由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子受體、具有抗增殖作用的蛋白質(zhì)、具有編程性細(xì)胞死亡作用的蛋白質(zhì)、具有細(xì)胞抑制作用的蛋白質(zhì)、具有細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)、具有炎性作用的蛋白質(zhì)、具有抗炎作用的蛋白質(zhì)、具有免疫抑制作用的蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、血管形成抑制劑、凝固因子、纖維蛋白溶解化合物以及抗凝劑、血液蛋白質(zhì)、病毒抗原、細(xì)菌抗原和腫瘤抗原和配體(如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或抗體)和一種上述提及的物質(zhì)之間的融合蛋白組成的組。在這一點(diǎn)上，本發(fā)明包含下列構(gòu)建體和治療方法。1.通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的腫瘤和慢性炎癥的治療腫瘤與慢性炎癥的特征在于通過(guò)增殖內(nèi)皮細(xì)胞形成新的血管。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的增殖的內(nèi)皮細(xì)胞是要通過(guò)本發(fā)明的構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞以表達(dá)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)直接或間接抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和/或殺死增殖內(nèi)皮細(xì)胞和鄰近的腫瘤細(xì)胞。1.1.在內(nèi)皮細(xì)胞中活化的激活物序列在一個(gè)實(shí)施方案中，在內(nèi)皮細(xì)胞中活化的激活物序列包括那些基因調(diào)節(jié)的序列和基因的啟動(dòng)子元件，這些基因編碼在特別是內(nèi)皮細(xì)胞中可檢測(cè)的蛋白質(zhì)。這些內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)以及它們的基因的啟動(dòng)子序列的例子在WO96/06940中描述。這些啟動(dòng)子包括編碼下列物質(zhì)的基因的啟動(dòng)子或激活物序列腦特異性內(nèi)皮葡萄糖-1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、Endoglin、VEGF受體-1(flt-1)、VEGF受體-2(flk-1，KDR)、tie-1或tie-2、B61受體(Eck-受體)、B61、內(nèi)皮素(例如內(nèi)皮素B或內(nèi)皮素-1)、內(nèi)皮素受體(具體地說(shuō)是內(nèi)皮素B受體)、甘露糖-6-磷酸受體、vonWillebrand因子、IL-1α、IL-1β、IL-1受體、血管細(xì)胞粘著分子(VCAM-1)、合成的激活物序列，例如包含和/或5’-TTATCT-3’結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子GATA-2的合成激活物序列。1.2.在與活化的內(nèi)皮細(xì)胞鄰近的細(xì)胞中活化的激活物序列當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖時(shí)，鄰近的細(xì)胞因?yàn)椤熬o接頭”可接近得自血液的大分子。這些功能和解剖學(xué)的相互關(guān)系是指在活化的內(nèi)皮細(xì)胞附近的細(xì)胞是用于本發(fā)明的靶細(xì)胞。在鄰近的細(xì)胞中活化的激活物序列的例子在WO96/06940中描述。那些激活物序列或啟動(dòng)子包括編碼VEGF的基因的啟動(dòng)子或激活物序列。VEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列是5’側(cè)翼區(qū)或3’側(cè)翼區(qū)或c-Src基因或v-Src基因。其它例子是類固醇激素受體和它們的啟動(dòng)子元件(Truss和Beato，Enocrin.Rev.14，459(1993))，具體地說(shuō)是鼠哺乳動(dòng)物腫瘤病毒啟動(dòng)子。1.3.抗腫瘤或抗炎活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因“抗炎”物質(zhì)可以具有一種或多種下列特征內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制、血管形成的抑制、血栓形成的抑制、細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性性質(zhì)、引起編程性細(xì)胞死亡的能力或把藥物前體轉(zhuǎn)化成為具有細(xì)胞毒性、細(xì)胞抑制或抗炎特性的活性藥物的能力。用于本申請(qǐng)的“抗腫瘤”物質(zhì)可以具有前面的一種或多種性質(zhì)。此外，“抗腫瘤”物質(zhì)可以是引起炎癥的物質(zhì)。這些物質(zhì)和它們的基因的例子在WO96/06940、WO96/06941和D19617851.7中描述。編碼這些物質(zhì)的基因是例如細(xì)胞增殖的抑制劑的結(jié)構(gòu)基因，例如成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)(pRb＝p110)和有關(guān)的p107與p130蛋白質(zhì)、p53蛋白質(zhì)、p21(WAF-1)蛋白質(zhì)、p16蛋白質(zhì)、其它c(diǎn)dk-抑制因子、GADD45蛋白質(zhì)或bak蛋白質(zhì)的基因。成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)(pRb＝p110)和有關(guān)的p107與p130蛋白質(zhì)通過(guò)磷酸化滅活；優(yōu)選的是這些細(xì)胞周期抑制劑的這類基因，這些基因包含表達(dá)的蛋白質(zhì)的滅活位點(diǎn)的突變，但不損害這些抑制劑的功能。其它例子是血栓形成誘導(dǎo)因子和/或血管形成抑制劑的結(jié)構(gòu)基因，例如血纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、PAI-2、PAI-3、血管抑制素(angiostatin)、干擾素(如IFNα、IFNβ、IFNγ)、血小板因子-4、IL-12、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、白血病抑制因子(LIF)或組織因子(TF)和其活性片段的基因。進(jìn)一步的例子是細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，例如，編碼穿孔素、粒酶、IL-2、IL-4、IL-12、干擾素(例如IFNα、IFNβ、IFNγ)、TNF、TNFα、TNFβ、制瘤素M、鞘磷脂酶或爪蟾抗菌肽和爪蟾抗菌肽衍生物的基因。1.4.細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性抗體、抗體片段和融合蛋白(抗原結(jié)合抗體或抗體片段和細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒性或炎癥蛋白質(zhì)或酶之間)的結(jié)構(gòu)基因。細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性抗體包括這樣的抗體，該抗體針對(duì)在內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤或白血病細(xì)胞上的膜結(jié)構(gòu)。這樣的抗體由，例如，Sedlacek等，Contrib.toOncol.32，KargerVerlag，München(1988)和Contrib.toOncol.43，KargerVerlag，München(1992)描述。其它例子為對(duì)下列物質(zhì)有特異性的抗體SialylLewis、被T-淋巴細(xì)胞識(shí)別的在腫瘤上的肽、致癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)、神經(jīng)節(jié)苷脂(例如GD3、GD2、GM、9-0-乙?；鵊D3、巖藻糖基GM1)、血型抗原及其前體、在多形上皮細(xì)胞粘蛋白上的抗原、在熱休克蛋白上的抗原或CD13、CD15、CD33、CAMAL、CD5、CD1c、CD23、膜免疫球蛋白的獨(dú)特型與同種型上的抗原、CD33、M38、IL-2受體、T-細(xì)胞受體、CALLA、CD19或非Hodgkin淋巴腫瘤。1.5靶細(xì)胞結(jié)合配體和細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)或酶之間的融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因。這樣的配體包括所有結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，例如，生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子的片段，如PDGF、bFGF、VEGF、TGFβ。此外，這樣的配體包括結(jié)合到活化的和/或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞的粘著分子，例如Slex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1、VLA4或玻連蛋白。此外，這樣的配體包括結(jié)合到腫瘤或白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜或膜受體上的化合物，例如，生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子片段。