專利名稱：：甲型流感病毒的檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒診斷學(xué)，更具體涉及甲型流感病毒的診斷。背景流感病毒在美國每年感染5-20%人群并引起30,000-50,000人死亡。雖然流感疫苗是預(yù)防感染的主要方法，但在美國還可使用四種抗病毒藥物金剛垸胺、金剛乙胺、奧塞米韋和扎那米韋。截止2005年12月，由于病毒M2蛋白中的氨基酸取代使病毒對金剛烷胺和金剛乙胺的耐受性提高，只推薦用奧塞米韋(TAMIFLU⑧)來治療甲型流感病毒?？焖俸蜏?zhǔn)確的流感實驗室診斷對初始檢測、在醫(yī)院和社區(qū)中成功控制爆發(fā)和指導(dǎo)治療至關(guān)重要。重要的是，早期給予藥物和患者對抗流感病毒治療的臨床反應(yīng)有直接關(guān)系。如果在發(fā)燒后前12個小時內(nèi)給予奧塞米韋，能夠在約72小時后減輕癥狀。如果在發(fā)生癥狀后48小時內(nèi)給予，能夠在1-2天內(nèi)緩解疾病。重要的是，難以區(qū)分甲型流感病毒的癥狀與其它病毒或細(xì)菌性呼吸道疾病。因此，快速鑒定流感病毒感染能夠為開始定向早期抗病毒治療提供機(jī)會，立即報道可防止不必要地使用抗生素。另外，準(zhǔn)確評價藥物功效取決于實驗室中是否可用準(zhǔn)確、快速、靈敏和特異性的檢測方法檢測流感病毒感染。發(fā)明概述本發(fā)明提供通過實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定生物樣品中甲型流感病毒核酸的方法。本發(fā)明提供了檢測甲型流感病毒的引物和探針，以及含有這類引物和探針的試劑盒?？墒褂帽景l(fā)明方法快速鑒定甲型流感病毒感染診斷樣品中的甲型流感病毒核酸。使用特定引物和探針時，該方法包括擴(kuò)增和用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)監(jiān)測特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的發(fā)生。在本發(fā)明的一個方面，提供了檢測來自個體的生物樣品中是否存在甲型流感病毒的方法。檢測甲型流感病毒核酸的方法包括進(jìn)行至少一個循環(huán)步驟，該循環(huán)包括擴(kuò)增步驟和雜交步驟。擴(kuò)增步驟包括使樣品接觸一對甲型流感病毒引物，以便在樣品中存在甲型流感病毒核酸分子時產(chǎn)生甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物。雜交步驟包括使樣品接觸一對甲型流感病毒探針。通常，甲型流感病毒探針對的成員能夠在不超過5個核苷酸上互相雜交。甲型流感病毒探針對中的第一種甲型流感病毒探針一般用供體熒光部分標(biāo)記，甲型流感病毒探針對中的第二種甲型流感病毒探針用對應(yīng)受體熒光部分標(biāo)記。該方法還包括檢測第一種甲型流感病毒探針的供體熒光部分和第二種甲型流感病毒探針的受體熒光部分之間是否存在FRET。存在FRET通常表明樣品中存在甲型流感病毒，而不存在FRET通常表明樣品中不存在甲型流感病毒。甲型流感病毒引物對通常包括第一種甲型流感病毒引物和第二種甲型流感病毒引物。第一種甲型流感病毒引物可包含序列5'-TAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCT-3，(SEQIDNO:l)，和/或第二種甲型流感病毒引物可包含序列5'-GGCATTTTGGACAAAGCGTCTA國3，(SEQIDNO:2)。第一種甲型流感病毒探針可包含序列5，-CGAAATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-3，(SEQIDNO:3)，和/或第二種甲型流感病毒探針可包含序列5，-TTGCTGGGAAAAACACAGATCTTGAGGC-3，(SEQIDNO:4)。在一些方面，一種甲型流感病毒引物可用熒光部分(供體或受體，視需要定)標(biāo)記，可代替一種甲型流感病毒探針。甲型流感病毒探針對成員可以在不超過2個核苷酸上互相雜交，或者可以不超過1個核苷酸上互相雜交。代表性供體熒光部分是熒光素，相應(yīng)受體熒光部分包括LC-Red640、LC-Red705、Cy5和Cy5.5。本領(lǐng)域已知其它對應(yīng)的供體和受體熒光部分。在一個方面，檢測步驟包括以供體熒光部分的吸收波長激發(fā)該樣品和觀察和/或測定受體熒光部分發(fā)射的波長(即觀察和域測定FRET)。在另一方面，檢測步驟包括定量測定FRET。在另一方面，可以在各循環(huán)步驟后進(jìn)行檢測步驟(如實時檢測)。通常，在45個循環(huán)(如40、35、30、25或20個循環(huán))內(nèi)出現(xiàn)FRET表明該個體存在甲型流感病毒感染。此外，檢測甲型流感病毒探針中一種或兩種與甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物之間的解鏈溫度可確認(rèn)是否存在甲型流感病毒。