專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)方法。具體而言，本發(fā)明涉及一種從鹿茸中分離細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)化培養(yǎng)技術(shù)和方法。
背景技術(shù)：
：自從1985年以來(lái)，我國(guó)學(xué)者及有關(guān)研究單位，用現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)試驗(yàn)手段作了許多專(zhuān)題研究工作檢試鹿茸的藥理作用，尋找藥化活性物質(zhì)，闡明了鹿茸的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理，確認(rèn)具有抗疲勞、促生長(zhǎng)、抗衰老強(qiáng)壯作用。1、氨基酸作為蛋白質(zhì)的組成成分在滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥中占一定地位，研究測(cè)出鹿茸含有17種以上游離氨基酸，包括7種人體必需氨基酸和2種半必需氨基酸，尤以?；撬岷可醺摺５诼谷撞煌课缓邪被岱N類(lèi)和數(shù)量差異較大。2、微量元素至少含17種，磷、鈣豐富。3、多胺是鹿茸中刺激蛋白質(zhì)、RNA、DNA合成的重要活性物質(zhì)，多胺有腐胺(Putrescine)、精脒(Spermindine)、精胺(Spermine)三種，鹿茸不同部位含量不同，茸尖含量最多，茸根部甚少。鹿茸氨基酸測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>4、核酸堿基成分，從鹿茸的沸水抽出的正丁醇溶性部分，得到次黃嘌呤(hypoxantnine)抗衰老活性物質(zhì)。5、脂質(zhì)類(lèi)鹿茸中含有大量滋養(yǎng)神經(jīng)組織的脂類(lèi)物質(zhì)。將梅花鹿茸生藥粉末分別用水，55%乙醇和70%乙醇抽出，各抽出物再分別用乙醚、正丁醇依次抽出得到A、B、C三部分。從正丁醇溶性部分用HPLC法測(cè)出次黃嘌呤。從醚溶性組分分離出雌二醇、17B孕酮、睪丸酮。另外，分離出滋補(bǔ)神經(jīng)組織的成分有蛋白脂質(zhì)(Proteolipids)卵磷脂(lec池in)、腦磷質(zhì)(Cephalen)、神經(jīng)節(jié)苷脂(genglioside)、糖質(zhì)(glycolipid)等15種之多。6、酶類(lèi)有過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶。7、糖類(lèi)用抗補(bǔ)體模型，從乙醇抽出殘?jiān)?，再?jīng)熱水抽出等得到活性多糖A—2，它與硫酸軟骨素相似、活性更強(qiáng)。對(duì)鹿茸藥化分析測(cè)定的新成果不再列舉，各方面研究顯示出鹿鶯是貴重的藥物寶庫(kù)，其藥用價(jià)值現(xiàn)已被世人所公認(rèn)。但是鹿茸不便分析提取難以制出精品藥物。特別是生產(chǎn)數(shù)量有限，價(jià)格不低，鹿茸很難進(jìn)入普通家庭。茸尖臘層高效部位更顯稀少、珍貴。這些現(xiàn)實(shí)問(wèn)題有待于新的突破。本發(fā)明詳細(xì)描述長(zhǎng)命百歲、延年益壽是人類(lèi)美好的夢(mèng)想，歷史和科學(xué)的局限性，讓與之奮斗者難以美夢(mèng)成真。生物技術(shù)誕生，生命科學(xué)的迅猛發(fā)展，超極限的提高人的生命力，己有可能。提高機(jī)體器官功能，促進(jìn)代謝產(chǎn)生能量，戰(zhàn)勝和恢復(fù)疲勞，修復(fù)損傷提高再生能力，在不斷科技創(chuàng)新中都將成為可能。經(jīng)過(guò)10余年的探索，我們實(shí)現(xiàn)了采藥尋寶計(jì)劃。摘取鹿茸角尖部生茸細(xì)胞用細(xì)胞反應(yīng)罐大規(guī)模生產(chǎn)鹿茸活性物質(zhì)獲得成功。研究檢試鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物所含活性物質(zhì)和藥理作用，均與鹿茸一致，經(jīng)專(zhuān)家鑒定得到完全肯定，認(rèn)為兩者相同或相似，替代鹿茸可用于保健品。鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)鹿茸物質(zhì)是生產(chǎn)方式的改革。由摘取鹿茸細(xì)胞開(kāi)始到完成大規(guī)模培養(yǎng)乃致達(dá)到細(xì)胞反應(yīng)罐生產(chǎn)是由多項(xiàng)新技術(shù)應(yīng)用，組成一套綜合工程項(xiàng)目和規(guī)范化生產(chǎn)工藝。本發(fā)明技術(shù)方案如下1、細(xì)胞種子選擇懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞源于東北長(zhǎng)白山梅花鹿或馬鹿，從百頭以上的種群中挑選3-7周歲健康強(qiáng)壯的質(zhì)量突出的個(gè)體，檢疫無(wú)疾病。在最佳生長(zhǎng)時(shí)期，從二杠或三杈採(cǎi)取原始材料，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。