這樣的生長(zhǎng)因子已經(jīng)由Cross等，細(xì)胞64，271(1991)，Aulitzky等，藥物，48，667(1994)，Moore，臨床癌癥研究，1，3(1995)，VanKooten等，Leuk.Lymph.12，27(1993))描述。1.6炎癥誘導(dǎo)劑的結(jié)構(gòu)基因炎癥誘導(dǎo)劑的結(jié)構(gòu)基因包括，如RANTES(MCP-2)、單核細(xì)胞趨化及活化因子(MCAF)、IL-8、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì)-1(MIP-1，-β)、嗜中性白細(xì)胞活化蛋白質(zhì)-2(NAP-2)、IL-3、IL-5、人白血病抑制因子(LIF)、L-7、IL-11、IL-13、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、眼鏡蛇毒因子(CVF)或功能對(duì)應(yīng)于人補(bǔ)體因子C3b的CVF序列、人補(bǔ)體因子C3或C3b序列、功能和結(jié)構(gòu)上類似于CVF的人補(bǔ)體因子C3的裂解產(chǎn)物或活化補(bǔ)體或引起炎癥的細(xì)菌蛋白質(zhì)，例如，鼠傷寒沙門氏菌的孔蛋白、金黃色葡萄球菌的“凝集”因子、革蘭氏陰性細(xì)菌的調(diào)節(jié)蛋白、軍團(tuán)菌屬或流感嗜血菌B型或克雷伯氏菌屬的“主要外膜蛋白”或鏈球菌G組的M-分子。1.7把前藥轉(zhuǎn)化為藥物的酶的結(jié)構(gòu)基因例如把藥物前體轉(zhuǎn)化或裂解成活性的細(xì)胞抑制劑的酶的結(jié)構(gòu)基因包括，例如，這樣的酶，如單純皰疹病毒胸苷激酶、水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶、細(xì)菌硝基還原酶、細(xì)菌β-葡糖苷酸酶、黑麥β-葡糖苷酸酶、人β-葡糖苷酸酶、人羧肽酶(CB)，例如，肥大細(xì)胞的CB-A、胰的CB-B、細(xì)菌羧肽酶、細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶、細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶、磷酸酶(例如人堿性磷酸酶、人酸性前列腺磷酸酶、5型酸性磷酸酶)、氧化酶(例如人賴氨酰氧化酶、人酸性D-氨基氧化酶)、過(guò)氧化物酶(例如人gluthation過(guò)氧化物酶、人嗜酸細(xì)胞過(guò)氧化物酶、人甲狀腺過(guò)氧化物酶)或半乳糖苷酶。2.用于治療血細(xì)胞產(chǎn)生缺乏的活性物質(zhì)2.1生血細(xì)胞激活物序列的選擇用于生血細(xì)胞的激活物序列可以是基因調(diào)節(jié)序列或基因元件(該基因編碼在生血細(xì)胞中強(qiáng)烈或有選擇地表達(dá)的蛋白質(zhì))。這種類型的基因調(diào)節(jié)的序列包括細(xì)胞因子或其受體的基因的啟動(dòng)子序列，其在未成熟的生血細(xì)胞中或鄰近的細(xì)胞(如骨髓的基質(zhì)細(xì)胞)中的表達(dá)先于隨后作用于生血細(xì)胞的細(xì)胞因子并作為活性物質(zhì)被需要。這種類型的作用于未成熟的生血細(xì)胞的細(xì)胞因子是，例如，如干細(xì)胞因子、IL-1、IL-3、IL-6、GM-CSF或血小板生成素或這些細(xì)胞因子的受體。這樣的細(xì)胞因子的參考在WO96/06941中給出。這些激活物序列包括下列物質(zhì)的基因的啟動(dòng)子序列，這些物質(zhì)例如，干細(xì)胞因子受體、干細(xì)胞因子、IL-1α、IL-1受體、IL-3、IL-3受體((α-亞單位)、IL-3受體(β-亞單位)、IL-6、IL-6受體、GM-CSF、GM-CSF受體(α-鏈)、干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)、促紅細(xì)胞生成素或促紅細(xì)胞生成素受體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，激活物序列可以是代謝特異性的。代謝(即通過(guò)缺氧)可活化的激活物序列的例子由Semeza等，PNAS88，5680(1991)以及McBurney等，核酸研究，19，5755(1991)描述。2.2.生血細(xì)胞活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的選擇“生血細(xì)胞活性物質(zhì)”一般是指作用于血細(xì)胞的增殖和/或分化的蛋白質(zhì)。這樣的物質(zhì)的基因的例子在WO96/06941中列出。這些包括貧血治療(例如紅細(xì)胞生成素)的結(jié)構(gòu)基因、白細(xì)胞減少治療(例如G-CSF、GM-CSF)的結(jié)構(gòu)基因、血小板減少治療(例如IL-3、白血病抑制因子(LIF)、IL-11或血小板生成素)的結(jié)構(gòu)基因。3.用于自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)、炎癥治療并防止器官排斥的活性物質(zhì)3.1.激活物序列的選擇可以利用的激活物序列是在巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞中強(qiáng)烈活化基因的啟動(dòng)子序列，或編碼在巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞中的免疫應(yīng)答期間廣泛產(chǎn)生的蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子序列。編碼這樣的蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子序列的例子在WO96/06941中描述。這些蛋白質(zhì)包括IL-1受體、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-2受體、IL-3、IL-3受體(α-亞單位)、IL-3受體(β-亞單位)、IL-4、IL-4受體、IL-5、IL-6、干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)、IFN應(yīng)答的啟動(dòng)子、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IFN、GM-CSF、GM-CSF受體(α-鏈)、IL-13、LIF、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)受體、I型和II型巨噬細(xì)胞清除劑受體、MAC-1(白細(xì)胞功能抗原)、LFA-1α(白細(xì)胞功能抗原)或p150，95(白細(xì)胞功能抗原)。3.2.活性物質(zhì)基因的選擇用于這個(gè)目的的活性物質(zhì)可以是下列物質(zhì)的DNA序列細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子或其抑制劑之一、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子受體的胞外部分、抗體、抗體片段、酶抑制劑或酶。對(duì)活性物質(zhì)的選擇取決于要處理的基本病癥和選擇的啟動(dòng)子序列。適于治療自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)、炎癥或用于防止器官排斥的結(jié)構(gòu)基因的選擇的例子在WO96/06941中給出。這些例子包括，例如變態(tài)反應(yīng)的治療的結(jié)構(gòu)基因，例如，編碼IFNβ、IFNγ、IL-10、特異地抗IL-4、可溶性IL-4受體、IL-12或TGFβ的抗體或抗體片段。防止移植的器官排斥的結(jié)構(gòu)基因，例如編碼IL-10、TGFβ、可溶性IL-1受體、可溶性IL-2受體、IL-1受體拮抗物、可溶性IL-6受體、免疫抑制性抗體或包含這些抗體的VH和VL片段的片段或通過(guò)接頭綴合的VH-和VL片段?？贵w對(duì)T-細(xì)胞受體或其CD3復(fù)合物、對(duì)CD4或CD8、對(duì)IL-2受體、IL-1受體或IL-4受體或?qū)φ持肿覥D2、LFA-1、CD28或CD40是特異性的。用于治療抗體介導(dǎo)的自身免疫疾病的結(jié)構(gòu)基因，例如，編碼TGFβ、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-12、可溶性IL-4受體、可溶性IL-6受體或免疫抑制抗體或其包含VH與VL的片段。用于治療細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的結(jié)構(gòu)基因，例如，編碼IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、TNFα、IL-4、TNFβ或免疫抑制抗體或其包含VH與VL的片段。編碼細(xì)胞增殖抑制劑、細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)或酶(用于把藥物前體轉(zhuǎn)化或活化成細(xì)胞抑制劑)或融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因與腫瘤治療的結(jié)構(gòu)基因相同。4.用于關(guān)節(jié)炎治療的活性物質(zhì)4.1用于關(guān)節(jié)炎的激活物序列選擇激活物序列一般指這樣的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列，以此形成轉(zhuǎn)錄因子或在例如滑膜細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中主動(dòng)地相互作用。為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選的啟動(dòng)子序列包括基因調(diào)節(jié)的序列和元件形成基因(該基因編碼特別在滑膜細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì))。