專利名稱：通用的激酶測定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定激酶或磷酸酶活性的方法，其包括結(jié)合配偶體、檢測分子和底物分子的相互作用。
分子和超分子裝配的生理修飾在生物系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮著主要作用。這些修飾可包括磷酸化、環(huán)化、糖基化、酰化、和/或硫酸化，等等，經(jīng)修飾的分子可包括多肽、核酸、和/或脂類等等。修飾的重要性在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中是尤其明顯的，所述通路中通過磷酸修飾例如磷酸化和環(huán)化相關(guān)聯(lián)的胞外和胞內(nèi)物質(zhì)影響著細(xì)胞的定位、性質(zhì)和活性。
能夠干擾由特定酶催化的或者特異底物的磷酸化或去磷酸化的化合物是所關(guān)心的，因為它們能干擾特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件并因而可用于由于此類途徑的調(diào)節(jié)異常而發(fā)生的疾病的治療或預(yù)防。
因此，開發(fā)測定激酶或磷酸酶活性的方法用于篩選可調(diào)節(jié)特異信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的化合物是所關(guān)心的。
EP1156329公開了測定激酶活性的方法，其基于由兩部分組成的系統(tǒng)，這兩部分為結(jié)合配偶體(BP)和進行A→A*轉(zhuǎn)化的底物分子。通常，結(jié)合配偶體是結(jié)合酶產(chǎn)物的實體并能自身附著于固相上，例如通過任何種類的共價或非共價相互作用附著到小珠。為了檢測，將標(biāo)記物(熒光團、發(fā)光團、接納體或淬滅劑)附著于A或BP上。檢測方法列表包括強度、偏振和能量傳遞測量。
WO00/75167公開了檢測向底物添加或從底物除去底物基團的方法，該方法也是基于兩部分組成的系統(tǒng)，這兩部分為結(jié)合配偶體，其優(yōu)選地是具有捕獲的金屬離子的大分子，和肽A，其中例如通過FRET檢測了磷酸化的肽向非磷酸化肽的轉(zhuǎn)化或反之亦然。
兩部分系統(tǒng)的一個缺點是，為了最佳的能量轉(zhuǎn)移，對于給定的BP和A*比率，需要供體和接納體的一定比率。因此，為產(chǎn)生最佳的FRET，必須滴定BP、A和A*。
然而，BP、A和A*之間的最佳比率通常一方面是受到BP對A*的結(jié)合能力和各自的結(jié)合常數(shù)的影響，而另一方面也受到目標(biāo)靶標(biāo)的酶反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)的影響。因此，在兩部分系統(tǒng)中FRET優(yōu)化必需的BP、A和A*的固定比率導(dǎo)致測定信號和質(zhì)量或者酶動力學(xué)和結(jié)果的生物學(xué)意義受到損害，即在最壞的情況下，在兩部分系統(tǒng)中實現(xiàn)所有組分的最佳酶反應(yīng)實現(xiàn)最佳動力學(xué)、BP和A*實現(xiàn)所轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的最佳結(jié)合、接納體—供體實現(xiàn)最佳FRET也許是不可能的。
EP1156329和WO00/75167中所公開的兩部分系統(tǒng)的一個實施方案包含摻入了發(fā)光團或受體的塑料小珠以及用于結(jié)合標(biāo)記的A*的表面涂層。換句話說，IMAPTM小珠在小珠的核心具有光學(xué)標(biāo)記。
