專利名稱：：一種檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒及其應(yīng)用。技術(shù)背景乳腺癌是人類最常見的一種惡性腫瘤，為女性主要惡性腫瘤之一。世界各國(guó)因地理環(huán)境、生活習(xí)慣的不同，乳腺癌的發(fā)病率有很大差異，北美和北歐的大多數(shù)國(guó)家為高發(fā)區(qū)，南美和南歐一些國(guó)家為中等，亞洲、拉丁美洲和非洲的大多數(shù)國(guó)家為低發(fā)區(qū)。在北美、兩歐等發(fā)達(dá)國(guó)家，女性乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，美國(guó)每年有12萬乳腺癌新發(fā)病例，發(fā)病率為72.2/10萬。我國(guó)雖屬世界上女性乳腺癌的低發(fā)區(qū)，但近年來乳腺癌的發(fā)病率明顯增高。我國(guó)各地區(qū)乳腺癌的發(fā)病率也不相同，滬、京、津及沿海地區(qū)是我國(guó)乳腺癌的高發(fā)地區(qū)。2006年我國(guó)乳腺癌發(fā)病率為52/10萬，居女性惡性腫瘤中的第一位。乳腺癌的治療方法有多種，如外科手術(shù)切除、放射治療、化學(xué)治療等。目前，手術(shù)切除為乳腺癌綜合治療方法中的首選，然而在手術(shù)切除技術(shù)已達(dá)到相當(dāng)成熟和普及的同時(shí)，乳腺癌切除后的高復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率已成為阻礙乳腺癌患者生存期提高的主要原因。手術(shù)前乳腺癌細(xì)胞由于自然或侵襲性醫(yī)源性因素脫落至外周血并隨血轉(zhuǎn)移至乳腺外，形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞，但是由于受檢測(cè)方法靈敏度及特異性較低的限制，該微量的癌細(xì)胞未能被檢測(cè)到，這些癌細(xì)胞隨血液到達(dá)外周組織并處于休眠狀態(tài)，當(dāng)患者機(jī)體免疫功能下降時(shí)，如大手術(shù)或移植后應(yīng)用抗排斥免疫抑制劑等，休眠的癌細(xì)胞就有可能被激活，隨血液循環(huán)返回到乳腺，并在乳腺內(nèi)恢復(fù)增殖，從而導(dǎo)致了乳腺癌的復(fù)發(fā)。腫瘤的轉(zhuǎn)移是臨床治療的一大難題，也是腫瘤致死的一個(gè)重要原因。目前，腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)現(xiàn)和確定，主要根據(jù)影像學(xué)(X光片、CT、磁共振、PET等)或病理形態(tài)來診斷。影像學(xué)檢查中，病灶或轉(zhuǎn)移灶需要形成一定大小才能夠被儀器成像和有效分辨；病理形態(tài)檢查中，需要取到合適的檢測(cè)標(biāo)本，且有相當(dāng)數(shù)量可觀察到的腫瘤細(xì)胞存在。因此，無論是影像學(xué)診斷還是病理學(xué)診斷，都是腫瘤形成及轉(zhuǎn)移后晚期、存在大量惡變細(xì)胞積累的階段，如果在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的早期，能夠發(fā)現(xiàn)并確定其轉(zhuǎn)移，則可以指導(dǎo)臨床治療方案的設(shè)計(jì)，并提供有力的預(yù)后依據(jù)。血行播散是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，所以在腫瘤患者外周血中進(jìn)行腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)、腫瘤特異性標(biāo)記產(chǎn)物檢測(cè)是了解腫瘤轉(zhuǎn)移情況的一種有效方法，對(duì)腫瘤形成及轉(zhuǎn)移的診斷具有極大的幫助，但是在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期，外周血中的腫瘤細(xì)胞一般很少，無法完全依賴病理形態(tài)檢查，未形成轉(zhuǎn)移灶或轉(zhuǎn)移灶未達(dá)到一定體積時(shí)，影像學(xué)診斷也無能為力，因此，循環(huán)血中的微量腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)和一些特異性產(chǎn)物檢測(cè)的研究，引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。外周血中腫瘤特異性基因mRNA的定量測(cè)定，有利于腫瘤的早期診斷，治療方案的確定以及預(yù)后的判斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)外周血中微量腫瘤細(xì)胞己成為可能并被嘗試。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。目前常用的T叫man熒光探針為寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，故檢測(cè)不到熒光；在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5，-3，外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。