這樣的蛋白質(zhì)的例子在WO96/06941中概述。這些蛋白質(zhì)包括，例如MMP-1(間質(zhì)膠原酶)、MMP-3(溶基質(zhì)素/transin)或組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)(例如TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3)。4.2.關(guān)節(jié)炎的活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的選擇用于這個(gè)目的的活性物質(zhì)一般是指一種DNA序列，其表達(dá)的蛋白質(zhì)直接或間接地抑制炎癥(例如在關(guān)節(jié)中)和/或促進(jìn)在關(guān)節(jié)中如軟骨和/或結(jié)締組織中胞外基質(zhì)的重建。這樣的蛋白質(zhì)的例子在WO96/06941中給出。這些蛋白質(zhì)包括，例如IL-1受體拮抗物、可溶性IL-1受體、IL-6、可溶性TNF受體、IL-4、IL-10、胰島素樣生長(zhǎng)因子、TGFβ、超氧化物歧化酶或TIMP(例如TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3)。5.抗感染物質(zhì)通常，活性物質(zhì)可以以兩種根本不同的形式制備對(duì)于病毒感染和寄生物入侵的治療或?qū)τ谟捎诓《?、?xì)菌或寄生物的傳染病的預(yù)防。疫苗一般用于傳染病的預(yù)防。然而，由常規(guī)手段制備有效疫苗的可能性受到限制。這樣，發(fā)展了DNA疫苗的技術(shù)。然而，這些DNA疫苗引起了安全和副作用的問(wèn)題(Fynan等，Int.J.Immunopharm.17，79(1995)；Donnelly等，免疫學(xué)2，20(1994))。下列用于傳染病預(yù)防的構(gòu)建體由于它們的細(xì)胞特異性和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)(這種調(diào)節(jié)提供了這些物質(zhì)的高度安全性)可與現(xiàn)有技術(shù)物質(zhì)區(qū)分5.1激活物序列的選擇5.1.1傳染病的治療可以選擇用于治療傳染病的激活物序列包含得自細(xì)胞基因的啟動(dòng)子序列(其活性特別因細(xì)菌或寄生物感染而改變)，或選擇的啟動(dòng)子序列是來(lái)自病毒(這些病毒轉(zhuǎn)化被其感染的細(xì)胞并刺激增殖)的序列。這些病毒包括，例如，HBV、HCV、HSV、HPV、HIV、EBV和HTLV。關(guān)于那些激活物序列的例子在WO96/06941中描述。5.1.2傳染病的預(yù)防可以選擇用于預(yù)防傳染病的激活物序列包含一般地在內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中強(qiáng)烈活化的啟動(dòng)子序列，或?qū)儆诰幋a一般地在內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)的蛋白質(zhì)的細(xì)胞基因的啟動(dòng)子序列。關(guān)于這些活化序列的例子在前面和后面的章節(jié)中給出。5.2活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的選擇5.2.1傳染病的治療可以選擇的活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)的DNA，這種蛋白質(zhì)具有細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒性、抗細(xì)菌或抗病毒的作用或可以是把無(wú)活性的前體轉(zhuǎn)化成細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒性、抗細(xì)菌或抗病毒的藥物的酶。細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制蛋白質(zhì)和細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的例子在WO96/06941中描述。這些物質(zhì)包括，例如抗病毒的活性細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，例如，IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFβ、TNFα、IL-1或TGFβ。其它例子是滅活特定的病毒的抗體或其含VH和VL的片段或其通過(guò)接頭綴合的VH和VL片段?？共《究贵w的例子為對(duì)HBV、HCV、HSV、HPV、HIV、EBV、HTLV、柯薩奇病毒或漢坦病毒特異性的抗體。進(jìn)一步的例子是rev.結(jié)合蛋白質(zhì)，例如，RBP9-27、RBP1-8U、RBP1-8D或RBP1-8的假基因。這些物質(zhì)還包括例如核酶，該核酶催化細(xì)胞周期控制蛋白質(zhì)的基因的mRNA或抗細(xì)菌蛋白質(zhì)的各自的病毒或結(jié)構(gòu)基因的mRNA，所述抗細(xì)菌蛋白例如中和細(xì)菌毒素或調(diào)理細(xì)菌的抗體，例如對(duì)腦膜炎雙球菌C或B、大腸桿菌、疏螺旋體屬、假單胞菌屬、幽門螺桿菌或金黃色葡萄球菌特異的抗體?？贵w或抗體片段是例證性的抗細(xì)菌或抗病毒的蛋白質(zhì)。如上所述，對(duì)于某些物質(zhì)，需要把前體酶促轉(zhuǎn)化成活性形式。在這樣的情況下，抗細(xì)菌、抗病毒、細(xì)胞毒性或抗寄生物物質(zhì)在按照本發(fā)明的構(gòu)建體已經(jīng)施用之后添加。轉(zhuǎn)化這樣的藥物前體的酶和這樣的酶的基因的例子在WO96/06940和WO96/06941和前述章節(jié)中描述。5.2.2傳染病的預(yù)防在一個(gè)實(shí)施方案中，活性物質(zhì)可以為對(duì)病原體特異的抗體或抗體片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，活性物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由病原體形成并通過(guò)免疫應(yīng)答(即通過(guò)抗體結(jié)合和/或細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞)導(dǎo)致中和和/或殺死病原體。這種類型的中和抗原已經(jīng)用作免疫抗原(參見(jiàn)Ellis的回顧，Adv.Exp.Med.Biol.327，263(1992))。編碼這樣的蛋白質(zhì)的DNA序列用來(lái)制備按照本發(fā)明的構(gòu)建體。這些基因的例子在WO96/06941中描述，例如，編碼下列物質(zhì)的基因流感A病毒抗原、HIV抗原、狂犬病毒抗原、HSV(單純疤疹病毒)抗原、RSV(呼吸道合胞體病毒)抗原、副流感病毒抗原、輪狀病毒抗原、VZV(水痘帶狀皰疹病毒)抗原、CMV(巨細(xì)胞病毒)抗原、麻疹病毒抗原、HPV(人乳頭腫瘤病毒)抗原、HBV(肝炎B病毒)抗原、HCV(肝炎C病毒)抗原、HDV(肝炎D病毒)抗原、HEV(肝炎E病毒)抗原、HAV(肝炎A病毒)抗原、霍亂弧菌抗原、布氏疏螺旋體抗原、幽門螺桿菌抗原、瘧疾抗原或抗獨(dú)特型抗體或其抗體結(jié)合片段，其互補(bǔ)決定區(qū)是傳染性有機(jī)體的中和抗原的蛋白質(zhì)或糖類結(jié)構(gòu)的拷貝。6.用于白血病和腫瘤治療的活性物質(zhì)6.1.用于白血病和腫瘤的激活物序列的選擇所提供的激活物序列可以是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列，以此形成轉(zhuǎn)錄因子或在白血病細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞相互作用中有活性。然而，本發(fā)明所用的優(yōu)選的激活物序列包括基因調(diào)節(jié)的序列和基因元件，這些基因編碼特別在腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)。例子在WO96/06941中引用，例如，編碼c-myc、HSP-70、bcl-1/細(xì)胞周期蛋白D-1、bcl-2、IL-6、IL-10，NFα、TNFβ、HOX-11、BCR-Abl、E2A-PBX-1、PML-RATA(前髓細(xì)胞白血病-視黃酸受體)、c-myc、N-CAM-蛋白質(zhì)，肝炎生長(zhǎng)因子受體、L-絲束蛋白或多形上皮粘蛋白(PEM)的基因的啟動(dòng)子。6.2.用于白血病和腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的選擇用于這個(gè)目的的活性物質(zhì)一般是指這樣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)抑制細(xì)胞的增殖，特別的也抑制腫瘤細(xì)胞或白血病細(xì)胞的增殖。這些細(xì)胞增殖抑制劑包括，例如，已經(jīng)描述過(guò)的編碼抑制性的、細(xì)胞抑制、編程性細(xì)胞死亡和細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)以及用于裂解藥物前體的酶的DNA序列。細(xì)胞增殖抑制劑還指DNA序列，它表達(dá)直接或間接地對(duì)白血病或腫瘤有細(xì)胞抑制或細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)已經(jīng)在前面的章節(jié)中描述。編碼這樣的蛋白質(zhì)的DNA序列可以用來(lái)制備按照本發(fā)明的構(gòu)建體。細(xì)胞增殖抑制劑一般還指編碼這樣的蛋白質(zhì)或肽的DNA序列，該蛋白質(zhì)或肽誘發(fā)對(duì)腫瘤有細(xì)胞毒性或細(xì)胞抑制作用的體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答。