2、建立細(xì)胞庫(kù)在GMP條件下將種原細(xì)胞做靜態(tài)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，經(jīng)嚴(yán)格選拔，找出理想者大量增殖，做不同代數(shù)觀察和保存，符合標(biāo)準(zhǔn)者存入細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)備用。3、懸浮培養(yǎng)購(gòu)入美國(guó)細(xì)胞反應(yīng)罐(1.5L，10L)灌注種細(xì)胞、攪拌培養(yǎng)，向細(xì)胞生長(zhǎng)液調(diào)節(jié)氣體、PH、溫度等給予適宜條件，待生長(zhǎng)達(dá)到最佳數(shù)量時(shí)多次灌注液體和分批收獲。4、收獲良好生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞達(dá)到數(shù)量要求時(shí)，收集后取樣質(zhì)量檢驗(yàn)。在低溫條件下保存。5、品質(zhì)檢查光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)呈前成軟骨細(xì)胞狀。超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞核完整核膜清晰，線粒體和內(nèi)織網(wǎng)量較高，細(xì)胞表面有纖突，活力好，生命力強(qiáng)，證明有繁衍能力。體積與原鹿茸細(xì)胞基本相同。人工培養(yǎng)鹿茸細(xì)胞細(xì)胞染色體檢査原代及傳代細(xì)胞的染色體數(shù)量呈二倍體或一部分呈亞二倍體、超二倍體。與梅花鹿體細(xì)胞相同。實(shí)施例1種子細(xì)胞獲取及建立懸浮培養(yǎng)鹿茸細(xì)胞系(株)中國(guó)梅花鹿、馬鹿，年齡215歲所生長(zhǎng)的初角、二杠、三杈鮮活鹿茸，從鹿茸的生長(zhǎng)(生發(fā))部位間充質(zhì)層摘取種源組織細(xì)胞。方法為以無(wú)菌手術(shù)機(jī)械法切割鹿茸組織，使其成為細(xì)小組織塊，置入生長(zhǎng)液在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收集足夠的單層細(xì)胞，再以攪動(dòng)式培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。攪拌速度每35天傳代一次，連續(xù)傳代2040次(或以上)細(xì)胞量達(dá)106/！111。實(shí)施例2鹿茸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法使用(乃至30L)細(xì)胞培養(yǎng)罐配合中空纖維柱構(gòu)成細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)。培養(yǎng)罐工作體積1.2L，培養(yǎng)條件要求37。C，pH7.1，60-80rpm轉(zhuǎn)速，溶解氧50%、空氣飽和通氣量0.1Lpm。鹿茸細(xì)胞接種濃度為1.10X104，經(jīng)過(guò)靜止期細(xì)胞培增，第5天達(dá)6.4X105，第5天開(kāi)始連續(xù)灌注新培養(yǎng)基，灌注率每天0.92，第9天細(xì)胞數(shù)由降低又回升到4.0X105/1111。隨著細(xì)胞數(shù)不斷增加，逐步增加灌注量，第12天從培養(yǎng)罐中直接排出1.2L細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞可達(dá)1.4X101Q/ml。在培養(yǎng)罐中留下0.2L細(xì)胞懸液，補(bǔ)充1.2L新培養(yǎng)基，繼續(xù)灌注連續(xù)培養(yǎng)將灌注率從0.92逐漸提高到3.08。在第21天活細(xì)胞濃度又達(dá)到1.04X107,此時(shí)，再次排放1.2L懸液收集到活細(xì)胞1.30X10,剩的懸液進(jìn)入第3周期培養(yǎng)(灌注率為3.85)，第29天細(xì)胞又可達(dá)到1.02X107，每7天收獲1次。實(shí)施例3鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)基配方:MEM(JORLIK改良MEM)基礎(chǔ)液，補(bǔ)充1.5g/L葡萄糖，O.Olmmol/L非必須氨基酸，510%小牛血清。實(shí)施例4鹿茸細(xì)胞純化將所獲細(xì)胞懸液稱(chēng)量(稱(chēng)重)1000rpm離心5-10分鐘，傾上清，加PBS洗后離心稱(chēng)重，分裝凍存于一4(TC。實(shí)施例5鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物氨基酸及微量元素測(cè)定用氨基酸自動(dòng)分析儀，從人工培養(yǎng)物中檢出17種以上氨基酸包括7種人體必需氨基酸和2種人體半必需氨基酸，一般高于鹿茸含量，總量高于鹿鶯。使用原子分光光度計(jì)檢測(cè)了微量元素，被檢的7種微量元素分別是Co、Ni、Mn、Cr、Zn、Cu、Fe各微量元素均高于鹿茸，其中Fe、Mn、Co、Cu尤為突出。實(shí)施例6鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物蛋白質(zhì)測(cè)定鹿茸含氮量為7.9%，鹿茸培養(yǎng)物為6.03%，鹿鶯含蛋白質(zhì)49.35%，鹿茸培養(yǎng)物蛋白質(zhì)含量為37.67%，兩者相似或略低。