在PCR擴(kuò)增過程中，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后檢測(cè)一次熒光強(qiáng)度，整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后，便可得到一條工作曲線，根據(jù)該曲線可對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種能夠準(zhǔn)確定量mRNA的檢測(cè)方法，通過檢測(cè)腫瘤特異性基因mRNA的表達(dá)以判斷循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在。人乳腺球蛋白(Humanma腿aglobin，hMAM)基因，由WatsonMA等利用mRNA差異顯示技術(shù)分離得出，位于llql2-q13，cDNA全長(zhǎng)503bp，其中開放閱讀框279bp，編碼93個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量IO.5kD。大量研究結(jié)果顯示，hMAM基因只在成人乳腺中表達(dá)，其他組織器官不表達(dá)，在原發(fā)性乳腺癌中過度表達(dá)，正常人外周血hMAMmRNA呈陰性；游離于細(xì)胞外的mRNA很不穩(wěn)定，極易被RNA酶解，故在外周血中若測(cè)得hMAMmRNA，則提示血循環(huán)中存在有完整的乳腺癌細(xì)胞。(WatsonMA，F(xiàn)lemingTP.Mammaglobin，amammary-specificmemberoftheuteroglobingenefamily,isoverexpressedinhumanbreastcancer.CancerRes，1996，56(4):860-865-GalS，F(xiàn)idlerC，LoYM，etal.DetectionofmammaglobinmRNAintheplasmaofbreastcancerpatients.AnnNYAcadSci，2001，945:192-194.)。因此，hM層mRNA是一項(xiàng)較好的血源性乳腺癌細(xì)胞的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。檢測(cè)乳腺癌患者骨髓及血中的hM層mRNA對(duì)判斷乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，治療效果評(píng)價(jià)及病情的動(dòng)態(tài)觀察具有重要意義，但目前尚沒有合適的陽性率高的檢測(cè)技術(shù)，例如韓正祥等應(yīng)用普通的RT-PCR檢測(cè)乳癌患者外周血hMAMmRNA的表達(dá)，陽性率僅為30.8%(16/52)，乳腺良性疾病患者和健康人對(duì)照組均為陰性(韓正祥，張敬川.hMAMmRNA和CEAmRNART-PCR檢測(cè)乳腺癌外周血微轉(zhuǎn)移.中國(guó)腫瘤臨床，2004，31(21):1235-1239.);普通的RT-PCR檢測(cè)只能對(duì)乳腺癌患者外周血hMAMmRNA的表達(dá)進(jìn)行定性檢測(cè)，不能進(jìn)行定量分析。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒，含有一對(duì)引物和探針。上述試劑盒中，所述引物對(duì)的一個(gè)引物的核苷酸序列是序列表中序列l(wèi)，另一個(gè)引物的核苷酸序列是序列表中序列2。上述試劑盒中，所述探針的核苷酸序列是序列表中序列3。所述試劑盒中還可包括進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR所需的試劑，這些試劑均可從商業(yè)途徑得到。上述檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的方法。上述檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的方法為利用上述檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒和方法，可準(zhǔn)確定量待測(cè)標(biāo)本中人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒和方法可用于臨床及科研中，可對(duì)腫瘤患者的外周血、骨髓中hM扁raRNA的表達(dá)情況進(jìn)行定性及定量分析，對(duì)判斷乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，評(píng)價(jià)治療效果及動(dòng)態(tài)觀察病情具有重要意義。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。圖l為標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果圖2為標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量檢測(cè)試劑盒的制備試劑盒中各組分為(一)細(xì)胞裂解液I;(二)細(xì)胞裂解液II;(三)RNA洗滌緩沖液I;(四)RNA洗滌緩沖液II;(五)無RNA酶的水；(六)RNA分離柱；(七)收集管；(八)PCR管；(九)DNA酶I儲(chǔ)存液；(十)反轉(zhuǎn)錄緩沖液；(十一)dNTP混合物；(十二)逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液；(十三)PCR反應(yīng)液和探針；(十四)尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)儲(chǔ)存液；(十五)標(biāo)準(zhǔn)品；(十六)對(duì)照品(包括陽性對(duì)照品和陰性對(duì)照品)。