這樣的蛋白質(zhì)或肽包括，例如，腫瘤疫苗的結(jié)構(gòu)基因。此處包括在腫瘤細(xì)胞上的抗原。例如，這樣的抗原由Sedlacek等，Contrib.toOncol.32，KargerVerlag，Munchen(1988)和Contrib.toOncol.43，KargerVerlag，Munchen(1992)回顧。其它例子是抗原或編碼SialylLewis、腫瘤細(xì)胞上的肽(可由T細(xì)胞識(shí)別)、致癌基因表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因、血型抗原及其前體、多形上皮粘蛋白的抗原或熱激蛋白的抗原。7.用于在血管阻塞中抑制平滑肌細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)7.1.用于平滑肌細(xì)胞的激活物序列的選擇在一個(gè)實(shí)施方案中，激活物序列可以是基因調(diào)節(jié)的序列或基因元件，這些基因編碼特別在平滑肌細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)。編碼這樣的蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子的例子在WO96/06938和WO96/06940中描述。這些包括原肌球蛋白、α-肌動(dòng)蛋白、α-肌球蛋白，PDGF受體、FGF受體、MRF-4、磷酸果糖激酶A、肌鈣蛋白C、肌細(xì)胞生成素、內(nèi)皮素A受體、結(jié)蛋白、VEGF或人工啟動(dòng)子。進(jìn)而，Helix-Loop-Helix(HLH)家族的因子(MyoD、Myf-5、肌漿蛋白MRF4)和Zinkfinger蛋白質(zhì)GATA-4被描述成肌肉特異性轉(zhuǎn)錄激活物。HLH蛋白質(zhì)以及GATA-4不僅在肌肉特異性基因啟動(dòng)子上而且在異源角度上顯示出肌肉特異性轉(zhuǎn)錄，例如，在人工啟動(dòng)子上。這樣的人工啟動(dòng)子例如5’-AGCAGGTGTTGGGAGGC-3’(SEQIDNO.3)的多個(gè)拷貝(例如，4×)或5’-GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG-3’(SEQIDNO4)的多個(gè)拷貝。7.2.平滑肌細(xì)胞活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的選擇用于這個(gè)目的的活性物質(zhì)一般指這樣的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。這些增殖抑制劑的例子在前面的章中已經(jīng)描述。8.抑制或活化凝固的活性物質(zhì)8.1.抑制或活化凝固的激活物序列的選擇用于這個(gè)目的的激活物序列一般可以是基因調(diào)節(jié)的序列或基因元件，這些基因編碼可在平滑肌細(xì)胞中、活化的內(nèi)皮細(xì)胞中、活化的巨噬細(xì)胞中或活化的淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。8.1.1平滑肌細(xì)胞在平滑肌細(xì)胞中的基因的啟動(dòng)子序列的例子已經(jīng)在WO96/06938中和前面的章中論及。8.1.2.活化的內(nèi)皮細(xì)胞或與活化的內(nèi)皮細(xì)胞鄰近的細(xì)胞特別在活化的內(nèi)皮細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)的例子已經(jīng)在WO96/06938和WO96/06940和前面的章中描述。8.1.3.活化的巨噬細(xì)胞和/或活化的淋巴細(xì)胞用于這個(gè)目的的激活物序列一般是指啟動(dòng)子序列，該啟動(dòng)子序列得自編碼巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答期間大量形成的蛋白質(zhì)的基因。例子已經(jīng)在WO96/06941和WO96/06938和前面的章中描述。8.2.用于抑制或活化凝固或調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的選擇在一個(gè)實(shí)施方案中，用于這個(gè)目的的活性物質(zhì)可以是直接或間接抑制血小板聚集或凝固因子或刺激纖維蛋白溶解作用的蛋白質(zhì)。這樣，這種類型的活性物質(zhì)被稱作抗凝劑。所使用的抗凝劑是，例如下列物質(zhì)的基因血纖維蛋白溶酶原激活物(PA)、例如組織PA(tPA)或尿激酶樣PA(uPA)或tPA和uPA的雜合體或蛋白質(zhì)C、抗凝血酶III、C-1S抑制劑、α1抗胰蛋白酶、組織因子途徑抑制劑(TFPI)或水蛭素。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于該目的的活性物質(zhì)也可以是促進(jìn)血液凝固的蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)的例子是，例如，血漿蛋白質(zhì)，如因子VIII、因子IX、vonWillebrand因子、FXIII、PAI-1或PAI-2。在第三個(gè)實(shí)施方案中，用于這個(gè)目的的活性物質(zhì)也可以是通過(guò)誘導(dǎo)血管形成或降低血壓調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的蛋白質(zhì)。編碼這樣的蛋白質(zhì)的基因的例子是血管形成因子，例如，VEGF或FGF或降低血壓的肽，例如，激肽釋放酶或內(nèi)皮細(xì)胞“氧化氮合酶”。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于這個(gè)目的的活性物質(zhì)可以是編碼血液蛋白質(zhì)的基因。這樣的血液蛋白質(zhì)的例子是清蛋白、C1-滅活劑、血清膽堿酯酶、運(yùn)鐵蛋白或1-抗胰蛋白酶。9.用于保護(hù)以免CNS破壞的活性物質(zhì)9.1用于保護(hù)以免CNS破壞的活性物質(zhì)的激活物序列9.1.1在內(nèi)皮細(xì)胞中活化的激活物序列在一個(gè)實(shí)施方案中，這種類型的激活物可以包括對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子序列。這些啟動(dòng)子序列的例子在WO96/06939中列出，并已經(jīng)在前面的章中描述。9.1.2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中活化的激活物序列一個(gè)優(yōu)選的激活物序列是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列，以此形成轉(zhuǎn)錄因子或在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用中有特定程度的活性。這些激活物序列的例子在WO96/06939中列出。這些包括編碼下列物質(zhì)的基因的啟動(dòng)子施旺細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)periaxin、谷氨酰胺合成酶、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)(神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白＝GFAP)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞蛋白質(zhì)S1OOb、IL-6(CNTF)、5-HT-受體、TNFα、IL-10、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體I和II或VEGF。9.2.神經(jīng)特異性因子的結(jié)構(gòu)基因的選擇用于本發(fā)明的目的的“神經(jīng)特異性因子”可以是編碼神經(jīng)元生長(zhǎng)因子或TNFα抑制劑的DNA序列。這些基因的例子在WO96/06939中列出。這些包括編碼下列物質(zhì)的基因FGF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3(NT-3)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4(NT-4)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性因子(CNTF)、TGFβ、可溶性TNF受體、IL-10、IL-10抑制素(inhibites)、可溶性的IL-1受體、IL-1受體I、IL-1受體II、IL-1受體拮抗物或可溶性IL-6受體。按照本發(fā)明的構(gòu)建體優(yōu)選地施用或注射進(jìn)破壞的組織、破壞的神經(jīng)區(qū)域或脊髓或腦以轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以表達(dá)治療蛋白質(zhì)。10.治療用途作為例子，在上面提到的部分中描述的構(gòu)建體可以施用給需要治療疾病的患者，這些疾病，例如，腫瘤、白血病、炎癥、其特征在于過(guò)度內(nèi)皮細(xì)胞增殖的病癥、血液細(xì)胞的缺乏產(chǎn)生、自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)、移植器官的即將發(fā)生的排斥、關(guān)節(jié)炎、感染、凝固病癥以及CNS破壞。對(duì)于施用，可以把描述的構(gòu)建體按照技術(shù)人員熟知的技術(shù)插入到質(zhì)粒載體或病毒載體中。載體可以局部運(yùn)用于患者或注射進(jìn)心血管系統(tǒng)(胸膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、膀胱內(nèi)、氣管內(nèi)、胃腸內(nèi))或注射進(jìn)不同的組織或器官之一。萬(wàn)一構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)基因編碼把無(wú)毒的、無(wú)效的藥物前體裂解或轉(zhuǎn)化成藥物的酶，該藥物前體在注射本發(fā)明的構(gòu)建體后運(yùn)用于患者。