代表性呼吸道生物樣品包括咽喉擦拭物、咽喉洗液、鼻腔擦拭物和下呼吸道樣品。生物樣品也可包括唾液，如美國專利號6,811,971所述。上述方法還可包括防止污染核苷酸的擴(kuò)增。防止擴(kuò)增包括在尿嘧啶存在下進(jìn)行擴(kuò)增步驟和在擴(kuò)增前用尿嘧啶-DNA糖基化酶處理樣品。此外，可以在對照樣品上進(jìn)行循環(huán)步驟。對照樣品可包括甲型流感病毒核酸分子的同一部分?；蛘?，對照樣品可包括不同于甲型流感病毒核酸分子的核酸分子?？梢栽谶@類對照樣品上用一對對照引物和一對對照探針進(jìn)行循環(huán)步驟。對照引物和探針不同于甲型流感病毒引物和探針。一個或多個擴(kuò)增步驟產(chǎn)生對照擴(kuò)增產(chǎn)物。各對照探針與對照擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。用本文所述方法檢測到生物樣品中的甲型流感病毒時，立即對獲得該生物樣品的患者進(jìn)行治療。治療可包括(例如)但不限于給予神經(jīng)氨酸酶抑制劑(如Tamiflu)、隔離或二者。在本發(fā)明另一方面，提供制品或試劑盒。本發(fā)明試劑盒可包括一對甲型流感病毒引物和一對甲型流感病毒探針，以及供體和相應(yīng)的受體熒光部分。例如，本發(fā)明試劑盒中提供的第一種甲型流感病毒引物可具有序列5，-TAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCT-3，(SEQIDNO:l)，和/或試劑盒中提供的第二種甲型流感病毒引物可具有序列5'-GGCATTTTGGACAAAGCGTCTA-3，(SEQIDNO:2)。本發(fā)明試劑盒中提供的第一種甲型流感病毒探針可具有序列5，-CGAAATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-3，(SEQIDNO:3)，和/或試劑盒中提供的第二種甲型流感病毒探針可具有序列5，-TTGCTGGGAAAAACACAGATCTTGAGGC-3，(SEQIDNO:4)。制品或試劑盒可包括標(biāo)記探針的熒光團(tuán)部分或已經(jīng)用供體或相應(yīng)受體熒光部分標(biāo)記的探針。試劑盒也可包括寫有使用引物、探針和熒光團(tuán)部分檢測樣品中是否存在甲型流感病毒的指南的包裝說明書。在另一方面，提供檢測來自個體的生物樣品中是否存在甲型流感病毒的方法。這類方法包括進(jìn)行至少一個循環(huán)步驟。循環(huán)步驟可包括擴(kuò)增步驟9和雜交步驟。通常，擴(kuò)增步驟包括使樣品與一對甲型流感病毒引物相接觸，以便在樣品中存在甲型流感病毒核酸分子時產(chǎn)生甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物。通常，雜交步驟包括使該樣品接觸甲型流感病毒探針。這類甲型流感病毒探針通常用供體熒光部分和相應(yīng)受體熒光部分標(biāo)記。該方法還包括檢測甲型流感病毒探針的供體熒光部分和受體熒光部分之間是否存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。是否存在熒光表明所述樣品中是否存在甲型流感病毒。在一個方面，擴(kuò)增可使用具有5'至3，外切核酸酶活性的聚合酶。因此，第一種和第二種熒光部分在探針長度上相距不超過5個核苷酸(如4、3、2或l個核苷酸)。在另一方面，甲型流感病毒探針包含能夠形成二級結(jié)構(gòu)的核酸序列。所述二級結(jié)構(gòu)的形成通常導(dǎo)致第一種和第二種熒光部分在空間上相互接近。根據(jù)這種方法，探針上所述第二種熒光部分可以是淬滅物。在本發(fā)明的另一個方面，提供了檢測來自個體的生物樣品中是否存在甲型流感病毒的方法。這類方法包括進(jìn)行至少一個循環(huán)步驟。循環(huán)步驟可包括擴(kuò)增步驟和染料結(jié)合步驟。擴(kuò)增步驟通常包括使樣品與一對甲型流感病毒引物相接觸，以便在樣品中存在甲型流感病毒核酸分子時產(chǎn)生甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物。染料結(jié)合步驟通常包括使甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物接觸雙鏈DNA結(jié)合染料。該方法還包括檢測雙鏈DNA結(jié)合染料是否結(jié)合到擴(kuò)增產(chǎn)物中。根據(jù)本發(fā)明，存在結(jié)合一般表明樣品中存在甲型流感病毒，不存在結(jié)合一般表明樣品中不存在甲型流感病毒。這類方法還可包括確定甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物和雙鏈DNA結(jié)合染料之間的解鏈溫度的步驟。通常，解鏈溫度確認(rèn)是否存在甲型流感病毒。