專利名稱：Se(r)rs置換檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測分析物，特別是樣品中的核酸的競爭性SE(R)RS 檢測法，以及涉及用于實施這些方法的工具和裝置。
背景技術(shù)：
對樣品中存在的特定生物分子進行敏感、特異和快速的檢測對于分子 診斷應(yīng)用是非常重要的。通常將所謂的捕獲探針固定在感受器表面上，通 過檢測被引入到靶(target)內(nèi)的標記或者通過提供標記的第二探針來監(jiān)測靶 與捕獲探針的特異性結(jié)合。這就需要將靶、探針和標記轉(zhuǎn)移到表面。因為 大分子的彌散是相當(dāng)緩慢的，因此與表面的結(jié)合成為了分析中的限時步 驟。耙與表面的結(jié)合可以是可逆的，例如在DNA雜交中，被雜交的靶分 子可以從表面剝離或熔化，基材可以在洗滌后重新使用。但是，這是費時 的。因此，在溶液中進行分析的所謂均質(zhì)檢測是有優(yōu)勢的。在檢測中，其 彌散距離非常小，因此裝置可以容易地再使用。然而，使用固定捕獲探針 具有便利的按圖案方式沉積(pattern-wise deposition)的多路處理(即同時測定 不同的耙)的優(yōu)點。
最近己經(jīng)引入了一種技術(shù)，其容許在均質(zhì)溶液內(nèi)進行多路、敏感的測 定，即所謂的表面增強(共振)拉曼光譜法(surface-enhanced (resonant) Raman spectroscopy, SE(R)RS))。對于SE(R)RS測定，被檢測的分子需要被吸附 到納米結(jié)構(gòu)的貴金屬表面上。由于激發(fā)束的光場和金屬表面(SERS)的等離 子體場之間的相互作用以及也由于發(fā)色團(SERRS)的共振激發(fā)都使得拉曼 信號增強了數(shù)個數(shù)量級。SE(R)RS具有獨特的性能，散射光是由尖銳的、 分子特異性震動帶組成，這使得能夠區(qū)分出一個溶液內(nèi)的多個分析物。當(dāng) SERRS用于DNA檢測時，具有雙官能團的SERRS標記經(jīng)例如PCR被整 合到了感興趣的核苷酸序列內(nèi)。SERRS標記通過帶電(正電荷)基團附著于 銀表面，并通過染料部分生成拉曼信號。拉曼信號被在極小的銀顆粒表面 生成的等離子體場猛烈擴增，這就容許進行極為敏感的檢測(皮摩爾級)。然而，上述的系統(tǒng)已經(jīng)被觀察到了一些缺陷。例如，只有當(dāng)標記被整
合到DNA時，對DNA的檢測才是可行的，這通常需要擴增步驟。此外， 染料標記的SERRS譜不依賴于其所附著的核酸的序列或結(jié)構(gòu)，這意味著在 測量之前必須從溶液中分別分離出未整合的引物或未雜交的探針。
US 6，750，065描述了利用SE(R)RS檢測蛋白，其中依據(jù)抗原從分析物 特異性抗體中置換出SE(R)RS標記的分析物樣化合物的能力來檢測所述抗 原。在置換之后，通過SE(R)RS表面的吸附檢測出與分析物樣化合物結(jié)合 的SE(R)RS標記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是利用SE(R)RS檢測簡化對樣品中核酸的體外檢 測，其中不需要標記分析物。
通過提供用于本發(fā)明的競爭性SE(R)RS的方法以及這些方法所用的工 具和裝置實現(xiàn)上述目的。
本發(fā)明的一個優(yōu)點是多路檢測是容易可行的，因為SE(R)RS譜的尖銳 的分子特異性震動帶使得可以同時對多個標記進行敏感的和準確的檢測。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點是可以同時測定出SE(R)RS和熒光，這提供了對 方法的額外驗證。
本發(fā)明的優(yōu)點是對SE(R)RS和熒光之一或兩者的實時測定可以為是否 存在特定的分析物提供快速的答案。
此外，熒光信號的出現(xiàn)即意味著樣品中存在著分析物。因此只通過檢 測熒光就可以提供快速的、定量的測定。
本發(fā)明的優(yōu)點還在于能夠提供內(nèi)標準物，使得能夠校正光學(xué)檢測、銀 納米顆粒聚集等中的變異。
本發(fā)明的優(yōu)點還在于不需要直接將標記吸附到表面就可以使得標記接 近SE(R)RS表面。不同的是，通過經(jīng)寡核苷酸雜交結(jié)合替代靶探針(包括標 記)和捕獲探針使得標記接近表面，這是可以容易控制的過程。通過這種方 式預(yù)防了對不同探針在SE(R)RS表面的表面吸附過程缺失控制的情況，而 這正是現(xiàn)有基于SE(R)RS檢測法的問題。
所附獨立和從屬權(quán)利要求給出了本發(fā)明的具體的和優(yōu)選的方面。從屬 權(quán)利要求的特征可以與獨立權(quán)利要求的特征以及在適當(dāng)?shù)那闆r下與其他從屬權(quán)利要求的特征相組合，而不僅只是權(quán)利要求中直接給出的那些特征。
在本發(fā)明的第一個方面，用置換檢測法確定出樣品中至少一種分析物 的存在和/或量，其中所述置換檢測法是基于以下步驟(a)使至少一個耙特 異性捕獲探針以及至少一個可置換的替代靶探針(已標記)接觸樣品，其中
靶特異性探針與SE(R)RS表面共價結(jié)合或者步驟(a)還包括使SE(R)RS表面 接觸靶特異性捕獲探針，以及(b)檢測通過可置換的替代耙探針和耙特異性 捕獲探針的結(jié)合形成的替代雜交體中的標記產(chǎn)生的信號，其中信號與樣品 中的分析物的存在和/或量成比例。
在這個方法中，步驟(a)還可以包括以下步驟(I)使可置換的替代耙探 針接觸靶特異性探針，以便獲得替代雜交體，其中靶特異性捕獲探針與 SE(R)RS表面共價結(jié)合并因此得到表面吸附的替代雜交體，或者步驟(I)還 包括使SE(R)RS表面接觸靶特異性捕獲探針，或者所述步驟(I)還包括使 SE(R)RS表面接觸替代雜交體，使得替代雜交體被吸附在SE(R)RS表面 上，形成表面吸附的替代雜交體；和(II)使樣品接觸表面吸附的替代雜交 體，以便容許分析物置換可置換的替代靶探針。
在這個方法中，步驟(b)還可以包括以下步驟(III)利用SE(R)RS和熒 光之一或兩者在步驟(I)后檢測表面吸附的替代雜交體上標記的信號；和(IV) 用與步驟(III)所用的檢測方法相同的檢測方法在步驟(II)后檢測表面吸附的 替代雜交體上標記的信號。在步驟(III)和(IV)中得到的信號差異與樣品中分 析物的存在和/或量成比例。
上述方法中的步驟(a)也還可以包括以下步驟(V)使可置換的替代耙 探針接觸靶特異性捕獲探針，以便獲得替代雜交體；(VI)使SE(R)RS接觸 替代雜交體，使得替代雜交體被吸附到表面，形成表面吸附的替代雜交 體；和(VII)使樣品接觸表面吸附的替代雜交體，以便容許分析物置換可置 換的替代靶探針。
為了能夠校準或校正變異例如聚集或光學(xué)變異，上述方法還引入了標 準，如通過步驟(c)接觸標準捕獲探針和標準探針(已標記)，據(jù)此獲得標 準雜交體，使SE(R)RS表面接觸標準雜交體據(jù)此獲得表面吸附的標準雜交 體，以及(d)檢測由所述表面吸附的標準雜交體的標記產(chǎn)生的信號。
在本發(fā)明的第二個方面，提供了替代靶探針和捕獲探針的組合，其中 替代靶探針的寡核苷酸的特征是解鏈溫度要比與捕獲探針的寡核苷酸100%互補的寡核苷酸的解鏈溫度更低，以及附著于替代耙探針上的標記還 具有表面增強(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和熒光活性之一或兩者。
在本發(fā)明的第三個方面，提供了用于檢測樣品中至少一種分析物的存 在或量的系統(tǒng)所用的一次性筒(cartridge)，其包括(a)—組源，包括樣品源、 至少一種替代靶源、至少一種靶特異性捕獲探針源、和至少一種檢測中所 用的添加物源；(b)接觸來自源的規(guī)定體積的裝置；和(c)用于確保為接觸裝 置提供源中的液體的裝置。該筒還可以包括至少一種內(nèi)標準試劑源，以及 用于檢測在所述接觸裝置中產(chǎn)生的信號的窗口。