本發(fā)明可借助于下列實(shí)施例與說(shuō)明性的表詳盡地解釋，但是不限制本發(fā)明的范圍。表的描述表1cdc25CCHR的結(jié)構(gòu)-功能分析。分析cdc25C啟動(dòng)子構(gòu)建體(基于C290；Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))在CHR區(qū)的突變?cè)贜IH3T3細(xì)胞中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。位置-16至-12代表以前定義的CDE(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。瞬時(shí)熒光素酶測(cè)定的結(jié)果表達(dá)為RLUs的比(觀察為生長(zhǎng)細(xì)胞相對(duì)于靜止細(xì)胞的活性)。在表中所顯示的結(jié)果總結(jié)了利用至少兩種獨(dú)立的質(zhì)粒DNA制劑的4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。值代表平均值；在所有情況下標(biāo)準(zhǔn)差不高于±1,5。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中包括了SV40報(bào)道質(zhì)粒以使誘導(dǎo)因子標(biāo)準(zhǔn)化(SV40報(bào)道基因典型地給出生長(zhǎng)細(xì)胞高于靜止細(xì)胞1.5倍的值)。表1突變構(gòu)建體.</tables>表2B-mybE2FBS-CHR組件和cdc25CCDE-CHR基元之間的特異性核苷酸交換對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)與E2F和CDF-1復(fù)合物的DNA結(jié)合的作用。B-myb和cdc25C抑制組件在頂端顯示。序列相互不同的五個(gè)位置指定為1-5區(qū)。下面指出的每個(gè)突變體攜帶在B-myb(上段)或cdc25C(下段)啟動(dòng)子背景下的兩個(gè)啟動(dòng)子之間的特異性交換?！癇”和“C”表明特定的突變型是在1-5區(qū)中包含cdc25C(C)還是B-myb(B)核苷酸(例如，B-C1是在第1區(qū)中包含cdc25C核苷酸的B-myb序列)。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)首先通過(guò)比較野生型和突變型構(gòu)建體在靜止NIH3T3細(xì)胞中的活性來(lái)測(cè)量。指定“抑制”的列總結(jié)了這種分析的結(jié)果。(+比突變型野生型＜2；-比突變型野生型＞3。然后分析功能啟動(dòng)子構(gòu)建體在血清刺激的NIH3T3細(xì)胞中細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的定時(shí)并測(cè)定半最大活性的時(shí)間?？招募^表明清楚地不同于B-myb和cdc25C野生型啟動(dòng)子的動(dòng)力學(xué)。CDF-1和E2F結(jié)合數(shù)據(jù)由EMSA以野生型和突變的B-mybE2FBS-CHR探針和野生型和突變的cdc25CCDE-CHR探針并利用HeLa細(xì)胞核提取物或部分純化的CDF-1獲得。為了顯示特異的核苷酸改變對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的從B-myb和cdc25C啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的定時(shí)上的作用，用指定的構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，在G0通過(guò)除去血清使其同步并通過(guò)添加10％FCS來(lái)刺激。數(shù)據(jù)基于12個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)(除了C-B1，2基于4個(gè)實(shí)驗(yàn)外)。對(duì)于每個(gè)構(gòu)建體為了有利于比較半最大表達(dá)值，將在20小時(shí)的數(shù)據(jù)規(guī)格化為100。表2</tables>實(shí)施例1.材料和方法1.1.細(xì)胞培養(yǎng)、DNA轉(zhuǎn)染和熒光素酶測(cè)定在用10％胎牛血清、青霉素和鏈霉素補(bǔ)充的Dulbecco-Vogt改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞。將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在添加5％新生小牛血清的DMEM中。NIH3T3細(xì)胞用DEAE葡聚糖技術(shù)轉(zhuǎn)染(Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995))。為了在G0同步化，在轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞在無(wú)血清的培養(yǎng)基中保持2天12小時(shí)，用10％FCS再刺激。利用SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因構(gòu)建體測(cè)定熒光素酶活性和使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化按公開的方法進(jìn)行(Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995))。1.2.序列分析和熒光素酶構(gòu)建體cdc25C和B-myb啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶構(gòu)建體由Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995)和Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995)描述。突變用PCR策略如前描述引入(Good和Nazar，核酸研究，20，4934(1992)；Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995))。通過(guò)利用雙脫氧核苷酸鏈終止法使用測(cè)序酶(USB)或Tth聚合酶(Pharmacia)的DNA測(cè)序法檢驗(yàn)了所有PCR-擴(kuò)增的片段。1.3.EMSA電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)如所述完成(Zwicker等，科學(xué)271，1595(1996))。當(dāng)使用部分純化的CDF-1時(shí)，在缺少脫氧膽酸鈉和NP-40的情況下實(shí)行EMSA。利用下列的雙鏈探針-cdc25C-wt5’-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAA(SEQIDNO.5)(CDE黑體；CHR斜體)。在位置-19、-16、-13、-12和-11位置(表1)分別如描述那樣突變了T1、T4、T7(也稱作cdc25C-mCDE)、A8和C9(Zwicker等，核酸研究，23，3822，(1995))。-cdc25C-10/-75’-ACTGGGCTGGCGGActtgTTGAATGGTCAA(SEQIDNO.6)-cdc25C-6/-3(也稱作cdc25C-mCHR)5’-ACTGGGCTGGCGGAAGGTggtcATGGTCAA(SEQIDNO.7)-cdc25C-1/+25’-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAAggtTCAA(SEQIDNO.8)-cdc25C-25’-ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAcTGGTCAA(SEQIDNO.9).所有其它的寡核苷酸的序列(包括B-myb)在其它地方描述(Zwicker等，科學(xué)271，1595(1996))或在表2中指出。隨機(jī)寡核苷酸包含一種無(wú)關(guān)的序列(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。利用了下列的抗體E2F-1(SantaCruzSC-251X)、E2F-2(SantaCruzSC-632X)、E2F-3(SantoCruzSC-879X)、E2F-4(SantaCruzSC-512X)、E2F-5(SantaCruzSC-999X)、DP-1(從N.LaThangue獲得)、DP-2(SantaCruzSC-830X)。1.4.CDF-1的部分純化核提取物在蛋白酶抑制劑亮抑蛋白酶肽(50ng/ml)、胃蛋白酶抑制劑A(5μg/ml)和抑蛋白酶肽(80ng/m.)的存在下在高鹽提取緩沖液中從HeLa懸浮培養(yǎng)物制備(Dignam等，核酸研究，11，1475(1983))。把包含兩個(gè)串聯(lián)cdc25CCDE-CHR基元的生物素化的寡核苷酸偶連到鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖上并用于利用與EMSA相同的條件(見(jiàn)上，除了用鮭精DNA代替聚(dAdT)作為非特異性競(jìng)爭(zhēng)劑)的親和色譜法(Kadonaga和Tjian，PNAS83，5889(1986))。洗脫通過(guò)逐步增加KCl的濃度至1M進(jìn)行。1.5.體外DMS足跡法編碼鏈cdc25C寡核苷酸的體外DMS足跡法如所描述的進(jìn)行(Zwicker等，科學(xué)271，1595(1196))。1.6.穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子的基因組足跡法為了穩(wěn)定的細(xì)胞系的產(chǎn)生，將野生型cdc25C熒光素酶構(gòu)建體C290和CHR突變的C290mCHR5/6(TTTGAA突變成TagGAA)插入pAGLu載體(這種載體包含基質(zhì)附著區(qū)(SAR))并通過(guò)電穿孔法引入NIH3T3細(xì)胞。