上述各組分的組成或制備如下(一)細(xì)胞裂解液I溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)0.lmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、0.lmol/L氯化鈉和0.05mol/L氯化鎂。溶劑是水。細(xì)胞裂解液I在25'C條件下，pH值為7.6。(二)細(xì)胞裂解液II溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)3raol/L異硫氰酸胍、2mol/L鹽酸胍、0.3raol/L醋酸鈉、0.2%十二烷基硫酸鈉。溶劑是水。細(xì)胞裂解液n在25'C條件下，pH值為5.2。(三)RNA洗滌緩沖液I溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)..0.2mol/L醋酸鈉、0.lmol/L氯酸鈉、0.lmol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸。溶劑是水。RNA洗滌緩沖液I在25"C條件下，pH值為7.6。(四)RNA洗滌緩沖液II溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)1.2mol/L檸檬酸鈉、0.511101幾三羥甲基氨基甲垸-鹽酸。溶劑是水。RNA洗滌緩沖液II在25t條件下，pH值為7.5。(五)無RNA酶的水向去離子水中加入焦碳酸二乙酯(DEPC)(購(gòu)自Biobasic公司)，至終濃度為0.05%，22-25。C放置10-12小時(shí)后，121。C高壓滅菌20分鐘，22-25。C放置備用。(六)RNA分離柱購(gòu)于安徽優(yōu)晶生物工程有限公司。(七)收集管購(gòu)于安徽優(yōu)晶生物工程有限公司。(八)PCR管購(gòu)于美國(guó)AppliedBiosystems(ABI)公司。(九)DNA酶I儲(chǔ)存液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)50mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、25ramol/L三羥甲基氨基甲烷-乙酰、12.5mmol/L氯化鎂、5.5mmol/L氯化鈣、25%甘油、0.5U/u1DNA酶I。溶劑是水。DNA酶I儲(chǔ)存液在25。C條件下，pH值為7.5。(十)反轉(zhuǎn)錄緩沖液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)9.1umol/L01igo(dT)12—18(TaKaRa)、3.6U/u1RNA酶抑制劑、72.7mmol/L二硫蘇糖醇(Invitrogen)、182mmol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸、273mmol/L氯化鉀、11誦ol/L氯化鎂。溶劑是水。反轉(zhuǎn)錄緩沖液在25'C條件下，pH值為8.3。(H^—)dNTP混合物含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，為其鈉鹽-水溶液，25。C條件下，pH值為7.0-7.5，四種dNTP濃度終濃度均為10mmol/L。如dATP為脫氧腺苷三磷酸，磷酸上的三個(gè)氫中的一個(gè)或兩個(gè)被鈉所取代，便形成了鈉鹽。其他幾種也是如此，即dNTP是以鈉鹽形式存在的。(十二)逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鈉、0.1mmol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫蘇糖醇(Invitrogen)、50%甘油、0.01%Nonidetp-40、200U/ul逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)。溶劑是水。逆轉(zhuǎn)錄酶在25'C條件下，pH值為7.5。(十三)PCR反應(yīng)液和探針1、PCR反應(yīng)液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)18.5腿ol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、2,78mmol/L氯化鎂、92.6畫1/L氯化鉀、0.37umol/L上下游引物、0.1U/u1Taq酶(TaKaRa)、400nmol/LdATP、400nmol/LdCTP、400nmol/LdGTP、400nmol/LdTTP。溶劑是水。PCR反應(yīng)液在25"C條件下，pH值為8.3。上述引物為Pl(上游引物)5，-TGAAGTTGCTGATGGTCCTCAT-3'(SEQIDNO:1)，P2(下游引物)5，-TCAGTCTTAGACACTTGTGGATTGATT-3，(SEQIDNO:2)。引物可溶于TE溶液中(TE溶液的組成為10mraol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸，lmmol/L乙二胺四乙酸，水)。2、探針探針序列為5，-FAM-AGCACTGCTACGCAGGCTCTGGCT-TAMRA-3，(SEQIDN0:3)。探針可溶于TE溶液中(TE溶液的組成為10mmol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸，l畫ol/L乙二胺四乙酸，水)，探針的濃度為2umol/L。上述引物和探針是以hMAM全長(zhǎng)cDNA序列(GenBank登錄號(hào)為NM_002411.1)為模板，使用ABI7000型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件分析TaqMan引物和探針位點(diǎn)，同時(shí)考慮hMAM基因組DNA序列情況，從中選擇最佳組合得到的。