在本發(fā)明的第四個方面，提供了用于檢測樣品中至少一種分析物的存 在或量的系統(tǒng)，包括(a)用于使至少一種靶特異性捕獲探針以及至少一種可 置換的替代靶探針(已標記)接觸樣品的裝置和(b)用于檢測通過可置換的替 代靶探針和耙特異性探針的結(jié)合形成的替代雜交體上的標記所產(chǎn)生的信號 的裝置。該系統(tǒng)還可以包括用于通過比較在從源向接觸工具提供試劑的不 同時間點在所述接觸工具中檢測到的檢測信號而計算出分析物的量的工 具。
本發(fā)明的教導(dǎo)容許設(shè)計出用于檢測樣品中分析物的改良方法和裝置。 通過下面的具體實施方式
以及結(jié)合


(其通過舉例說明的方式闡 述了本發(fā)明的原理)，本發(fā)明的上述的和其他的特征、特點和優(yōu)點都是顯而 易見的。這里的描述只是用于舉例說明的，并不限制本發(fā)明的范圍。下面 所引用的參考圖指的是附圖。

圖1是SERRS置換檢測的一個實施方式的示意圖。A:通過帶負電荷 的表面和帶正電荷的表面定位基團之間的電化學(xué)相互作用，包括與分析物 中靶序列互補的序列的捕獲探針被吸附到檸檬酸還原的銀納米顆粒的表面 上?？芍脫Q的替代靶探針與捕獲探針互補并因此與其雜交。通過這種方 式，SERRS染料接近于銀表面，并且可以檢測出強烈的SERRS信號。B: 在加入樣品之后，包括靶序列的分析物和替代靶探針競爭與捕獲探針雜 交。因為可置換的替代靶探針(包括一個或多個SNP)并非與捕獲探針完全 互補，因此與分析物的雜交是更為有效的，分析物因此可以從銀表面置換 出可置換的替代靶探針。SERRS信號因此與樣品中分析物的量成比例的減弱。
圖2是顯示作為波長函數(shù)的SERRS染料HEX的吸收光譜的圖。
圖3是顯示含有促進在銀表面發(fā)生吸附的氨基炔丙基部分的5'HEX標
記的寡核苷酸的SERRS光譜的圖。在寡核苷酸被吸附到精胺聚集的銀納米
顆粒之后，測定出SERRS信號(沒有背景校正)。
圖4是闡述本發(fā)明的一個實施方式的檢測方法的框圖。
圖5是本發(fā)明的一個實施方式的裝置的示意圖。
在不同的圖中，相同的附圖標記指的是相同的或類似的元件。
具體實施例方式
參照具體的實施方式以及特定的附圖描述了本發(fā)明，但是本發(fā)明并不 限定于此，而只受權(quán)利要求的限定。權(quán)利要求中的任何附圖標記都不構(gòu)成 對發(fā)明范圍的限制。在此所述的附圖都只是示例說明的以及非限制性的。 在圖中，為了舉例說明的目的， 一些元件的尺寸可以被放大以及不按標尺 繪制。在術(shù)語"包括"用于本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求的地方，其并不排除 其他元件或步驟。當(dāng)用不定冠詞或定冠詞表示單數(shù)名詞例如"一個"、"所 述"時，其包括多個名詞，除非有其他特別的說明。
此外，說明書和權(quán)利要求中的術(shù)語第一、第二、第三等被用于相似元 件之間的區(qū)分，并不一定被用于描述前后或時間的次序。要明白所用的術(shù) 語在合適的情況下是可以互換的，在此所述的本發(fā)明的實施方式能夠按不 同于在此所述或圖解的其他次序進行操作。
在此單獨地提供了下面的術(shù)語或定義，以有助于理解本發(fā)明。這些定 義不應(yīng)當(dāng)被解釋為具有比本領(lǐng)域人員所了解的定義更小的范圍。
定義
"分析物"在此指的是用本發(fā)明的方法檢測和/或定量的物質(zhì)。 "靶序列(target sequence)"在此指的是分析物內(nèi)的特定核苷酸序列，其 用于特異性檢測分析物。
"樣品"在此涉及相信其包括至少一種感興趣的分析物的組合物。 "對照樣品"在此涉及與樣品相同或非常相似的組合物。 "標記"在此指的是能夠產(chǎn)生可檢測的SE(R)RS或熒光信號的分子或材料。
"寡核苷酸"在此指的是5到200個核苷酸之間的序列，它可以是天然 存在的DNA或RNA核苷酸，修飾的或合成的核苷酸或核苷酸類似物，被 連接為DNA、 RNA、 PNA、或自其衍生的任何骨架變體的核苷酸。
"捕獲探針"在此指的是包括表面-定位基團(surface-seeking group)的寡 核苷酸序列，所述基團容許捕獲探針結(jié)合至SE(R)RS表面。捕獲探針的寡 核苷酸序列可以與靶序列互補("靶特異性捕獲探針")以及能夠特異性與靶 序列雜交或者可以與不同的預(yù)定的標準序列互補("標準捕獲探針")，其是 標準探針的一部分。
"替代靶探針(surrogate target probe)"在此指的是能夠特異性結(jié)合捕獲探 針的合成的、標記的寡核苷酸。"可置換的替代靶探針(displaceable surrogate target probe)"是以比未修飾的并與捕獲探針100%互補的序列的結(jié) 合強度更弱的強度結(jié)合捕獲探針的替代靶探針。在"不可置換的替代靶探 針"中，序列與捕獲探針、靶特異性捕獲探針或者標準捕獲探針("標準探 針")完全互補，造成了不可置換的替代靶探針和相應(yīng)的捕獲探針的強結(jié) 合。標記例如經(jīng)共價連接附著于替代靶探針，或者其可以是結(jié)合替代靶探 針的分離的實體。
"替代雜交體(smrogate hybrid)"在此指的是替代靶探針和捕獲探針的組合。
"靶雜交體"在此指的是分析物內(nèi)的靶序列和靶特異性捕獲探針的組合。
"標準雜交體"在此指的是標準探針和標準捕獲探針的組合，其與
SE(R)RS表面共價或非共價相連接。
"SE(R)RS表面"在此指的是能夠增強SE(R)RS標記的信號的材料。 "表面吸附的替代雜交體"、"表面吸附的靶雜交體"、和"表面吸附的標
準雜交體，，在此指的是分別被吸附到SE(R)RS表面上的替代雜交體、靶雜
交體和標準雜交體。
本發(fā)明提供了用于檢測樣品中一種或多種分析物的存在和/或量的方
法、工具和裝置。
本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)，即通過基于標記探針的置換可檢測出樣品中 的分析物，從而提供了不需要對分析物進行標記的一步式分析物特異性方法。這是一個重要的節(jié)省時間的改進，其還有助于提高檢測的可靠性，因 為可以用全部標準的和預(yù)制的試劑實施檢測。
本發(fā)明的方法、工具和裝置都是基于可置換的替代靶探針的應(yīng)用，所
述探針是被標記的，并且能夠與可以結(jié)合SE(R)RS表面的靶特異性捕獲探 針雜交。當(dāng)可置換的替代耙探針的標記是SE(R)RS標記時，與捕獲探針的 雜交以及與SE(R)RS表面的接觸會造成"表面吸附的替代雜交體"的生成， 這可以增強對標記的檢測。在可置換的替代靶探針序列中存在至少一個與 捕獲探針序列的錯配(非互補的核苷酸)會引起可置換的替代靶探針與捕獲 探針的結(jié)合減弱。在使包括與捕獲探針完全互補的靶序列的分析物接觸與 捕獲探針結(jié)合的替代靶探針(可以是這樣的或者是表面吸附的替代雜交體) 之后，可置換的替代靶探針被置換。
本發(fā)明的方法檢測的分析物可以是核酸。更具體地，分析物是DNA 例如基因、病毒DNA、細菌DNA、真菌DNA、哺乳動物DNA、質(zhì)粒 DNA、或DNA片段。分析物也可以是RNA例如病毒RNA、 mRNA、 rRNA。分析物也可以是cDNA、寡核苷酸、或合成DNA、 RNA、 PNA、 LNA、包括一或多個合成寡核苷酸的核苷酸序列、修飾的寡核苷酸或其他 核酸類似物。分析物可以是源自生物體的核酸，所述生物體包括但不限于 病毒、細菌、微生物例如沙門菌、鏈球菌、軍團菌、大腸桿菌、賈第蟲、 隱孢子蟲、立克次體、孢子、霉菌、酵母菌、藻類、阿米巴、甲藻、單細 胞生物體、病原體或多細胞生物體例如動物或人類的細胞。