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆在G418選擇下分離并分析在靜止細(xì)胞和生長(zhǎng)細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)。擴(kuò)張具有期望的表達(dá)方式的克隆并如所描述的(Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995))通過(guò)基因組足跡法分析(Pfeifer等，科學(xué)246，810(1989))，所不同的是第一引物(P1)對(duì)熒光素酶基因5’-GTAACACAAAGGAATTCAAGC(SEQIDNO10)是特異性的。2.結(jié)果2.1CDF-1的鑒定2.1.1cdc25CCHR的鑒定前不久CDE的共有序列被定義為G/CGC/TGG/C(在cdc25C中的GGCGG)(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。然而，對(duì)于CHR，這樣的信息目前還沒(méi)有。為了描繪CHR的邊界并鑒別關(guān)鍵的核苷酸位置，許多突變被引入到cdc25C啟動(dòng)子的CHR中，這些突變型構(gòu)建體的功能通過(guò)測(cè)量其在NIH3T3細(xì)胞中(在G0中同步)的抑制來(lái)分析。在表1中的數(shù)據(jù)清楚地顯示CHR從-7擴(kuò)展至-2，在這個(gè)區(qū)中的所有核苷酸位置是必須的。相反地，CDE和CHR之間的核苷酸位置(-11至-8；AAGG)與CHR下游的核苷酸(≥1；TGG...)能改變而對(duì)抑制劑功能無(wú)可檢測(cè)到的作用。這樣cdc25CCHR可定義作序列TTTGAA。2.1.2.體內(nèi)CDE占據(jù)依賴于完整的CHR以前的數(shù)據(jù)清楚地顯示在不同的啟動(dòng)子中的CDE和CHR以協(xié)同的方式起作用，因?yàn)樵谌魏卧耐蛔冊(cè)贕0會(huì)破壞抑制(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。這可以指相互作用的因子協(xié)同結(jié)合到兩個(gè)元件上。這個(gè)問(wèn)題通過(guò)攜帶cdc25C啟動(dòng)子構(gòu)建體(在CHR中具有滅活的突變(cdc25C-mCHR5/6TTTGAA改變成TagGAA))的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞系的基因組足跡法澄清。期望的保護(hù)方式可在穩(wěn)定表達(dá)野生型cdc25C啟動(dòng)子構(gòu)建體的對(duì)照系中觀察到。相反地，攜帶具有CHR突變的cdc25C啟動(dòng)子的細(xì)胞系沒(méi)有在CDE和突變的CHR區(qū)中顯示任何保護(hù)，同時(shí)用于NF-Y的兩個(gè)組成性上游結(jié)合位點(diǎn)的占據(jù)(Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995))在突變型啟動(dòng)子中沒(méi)有改變。這樣，必然得到這樣的結(jié)論CDE占據(jù)依賴于完整的CHR，這表明在細(xì)胞之內(nèi)的協(xié)同結(jié)合。這樣的結(jié)論得到下列觀察結(jié)果支持在cdc25C啟動(dòng)子中的CDE和CHR之間的5bp或10bp的插入除去了抑制。2.1.3.CDF-1的鑒別HeLa細(xì)胞的核提取物的電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)導(dǎo)致活性的鑒別，這種活性以協(xié)同方式和cdc25C啟動(dòng)子的CDE和CHR相互作用。此外，這種活性結(jié)合到突變型抑制劑元件強(qiáng)烈地與這些元件的功能特性相關(guān)。表現(xiàn)出類似野生型的抑制功能的突變型(在-19中T代替G；在-11中C代替A或-1/+2的缺失)顯示出在結(jié)合測(cè)定中和野生型序列相同的競(jìng)爭(zhēng)(自身競(jìng)爭(zhēng))能力。相反地，導(dǎo)致在G0細(xì)胞中減少的或削弱的抑制的在CDE(在-16中T代替G；在-13中T代替G或在-12中A代替G)或CHR(-10/-1的缺失，-6/-3的缺失或在-2中C代替A)中的其它突變型顯示了競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合能力的縮小。觀察的協(xié)同結(jié)合與通過(guò)結(jié)構(gòu)-功能分析建立的相互關(guān)系一起與CDE-CHR結(jié)合因子的期望的特性一致。這種活性稱為CDF-1。2.1.4CDF-1接觸在大溝中的CDE以及在小溝中的CHR為了獲得在體內(nèi)CDF-1是與抑制劑單元相互作用的活性的其它證據(jù)，CDF-1與DNA的相互作用由體外甲基化保護(hù)足跡法分析。先前顯示體內(nèi)CDE在大溝中接觸，同時(shí)CHR在小溝中占據(jù)(Zwikker等，EMBO雜志，14.4514(1995))。通過(guò)上鏈的體外足跡法獲得了十分類似的結(jié)果。在CDE中的四個(gè)G-殘基被特異性地保護(hù)(這表明大溝接觸(N-7))，在CHR中的兩個(gè)A-殘基也特異性地被保護(hù)(這表明小溝接觸(N-3))。體外CDF-1和CDE-CHR之間的相互作用的方式這樣充分地與細(xì)胞內(nèi)所作的觀察協(xié)調(diào)。2.1.5.CDF-1與包含CDE-CHR組件的多個(gè)啟動(dòng)子的相互作用以前的研究顯示功能性CDE-CHR組件存在于不同的啟動(dòng)子中，包括cdc25C、cdc2以及細(xì)胞周期蛋白A(Zwicker等，EMBO雜志，14，4514(1995))。此外，結(jié)合位點(diǎn)的類似的配置在B-myb啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)，其中具有與cdc25CCDE相同的核心序列的E2F位點(diǎn)緊接著定位在類似CHR元件的上游(Bennett等，致癌基因13，1073(1996)；Zwicker等，科學(xué)271，1595(1996))。因此，研究上面鑒定的CDF-1活性是否與這些啟動(dòng)子中抑制劑位點(diǎn)相互作用具有明顯的吸引力?？梢园l(fā)現(xiàn)兩個(gè)包含CDE-CHR的啟動(dòng)子(即cdc2和細(xì)胞周期蛋白A)作為cdc25C啟動(dòng)子以類似的效能結(jié)合CDF-1活性。在所有的三種情況下，結(jié)合依賴于結(jié)合到CDE和CHR兩者的協(xié)同結(jié)合，因?yàn)樵谌魏我粋€(gè)位點(diǎn)的突變(參見(jiàn)材料和方法)削弱與cdc25C探針的競(jìng)爭(zhēng)。雖然一些競(jìng)爭(zhēng)可在更高的競(jìng)爭(zhēng)劑濃度觀察到，以相同比率的探針∶競(jìng)爭(zhēng)劑(1∶20)通過(guò)B-myb啟動(dòng)子E2FBS-CHR組件的競(jìng)爭(zhēng)不明顯。CDF-1活性顯示出與所有三種包含CDE-CHR的啟動(dòng)子的特異性和強(qiáng)烈的相互作用的事實(shí)提供了本研究中鑒定的活性相關(guān)性的其它證明。2.1.6.CDF-1不包含已知的E2F家族成員鑒于CDE和E2FBS的相似性，尋求研究上述鑒定的CDF-CHR活性是否包含已知的E2F或DP家族成員。為此，在針對(duì)特異的DP和E2F蛋白質(zhì)的抗體的存在下進(jìn)行EMSA。所有這些抗體在不同的組合中顯示出誘導(dǎo)超轉(zhuǎn)變(supershifts)或消滅E2F/DP的結(jié)合。然而，可以清楚地顯示沒(méi)有一種所利用的抗體影響CDF1-DNA復(fù)合物的形成，這表明CDF-1不包含任何已知的E2F或DP家族成員。2.2.確定優(yōu)選的E2F或CDF-1或E2F和CDF-1結(jié)合的核苷酸的鑒別核苷酸序列結(jié)合E2F和CDF-1的鑒別由于下列事實(shí)而復(fù)雜化DP/E2F和CDF-1復(fù)合物在EMSA中顯示出十分類似的電泳遷移率。因此，利用20bpcdc25CCDE-CHR序列通過(guò)DNA-親和色譜法分級(jí)分離HeLa核提取物(詳見(jiàn)材料和方法)。這種方法產(chǎn)生部分純化的CDF-1，它與在粗提取物中的CDF-1顯示出十分類似的結(jié)合特性并給出CDF-1從E2F結(jié)合活性中的完全分離。為了分析E2F復(fù)合物，把cdc25CCDE-CHR競(jìng)爭(zhēng)寡核苷酸包括在結(jié)合反應(yīng)中以阻止放射性標(biāo)記的CDF-1復(fù)合物的形成。為了確定DP/E2F與CDF-1的結(jié)合位點(diǎn)，把特異的核苷酸在B-myb和cdc25C啟動(dòng)子之間五個(gè)特異區(qū)之間交換，其中在該區(qū)中抑制組件相互不同(在表2的頂端指示為1-5)。首先試驗(yàn)相應(yīng)的序列的E2F結(jié)合(即在HeLa核提取物中DP1/E2F-1、-3和-4的結(jié)合)與和部分純化的CDF-1的相互作用。該研究產(chǎn)生了兩個(gè)清晰的結(jié)果。1.位于CDF或E2FBS的核心的側(cè)翼的核苷酸(1和2區(qū))在E2F結(jié)合中起著十分重要的作用。相對(duì)地，相同的殘基不明顯地影響CDF-1的結(jié)合。當(dāng)在第1區(qū)中的核苷酸(在B-myb中的CT)影響DP1/E2F-4(表2中的B-C1)的最大結(jié)合，在第2區(qū)的G-殘基對(duì)與所有E2F復(fù)合物的相互作用來(lái)說(shuō)至關(guān)緊要(在表2中的B-C，2和B-C2)。與這個(gè)結(jié)論一致，B-myb第1和2區(qū)(而不僅是第1區(qū))的導(dǎo)入使cdc25CCDE具有以高效率與DP1/E2F-1、-3和-4復(fù)合物相互作用的能力(表2中的C-B1，2)。