實(shí)施例7鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物總糖用酚一硫酸法和DNS法測(cè)鹿茸總糖量為0.544%，鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物總糖含量則為1.433%比鹿茸高三倍總糖測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>據(jù)報(bào)道鹿茸多糖腹腔注射100mg/kg的抗炎作用，相當(dāng)于30mg/kg強(qiáng)地松作用。可見(jiàn)鹿茸多糖對(duì)炎癥確有抑制作用。實(shí)施例8鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物有機(jī)磷測(cè)定兩者主要含有機(jī)磷，僅有少量無(wú)機(jī)磷，總磷量低于鹿茸。實(shí)施例9鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物多胺含量檢測(cè)用高效液相色譜法，以乙二胺為內(nèi)標(biāo)對(duì)鹿茸培養(yǎng)物及鹿茸中的多胺含量進(jìn)行測(cè)定。由于多胺是2個(gè)或2以上氨基或亞氨基長(zhǎng)鏈脂肪組化合物，為便于測(cè)定釆用了酰衍生法，使成為高消光物質(zhì)的苯甲酸衍生物。檢試結(jié)果，鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物中的多胺含量遠(yuǎn)高于鹿茸。三種物質(zhì)中腐胺含量最多，精脒次之，精胺含量雖比前二種較少，也可超出鹿茸含量10倍。見(jiàn)表多胺含量測(cè)定(CnM/g)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>多胺是一類(lèi)活性較強(qiáng)的生理活性物質(zhì)，大量分布于鹿茸生長(zhǎng)帶的組織細(xì)胞中，特別是生長(zhǎng)活躍的鹿茸母細(xì)胞濃度更高。多胺不僅對(duì)RNA、DNA及蛋白質(zhì)的代謝有重要影響，而且腐胺能夠促進(jìn)組織生長(zhǎng)，損傷組織再生和修復(fù)，改變體內(nèi)代謝狀態(tài)及炎癥的病理過(guò)程均有密切關(guān)系。是鹿茸和鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)物最具代表性的活性物質(zhì)。權(quán)利要求1.一種鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)方法，優(yōu)選為梅花鹿。其特征為采用鹿茸細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以獲取更多的鹿茸細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹿茸細(xì)胞，其特征在于來(lái)源于梅花鹿以及馬鹿的二杠茸。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹿茸細(xì)胞是以無(wú)菌手術(shù)機(jī)械法切割鹿茸組織，使其成為細(xì)小組織塊，置入生長(zhǎng)液在培養(yǎng)箱培養(yǎng)，收集足夠的單層細(xì)胞，再以攪動(dòng)式培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。攪拌速度每35天傳代一次，連續(xù)傳代2040次所得。4.按權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)是調(diào)節(jié)鹿茸細(xì)胞生長(zhǎng)液中氣體、pH、溫度等適宜條件，待生長(zhǎng)達(dá)到最佳數(shù)量時(shí)多次灌注液體和分批收獲。5.按權(quán)利要求1所述的懸浮培養(yǎng)鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)基配方MEM(JORLIK改良MEM)基礎(chǔ)液，補(bǔ)充1.5g/L葡萄糖，0.01mmol/L非必須氨基酸，510%小牛血清。6.按權(quán)利要求1所述的鹿茸細(xì)胞純化將所獲細(xì)胞懸液稱(chēng)量(稱(chēng)重)1000rpm離心5-10分鐘，傾上清，加PBS洗后離心稱(chēng)重，分裝凍存于一40°C。全文摘要本發(fā)明一種鹿茸細(xì)胞培養(yǎng)方法，提供一種采用Celligen細(xì)胞培養(yǎng)罐進(jìn)行鹿茸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，規(guī)?；a(chǎn)富含多種活性物質(zhì)、能夠替代鹿茸組織的鹿茸母細(xì)胞。其生產(chǎn)周期為7天，細(xì)胞濃度可達(dá)1.04×10⁷/ml，可連續(xù)高密度培養(yǎng)。細(xì)胞可用于保健品生產(chǎn)。具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。文檔編號(hào)C12N5/06GK101265463SQ20071006448公開(kāi)日2008年9月17日申請(qǐng)日期2007年3月16日優(yōu)先權(quán)日2007年3月16日發(fā)明者申大為,鄭海發(fā),偉高申請(qǐng)人:鄭海發(fā);高偉