其中含有本發(fā)明所針對檢測的分析物的樣品的性質(zhì)不是關(guān)鍵的，它們 可以是任何懷疑包括核酸的制品。樣品可以是包括生物材料的樣品，例如 但不限于機體組織或體液例如血液、唾液、精液、糞便或尿液、以及源自 或提取自這些生物材料的組合物。樣品可以包括生物材料例如細胞如組織 細胞、紅細胞、白細胞、血小板、死細胞的組分。可以通過拭子例如口腔 拭子、咽拭子、陰道拭子、尿道拭子、宮頸拭子、咽拭子、直腸拭子、傷 口拭子、膿腫拭子、鼻咽拭子等的方式從生物體中獲得所述材料。樣品可 以包括體液例如淋巴液、羊水、腦脊液、腹腔積液、胸腔積液、囊腫液、 滑液、玻璃體液、房水、囊液、洗眼液、眼睛吸出物、血漿、血清、肺灌 洗液、肺吸出物、或其部分或組分?？梢詮臋C體的任何組織的生物活檢材 料中獲得樣品。另外，組織培養(yǎng)細胞包括外植材料、原代細胞、次級細胞株等、以及裂解液、提取物、懸浮液或從任何細胞、組織或器官獲得的材 料也都被認為是在此所用的術(shù)語樣品的含義之內(nèi)。包括微生物或病毒的樣 品也是在利用本發(fā)明的方法進行的核酸檢測的范圍之內(nèi)。從法醫(yī)環(huán)境中獲 得的材料也是在術(shù)語"樣品"的預(yù)期含義之內(nèi)。樣品也可以包括食品和飲 料、環(huán)境樣品例如水、土壤、沙子等。這些列舉并非是排他性的。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，樣品被預(yù)處理，以便有助于用檢測方法
對分析物的檢測。提取核酸例如DNA或RNA是對本發(fā)明所針對的樣品的 常用的預(yù)處理。適用于提取核酸的方法和試劑盒是本領(lǐng)域可獲得的，并包 括基于苯酚-氯仿提取、鹽析DNA提取、和硫氰酸胍提取的方法和試劑 盒。
示例性的核酸分離技術(shù)包括(l)有機提取隨后乙醇沉淀，例如利用苯酚/ 氯仿有機溶劑(例如Ausbel等編，當(dāng)前分子生物學(xué)方案，包括直到2003年 6月的補遺，John Wiley & Sons,紐約)，優(yōu)選的利用自動化DNA提取 儀，例如Applied Biosystems (Foster City, Calif.)的341型DNA提取儀；(2) 固定相吸附法(例如Boom等的美國專利No. 5234809; Walsh et al., BioTechniques 10(4): 506-513 (1991));和(3)鹽誘導(dǎo)的DNA沉淀法(例如 Miller et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(3):9-10)，這些沉淀法通常被稱作"鹽 析"法?？梢杂蒙唐坊色@得的試劑盒加速這些方法，例如基因組DNA純 化試劑盒和總RNA分離系統(tǒng)(都來自Promega, Madison, Wis.)。此外，利用 例如ABI PRISM 6700自動化核酸工作站(Applied Biosystems, Foster City, Calif.)或ABI PRISM 6100核酸制備站以及相關(guān)的方案例如NucPrep Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant Tissue, Applied Biosystems Protocol 4333959 Rev， A (2002)、 Isolation of Total RNA from Cultured Cells, Applied Biosystems Protocol 4330254 Rev. A (2002)、以及 ABI PRISM Cell Lysis Control Kit, Applied Biosystems Protocol 4316607 Rev. C (2001)可以將這些方法自動化或半自動化。
上面預(yù)處理方法還可以包括片段化步驟，例如通過酶消化、剪切或超 聲處理、和/或酶擴增步驟例如經(jīng)PCR包括RT-PCR的擴增。更具體地， 當(dāng)需要敏感的檢測核酸時，可以在檢測分析物之前實施對靶DNA的PCR 擴增。因此，在這個實施方式中，被實施檢測的樣品包括擴增的PCR產(chǎn) 物。本發(fā)明的方法被設(shè)計用于檢測單鏈(SS)核酸。因此，為了用本發(fā)明的方 法檢測雙鏈(ds)核酸，需要將雙鏈核酸變性，使得兩條鏈分離成為單核苷 酸鏈。DNA變性法包括高溫孵育(在DNA解鏈點以上的溫度，通常使用 95。C溫度，這可以造成樣品中絕大多數(shù)酶活性的自發(fā)滅活)，隨后立即將 其放入到冰中，以避免鏈的復(fù)性。也可以用低鹽濃度或高pH變性DNA。 已經(jīng)描述了一些用于從PCR產(chǎn)物的dsDNA生成ssDNA的方法。這些方法 包括不對稱PCR、利用化學(xué)修飾的引物的PCR，這會合成不等長的鏈，以 及對一條經(jīng)合適修飾的鏈進行優(yōu)先的外切酶消化，之后經(jīng)純化步驟分離出 ssDNA (Pragratis N.C.， 1996， Nucl. Acids Res" 24:3645-3646)。
本方法提供了涉及利用標記的檢測和/或定量的置換檢測法。雖然本發(fā) 明的方法利用了 SE(R)RS標記和SE(R)RS表面的組合信號的特殊性能，但 是本發(fā)明指出利用基于SE(R)RS的檢測或檢測標記的熒光，或者利用基于 SE(R)RS和基于熒光的檢測可以實施對樣品中分析物的檢測和/或定量。本 發(fā)明的方法的這個特點是基于以下的事實(a)絕大多數(shù)SE(R)RS標記也都 是熒光標記，反之亦然；和(b) SE(R)RS表面的接近性對從標記檢測到的 SE(R)RS和熒光信號具有相當(dāng)大的逆向的影響。
SE(R)RS標記通常從金屬表面的接近性的信號強度強化作用中獲益。 當(dāng)標記被吸附到或者鄰近SE(R)RS表面(相距的距離可以增強它們的拉曼散 射)時，標記的發(fā)射熒光可以被金屬表面淬滅。當(dāng)標記位于更遠離表面的位 置時，增強了熒光而不是拉曼散射。
當(dāng)進一步增加距離時，對熒光的增強作用也逐漸消失。因此，當(dāng)標記 與SE(R)RS表面非常接近時，增強了 SE(R)RS信號，并淬滅了熒光信號。 另一方面，當(dāng)標記離開SE(R)RS表面附近時，SE(R)RS信號逐漸消失，而 熒光信號仍可被檢測到。
但本發(fā)明方法中對分析物的檢測法依據(jù)于SE(R)RS時，對SE(R)RS信 號和/或其強度的檢測與樣品中分析物的量成反比例。事實上，當(dāng)通過雜交 的可置換的替代靶探針和捕獲探針的復(fù)合物即所謂的"替代雜交體"提供信 號時，樣品中分析物濃度的增加會造成可置換的替代靶探針的置換增加以 及SE(R)RS信號的減弱。
此外，本發(fā)明中對分析物的SE(R)RS檢測需要標記，所述標記是 SE(R)RS活化材料，即當(dāng)被合適地照亮?xí)r其能夠產(chǎn)生SERS或SERRS光譜，在此也被稱作SE(R)RS標記或染料。SE(R)RS標記的非受限的實例包 括熒光素染料例如5-(和6-)羧基-4',5'-二氯-2'，7'-二甲氧基熒光素、5-羧基-2'，4',5',7'-四氯熒光素和5-羧基熒光素；羅丹明染料例如5-(和6-)羧基羅丹 明、6-羧基四甲基羅丹明和6-羧基羅丹明X;酞菁例如甲基酞菁、亞硝酰 基酞菁、磺酰基(sulphonyl)酞菁和氨基酞菁；偶氮染料、偶氮甲堿、青色 素和黃嘌呤例如甲基衍生物、亞硝?；苌?、磺胺基(sulphano)衍生物和 氨基衍生物；和琥珀酰熒光素。可以用任何傳統(tǒng)的方式取代每種標記，生 成大量有用的標記。值得注意的是，對標記的選擇受到一些因素的影響， 例如標記的共振頻率、樣品中其他分子的共振頻率等。在例如美國專利No. 5306403、 6002471 、和6174677的領(lǐng)域描述了用于檢測生物分子的 SE(R)RS標記。