為獲得充足的結(jié)合能力I，MAPTM小珠一般具有100nm或更大的直徑。與一般的供體接納體對的能量轉(zhuǎn)移距離為3至9nm相比，該直徑是大的。因而，摻入的小珠與結(jié)合肽之間的能量轉(zhuǎn)移是相當(dāng)無效的，在小珠內(nèi)部有許多雖不識別FRET配偶體但仍增加測定背景信號的發(fā)光團。這導(dǎo)致動力學(xué)范圍減小和靈敏性降低。
因此，本發(fā)明的目的是開發(fā)通過測定能量供體和能量接納體之間的能量轉(zhuǎn)移來測定激酶或磷酸酶活性的更加有效的方法。
本發(fā)明的測定法由三部分組成(i)“結(jié)合配偶體”(ii)用FRET對的供體或接納體標(biāo)記的檢測分子(iii)底物分子——小分子、肽或蛋白質(zhì)——其經(jīng)酶轉(zhuǎn)化，因而如果酶是蛋白激酶則氨基酸(Ser、Thr、Tyr)被磷酸化。相同的設(shè)置可用于蛋白質(zhì)磷酸酶，其中各自的氨基酸被去磷酸化。因此，本發(fā)明提供了用于測定激酶或磷酸酶活性的方法，其包括結(jié)合配偶體、檢測分子和底物肽，其中所述檢測分子用能量供體或接納體標(biāo)記，如果檢測分子用能量接納體標(biāo)記，那么所述底物分子用能量供體標(biāo)記，如果檢測分子用能量供體標(biāo)記，那么所述底物分子用能量接納體標(biāo)記，其中所述結(jié)合配偶體僅結(jié)合磷酸化的底物分子，該方法包括步驟a)用激酶磷酸化所述底物分子或者用磷酸酶將磷酸化的底物去磷酸化；和b)將步驟a)中所獲得的底物分子與所述結(jié)合配偶體和所述檢測分子相互作用；和c)通過測定結(jié)合至所述結(jié)合配偶體上的所述底物分子和所述檢測分子的從能量供體至能量接納體的能量轉(zhuǎn)移來測定激酶或磷酸酶活性。優(yōu)選地，所述結(jié)合配偶體是金屬離子，其優(yōu)選地結(jié)合固相，例如，小珠、膜、樣品固定器。在最優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合配偶體是IMAPTM小珠上的金屬離子。IMAPTM小珠可從Molecular Devices Corp獲得。已有顯示，IMAPTM小珠可用作結(jié)合平臺以促使兩個熒光團足夠靠近在一起進行熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，從而成為用于激酶測定和磷酸酶測定的通用檢測系統(tǒng)。
在另一優(yōu)選的實施方案中，底物分子是蛋白質(zhì)或肽。
如此處所用的，“結(jié)合配偶體”指的是實體，其結(jié)合酶產(chǎn)物并且自身能夠通過任何種類的共價或非共價相互作用附著于固相例如小珠上。
如此處所用的，“檢測分子”指的是攜帶標(biāo)記、例如熒光標(biāo)記并結(jié)合至結(jié)合配偶體上的分子，所述標(biāo)記允許檢測分子的檢測。
如此處所用的，“底物分子”指的是小分子、肽或蛋白質(zhì)，其經(jīng)酶通過酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化。
如此處所用的，“能量供體”指的是熒光標(biāo)記，其在受到激發(fā)時，能夠?qū)⑵淠芰哭D(zhuǎn)移至能量接納體。
如此處所用的，“能量接納體”指的是可從能量供體接受能量的分子。
如此處所用的，“激酶活性”指的是酶(激酶)對底物的磷酸化。
如此處所用的，“磷酸酶活性”指的是酶(磷酸酶)對底物的去磷酸化。
如此處所用的，“磷酸化的底物分子”指的是經(jīng)酶(激酶)磷酸化的小分子、肽或蛋白質(zhì)。
如此處所用的，“發(fā)射壽命”指的是熒光團在激發(fā)后保持激發(fā)狀態(tài)的時間的平均量。
與熒光偏振讀出相比，利用TR-FRET作為讀出的實現(xiàn)提供了下列優(yōu)點●測定信號的質(zhì)量增強，該測定信號通過統(tǒng)計學(xué)參數(shù)z’來表達，特別是對于低底物轉(zhuǎn)化。