上述引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。(十四)尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)儲(chǔ)存液溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)50%甘油、30mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、150ramol/L氯化鈉、1.0誦ol/L乙二胺四乙酸、1.0mmol/L二硫蘇糖醇(Invitrogen)、0.05%Tween20、1U/y1尿嘧啶DNA糖基化酶。溶劑是水。UNG酶儲(chǔ)存液在25"C條件下，pH值為7.5。(十五)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品為終濃度為2X108拷貝數(shù)/y1的pMD18-力鵬i/7i7重組質(zhì)粒，TE溶液溶解(TE溶液的組成為10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，l腿ol/L乙二胺四乙酸，水)。標(biāo)準(zhǔn)品中插入的力#1片段(名稱為iWAWi7)的DNA序列如序列表中SEQIDNO:4所示。1、細(xì)胞總RNA的提取1)將人乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基(Gibco公司)按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)。2)將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶(質(zhì)量百分含量)消化，1000rpm離心收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，每管約1X1()6個(gè)細(xì)胞。3)提取細(xì)胞總RNA，具體過程如下①往沉淀的細(xì)胞中加入650u1細(xì)胞裂解液II(向細(xì)胞裂解液II中加入2-巰基乙醇，加入量為每lmL細(xì)胞裂解液II加入20"1濃度為14.5mol/L的2-巰基乙醇，分裝2-巰基乙醇要在通風(fēng)櫥下進(jìn)行)，漩渦振蕩充分混勻。②再加入650ix1的70%乙醇，漩渦振蕩混勻。③把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分離柱內(nèi)，10000g離心1分鐘，棄去流出液體并繼續(xù)進(jìn)行步驟③的操作。④向DNA酶I儲(chǔ)存液管中加入400"1無RNA酶的水，混勻、短暫離心收集，吸取45ul該液體直接加到RNA分離柱濾膜上，室溫放置15分鐘。⑤吸取700ulRNA洗滌緩沖液I加入到RNA分離柱上洗滌柱子，10000g離心l分鐘，棄去2mL收集管。⑥將RNA分離柱固定于另一新的2mL收集管上，加入500p1經(jīng)稀釋的RNA洗滌緩沖液II(RNA洗滌緩沖液II在使用前，每3mL加入12mL無水乙醇)，10000g離心1分鐘，棄去流出液，該收集管可重復(fù)使用。⑦再用500"1的RNA洗滌緩沖液II洗滌柱子，離心并棄去流出液。然后12000g離心1分鐘，甩干RNA分離柱基質(zhì)。⑧把柱子轉(zhuǎn)移到無RNA酶的1.5ml離心管，加入50y1無RNA酶的水，確保加入的無RNA酶的水直接加在柱基質(zhì)上，10000g離心l分鐘，洗脫RNA。將裝有RNA溶液的離心管置于冰盒上，備用。2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將dNTP混合物及逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液加入反轉(zhuǎn)錄緩沖液中配制成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶儲(chǔ)存液、反轉(zhuǎn)錄緩沖液的體積比為2:1:11)，混勻，短暫離心，置于冰盒上備用，使用后剩余的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液可于-2(TC冰箱中保存。反轉(zhuǎn)錄體系為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3.5ul、總RNA溶液4.Oul、無RNA酶的水2.5ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42°C，15分鐘一95°C，5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取出離心管置于冰盒上。3、PCR擴(kuò)增用TaKaRa公司的普通PCR擴(kuò)增試劑盒，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)體系為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5ul、10XPCR緩沖液5.0ul、dNTP混合物4.0ul、上、下游引物(Pl、P2)各2.0ul、Taq酶O.5ul、水31.5ul。PCR反應(yīng)條件為先94X:、3分鐘一再94。C、30秒，6CTC、45秒，72°C、50秒，共35個(gè)循環(huán)一最后72'C、7分鐘。