當(dāng)標記檢測依據(jù)于熒光時，對信號和/或其強度的檢測與樣品中分析物 的量直接成比例。事實上，當(dāng)標記沒有與捕獲探針結(jié)合(或者被置換掉) 時，就只能檢測到與可置換的替代靶探針結(jié)合的標記的熒光信號，樣品中 分析物濃度的增加會造成可置換的替代靶探針的置換增加以及熒光信號的 增加。
當(dāng)標記檢測依據(jù)于熒光時，使用熒光標記。熒光標記包括但不限于異 硫氰酸熒光素(FITC)、羧基熒光素例如四甲基羅丹明(TMR)、羧基四甲基 羅丹明(TAMRA)、羧基-X-羅丹明(ROX)、磺基羅丹明(德克薩斯紅TM)、熒 光素紅和熒光素橙、藻紅蛋白、藻青蛋白和Crypto-FluorTM燃料等。
在具體實施方式
中，本發(fā)明提供了檢測熒光和SE(R)RS檢測的方法。 包括檢測替代靶探針的標記的熒光和SE(R)RS信號的方法提供了對準確性 的額外控制，因為它們?nèi)菰S直接和間接的檢測樣品中分析物的存在和/或 量。在這些方法中，使用適用于兩種檢測方法的標記。更具體地，利用選 自由HEX(2，5,l，，3，，7，,9，,-六氯-6-羧基熒光素)、熒光素、和TET (6-羧基-2',4，7,7'-四氯熒光素)組成的組中的標記實施本發(fā)明的方法。
在本發(fā)明中，標記附著于替代靶探針，其可以是可置換的或者不可置 換的替代靶探針。通過在現(xiàn)有技術(shù)(例如，美國專利6127120)中所述的方法 可以實施標記與寡核苷酸的附著。例如在美國專利4962037、 5405747、 6136543、和6210896中描述了用于通過將標記整合到寡核苷酸內(nèi)來制備標 記寡核苷酸的其他方法。在本發(fā)明的一個具體實施方式
中，使用了SE(R)RS標記，其直接地或者經(jīng)接頭化合物附著于核苷酸探針。含有被設(shè) 計成與其他分子例如核苷酸或核酸共價反應(yīng)的反應(yīng)基團的SE(R)RS標記是 商品化可獲得的(例如Molecular Probes、 Eugene、 Oreg)?？梢詮臉藴噬虡I(yè) 來源(例如，Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Ind.; Promega Corp., Madison, Wis.; Ambion, Inc., Austin, Tex.; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, N丄)購得共價附著于核苷酸前體的SE(R)RS標記。
在本發(fā)明中，通過提供可置換的替代耙探針實施檢測，所述可置換的 替代靶探針是被標記的并包括與感興趣的分析物內(nèi)的靶序列相似的序列， 使得能夠與分析物競爭與捕獲探針的結(jié)合。通過提供以比分析物結(jié)合捕獲 探針的強度更低的強度結(jié)合捕獲探針的替代靶探針來確保分析物競爭并置 換所述可置換的替代靶探針的能力。在一個具體實施方式
中，解鏈溫度(TJ 被定義成其中50°/。雜交體被變性成單鏈的溫度，其中替代雜交體的解鏈溫 度要比耙雜交體的溫度更低。通過向可置換的替代靶探針的核苷酸序列中 引入一個或多個修飾通?？梢源_保這一點，所述修飾實現(xiàn)了替代靶探針與 捕獲探針的結(jié)合。合適的修飾包括引入一個或多個單核苷酸多態(tài)性(SNP)、 插入(例如發(fā)夾結(jié)構(gòu))等。現(xiàn)有技術(shù)描述了多種不同的計算寡核苷酸的解鏈 溫度的方法，而因特網(wǎng)上可提供不同的來源基于算法的計算Tm的服務(wù)(例 如Stratagene: www.stratagene.com/OPCR/tnCalc.asp)。這些方法使得評價在
可置換的靶探針序列中整合一個或多個錯配對Tm的影響成為可能。雖然每
種方法都給出了稍微不同的結(jié)果，必須經(jīng)驗性地確定出最佳的TJ直，絕大 多數(shù)這些方法可用于提供可置換的靶探針在本發(fā)明中的適用性的指示。
可置換的替代靶探針和靶序列的寡核苷酸序列之間的解鏈溫度的差異 對應(yīng)于最佳的退火溫度的差異。如果退火溫度被定得太高，核苷酸序列(例 如探針、分析物)將不能有效地退火，如果退火溫度被定得太低，核苷酸序 列(例如探針、分析物)可以非特異性退火。當(dāng)在實施本發(fā)明的方法時，為 了保證分析物對可置換的替代靶探針的置換，要在退火溫度下實施分析物 和捕獲探針以及可置換的替代靶探針(其可以被任選地容許形成替代雜交體) 的接觸，所述退火溫度和可置換的替代靶探針的解鏈溫度相同或者優(yōu)選的 更高。因此，在一個實施方式中，可以在可置換的替代靶探針的解鏈溫度 下實施接觸步驟，更特別的是在比可置換的替代靶探針的解鏈溫度高0到 10°C之間的最佳退火溫度下實施接觸步驟，最特別的是在比可置換的替代靶探針的解鏈溫度高0到5°C之間的最佳退火溫度下實施接觸步驟。
要指出的是，可置換的替代靶探針和捕獲探針的接觸步驟包括在最佳
地比替代雜交體的解鏈溫度低2-6°C的退火溫度下的退火步驟。
也要指出的是，分析物和捕獲探針以及可置換的替代靶探針(其任選地 可被容許形成替代雜交體)的接觸步驟包括變性步驟(通常加熱到約90-95°C)，以及此后的在耙序列的最佳退火溫度(其比可置換的替代耙探針的 最佳退火溫度更高)下實施的退火步驟。當(dāng)分析物是雙鏈的分析物且需要對 雙鏈DNA變性以便容許檢測時，變性步驟可以是感興趣的步驟。當(dāng)不僅 需要樣品中的分析物的定性信息，也需要定量信息時，變性步驟也可以是 感興趣的步驟。
在具體實施方式
中，替代雜交體被設(shè)計成其Tm比靶雜交體的Tm低約 15到20°C。這通過例如在替代靶探針的寡核苷酸部分中包含一些錯配可 能是可行的。因此，替代雜交體在其中靶雜交體保持保守即捕獲探針仍退 火于耙序列的溫度下可以被完全解鏈。這個方法能夠利用溫和溫度下的單 個解鏈步驟。
在本發(fā)明的實施方式中，在解鏈和/或退火期間可以"實時"監(jiān)測可置換 的替代耙探針上出現(xiàn)的標記的信號檢測。
本發(fā)明的方法所用的不同試劑的接觸可以有所不同，這取決于所需的 檢測信號(以及從中獲得的信息)的性質(zhì)。在本發(fā)明的具體實施方式
中，首 先接觸捕獲探針和可置換的替代靶探針，并容許形成替代雜交體。在向該 雜交體中加入SE(R)RS表面之后，該替代雜交體的信號可以被檢測到并作 為基線檢測信號。然后使樣品接觸替代雜交體，樣品中的分析物可以從捕 獲探針中置換出可置換的替代靶探針。對剩余的替代雜交體的信號的檢測 是樣品中分析物的指示?；蛘撸梢酝瑫r接觸樣品、替代靶探針、和捕獲 探針。在另一個實施方式中，在加入SE(R)RS表面之前，使替代雜交體接 觸樣品。在后兩個實施方式中，沒有檢測過基線值，只能獲得存在分析物 的標記信號的指示。但是，如果例如在對照樣品中例如在測定大量相似的 樣品之前實施分離的測量，可以確定出基線值?；蛘?，如果向樣品中引入 包括不同SE(R)RS標記的內(nèi)標準物(如下所述)，可以確定出基線值。此 外，如果只需要定性信息，可以用檢測熒光(可置換的替代靶探針形成的) 驗證樣品中革巴序列的存在。在本發(fā)明的具體實施方式
中，捕獲探針與SE(R)RS表面共價結(jié)合，去除了對包括吸附到SE(R)RS表面的附加步驟的 需要。如上所述，在絕大多數(shù)情況中，通過檢測熒光信號可以互補或取代 SE(R)RS信號檢測。
在本發(fā)明另一個方面中，提供了其中分析物的檢測是基于如上所述的 競爭性SE(R)RS的方法，其中包括(內(nèi))標準雜交體，以便校正檢測的聚集 和光學(xué)變異。在這個方面中，方法還包括加入能夠形成"標準雜交體"的作 為標準探針和標準捕獲探針的捕獲探針及其互補的標記探針的步驟。在一 個具體實施方式
中，標準雜交體是內(nèi)標準物，即被加入到樣品中的內(nèi)標準 物。為了能夠區(qū)分出標準雜交體和樣品中替代雜交體的信號，使用了不同 的SE(R)RS(和/或熒光)標記。在另一個具體實施方式