●由于定時選通(time gated)、延遲檢測，測定信號相對于背景熒光干擾的穩(wěn)定性增強。
●對于需要轉(zhuǎn)化的底物的量的靈敏性增強(FP讀出測量溶液中所有底物分子的熒光團的平均信號；FRET僅識別結(jié)合至磷酸化底物分子上的熒光團的部分)。
●試劑消耗減少到1/20以下。
另外，本發(fā)明的方法中所用的三部分系統(tǒng)比現(xiàn)有技術(shù)的兩部分系統(tǒng)具有下列優(yōu)勢，即使兩部分系統(tǒng)也是通過(TR)-FRET來實現(xiàn)的●底物產(chǎn)物的最佳結(jié)合所需的小珠量和最佳能量轉(zhuǎn)移信號所需檢測分子的量可分別滴定。
●均結(jié)合至小珠表面的檢測分子和底物分子之間的能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致更加有效的FRET信號。
●而且，可以分別選擇小珠(BP)、檢測分子和底物分子，即，人們可設(shè)想一種測定工具箱，含有幾種通用物品，例如小珠、檢測分子、底物和幾套FRET對。從此工具箱中選擇產(chǎn)生出不同的測定法應(yīng)用。對于兩部分系統(tǒng)，此種靈活性和通用性是更困難的且實際上甚至不可能的。
因此，還提供了用于實施根據(jù)上文和下文所述方法的試劑盒，其在分開的容器中包含小珠、一種以上的的檢測分子、一種以上的的底物分子，其中所述檢測分子和所述底物分子是以幾套FRET對來提供的。
優(yōu)選地，能量供體具有小于50微秒，更優(yōu)選地小于10微秒，甚至更優(yōu)選地小于5微秒的發(fā)射壽命。最優(yōu)選地，能量供體具有2至3微秒的發(fā)射壽命。
在優(yōu)選的實施方案中，將Ru-發(fā)光團用作能量供體。與鑭系元素(Eu、Tb、Sm)螯合物和穴狀化合物相比，Ru-發(fā)光團具有幾個普遍的優(yōu)勢●與接納體有良好重疊的寬的發(fā)射光譜，不同于鑭系元素染料的尖光譜。
●更高的化學(xué)穩(wěn)定性，其對于標(biāo)記化學(xué)(可能更加嚴(yán)格的條件，以及在純化過程中)和測定法(沒有來自試劑的干擾，已知鑭系元素染料對典型的激酶測定的重要成分，例如EDTA、Mg離子或Mn離子是敏感的)是有利的。
在另一優(yōu)選的實施方案中，將Tb發(fā)光團用作能量供體。
激發(fā)狀態(tài)的微秒壽命和所得發(fā)射提供了特別的優(yōu)點。在測定條件下Ru(batho)2bpy絡(luò)合物的一般發(fā)射壽命是2-3微秒。微秒壽命允許對來自其它測定成分和熒光化合物的熒光的有效背景抑制。然而，光子發(fā)射時間比鑭系元素快100倍，即檢測器積分的時間為電背景信號時間的1/100以下。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用一種系統(tǒng)進行所述方法，在該系統(tǒng)中，樣品相對于光學(xué)檢測路徑運動。優(yōu)選地，所述系統(tǒng)是實驗室器具自旋系統(tǒng)(labware spin system)，更優(yōu)選地Tecan lab CD或來自SpinX的系統(tǒng)。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述系統(tǒng)是顯微流體系統(tǒng)或流通池。在這樣的設(shè)置下，在樣品運動中鑭系元素發(fā)射太慢而不能讀出。為了利用TR-FRET讀出，實驗室器具/盤或樣品流將不得不分別通過起始-停止循環(huán)，這實際上是不可能的并且是費時的。備選地，人們將不得不修改修改裝置以獲得不同的激發(fā)/檢測路徑，在此將不得不根據(jù)讀出的計時調(diào)整路徑的位置。
利用Ru-絡(luò)合物和短的微秒壽命的“Fast-TR-FRET”允許在樣品沒有主要修飾的情況下運動時在線讀出并提供了特別的優(yōu)勢。IMAPTM技術(shù)是用于激酶的通用測定法并因此優(yōu)選使用。然而，F(xiàn)P讀出具有上述的缺點。在此設(shè)置下不能容易地使用鑭系元素TR-FRET。