相對(duì)地，在E2FBS核心或CDE周圍的這些核苷酸變化沒(méi)有一個(gè)影響CDF-1的結(jié)合(在表2中的B-C1和B-C1，2；B-C和C-B1和C-B1，2)。2.轉(zhuǎn)變對(duì)CDF-1結(jié)合來(lái)說(shuō)是真實(shí)的當(dāng)不影響E2F結(jié)合時(shí)，CHR的結(jié)構(gòu)對(duì)CDF-1結(jié)合有巨大影響，并在這點(diǎn)上第4區(qū)是至關(guān)緊要的。這樣，在cdc25C和B-myb之間的這個(gè)區(qū)中的兩個(gè)寡核苷酸的交換導(dǎo)致CDF-1結(jié)合到B-myb啟動(dòng)子的強(qiáng)烈的增加(表2中的B-C4)，而同時(shí)轉(zhuǎn)變交換破壞了CDF-1結(jié)合到cdc25C啟動(dòng)子(表2中的C-B4)。相對(duì)地，在第4區(qū)中的CHR改變不影響E2F復(fù)合物的結(jié)合。由于形式上它是可能的Bmyb-CHR超出了cdc25CCHR確定的邊界，在這些位置(表中的3和5區(qū))中兩個(gè)啟動(dòng)子不同，不能排除的是由于不完全的Bmyb-CHR，C-B4沒(méi)有與CDF-1相互作用。因此，在3和5區(qū)中發(fā)現(xiàn)的B-myb核苷酸也引入cdc25C序列(除了在第4區(qū)中的改突外)(表2中的C-B3，4、C-B3，4，5和C-B4，5)。然而，這些其它的改變僅能使CDF-1結(jié)合恢復(fù)到邊際程度，這確認(rèn)Bmyb-CHR和cdc25C-CHR序列對(duì)于相互作用的蛋白質(zhì)不等同。最后分析以上所觀察的E2F和CDF-復(fù)合物與B-myb和cdc25C的不同相互作用如何影響細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄抑制和調(diào)節(jié)的定時(shí)。把試驗(yàn)E2F和CDF-1結(jié)合的相同序列引入B-myb和cdc25C啟動(dòng)子熒光素酶構(gòu)建體，并且在血清刺激的NIH3T3細(xì)胞(已在G0同步化)中試驗(yàn)活性。在表2中的數(shù)據(jù)顯示在類似野生型CDF-1結(jié)合存在下，E2F結(jié)合到B-myb啟動(dòng)子的取消會(huì)削弱在G0中的抑制(參見(jiàn)B-C1，2)。這個(gè)觀察強(qiáng)烈地表明E2F而非CDF-1復(fù)合物引起B(yǎng)-myb基因細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄，這與CDF-1對(duì)B-myb啟動(dòng)子比較低的親和力是一致的。相對(duì)地，可以發(fā)現(xiàn)cdc25CCDE的突變(取消CDF-1結(jié)合)也削弱細(xì)胞周期調(diào)節(jié)。同樣地，以B-myb取代cdc25C除去CDF-1結(jié)合以及在G0的抑制(在表2中的C-B4；C-B3，4和D-B3，4，5)。在B-myb啟動(dòng)子背景(B-C4)中攜帶cdc25CCHR的轉(zhuǎn)變構(gòu)建體顯示出中間細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)，即，轉(zhuǎn)錄的去阻遏相對(duì)于野生型B-myb延遲3小時(shí)。2.3.用于按照本發(fā)明的基因治療的基因構(gòu)建體構(gòu)建及應(yīng)用的實(shí)施例選擇的基因構(gòu)建體有下列DNA組分(按下游方向列出，從5’至3’)SV40的啟動(dòng)子/早期增強(qiáng)子區(qū)(核苷酸48至5191；Tooze(ed.)，DNA腫瘤病毒(冷泉港，紐約，紐約，冷泉港實(shí)驗(yàn)室；Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995))，結(jié)合至SEQIDNO1上，后者結(jié)合至序列GCCACC上(Kodak，細(xì)胞生物學(xué)雜志，108，229(1989))，后者結(jié)合至免疫球蛋白的信號(hào)肽的cDNA上(核苷酸序列≤63至≥107；Riechmann等，自然，332，323(1998))，后者結(jié)合至β-葡糖苷酸酶的cDNA上(核苷酸序列≤93至≥1982；Oshima等，PNASUSA84，665(1987))。將基因構(gòu)建體克隆進(jìn)pUC18/19質(zhì)粒載體中?；驑?gòu)建體的不同組分的聯(lián)接經(jīng)由適合的位點(diǎn)制造，該位點(diǎn)通過(guò)PCR擴(kuò)增保存在每個(gè)組分的末端。此外，利用對(duì)選擇的限制位點(diǎn)特異的連接酶。這些連接酶有市售并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道。按照由Lucibello等(EMBO雜志，14，132(1995))描述的方法用上述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HuVEC)。由HuVECs產(chǎn)生的β-葡糖苷酸酶的量通過(guò)利用4-甲基鏾形酮基(methylumbelliferyl)-β-葡糖苷酸作為底物測(cè)量。為了試驗(yàn)細(xì)胞周期特異的特異性，將內(nèi)皮細(xì)胞在G0/G1通過(guò)甲硫氨酸缺乏48小時(shí)同步化。細(xì)胞的DNA含量在用Hoechst33258染色后通過(guò)FACS分析測(cè)量(Lucibello等，EMBO雜志，14，132(1995))。獲得了下列結(jié)果1.相對(duì)于未轉(zhuǎn)染的HuVECs，轉(zhuǎn)染的HuVECs分泌多得多的β-葡糖苷酸酶。2.增殖的HuVECs(DNA＞2S)比在G0/G1中同步化的HuVECs分泌明顯更多的β-葡糖苷酸酶。3.因此，SEQIDNO1導(dǎo)致在用上述的基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的HuVECs中β-葡糖苷酸酶的細(xì)胞周期特異性表達(dá)。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名HoechstAktiengesellschaft(B)街道-(C)城市Frankfurt(D)州-(E)國(guó)家Deutschland(F)郵政編碼(ZIP)65926(G)電話069-305-3005(H)電信069-35-7175(I)電傳41234700(ii)發(fā)明題目用于結(jié)構(gòu)基因的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)表達(dá)的核酸構(gòu)建體(iii)序列數(shù)14(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WordPerfect5.1furMS-DOS(2)關(guān)于SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..20(xi)序列描述SEQIDNO1ACTTGGCGGGAGATTTGAAT20(2)關(guān)于SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..20(xi)序列描述SEQIDNO2GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT20(2)關(guān)于SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..17(xi)序列描述SEQIDNO3AGCAGGTGTTGGGAGGC17(2)關(guān)于SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..41(xi)序列描述SEQIDNO4GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGCAGATAGAGG41(2)關(guān)于SEQIDNO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO5ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAA30(2)關(guān)于SEQIDNO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO6ACTGGGCTGGCGGACTTGTTGAATGGTCAA30(2)關(guān)于SEQIDNO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO7ACTGGGCTGGCGGAAGGTGGTCATGGTCAA30(2)關(guān)于SEQIDNO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO8ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGAAGGTTCAA30(2)關(guān)于SEQIDNO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度30個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..30(xi)序列描述SEQIDNO9ACTGGGCTGGCGGAAGGTTTGACTGGTCAA30(2)關(guān)于SEQIDNO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO10GTAACACAAAGGAATTCAAGC21(2)關(guān)于SEQIDNO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO11GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT20(2)關(guān)于SEQIDNO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO12GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGCTGGCGGAAGGTTTGAAT40(2)關(guān)于SEQIDNO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO13ACTTGGCGGGAGATAGGAAA20(2)關(guān)于SEQIDNO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞啟動(dòng)子(B)位置1..21(xi)序列描述SEQIDNO14GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT權(quán)利要求1.