4、vWAWi7擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得1)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2X瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切取含121bp目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，用紙巾擦干后，切碎，稱重，按照100mg^00ul的比例確定膠的體積。2)用DNA凝膠回收試劑盒(購(gòu)自上海英俊生物技術(shù)有限公司)回收擴(kuò)增產(chǎn)物①按照試劑盒說明書中的比例在回收膠中加入DE-A液，6(TC加熱至完全熔化。②加入0.5倍體積于DE-A液的DE-B液，混勻；加入異丙醇，使其終濃度為20%。③將上述液體轉(zhuǎn)入制備管中，5500rpm離心1分鐘，棄濾液。④加入0.5mL緩沖液Wl后，5500rpm離心1分鐘，棄濾液。加入0.7mL緩沖液W2，5500rpm離心1分鐘，棄濾液。⑥再加入0.7mL緩沖液W2，5500rpm離心1分鐘，棄濾液;12000rpm，離心1分鐘，以甩干濾膜基質(zhì)。⑦將制備管置于新的1.5mL離心管中，在濾膜中央加入25nl水，室溫靜置l分鐘后，12000rpm，離心1分鐘洗脫DNA。5、力J饑WW的克隆及鑒定1)重組載體的構(gòu)建①10u1體系中，力口入ly1T載體(pMD18-TVector)(TaKaRa)，4u1DNA樣品，加入5nl連接緩沖液(100鵬ol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、15mmol/L氯化鎂、1.0mmol/L三磷酸腺苷、20mmol/L二硫蘇糖醇(Invitrogen)、1U/u1麗A連接酶。連接緩沖液在25'C條件下，pH值為7.5。)，16。C反應(yīng)14小時(shí)。②取5!il連接產(chǎn)物，加入到100ul大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)菌中，混勻后冰浴40分鐘，置于42'C水中熱休克90秒，冰浴2分鐘。③加入無抗生素的LB培養(yǎng)基400p1，于37r搖床上以150rpm的速度混合振搖45分鐘后，將離心管中液體均勻地涂布于LA平板上，37T:平放20分鐘后，倒置培養(yǎng)12小時(shí)。2)重組載體的鑒定①觀察LA平板上的菌落，隨機(jī)挑取長(zhǎng)得較好的菌落，分別轉(zhuǎn)至裝有5mLLA培養(yǎng)基的大試管中，編號(hào)后置37。C搖床中，250rpm，振搖8-14小時(shí)左右，至0D6。。"0,4。②取1.5mL培養(yǎng)物至離心管中，4°C，11000rpm離心30秒，棄盡上清液。③100u1預(yù)冷的裂解液I(500mraol/L葡萄糖，25ramol/LTris.Cl(pH8.0，25°C)，10mmol/LEDTA(pH8.0，25°C)，水)重懸沉淀，劇烈振蕩混勻后加入200n1新配制的裂解液II(200鵬o1/1NaOH，1%SDS，水)，混勻后，冰浴3分鐘，再加入150iU預(yù)冷的裂解液in(3mol/L醋酸鉀；pH5.2，25°C)，顛倒混勻后冰浴3-5分鐘；4°C，11000rpm離心5分鐘后將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。④加入等體積的酚/氯仿(l:l)，振蕩后4。C，11000rpm離心2分鐘，再將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管。⑤加入l/10體積的3MNaAc溶液和2.5倍無水乙醇，混勻后，室溫靜置10分鐘，4°C，11000rpm離心IO分鐘后棄上清。⑥加入lmL70X乙醇，振蕩漂洗后4。C，11000rpm離心2分鐘；棄去上層液體。⑦加入少量無水乙醇，4°C，11000rpm離心2分鐘，棄去乙醇后，室溫倒置10分鐘，加入30u1蒸餾水溶解質(zhì)粒DNA。⑧取適量的質(zhì)粒DNA作為模板，在引物P1和P2的引導(dǎo)下，進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增出151bpDNA片段的為陽性克隆質(zhì)粒，從而篩選出目的菌落。3)力v^J/7i7擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定①質(zhì)粒的大量抽提A)取lraL含目的菌落的菌液，加入到30mLLA培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至OD,約為0.6。B)取25mL上述菌液接種至300mLLA培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)10-14小時(shí)，然后4"C，4500rpm，20分鐘離心收菌。C)用200mL預(yù)冷的STE(10mmol/LTris-HC1(PH8.0，25°C)，0.lraol/LNaCl，l腿ol/LEDTA(PH8.0，25°C)，水)重懸菌體，4°C，4500rpm，20分鐘離心收菌。D)加入9mLSolutionI(500國(guó)ol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0，25。C)，10mmol/LEDTA(pH8.0，25°C)，水)，混勻，再加入lmL用10mmol/LTris-HC1(pH8.0)新鮮配制的溶菌酶(10mg/mU，再加入10mL新鮮配制的SolutionII(200mmol/lNaOH，1%SDS，水)，輕輕混勻5-7次，室溫靜置5分鐘。E)加入7.5mL冰冷的SolutionIII(3mol/L醋酸鉀；pH5.2，25°C)，輕輕混勻，冰浴10分鐘；4°C，11000rpm離心IO分鐘，取上清。