在優(yōu)選的實施方案中，能量接納體是顯示出與Ru-絡(luò)合物有光譜重疊的熒光團，所述Ru-絡(luò)合物產(chǎn)生至少10，優(yōu)選至少20，更優(yōu)選至少50的R0(Frster Radius)。R0與光譜重疊J(λ)之間的關(guān)系通過下列公式(來自Lakowicz，J.R.，Principles of Fluorescence Spectroscopy，第二版，Kluwer Academin/Plenum Publishers，p.369)定義
R0＝0.211[κ2n-4QDJ(λ)]1/6()其中J(λ)=∫0∞FD(λ)ϵA(λ)λ4dλ=∫0∞FD(λ)ϵA(λ)λ4dλ∫0∞FD(λ)dλ]]>在更優(yōu)選的實施方案中，能量接納體是Alexa Fluor 700、Atto 700、Dy701或Alexa Fluor 750。在最優(yōu)選的實施方案中，所述能量接納體是Alexa Fluor 700。
在最優(yōu)選的實施方案中，Ru發(fā)光團是Ru(batho)2bpy。
WO02/41001中公開了可在本發(fā)明中使用的用于Ru-絡(luò)合物與熒光團之間的此類熒光共振能量轉(zhuǎn)移測定的另外的染料對。
結(jié)合配偶體的稀釋度至少是500倍，優(yōu)選地至少1000倍或者在400倍或1000倍和10000倍之間，其中稀釋度在2000倍和10000倍之間或者2000倍和8000倍之間。
在下列章節(jié)中討論了在實施例中公開的非限制性實施方案作為測試系統(tǒng)，利用Alexa Fluor700作為能量接納體標(biāo)記磷酸化和非磷酸化底物肽，并利用Ru(batho)2bpy作為能量供體標(biāo)記磷酸化的底物肽。Alexa標(biāo)記的激酶底物肽是通過該酶磷酸化的。為進行檢測，將磷酸化的Ru(batho)2bpy檢測肽和IMAPTM小珠加入反應(yīng)混合物。磷酸化底物和檢測肽都結(jié)合至小珠上，從而磷酸化底物和檢測肽密切接近，因此可以發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)(
圖1)。
作為FRET對，將長壽命的金屬-配體絡(luò)合物Ru(batho)2bpy(τ＝3μs)用作能量供體并將Alexa Fluor 700用作能量接納體。Ru標(biāo)記的肽與IMAPTM小珠的結(jié)合不影響利用Alexa Fluor 700作為熒光團進行的熒光偏振測定。在兩種讀出技術(shù)(FP和FRET)的比較中，證實了FRET是更加靈敏的方法。10％的磷酸化就已經(jīng)產(chǎn)生了超過0.5的z’因子。另外，F(xiàn)RET測定所需的IMAPTM小珠為FP相比所需小珠的1/10以下。因此，實現(xiàn)了試劑消耗的顯著減少，無需小型化的液體處理和讀出，其通常為了節(jié)約昂貴試劑而進行但卻使測定處理變得復(fù)雜并從而可能導(dǎo)致不穩(wěn)定和不可重復(fù)的處理。
總之，此處所公開的Fast-TR FRET激酶IMAPTM測定法是穩(wěn)定的、靈敏的、需要更少的IMAPTM小珠并由于定時選通的檢測而具有低的背景熒光。
如從FP實驗中所知的，信號受到ATP的影響，因為ATP占據(jù)了小珠上的空的結(jié)合位點，阻止了磷酸化肽的結(jié)合。與ATP相比，EDTA不影響FRET信號。在此處所述的三部分系統(tǒng)的測定組分滴定后，可忽略ATP的影響。
原則上兩種熒光團均可用作底物的標(biāo)記物。Ru絡(luò)合物作為底物標(biāo)記物的優(yōu)勢在于高的化學(xué)穩(wěn)定性以及——與Alexa Fluor 700相比——其可作為NHS酯和馬來酰亞胺使用，這提高了標(biāo)記方法的靈活性。