一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含a)至少一種激活物序列；b)至少一種嵌合啟動(dòng)子組件，該組件包含結(jié)合E2F家族的蛋白質(zhì)和CDF-1家族的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；c)至少一種結(jié)構(gòu)基因，其中所說(shuō)的嵌合啟動(dòng)子組件引起細(xì)胞周期中基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)，它比B-myb啟動(dòng)子遲，但比cdc25C啟動(dòng)子早。2.如權(quán)利要求1所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的激活物序列是所說(shuō)的嵌合啟動(dòng)子組件的上游。3.如權(quán)利要求1或2所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的嵌合啟動(dòng)子組件包含至少一種核苷酸序列，該核苷酸序列選自由ACTTGGCGGGA-GATTTGAAT(SEQIDNO1)和GCTTGGCGGGAGGTTTGAAT(SEQIDNO2)組成的組。4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的嵌合啟動(dòng)子組件與所說(shuō)的激活物序列相互作用，其中所說(shuō)的相互作用影響所說(shuō)的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的激活物序列是細(xì)胞特異性的、代謝特異性的或病毒特異性的。6.如權(quán)利要求5所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的細(xì)胞特異性激活物序列在選自由下列細(xì)胞組成的組的細(xì)胞中活化內(nèi)皮細(xì)胞、漿膜細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白血病細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、角化細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。7.如權(quán)利要求5所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的病毒特異性激活物序列是啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列，該啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列來(lái)源于選自由HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、CMV、SV40和HIV組成的組的病毒。8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的結(jié)構(gòu)基因編碼一種酶或者在配體和轉(zhuǎn)化或裂解藥物前體產(chǎn)生藥物的酶之間的一種融合蛋白。9.如權(quán)利要求6至12中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的結(jié)構(gòu)基因編碼一種物質(zhì)，該物質(zhì)選自由下列物質(zhì)組成的組細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子受體、具有抗增殖作用的蛋白質(zhì)、具有編程性細(xì)胞死亡作用的蛋白質(zhì)、具有細(xì)胞抑制作用的蛋白質(zhì)、具有細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)、具有炎性作用的蛋白質(zhì)、具有抗炎作用的蛋白質(zhì)、具有免疫抑制作用的蛋白質(zhì)、抗體、抗體片段、血管生成抑制劑、凝固因子、纖維蛋白溶解化合物和抗凝劑、血液蛋白質(zhì)、病毒抗原、細(xì)菌抗原和腫瘤抗原以及在配體和上述物質(zhì)之一之間的融合蛋白。10.如權(quán)利要求8或9中所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的配體選自由生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子以及抗體組成的組。11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的核酸是DNA。12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說(shuō)的構(gòu)建體在5’-3’方向包含下列組分結(jié)合到包含序列ACTTGGCGGGAGATTTGAAT(SEQIDNO1)的DNA片段上的SV40的啟動(dòng)子/早期增強(qiáng)子區(qū)的核苷酸48至5191，所說(shuō)的含SEQIDNO1的DNA片段結(jié)合到編碼免疫球蛋白的信號(hào)肽的核苷酸63至107上，而后者結(jié)合到β-葡糖苷酸酶的cDNA的核苷酸93至1982上。13.一種載體，該載體包含如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體。14.在權(quán)利要求13中所要求的載體，其中所說(shuō)的載體是非病毒載體。15.在權(quán)利要求13中所要求的載體，其中所說(shuō)的載體是病毒載體。16.一種細(xì)胞，該細(xì)胞包含如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體或如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所要求的載體。17.一種用于制備如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體或如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所要求的載體的方法，其中分步連接所說(shuō)的構(gòu)建體的元件。18.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所要求的核酸構(gòu)建體或如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所要求的載體在制備藥物上的用途，該藥物用于治療腫瘤疾病、白血病、心血管疾病、炎癥反應(yīng)、自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、牛皮癬病、移植器官的即將發(fā)生的排斥、CNS破壞、傳染病、血液凝固病癥和/或慢性病毒感染。19.可由下列步驟獲得的CDF-1蛋白質(zhì)(a)從HeLa細(xì)胞制備核提取物，和(b)通過(guò)在包含CDE-CHR序列基元的寡核苷酸存在下的親和色譜法純化步驟(a)的提取物。20.按照權(quán)利要求19的CDF-1蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的CDE-CHR序列基元包含序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAAT。21.按照權(quán)利要求19的CDF-1蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的CDE-CHR序列基元包含序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGCTGGCGGAAGGTTTGAAT。22.按照權(quán)利要求19-21中任一項(xiàng)的CDF-1蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的寡核苷酸與瓊脂糖偶聯(lián)。23.按照權(quán)利要求19-22中任一項(xiàng)的CDF-1蛋白質(zhì)，其中所說(shuō)的核提取物通過(guò)HeLa細(xì)胞的鹽提取制備。24.按照權(quán)利要求19-23中任一項(xiàng)的CDF-1蛋白質(zhì)在鑒定CDF-1的抑制劑或刺激劑上的用途。全文摘要本發(fā)明涉及一種核酸構(gòu)建體以及蛋白質(zhì)CDF－1,所說(shuō)的核酸構(gòu)建體包含至少一種激活物序列、至少一種嵌合啟動(dòng)子組件(該組件包含結(jié)合E2F家族的蛋白質(zhì)和CDF－1家族的蛋白質(zhì)的核苷酸序列)、至少一種結(jié)構(gòu)基因,其中所說(shuō)的嵌合啟動(dòng)子組件引起細(xì)胎周期中基因表達(dá)的正調(diào)節(jié),它比B－myb啟動(dòng)子遲,但比cdc25C啟動(dòng)子早。文檔編號(hào)C12N15/09GK1197077SQ9810692公開日1998年10月28日申請(qǐng)日期1998年2月17日優(yōu)先權(quán)日1997年2月18日發(fā)明者R·穆勒,N·劉,J·威克爾,H－H·塞德拉克申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司