中，向一部分樣品中 加入標準雜交體。在仍一個具體實施方式
中，向?qū)φ諛悠分屑尤霕藴孰s交 體。當(dāng)測量大量的相似樣品時，后兩個實施方式是特別有用的。
在一個實施方式中，標準捕獲探針的序列與檢測所用的捕獲探針的序 列相同，且標準探針是不可置換的替代耙探針。當(dāng)不可置換的替代耙探針 的Tm比可置換的替代探針的Tm更高時，分析物在替代靶探針的Tm下不 會從捕獲探針中置換出不可置換的替代靶探針。或者，標準捕獲探針的核 苷酸序列不是耙特異的而是(任意的)序列，其特異性結(jié)合相應(yīng)的標準探 針。這就避免了標準雜交體和分析物檢測之間的任何相互作用，甚至當(dāng)整 合了更高的溫度步驟使得可以在檢測(或需要時加入SE(R)RS表面)之前的 任何時間實施向樣品中加入標準雜交體(雜交體或者其單個的組分)時。此 外，提供不同于分析物的標準探針和標準捕獲探針組合可以容許在不同的 檢測中使用相同的標準雜交體。
在本發(fā)明中，描述了置換監(jiān)測，其利用了表面增強光譜(以及任選地其 對熒光的固有的作用)的特殊性能。表面增強光譜檢測例如SE(R)RS是依據(jù) 于在被吸附到或非常接近于G ±30 A)粗糙金屬表面上的分析物上所觀察到 的拉曼散射的強烈增強作用。在本發(fā)明中，通過加入合適的SE(R)RS表面 檢測出SE(R)RS標記。表面通常是貴金屬(Au、 Ag、 Cu)或堿金屬(Li、 Na、 K)表面。金屬表面例如可以是刻蝕的或其它粗糙的金屬表面、金屬溶 膠或者在一個具體實施方式
中，金屬膠體顆粒聚集成金屬溶膠可以確保拉 曼散射增強大于108-1014。在本發(fā)明的檢測法中，制成SE(R)RS表面的金 屬納米顆粒也可以被排列成金屬納米島膜、基于金屬涂層的納米顆粒的基材、具有包埋的金屬納米顆粒的聚合物膜等。金屬表面可以是裸金屬或者 可以包括金屬表面上的金屬氧化物層。這可以包括有機涂層例如檸檬酸或 合適聚合物例如多賴氨酸或多酚的涂層，以便增加其吸著質(zhì)能力。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，制成SE(R)RS表面的金屬膠體顆粒是按 可控模式聚集的納米顆?；蚰z體納米顆粒，例如US 2005/0130163 Al所 述。制備納米顆粒的其他方法也是已知的(例如美國專利6054495、 6127120、和6149868)。也可以從商業(yè)來源(例如Nanoprobes Inc., Yaphank, N.Y,; Polysciences， Inc., Warrington, Pa.)獲得納米顆粒。金屬顆?？梢允侨?何形狀的，只要它們能夠產(chǎn)生SE(R)RS作用。它們的直徑通常約為4到 50nm，最特別是在25到40nm之間，這都取決于金屬類型。
在另一個具體實施方式
中，SE(R)RS表面是銀或金納米顆粒的膠體懸 浮液或者其聚集的膠體。通過使用聚氨例如聚L-賴氨酸或精胺可以確保所 聚集的膠體顆粒的最佳尺寸和形狀，這對于檢測的重復(fù)性和校準性是關(guān)鍵 的。因為所聚集的膠體的大小可以隨著時間發(fā)生改變，理想上可以在檢測 樣品上原位形成膠體，以及之后應(yīng)當(dāng)立刻獲得SE(R)RS光譜(優(yōu)選的在聚集 約15分鐘內(nèi))。
在另一個具體實施方式
中，SE(R)RS表面是由金納米顆粒組成，所述 金納米顆粒通過在共價連接捕獲探針和金納米顆粒之后加入氫醌銀而經(jīng)銀 涂覆。最特別的，在這個實施方式中，SE(R)RS表面是由分別經(jīng)金或銀薄 層(l到數(shù)納米)涂覆的銀或金納米顆粒組成的。
在仍另一個實施方式中，SE(R)RS表面是由銀或金的穩(wěn)定的納米顆粒 簇組成的，所述簇是通過與雙或多官能大分子(telemer)的交聯(lián)形成的，所 述大分子可以與所述簇化學(xué)結(jié)合。
在本發(fā)明利用SE(R)RS檢測和熒光檢測之一或兩者的檢測和/或定量方 法中，通過結(jié)合替代靶探針和捕獲探針(后者與SE(R)RS表面相連)可以使 得替代靶探針的標記非常接近于SE(R)RS表面?？梢酝ㄟ^共價鍵或非共價 鍵結(jié)合捕獲探針和SE(R)RS表面。用于結(jié)合寡核苷酸與SE(R)RS表面的各 種方案和方式是本領(lǐng)域己知的(美國專利612712和6972173)，并且都可以 被應(yīng)用于結(jié)合捕獲探針或替代雜交體和SE(R)RS表面。
在一個實施方式中，捕獲探針對SE(R)RS表面的附著是通過共價鍵進 行的。捕獲探針與表面定位基團相吻合，以便促進或有助于探針化學(xué)吸附于SE(R)RS表面。表面定位基團可溶于溶液，但是優(yōu)選地與SE(R)RS表面 相互作用。通過將一個或多個官能團整合到捕獲探針的寡核苷酸部分內(nèi)可 以確保這一點。合適的官能團包括Lewis堿例如硫醇和胺類，其容易被加 到核酸內(nèi)。表面定位基團的其他實例包括絡(luò)合基團例如氮、氧、硫和磷供 體、螯合基團、橋接配體和多聚體形成配體。對于金表面而言，含磷和硫 的基團是特別優(yōu)選的。
在一個具體實施方式
中，捕獲探針的表面定位基團是能夠使得捕獲探 針與SE(R)RS表面共價相連的苯并三唑。
在另一個具體實施方式
中，捕獲探針的表面定位基團是由至少一個能 夠使得捕獲探針與SE(R)RS表面共價相連的巰基組成。
優(yōu)選的官能團是能夠提供附加的陽離子位點(在所用的條件之下)的基 團，例如包括氨基的基團，優(yōu)選的是伯胺基團。在一個優(yōu)選的實施方式 中，捕獲探針的表面定位基團包括帶正電荷的炔丙胺部分。在另一個實施 方式中，通過加入單體的或多聚體的多胺，更特別的加入短鏈脂肪族多胺 例如精胺可以確保捕獲探針對金屬SE(R)RS表面的吸附。因此，在一個實 施方式中，本發(fā)明的方法包括在檢測之前向樣品中加入多胺。應(yīng)當(dāng)在獲得 SE(R)RS光譜之前，容許所述多胺與替代雜交體相互作用的時候引入多 胺。多胺優(yōu)選地是短鏈脂肪族多胺例如精胺、精脒、1,4-二氨基哌嗪、二 乙撐三胺、N-(2-氨乙基)-l，3-丙二胺、三乙四胺和四乙撐戊胺。具有每重復(fù) 單位四個NH2基團的精胺特別適用于本發(fā)明。優(yōu)選地引入酸鹽形式例如氫 氯化物鹽的多胺。當(dāng)SE(R)RS表面是膠體(見上)時，這是最為常用的。所 加入的多胺的量優(yōu)選地比獲得多胺對表面的單層覆蓋所需的量多100到 1000倍數(shù)量級。過量的多胺在表面上形成涂層，確保了捕獲探針和/或替代 雜交體的最佳的膠體聚集和吸附。
如上所述，本發(fā)明的方法特別涉及基于表面增強(共振)的拉曼光譜學(xué) 或SE(R)RS的檢測和/或定量方法。雖然在此通常指的都是SE(R)RS，要明 白基于其他類型的表面增強光譜學(xué)的檢測方法也是本發(fā)明所針對的，例如 但不限于表面增強熒光、正常(Stokes或抗Stokes)拉曼散射、共振拉曼散 射、同相(Stokes或抗Stokes)拉曼光譜(CSRS或CARS)、表面增強(共 振)CARS、受激拉曼散射、反向拉曼光譜、受激增益拉曼光譜、高拉曼散 射、表面增強高拉曼散射、分子光學(xué)激光檢測儀(MOLE)或拉曼微探針或拉曼顯微鏡或共聚焦拉曼顯微光譜儀、三維或掃描拉曼、拉曼飽和光譜、時
間分辨共振拉曼、拉曼去耦合光譜或uv-拉曼顯微鏡。
在本發(fā)明的一個特別的實施方式中，本發(fā)明的檢測方法涉及SERRS， 因為在標記的共振頻率時的操作得到了增加的敏感性。在這種情況中，被 用于生成拉曼光譜的光源是相干光源例如激光，其基本上被調(diào)頻到所用標 記的最大吸收頻率。當(dāng)標記和SE(R)RS表面和替代靶探針的寡核苷酸相連 時，該頻率可能會輕微偏移，但是熟練人員能夠很好地調(diào)頻光源，以適應(yīng) 這一點。光源可以被調(diào)頻到接近標記的最大吸收的頻率或調(diào)頻到標記的吸 收光譜的次級峰處或其附近的頻率。SERRS還可以包括在活性表面或(聚 集)膠體上的等離子體的共振頻率實施的操作。