F)加入2/3體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘，11000rpm離心10分鐘，G)用70%乙醇洗滌沉淀，8000rpm，15分鐘離心回收，用2mLTE溶解沉淀。H)加入2mL5mol/L的LiCl，混勻，10000g離心10分鐘，棄去上清。I)用70%乙醇洗滌沉淀，棄上清，盡量控干液體，室溫靜置至干燥。J)加入300ulTER，溶解沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，37。C水浴1-2小時(shí)。K)加入300ul1.6mol/LNaCl(含13%聚乙二醇)，混勻，4"C，12000rpm離心15分鐘，棄上清。L)250ulTE(pH8.0)溶解沉淀，分別用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。M)取上清，加入60iU10mol/LNH4Ac及2倍體積的無水乙醇(或95%乙醇)，混勻，4°C，12000g離心5分鐘，棄上清。N)120p175%乙醇洗滌沉淀，4°C，12000g離心IO分鐘，棄上清，盡量控干液體，室溫靜置至干燥。0)加入100yl三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)質(zhì)粒的濃度和純度。②質(zhì)粒的序列測(cè)定對(duì)含有目的基因片段的陽性克隆質(zhì)粒用美國(guó)AppliedBiosystems公司的377測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果重組載體中的插入片段力J饑Wi7具有序列表中SEQIDNO:4的DNA序列，將該重組載體命名為pMD18-力J/AWZ。將pMD18-M^i/7i7作為標(biāo)準(zhǔn)品。③將上述抽提得到的質(zhì)粒pMD18-用TE溶液溶解(TE溶液的組成為10腿ol/L三羥甲基氨基甲垸-鹽酸，lmmol/L乙二胺四乙酸，水)至終濃度為2X108拷貝數(shù)/ul。(十六)對(duì)照品陽性對(duì)照品為含有hMAMmRNA的總RNA，陰性對(duì)照品為正常人外周血總RNA，RNA提取方法同樣品RNA提取方法(實(shí)施例2的步驟三)。將提取到得兩種總RNA分別用無RNA酶的水溶解至終濃度為0.2ug/ul，取5ul上述RNA樣品加入lml無水乙醇中，-20。C保存。將上述各組分分裝，組合為10人份的試劑盒，每盒中各組分的量為細(xì)胞裂解液I1瓶(30mL/瓶)、細(xì)胞裂解液ni瓶(10mL/瓶)、RNA洗滌緩沖液I1瓶(10mL/瓶)、RNA洗滌緩沖液IIl瓶(3mL/瓶)、無RNA酶水1瓶(4mL/瓶)、RNA分離柱、收集管、PCR管、DNA酶I儲(chǔ)存液1管(120ul/管)、反轉(zhuǎn)錄緩沖液1管(33ul/管)、dNTP混合物1管(6.0ul/管)、逆轉(zhuǎn)錄酶1管(3.Oul/管)、PCR反應(yīng)液1管(25L75u1/管)、UNG酶儲(chǔ)存液1管(4.75ul/管)、探針1管(28.5ul/管)、標(biāo)準(zhǔn)品1管(10u1/管)、陽性對(duì)照品l管(l.Oug/管)、陰性對(duì)照品l管(l.Oug/管)。實(shí)施例2、人乳腺球蛋白基因mRNA表達(dá)量的檢測(cè)用實(shí)施例1制備的10人份的試劑盒檢測(cè)下述實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本中的人乳腺球蛋白基因mRNA表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)組46例病理診斷確診的乳腺癌患者，其中13例臨床確診己發(fā)生轉(zhuǎn)移。對(duì)照組IO例肺癌患者，4例胃癌患者，6例肝癌患者，18例乳腺良性疾病患者及10例健康對(duì)照。一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備1、將細(xì)胞裂解液I按1:9的比例用滅菌去離子水稀釋成細(xì)胞裂解液I稀釋液。2、向細(xì)胞裂解液II中加入2-巰基乙醇，加入量為每lmL細(xì)胞裂解液II中加入20u1濃度為14.5M的2-巰基乙醇，分裝2-巰基乙醇要在通風(fēng)櫥下進(jìn)行。3、RNA洗滌緩沖液II在使用之前，每瓶加入12mL無水乙醇。4、配制70X的乙醇溶液10mL。二、取樣采受試者靜脈血3mL于無菌離心管中，使用EDTA作抗凝劑(1.44mg/mL全血)。樣本采集后應(yīng)立即使用，若不能立即使用，可在4t:保存1-2小時(shí)，但時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則將影響測(cè)定結(jié)果。全血經(jīng)處理后，得到的有核細(xì)胞可于-8(TC或液氮中保存。得到實(shí)驗(yàn)組樣品和對(duì)照組樣品。三、實(shí)驗(yàn)組樣品和對(duì)照組樣品的細(xì)胞總RNA的提取1)取3mL步驟二獲得的新鮮抗凝血液加入到50mL無菌離心管后，再加入15mL的細(xì)胞裂解液I稀釋液，漩渦振蕩混勻。2)冰浴15分鐘后，在漩渦振蕩器上迅速混勻兩次，溶液變澄清表明紅細(xì)胞已裂解。如果個(gè)別樣品的血細(xì)胞計(jì)容或ECR升高時(shí)，可延長(zhǎng)冰浴時(shí)間至20分鐘。3)4'C、450g離心IO分鐘沉淀有核細(xì)胞，完全棄去上清液。4)用5mL的細(xì)胞裂解液I稀釋液洗滌沉淀的有核細(xì)胞，漩渦振蕩以完全懸浮細(xì)胞。5)4"C、450g離心10分鐘，并再次完全棄去上清。6)向沉淀的有核細(xì)胞中加入lmL細(xì)胞裂解液I稀釋液，漩渦振蕩以完全懸浮細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移至無菌的1.5mL離心管中，4°C、450g離心10分鐘，完全棄去上清。