Alexa Fluor 700的備選物可以是Atto 700，其具有相當(dāng)?shù)募ぐl(fā)和發(fā)射光譜并可作為NHS酯和馬來酰亞胺使用。由于其較小的吸收系數(shù)(ε＝120000M-1cm-1)，與Ru-Alexa Fluor 700(ε＝192000M-1cm-1，R0＝62)相比，F(xiàn)RET對Ru-Atto 700的R0減少了～5。用Ru絡(luò)合物(或備選地Alexa Fluor 700或Atto 700)標(biāo)記的帶有磷酸基團的磷酸酪氨酸、其它磷酸化的氨基酸或其它小分子可用作“通用的”檢測分子。
圖1利用IMAPTM小珠進行Fast-TR FRET讀出的激酶反應(yīng)的示意圖。
圖2分別用15nM磷酸化的Alexa-肽和100nM和300nM磷酸化的Ru-肽所觀察到的FRET信號(黑色)，IMAPTM稀釋度1∶800。灰色15nMAlexa-肽和磷酸化的Ru-肽和IMAPTM小珠，白色磷酸化的Ru-肽和IMAPTM小珠。將小珠在室溫下孵育30分鐘。讀出730(30)nm，延遲100ns，選通(gate)100ns，曝光時間4s。左邊部分(a)顯示了原始數(shù)據(jù)，右邊部分(b)顯示了有效的FRET信號。
圖320nM磷酸化的Ru-肽和100nM磷酸化的Alexa-肽(IMAPTM稀釋度1∶4000)(白色)以及15nM磷酸化的Alexa-肽和100nM磷酸-PDHK-Ru(IMAPTM稀釋度1∶800)(黑色)的原始數(shù)據(jù)。讀出730(30)nm，延遲100ns，選通100ns，曝光時間10s(白色)和4s(黑色)。
圖4利用20nM磷酸化的Alexa-肽和100nM磷酸化的Ru-肽使用不同IMAPTM稀釋液的FRET信號，孵育60分鐘，讀出730(30)nm，延遲100ns，選通100ns，曝光時間5s。
圖5ATP對FRET信號的影響。20nM磷酸化的Alexa-肽，100nM磷酸化的Ru-肽，室溫下孵育60分鐘，讀出730(39)nm，延遲100ns，選通100ns，曝光時間8s。
圖6EDTA對FRET信號的影響。20nM磷酸化的Alexa-肽，100nM磷酸化的Ru-肽，室溫下孵育60分鐘，讀出730(30)nm，延遲100ns，選通100ns，曝光時間8s。
圖7用20nM(磷酸化的)Alexa-肽和100nM磷酸化的Ru-肽對激酶測定法的模擬，IMAPTM稀釋度1∶400((a)和(b))和1∶4000((c)和(d))。室溫下孵育60分鐘。讀出FRET730(30)nm，延遲100ns，選通100ns，曝光時間10s，F(xiàn)P激發(fā)655(50)nm，發(fā)射710(40)nm。
圖8激酶測定法的動力學(xué)。讀出730(30)nm，延遲100ns，選通100ns，曝光時間7s。
圖9ATP的劑量反應(yīng)曲線，利用1μM Alexa-肽進行激酶反應(yīng)。讀出中的終濃度是；20nM(磷酸化的)Alexa-肽，100nM磷酸化的Ru-肽，1∶4000稀釋度的IMAPTM小珠。讀出730(30)nm，延遲100ns，選通100ns，曝光時間10s。
實施例實施例1對由于結(jié)合至IMAP小珠產(chǎn)生的FRET的觀察材料●來自Biosyntan的用Alexa Fluor 700標(biāo)記的底物肽(YHGHSMSAPGVSTAC)●來自Biosyntan的用Alexa Fluor 700和Ru(batho)2bpy標(biāo)記的磷酸化的底物肽(YHGHS(H2PO4)MSAPGVSTAC)●激酶PDHK2(重組丙酮酸脫氫酶激酶2，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法表達)●來自Molecular Devices的IMAPTM小珠(IMAPTMExplorerKit(IPP)產(chǎn)品#R8062)●緩沖液用dest.H2O+0.05％BSA 