在本發(fā)明的基于SE(R)RS檢測的方法中，通常選出對應(yīng)于例如標記的 最大吸收的一個峰，只在該峰的波長處實施激發(fā)?；蛘撸?dāng)例如利用不同 的標記同時檢測不同的分析物時，必須要檢測出整個"指紋"光譜，以便鑒 定出不同的標記。利用整個指紋光譜(具有超過一個拉曼帶的光譜范圍)或 者利用一個獨特的拉曼帶，通常可以用多因素分析方法(例如部分最小二乘 法回歸、主成份回歸分析等)實施對所含每種標記的定性和/或定量的鑒 定。
在本發(fā)明的一個特別的實施方式中，本發(fā)明的方法涉及用表面增強(共 振)拉曼和熒光光譜(見上)同時實施的檢測。
通常利用來自激光的具有可見光光譜頻率的入射光實施基于SE(R)RS 檢測法中的檢測步驟。所選的實際頻率取決于標記、表面和分析物。對于 貴金屬表面例如銀和金而言，可見光光譜中的綠光或紅光區(qū)的頻率大體上 易于得到更好的表面增強作用。但是，也可以使用其他頻率例如紫外線或 近紅外線范圍內(nèi)的頻率的狀態(tài)。對具有合適頻率和功率的合適光源的選擇 以及必要時的調(diào)頻都是在本領(lǐng)域人員的能力范圍之內(nèi)，特別是在參照可獲 得的SE(R)RS文獻的情況下。
用于基于SE(R)RS檢測法的激發(fā)源包括但不限于氮激光、氦鎘激光、 氬離子激光、氪例子激光等。多個激光可以提供較廣的激發(fā)光線的選擇， 這對于共振拉曼光譜是重要的。在一個具體的實施方式中，氬離子激光被 用于LabRam集成裝置(Jobin Yvon)，其激發(fā)波長為514.5nm。
利用帶通濾波器光譜方法純化出激發(fā)束，并且用6倍接物鏡可以將其聚焦于基材。通過使用全息分光鏡生成激發(fā)束和發(fā)射的拉曼信號的直角幾 何學(xué)可以將接物鏡用于激發(fā)樣品以及收集拉曼信號。需要測定出拉曼信號
相對于激發(fā)束的強背景的強度。背景主要是Rayldgh散射光和鏡面反射， 通過高效濾光片可以將其選擇性地去除。例如，可以用全息陷波濾波器減 少Rayleigh散射線。
用拉曼檢測儀檢測出表面增強拉曼發(fā)射信號。各種可能用于拉曼光譜 的檢測單元是本領(lǐng)域己知的，可以使用任何己知的拉曼檢測單元。例如在 美國專利US 6002471中參數(shù)了拉曼檢測單元的實例。可以使用其他類型的 檢測儀例如電荷耦合裝置(CCD)、具有紅光增強強化的電荷耦合裝置(RE-ICCD)、硅光電二極管、或單個或系列排列的用于級聯(lián)擴增信號的光倍增 管。光子計數(shù)電子學(xué)可以用于敏感檢測。對檢測儀的選擇主要取決于實施 特殊檢測所需的檢測敏感度。 一些裝置適用于收集SE(R)RS信號，包括波 長選擇鏡、用于散射光檢測的全息光學(xué)元件以及導(dǎo)光纖維波導(dǎo)儀。例如 WO 97/05280討論了各種方案。
用于獲得和/或分析SE(R)RS光譜的裝置可以包括一些形式的數(shù)據(jù)處理 器例如計算機。SE(R)RS信號一旦被合適的檢測儀捕獲，其頻率和強度信 號通常被傳輸?shù)接嬎銠C進行分析。比較指紋拉曼光譜和參照光譜以便鑒定 出所檢測的拉曼活性化合物或者用測定頻率的信號強度計算出所檢測的拉 曼活性化合物的量。
本發(fā)明的具體實施方式
提供了用于檢測樣品中的兩個PCR產(chǎn)物基因A 和基因B的SE(R)RS置換檢測法。方法基本如下所示。分別接觸基因A和 基因B的捕獲探針以及它們相應(yīng)的攜帶標記HEX和TET的替代靶探針， 并容許其雜交。捕獲探針含有促進吸附到銀表面上的表面定位基團。替代 靶探針和捕獲探針的雜交生成了基因A和基因B的每個靶序列的替代雜交 體。替代雜交體隨后被吸附到銀納米膠體上。實施第一個SE(R)RS測量。 加入含有所擴增的基因A和B的樣品。在95°C變性以解離替代靶和雙鏈 PCR產(chǎn)物之后，將溫度降低到退火溫度，所述退火溫度對于退火分析 DNA(即變性的基因A和B)和它們相應(yīng)的捕獲探針是最佳的溫度，以及對 于退火替代靶探針和這些探針是次最佳的溫度。通過這種方式發(fā)生了分析 DNA和替代靶探針之間的競爭，這將造成從表面吸附的替代雜交體中有效 地置換出替代靶探針。如上討論所示，置換情況在比替代雜交體的Tm更高的退火溫度時是最佳的。第二個SE(R)RS測量將生成比在加入分析物之 前更低的SE(R)RS信號，因為附著于所置換的替代靶探針的SE(R)RS標記 不再足夠接近于SE(R)RS表面。任選地，同時或者取代SE(R)RS測定熒 光。由于淬滅的原因，替代雜交體中標記的熒光接近為零。如果樣品中存 在分析物，信號將因此增加，因為替代靶探針的置換去除了淬滅的來源。 每個基因所置換的替代靶探針的量是樣品中存在的基因A禾卩B的量的指 示。
圖5是本發(fā)明的一個實施方式的系統(tǒng)100的示意圖。系統(tǒng)100適用于 利用基于SE(R)RS和熒光的置換檢測法檢測以及任選地定量樣品中至少一 種分析物的存在。它包括用于提供樣品的源101、至少一個用于提供替代 靶探針的源102、至少一個用于提供捕獲探針的源103、以及任選的至少一 個用于提供作為內(nèi)標準物的試劑的源104以及至少一個作為檢測中的添加 劑的源105。裝置還包括工具107，其中接觸并呈遞用于檢測的替代耙探 針、捕獲探針和分析物。接觸工具107也包括用于確保接觸工具內(nèi)的合適 溫度的加熱設(shè)備。
裝置還包括工具106，其用于
a) 為工具107提供用于接觸替代耙探針和捕獲探針以生成替代雜 交體的分別來自源102和103的替代靶探針和捕獲探針；
b) 為工具107提供用于接觸替代雜交體和SE(R)RS表面使得能夠 檢測附著于替代靶探針上的SE(R)RS標記的來自源105的添加物；
c) 為工具107提供包括用于接觸樣品和替代雜交體使得能夠置換 替代靶探針的來自源101的分析物的樣品；
d) 為工具103提供用于校準檢測的聚合物形成的變異以及光學(xué)變 異的來自至少一種源104的至少一種內(nèi)標準物試劑。
工具106可以包括樣品和/或分析物的重量分析進料，也可以包括管道/ 管路和閥門例如可選擇及可控的閥門的排列，以容許給接觸工具107提供 來自源IOI、 102、 103、 104和105的液體?；蛘?，也可以將來自源101到 105的液體泵入到接觸工具107內(nèi)。
組分的上述排列都可以位于筒111例如用于分子診斷的一次性筒111內(nèi)。
控制和分析電路109可以至少部分位于筒111內(nèi)或者可以任選地位于筒111夕卜，其可以被任選地提供用于控制工具106的操作。通過與筒表面
合適的接觸例如通過終端可以將控制和分析電路109與工具106相連接。
此外，提供了用于檢測標記的工具108。工具108可以與筒111整 合，或者可以位于筒的外面，筒lll提供了視窗，使得檢測工具108可以 檢測樣品等。工具108可以處于控制和分析電路109的控制之下。檢測工 具108可以是能夠使用如上提及的SE(R)RS和熒光檢測法的檢測儀。工具 108可以包括激發(fā)光源、濾波器和檢測儀。用于檢測的工具通常包括分光 光度儀。檢測的代表性信號可以提供給控制和分析電路109，其可以被采 用實施如上所述的本發(fā)明的任一分析算法?？梢栽谌魏魏线m的展示工具 IIO例如視覺展示單元、繪圖儀、打印機等上展示結(jié)果?？刂坪头治鲭娐?109可以與局域網(wǎng)或廣域網(wǎng)連接，以便將結(jié)果傳輸?shù)竭h距離的地方?？梢?用任何合適的方式應(yīng)用控制和分析電路109，例如專用硬件或合理編程的 計算機、微控制器或包埋處理器例如微處理器、程序控制的門陣列例如 PAL、 PLA或FPGA等。