7)往沉淀的有核細(xì)胞中加入650ul細(xì)胞裂解液I1(已加入2-巰基乙醇)，漩渦振蕩充分混勻。8)再加入650ii1的70%乙醇，漩渦振蕩混勻。此時(shí)可能會(huì)由于乙醇的加入而產(chǎn)生沉淀物，但這不會(huì)影響RNA的提取。9)把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分離柱內(nèi)(該柱最大結(jié)合能力是800ul，故每次加入量不宜超過750ul)，10000g離心l分鐘，棄去流出液體并繼續(xù)進(jìn)行步驟9的操作。10)向DNA酶I儲(chǔ)存液管中加入480ul無RNA酶的水，混勻、短暫離心收集，吸取45u1該液體直接加到RNA分離柱濾膜上，室溫放置15分鐘。11)吸取700ulRNA洗滌緩沖液I加入到RNA分離柱上洗滌柱子，lOOOOg離心1分鐘，棄去2mL收集管。12)將RNA分離柱固定于另一新的2raL收集管上，加入500y1已稀釋的RNA洗滌緩沖液II，10000g離心l分鐘，棄去流出液。該收集管可重復(fù)使用。13)再用500iil已稀釋的RNA洗滌緩沖液n洗滌RNA分離住，離心并棄去流出液。然后12000g離心1分鐘，以甩干RNA分離柱基質(zhì)。14)將RNA分離柱轉(zhuǎn)移至無RNA酶的1.5mL離心管上，取50u1無RNA酶的水加入到RNA分離柱基質(zhì)上，10000g，離心1分鐘。將裝有RNA的離心管置于冰盒上，備用。得到實(shí)驗(yàn)組樣品RNA和對(duì)照組樣品RNA。四、熒光定量PCR1、實(shí)驗(yàn)組樣品RNA、對(duì)照組樣品RNA、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的反轉(zhuǎn)錄將裝有反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、逆轉(zhuǎn)錄酶的離心管從-2(TC冰箱中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，短暫離心，將dNTP混合物及反轉(zhuǎn)錄緩沖液全部加入逆轉(zhuǎn)錄酶管中配制成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，混勻，短暫離心，置于冰盒上備用，使用后剩余反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液可于-2(TC冰箱中保存。反轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3.5ul、總RNA溶液5.Oul、無RNA酶的水1.5ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42°C、15分鐘一95°C、5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物取出置于冰盒上。得到實(shí)驗(yàn)組樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、對(duì)照組樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、陽性對(duì)照反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和陰性對(duì)照反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。2、標(biāo)準(zhǔn)品的處理將標(biāo)準(zhǔn)品貯存液(2X108拷貝數(shù)/ul)梯度稀釋為2X107，2X106，2X105，2X104，2X103，2X102，2X10'拷貝數(shù)/ul。3、熒光定量PCR將裝有PCR反應(yīng)液、探針及UNG酶儲(chǔ)存液的離心管從-2(TC冰箱中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，短暫離心，將探針及PCR反應(yīng)液全部加入U(xiǎn)NG酶儲(chǔ)存液管中，混勻，短暫離心，置于冰盒上備用，使用后剩余液體于-2(TC冰箱中保存。在ABI公司7000型定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為模板5.Oixl、PCR反應(yīng)液15.0ul、水5.0ul。其中，模板為實(shí)驗(yàn)組樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或?qū)φ战M樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或陽性對(duì)照反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或陰性對(duì)照反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或標(biāo)準(zhǔn)品。PCR反應(yīng)條件為37°C，10分鐘一95°C，15分鐘一95°C，15秒一6CTC，1分鐘。共50個(gè)循環(huán)。五、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果如圖l所示。