1∶5稀釋的IMAPTM結(jié)合緩沖液裝置●Zeiss平板::視覺讀出器●平板Costar 384，UV-NBS●激發(fā)波長355nm●發(fā)射濾光器(emission filter)30(30)nm，615(10)nm在第一個實驗中，將1∶800稀釋的IMAPTM小珠(對于FP測定的建議稀釋度為1∶400)分別加入到用Alexa Fluor 700標(biāo)記的15nM(終濃度)的磷酸化或非磷酸化的底物肽(此后(磷酸化的)Alexa-肽)以及用Ru(batho)2bpy標(biāo)記的100nM和300nM(終濃度)的磷酸化底物肽(此后磷酸化的Ru-肽)的混合物中。然后將反應(yīng)混合物稀釋50倍用于利用IMAPTM小珠和磷酸化Ru-肽進行讀出。圖2a顯示了該測定的原始數(shù)據(jù)。僅有FRET信號(黑色)高于單獨Ru絡(luò)合物的背景信號(白色)。由于非磷酸化Alexa-肽對小珠的非特異結(jié)合，沒有FRET(灰色)。背景校正的FRET信號(圖2b)隨磷酸化Ru-肽濃度的增加而增加，表明用100nM磷酸化的Ru-肽和15nM磷酸化的Alexa-肽沒有使IMAPTM小珠飽和。
實施例2Alexa-肽和Ru-肽作為底物的比較也利用20nM磷酸化的Ru-肽和100nM磷酸化的Alexa-肽、用1∶4000稀釋的IMAPTM小珠來進行實驗。圖3比較了利用Ru-肽(白色)或Alexa-肽(黑色)作為底物的實驗的原始數(shù)據(jù)。因為對兩個實驗使用了不同的測定參數(shù)，僅能對FRET信號與Ru背景的比率進行直接比較。然而當(dāng)使用Alexa標(biāo)記的底物時，F(xiàn)RET信號是Ru背景的兩倍，當(dāng)使用Ru標(biāo)記的底物時這個比率上升至6倍。在兩個實驗中，由于FRET信號的時間控制的檢測(延遲100ns)，Alexa Fluor 700均沒有增強背景。
實施例3IMAPTM小珠的滴定為確定用于讀出的最佳條件，用20nM的磷酸化Alexa-肽和100nM磷酸化Ru-肽對不同的IMAPTM稀釋度進行了測試(圖4)。當(dāng)1∶2000稀釋度IMAPTM小珠與1∶400的稀釋度相比時，F(xiàn)RET信號增強了3倍。進一步稀釋到1∶10000時，信號又下降到大約與1∶400相同的信號。如前所述，用1∶400稀釋度，IMAPTM小珠是不飽和的。進一步稀釋獲得了每個IMAPTM小珠上更多磷酸化的Ru-肽，并導(dǎo)致了FRET信號的增強。用大于1∶2000的稀釋度時，每個IMAPTM小珠的磷酸化Ru-肽的數(shù)目再次減少。
實施例4ATP和EDTA對FRET信號的影響FP實驗表明ATP的加入減小了偏振窗，因為ATP結(jié)合至小珠上并因而阻止了磷酸化激酶底物的結(jié)合。因此預(yù)期ATP也影響FRET信號。通常利用100μM ATP和1μM底物進行激酶反應(yīng)。在加入IMAPTM小珠進行FRET讀出之前，將反應(yīng)化合物稀釋50倍，得到2μM的ATP終濃度。圖5顯示了隨ATP濃度增加FRET信號減小。使用2μM ATP，F(xiàn)RET信號減小了一半。
圖6表明加入用于終止激酶反應(yīng)的EDTA并不影響FRET信號。EDTA不影響磷酸化底物對IMAPTM小珠的結(jié)合，也在任何情況下都不影響釕絡(luò)合物。所測試的EDTA濃度(高達64μM)對IMAPTM小珠也沒有可檢測得到的影響。更高的濃度可能絡(luò)合小珠上的M3+，并因而影響磷酸化肽的結(jié)合。