在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，源101中的樣品可以是含有從 PCR反應(yīng)中獲得的DNA的溶液。這個實施方式特別適用于分子診斷的一 次性筒，其可以包括細胞裂解站和PCR反應(yīng)站，特別是多路PCR反應(yīng) 站。然后PCR反應(yīng)站的輸出形成了源101。用于檢測擴增寡核苷酸的源 103中的捕獲探針是分析物特異性寡核苷酸探針。源102中的替代靶探針 是附著有SE(R)RS標記的適用于SE(R)RS和熒光檢測的寡核苷酸探針。在 一個具體實施方式
中，替代靶探針的核苷酸序列含有SNP，使得替代靶探 針與捕獲探針的結(jié)合是次最佳的。源104可以含有預(yù)定量的形成(不可置換 的)標準雜交體的內(nèi)標準物。第一源105含有合適的金屬表面例如經(jīng)金屬表 面涂覆的膠體顆?；蛑?，特別是經(jīng)金屬表面涂覆的可聚集的膠體顆?；?珠。第二源105可以含有聚集劑例如精胺。
在這個具體實施方式
中，適當(dāng)提供及接觸來自源101到105中的試劑 形成了含有表面吸附的替代雜交體和表面吸附的標準雜交體的接觸工具 107。在該點實施的第一次測量作為參照。隨后，加入樣品。在從捕獲探針 置換出替代靶探針之后，觀察到SE(R)RS信號的減弱和域熒光的增強。
具體表達本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的其他設(shè)置對于本領(lǐng)域人員是顯而易見的。本發(fā)明的另一個方面提供了本發(fā)明的系統(tǒng)、 一次性筒、組合和方法在 應(yīng)用例如但不限于醫(yī)學(xué)診斷例如感染性疾病的分子診斷、病理學(xué)、毒理 學(xué)、流行病學(xué)、生物戰(zhàn)、環(huán)境取樣、法醫(yī)學(xué)等中對樣品中分析物的檢測和/ 或定量中的用途。
要明白盡管在此已經(jīng)討論了本發(fā)明的裝置的具體構(gòu)造和配置以及材 料，只要不脫離本發(fā)明的范圍和精神就可以進行形式和細節(jié)方面的各種變 更或修飾。
實施例1:利用競爭性SERRS和內(nèi)校準來檢測并定量樣品中的特異基因
由流感病毒A的某些亞型在動物種群特別是雞中引起的高致病性禽流 感是持續(xù)的全球性人類公共衛(wèi)生的危險。禽流感A亞型H5N1病毒引起的 直接人類感染最近已經(jīng)造成了相當(dāng)高的病死率，這使得快速和準確診斷的 需要更為迫切。依據(jù)外在糖蛋白、血凝素(HA)和神經(jīng)酰胺酶(NA)的抗原差 異將A型流感病毒分成不同的亞型。本發(fā)明提供了一種通過用病毒核酸的 RT-PCR和SERRS對病毒進行亞型分類的新的、快速和準確的方法。
從臨床樣品中提取出病毒RNA，利用病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和Wright"" (1995), J. Clin. Microbiol., 33:1180-1184中的隨機引物生成與病毒RNA互補 的cDNA。用如WHO 2005年6月在日內(nèi)瓦發(fā)表的"鑒定人體樣品中的禽流 感A病毒的推薦實驗室檢查"中所述的兩組被分別設(shè)計成生成219和616bp PCR產(chǎn)物的特異于流感病毒亞型H5N1的HA和NA基因的引物實施多路 PCR。隨后用競爭性SERRS檢測出所擴增的產(chǎn)物。
分別設(shè)計出兩個與HA和NA內(nèi)的區(qū)域互補的分析物特異性探針即捕 獲探針，其具有由帶正電荷的炔丙胺部分組成的用于附著于銀納米顆粒上 的表面定位基團。分別經(jīng)SERRS染料HEX和TET標記的兩個附加的合成 寡核苷酸即替代靶被設(shè)計成分別與HA-和NA-捕獲探針的一部分互補，除 了一個錯配(SNP)外。
在使相應(yīng)的捕獲探針接觸替代靶探針之后，形成了替代雜交體。但 是，由于替代靶探針序列中錯配的存在，替代靶探針及其相應(yīng)的HA-和 NA-捕獲探針被松散地退火。
向上述混合物中加入預(yù)定量的攜帶有不同于用于檢測的標記的標記的 作為不可置換替代雜交體的內(nèi)標準物，進行校準并校正聚合物形成和激發(fā)強度方面的可能變異。
第一步確定出HEX和TET的SERRS測量的參照點以及內(nèi)校準的參照 點。此后，混合上面制備的溶液和lOpI四氯精胺(100mM水溶液，新鮮制 備)，以及隨后混合250W水和250nl經(jīng)檸檬酸還原的銀納米顆粒(如Munro "a/. (1995)， Langmuir， 11:3712-3720所述的那樣制備)。替代雜交體在銀膠 體上的吸附使得HEX和TET染料非常接近于金屬表面，這樣就能夠進行 SERRS檢測，同時淬滅熒光。同樣，內(nèi)標準物在銀膠體上的吸附使得能夠 進行內(nèi)標準物染料的SERRS檢測。在混合后即刻，利用帶有提供514.5nm 激發(fā)波長的氬激光的LabRam系統(tǒng)(Jobin Yvon)從所制備的溶液中獲得 SERRS光譜。
為了檢測出所擴增的H5N1病毒的HA和NA基因，加入PCR反應(yīng)的 輸出物。在95°C下的變性之后，在合適退火溫度下的孵育形成了分析物 DNA禾n HA-及NA-捕獲探針的結(jié)合，后者(捕獲探針)附著于所聚集的銀膠 體上。因為分析物的序列優(yōu)選地互補于HA-和NA-特異性捕獲探針，分析 物DNA與HA-及NA-捕獲探針的雜交形成了在替代雜交體的解鏈溫度下 不可置換的靶雜交體。只要標準雜交體的Tm比替代雜交體的Tm更高， 那么上面的孵育步驟就不會影響標準雜交體。
在分析物DNA和捕獲探針結(jié)合后的即刻以及在第一次測量后的15分 鐘內(nèi)，得到第二個SERRS光譜?，F(xiàn)在由于染料所附著的替代靶探針從金屬 表面的置換就降低了 HEX和TET染料的SERRS信號的強度。現(xiàn)在就可以 計算出PCR輸出中HA或NA基因的量，因為它對應(yīng)于所置換的替代靶探 針的量。因此，需要比較第一次和第二次SERRS測量值。
為了校準的需要，比較了內(nèi)在標準物的第一次和第二次SERRS光譜， 并校正了強度變異。
本實施例表明利用競爭性SERRS可以實現(xiàn)對所擴增的病毒HA和NA 基因的準確檢測，且不需要標記所擴增的基因。
權(quán)利要求
1. 用于檢測樣品中至少一種分析物的存在和/或量的方法，包括以下步驟(a)使所述樣品接觸(i)至少一種靶特異性捕獲探針，其包括-能夠特異性結(jié)合所述分析物內(nèi)的靶序列的寡核苷酸，和(ii)至少一種可置換的替代靶探針，其包括-能夠特異性結(jié)合所述捕獲探針的寡核苷酸，-具有表面增強(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和熒光活性之一或兩者的標記，其中所述至少一種靶特異性捕獲探針與SE(R)RS表面共價結(jié)合或者所述步驟(a)還包括使所述至少一種靶特異性捕獲探針接觸SE(R)RS表面；和(b)檢測由至少一種替代雜交體中的所述標記產(chǎn)生的信號，所述替代雜交體由所述至少一種可置換的替代靶探針和所述至少一種靶特異性捕獲探針結(jié)合而形成，所述信號與所述樣品中所述至少一種分析物的存在和/或量成比例。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中步驟(a)包括以下步驟(I) 使所述至少一種靶特異性捕獲探針接觸所述至少一種可置換的替代 耙探針，以便獲得至少一種替代雜交體；其中所述至少一種靶特異性捕獲探針與SE(R)RS表面共價結(jié)合并因此 獲得至少一種表面吸附的替代雜交體；或者所述步驟(I)還包括使所述至少 一種靶特異性捕獲探針接觸SE(R)RS表面或者所述步驟(I)還包括使所述至 少一種替代雜交體接觸所述SE(R)RS表面，使得所述至少一種替代雜交體 吸附于所述表面上形成至少一種表面吸附的替代雜交體；(II) 使所述至少一種表面吸附的替代雜交體接觸所述樣品，以便容許 所述至少一種分析物置換所述至少一種可置換的替代靶探針；且其中步驟(b)包括以下步驟(III) 利用SE(R)RS和熒光之一或兩者在步驟(I)之后檢測所述至少一種 表面吸附的替代雜交體上的所述標記的信號；和(iv)利用與步驟(m)相同的檢測方法在步驟(n)之后檢測所述至少一種表面吸附的替代雜交體的信號；其中在步驟(m)和(iv)中獲得的信號的差異被認為與所述樣品中所述至少一種分析物的存在和/或量成比例。