橫坐標(biāo)為PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為檢測(cè)器檢測(cè)到的熒光值，圖中曲線從左至右分別代表起始模板數(shù)為1X108、1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、1X1()2拷貝數(shù)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)為Ct值。圖2中的Log特指LogH)。六、檢測(cè)結(jié)果選中上述所有樣品檢測(cè)孔，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相應(yīng)分析，得出待測(cè)樣品的起始模板數(shù)(M)。每毫升全血樣本中hM扁mRNA的拷貝數(shù),MX6.6。1)13例臨床確診已轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者檢測(cè)結(jié)果均為陽性，具體結(jié)果如表l所示。表113例臨床確診已轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者h(yuǎn)MAMmRNA拷貝數(shù)的檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2)33例臨床未確診轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中IO例為陽性，其余23例為陰性。結(jié)果如表2所示。表233例臨床未確診轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者h(yuǎn)MAMmRNA拷貝數(shù)的陽性檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3)對(duì)照組IO例肺癌患者、4例胃癌患者、6例肝癌患者、18例乳腺良性疾病患者及10例正常健康人均為陰性，未檢測(cè)到hMAM的表達(dá)。上述結(jié)果表明用本發(fā)明的試劑盒可對(duì)hMAMmRNA的表達(dá)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定性及定量分析。序列表<110>中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)<120>—種檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒及其應(yīng)用〈130〉CGGNARY71692<160〉4<210>1〈211>22<212〉腿<213〉人工序列<400>1tgaagttgctgatggtcctcat〈210〉2<211>27<212>DNA〈213>人工序列〈400〉2tcagtcttagacacttgtggattgatt<210>3<211〉24<212>DNA<213〉人工序列<400>3agcactgctacgcaggctctggct24<210〉4〈211>121〈212〉DNA〈213>人屬人(ifo/zo卿ie"50<400〉4tgaagttgctgatggtcctcatgctggcggccctctcccagcactgctacgcaggctctg60gctgccccttattggagaatgtgatttccaagacaatcaatccacaagtgtctaagactg120a12權(quán)利要求1、一種檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括一對(duì)引物和探針，所述引物對(duì)中，一個(gè)引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一個(gè)引物的核苷酸序列是序列表中序列2，所述探針的核苷酸序列是序列表中序列3。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征為所述試劑盒中還包括進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR所需的試劑。3、權(quán)利要求1或2所述的試劑盒在檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量中的應(yīng)用。4、一種檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的方法，是利用權(quán)利要求1或2所述的試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測(cè)人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量的試劑盒及其應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明所提供的試劑盒和方法，可準(zhǔn)確定量待測(cè)標(biāo)本中人乳腺球蛋白mRNA表達(dá)量。本發(fā)明所提供的試劑盒和方法可用于臨床及科研中，可對(duì)腫瘤患者的外周血、骨髓中hMAMmRNA的表達(dá)情況進(jìn)行定性及定量分析，對(duì)判斷乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，評(píng)價(jià)治療效果及動(dòng)態(tài)觀察病情具有重要意義。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101215604SQ20071030387公開日2008年7月9日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者田志剛,民程,陳永艷,魏海明申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)