實施例5激酶測定法為測試Fast-TR FRET激酶IMAPTM測定法的靈敏性并與已建立的FPIMAPTM測定法相比較，進行了激酶測定法的模擬。通過混合非磷酸化的和磷酸化的Alexa-肽將20nM Alexa-肽的磷酸化水平從0％增加至100％。使用了兩種IMAP稀釋度，即對于FP測定的建議稀釋度1∶400和用100％磷酸化的Alexa-肽仍顯示良好的FRET信號的1∶4000稀釋度(圖4)。對于兩種IMAPTM稀釋度，F(xiàn)RET信號均隨磷酸化的增加而增加(圖7(a)和(c))。正如預(yù)期的，與1∶400稀釋度相比，1∶4000稀釋度的FRET信號更高，從10％至100％磷酸化產(chǎn)生了大于0.5的z’因子(空心菱形)。對于FP測定，1∶400的IMAPTM稀釋度的檢測窗口是200mP并且從20％至100％磷酸化得到了0.5或者更好的z’因子(圖7(b))。1∶4000的IMAPTM小珠稀釋度將窗口劇烈地減小至70mP(圖7(d))并減小了FP實驗的靈敏性。
實施例6激酶反應(yīng)的動力學(xué)將1μl的PDHK2酶稀釋于11μl激酶緩沖液(25mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl，18.7mM MgCl2，0.4mM NH4Ac，0.025％Triton X-100，1.87mM DTT)中。然后將3μl溶解于底物緩沖液(25mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl，0.01％Triton X-100)中的5μM Alexa標(biāo)記的底物肽的溶液加入到酶中。作為陽性對照，底物溶液含有500μM ATP，而對于陰性對照，反應(yīng)物中不存在ATP。這產(chǎn)生了用于1μM底物和100μM ATP反應(yīng)的終濃度。在30℃下孵育2、3、4和5小時后，通過取走1μl反應(yīng)混合物并加入24μl 200nM磷酸化的Ru-肽和25μl IMAP結(jié)合緩沖液中的IMAP小珠來終止反應(yīng)，得到100nM的磷酸化Ru-肽終濃度。使用了三種稀釋度的IMAPTM小珠，1∶2000、1∶4000和1∶8000。在室溫下將小珠孵育60分鐘。為讀出，最終底物濃度是20nM(磷酸化的)Alexa-肽，利用2μM的最終ATP濃度，將容易檢測FRET信號(圖5)。圖8顯示了對于陽性和陰性對照，在三種IMAP稀釋度(藍色1∶2000、紅色1∶4000、綠色1∶6000)下的激酶反應(yīng)動力學(xué)。對于所有三種稀釋度，所觀察到的FRET信號都是足夠強的。
實施例7激酶反應(yīng)的ATP依賴性ATP的劑量反應(yīng)曲線(圖9)顯示測定中所用的ATP(100μM)是大大超過3.6μM的EC50。注意這些是激酶反應(yīng)中的濃度，在讀出中它們?yōu)?/50。過量ATP使得不能發(fā)現(xiàn)ATP結(jié)合位點的競爭抑制劑，并確保了沒有抑制劑時的最大磷酸化。信號在32μM ATP下達到最大。在更高的ATP濃度下信號又下降了，這是由于讀出混合物中游離的ATP結(jié)合至IMAPTM小珠上并從而降低了IMAPTM小珠的結(jié)合能力。IMAPTM小珠的結(jié)合能力的問題是眾所周知的并需要通過測定試劑的適當(dāng)?shù)味ㄔ跍y定中調(diào)整。
由于增加此處所測的ATP濃度至128μM(在讀出中2.56μM)和256μM(在讀出中5.12μM)導(dǎo)致FRET信號的降低(從最大信號(32μM，在讀出中0.64μM)下降到1/1.6和1/1.9)與ATP的滴定是非常相當(dāng)?shù)?圖5)，所述滴定導(dǎo)致這些ATP濃度下降到1/1.6和1/2.1。
權(quán)利要求
1.用于測定激酶或磷酸酶活性的方法，其包括將結(jié)合配偶體、檢測分子和底物分子相互作用，其中所述檢測分子用能量供體或接納體標(biāo)記，如果檢測分子用能量接納體標(biāo)記，那么所述底物分子用能量供體標(biāo)記，如果檢測分子用能量供體標(biāo)記，那么所述底物分子用能量接納體標(biāo)記，其中所述結(jié)合配偶體僅結(jié)合磷酸化的底物分子，所述方法包括步驟a)用激酶磷酸化所述底物分子或用磷酸酶將磷酸化的底物分子去磷酸化；和b)將步驟a)中所獲得的底物分子與所述結(jié)合配偶體和所述檢測分子相互作用；和c)通過測定結(jié)合至所述結(jié)合配偶體上的所述底物分子和所述檢測分子的從能量供體至能量接納體的能量轉(zhuǎn)移來測定激酶或磷酸酶活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述結(jié)合配偶體是IMAPTM小珠上的金屬離子。