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟(a)包括以下步驟(V) 使所述至少一種靶特異性捕獲探針接觸所述至少一種可置換的替 代靶探針，以便獲得至少一種替代雜交體；(VI) 使所述至少一種替代雜交體接觸所述SE(R)RS表面，使得所述至 少一種替代雜交體吸附于所述表面上，形成至少一種表面吸附的替代雜交 體；和(VII) 使所述至少一種表面吸附的替代雜交體接觸所述樣品，以便容許 所述至少一種分析物置換所述至少一種可置換的替代靶探針。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中步驟II包括確保合適的退火條件，以容 許所述樣品中所述至少一種分析物與所述至少一種捕獲探針的雜交。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種可置換的替代靶探針包括 與所述至少一種捕獲探針的所述核苷酸序列并非100%互補的寡核苷酸序 列。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種靶特異性捕獲探針還包括 表面定位基團以及所述至少一種靶特異性捕獲探針通過所述表面定位基團 結(jié)合所述SE(R)RS表面。
7. 權(quán)利要求l的方法，還包括步驟 (c)使(m)標準捕獲探針，其包括-寡核苷酸，禾口-表面定位基團；接觸(iv) 標準探針，其包括-與所述標準捕獲探針的序列100%互補的寡核苷酸，和 -具有表面增強(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和熒光活性之一或兩者的標記；據(jù)此獲得標準雜交體；并接觸(v) SE(R)RS表面；據(jù)此獲得表面吸附的標準雜交體；和(d)檢測由所述表面吸附的標準雜交體中的所述標記產(chǎn)生的信號。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中將在步驟(c)中獲得的所述標準雜交體加 入到所述樣品中，且其中所述標準探針包括不同于所述至少一種替代耙探 針所具有的標記的標記。
9. 權(quán)利要求7的方法，其中所述標準捕獲探針包括不與所述靶序列 雜交的寡核苷酸序列。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中在不同于步驟(a)和(b)的容器中實施所述 步驟(c)和(d)。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中步驟(a)和(b)中的所述樣品是對照樣叩o
12. 權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種捕獲探針包括表面定位基團。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中所述表面定位基團是苯并三唑。
14. 權(quán)利要求1的方法，其中所述SE(R)RS表面是由金納米顆粒組成 的，所述金納米顆粒通過在所述捕獲探針和所述金納米顆粒的共價連接之 后加入氫醌銀而由銀涂覆。
15. 權(quán)利要求l的方法，其中SE(R)RS表面是銀或金納米顆粒的膠體 懸浮液或其聚集的膠體。
16. 權(quán)利要求1的方法，其中所述SE(R)RS表面是由分別涂覆有一薄 層(l到數(shù)納米)金或銀的銀或金納米顆粒組成的。
17. 權(quán)利要求1的方法，其中所述SE(R)RS表面是由銀或金的穩(wěn)定的 納米顆粒簇組成的。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中通過與能化學(xué)結(jié)合所述簇的雙官能或多 官能的大分子(telemer)的交聯(lián)形成所述簇。
19. 替代靶探針和捕獲探針的組合，其包括(i) 捕獲探針，其包括-寡核苷酸；(ii) 替代靶探針，其包括-能夠結(jié)合所述捕獲探針的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的特征是解鏈溫度低于與所述捕獲探針的寡核苷酸100%互補的寡核苷酸的解鏈溫度，-具有表面增強(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和熒光活性之一或兩者的 附著于所述替代耙探針上的標記。
20. 權(quán)利要求19的組合，其中所述捕獲探針與SE(R)RS表面共價結(jié)
21. 權(quán)利要求19的組合，其中所述捕獲探針包括能夠結(jié)合SE(R)RS表 面的表面定位基團。
22. 在檢測樣品中至少一種分析物的存在和/或量的系統(tǒng)中使用的一次 性筒(lll)，其包括(a) —組源，包括-樣品源(IOI);-至少一個替代靶源(102);-至少一個耙特異性捕獲探針源(103);-至少一個檢測中所用的添加物源(105);(b) 用于接觸來自所述源的規(guī)定體積的工具(107);禾口(c) 用于確保給接觸工具(107)提供來自所述源的液體的工具(106)。
23. 權(quán)利要求22的筒，還包括至少一個內(nèi)標準試劑源(104)。
24. 權(quán)利要求22的筒，還包括用于檢測所述接觸工具中產(chǎn)生的信號的 視窗。
25. 用于檢測樣品中至少一種分析物的存在或量的系統(tǒng)(IOO)，其包括(a) 工具(l(V7)，用于使所述樣品接觸(i) 至少一種靶特異性捕獲探針，其包括-能夠特異性結(jié)合所述分析物內(nèi)的靶序列的寡核苷酸，和(ii) 至少一種可置換的替代靶探針，其包括-能夠特異性結(jié)合所述捕獲探針的寡核苷酸，-具有表面增強(共振)拉曼散射(SE(R)RS)和熒光活性之一或兩 者的標記；和(b) 工具(10S)，用于檢測通過所述至少一種可置換的替代靶探針與所 述至少一種靶特異性捕獲探針結(jié)合而形成的至少一種替代雜交體中的所述 標記產(chǎn)生的信號。
26. 權(quán)利要求25的系統(tǒng)，還包括用于計算所述至少一種分析物的量的 工具(109)，所述計算通過比較在從所述源給所述接觸工具(107)提供試劑的 不同時間點上在所述接觸工具(107)中檢測到的檢測信號而進行。
27. 權(quán)利要求25的系統(tǒng)，其中用于檢測的所述工具(108)包括光源、濾 波器和檢測工具。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用SE(R)RS而不需要標記分析物來檢測樣品中的分析物(特別是核酸)的檢測方法。該檢測方法基于樣品中的分析物將標記的替代靶探針從捕獲探針置換。本發(fā)明也提供相應(yīng)的檢測系統(tǒng)、用于這種系統(tǒng)的一次性筒、以及替代靶探針和捕獲探針的組合。
文檔編號C12Q1/68GK101443461SQ200780017624
公開日2009年5月27日 申請日期2007年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月16日
發(fā)明者G·H·P·K·C·普亞迪拉, K·A·施密特, R·溫貝格爾-弗里德爾, R·范登哈姆 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司