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中能量供體具有小于50微秒的發(fā)射壽命。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述發(fā)射壽命小于10微秒。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述發(fā)射壽命小于5微秒。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述發(fā)射壽命為2至3微秒。
7.權(quán)利要求1至6中任意一項的方法，其中能量供體是Ru-發(fā)光團。
8.權(quán)利要求1至7中任意一項的方法，其中能量接納體是顯示出與Ru-絡(luò)合物有光譜重疊的熒光團，所述Ru-絡(luò)合物產(chǎn)生至少10的R0。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述能量接納體是Alexa Fluor 700、Atto700、Dy701或Alexa Fluor 750。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述能量接納體是Alexa Fluor 700。
11.權(quán)利要求7至10的方法，其中所述Ru-發(fā)光團是Ru(batho)2bpy。
12.權(quán)利要求1至11的方法，其中用一種系統(tǒng)進行所述方法，在該系統(tǒng)中樣品相對于光學(xué)檢測路徑運動。
13.權(quán)利要求1至12的方法，其中所述系統(tǒng)是實驗室器具自旋系統(tǒng)。
14.權(quán)利要求1至12的方法，其中所述系統(tǒng)是顯微流體系統(tǒng)或流通池。
15.權(quán)利要求1至14的任意一項的方法，其中結(jié)合配偶體的稀釋度是至少500倍。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述稀釋度為1000倍至10,000倍。
17.用于實施根據(jù)權(quán)利要求1至16的方法的試劑盒，其在分開的容器中包含結(jié)合配偶體和至少一種檢測分子，其中所述結(jié)合配偶體和檢測分子的最佳量可分別滴定。
18.權(quán)利要求17的試劑盒，其還包含底物分子。
19.用于實施根據(jù)權(quán)利要求1至16的方法的試劑盒，其在分開的容器中包含小珠、一種以上的檢測分子、一種以上的底物肽、其中所述檢測分子和所述底物肽作為幾套FRET對來提供。
20.前文中所述、尤其參考前面的實施例描述的方法和試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及以三部分系統(tǒng)為基礎(chǔ)的測定激酶或磷酸酶活性的方法。該方法包括接觸結(jié)合配偶體，其可結(jié)合磷酸化的肽、檢測分子和底物肽。通過測量存在于檢測分子和底物分子上的能量供體和能量接納體之間的能量轉(zhuǎn)移可實現(xiàn)活性的測定。
文檔編號C12Q1/48GK1904061SQ20061010893
公開日2007年1月31日 申請日期2006年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月29日
發(fā)明者T·恩德勒, D·羅特 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司