代表性雙鏈DNA結(jié)合染料包括SYBRGREEN1、SYBRGOLD⑧和溴化乙啶。在另一方面，本發(fā)明能夠使用本文所述方法確定個體是否需要甲型流感病毒治療。甲型流感的治療可包括例如給予該個體神經(jīng)氨酸酶抑制劑(如Tamiflu)。本發(fā)明也提供使用本文所述制品確定個體是否需要甲型流感病毒治療。另外，本文所述的方法和/或制品可用于監(jiān)測甲型流感治療在個體中的有效性，以及用于流行病學(xué)研究以監(jiān)測甲型流感在人群(如村莊、城市或國家)個體之間和/或人群之間的傳播和進(jìn)展。本文所述的方法和/或制品(如試劑盒)可用于確定患者是否需要甲型流感病毒治療。除非另有說明，本文所用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義。雖然可采用與本文所述相似或等同的方法和材料實施或測試本發(fā)明，但下面描述了合適的方法和材料。此外，材料、方法和實施例僅為說明性而不具限制性。本文搜術(shù)的所有發(fā)表物、專利申請、專利和其它參考文獻(xiàn)均全文納入本文作參考。出現(xiàn)矛盾時，以本說明書、包括定義為準(zhǔn)。在附圖和下述描述中詳細(xì)描述了本發(fā)明的一種或多種實施方式。通過附圖和詳述以及權(quán)利要求書，不難了解本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明詳述本文描述了比現(xiàn)有實驗更靈敏、更特異地檢測生物樣品中甲型流感病毒的實時實驗。本發(fā)明提供檢測甲型流感病毒感染的引物和探針以及含有這類引物和探針的制品。與其它方法相比，實時PCR在檢測甲型流感病毒中的高靈敏度，以及實時PCR的改良特征，包括樣品封閉和擴(kuò)增產(chǎn)物的實時檢測，使得在臨床實驗室中使用這種技術(shù)來進(jìn)行甲型流感病毒感染的常規(guī)診斷成為可能。甲型流感病毒核酸和寡核苷酸本發(fā)明提供通過擴(kuò)增(例如)一部分甲型流感病毒核酸檢測甲型流感病毒的方法?？色@得甲型流感病毒的核酸序列。參見例如，流感序列數(shù)據(jù)庫(ISD)(因特網(wǎng)址flu.lanl.gov，參見刊于IV型流感控制選擇(Op"o朋/orAeCo"&o/。//"ywe"za/F)中的Macken等，2001，"Thevalueofadatabaseinsurveillanceandvaccineselection"(數(shù)據(jù)庫在監(jiān)視和疫苗選擇中的價值)，A.D.M.E.，Osterhaus和Hampson(編)，埃爾斯威爾科學(xué)公司(ElsevierScience),阿姆斯特丹，103-106頁)和基因組研究所(TheInstituteforGenomicResearch,TIGR)的微生物測序中心(MicrobialS叫uencingCenter,MSC)，因特網(wǎng)址為tigr.org/msc/infl_a_virus.shtml。具體說，本發(fā)明提供擴(kuò)增和檢測甲型流感病毒核酸分子的引物和探針。也可采用本文所述內(nèi)容以外的甲型流感病毒核酸來檢測樣品中的甲型流感病毒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可采用常規(guī)方法，例如但不限于本文所述的方法來評價本文所述內(nèi)容以外的甲型流感病毒核酸(如功能性變體)的(如)特異性和/或靈敏度。代表性功能性變體包括例如本文所述核酸中的缺失、插入和/或取代?？刹捎?例如)計算機(jī)程序如OLIGO(分子生物學(xué)研究公司(MolecularBiologyInsights,Inc.),科羅拉多州卡斯卡得(Cascade，CO))來設(shè)計擴(kuò)增甲型流感病毒核酸分子，如甲型流感病毒的引物。設(shè)計用作擴(kuò)增引物的寡核苷酸時的重要特征包括但不限于利于檢測(如電泳檢測)的合適大小的擴(kuò)增產(chǎn)物、引物對成員的解鏈溫度相似和各引物的長度(即引物需要足夠長，以便序列特異性退火并啟動合成，但不應(yīng)過長以免降低寡核苷酸合成期間的忠實性)。一般地，寡核苷酸引物長度為15-30(如16、18、20、21、22、23、24或25)個核苷酸。可以類似于設(shè)計引物的方式設(shè)計用作雜交探針的寡核苷酸，但探針對成員優(yōu)選退火至擴(kuò)增產(chǎn)物同一條鏈上，相距不超過5個核苷酸，以便發(fā)生FRET(例如，相距不超過l、2、3或4個核苷酸)。這種最低程度的間隔一般會使各熒光部分足夠接近，以便發(fā)生FRET。然而應(yīng)理解，可能提供其它間隔距離(如6個或多個核苷酸)使熒光部分相對安置在合適位置上(例如，與接頭臂)，以便發(fā)生FRET。此外，可設(shè)計探針與含有多態(tài)性或突變的靶標(biāo)雜交，從而區(qū)別檢測甲型流感病毒毒株，檢測基于對應(yīng)于待區(qū)分具體甲型流感病毒毒株的不同探針對的絕對雜交，或者基于(例如)探針對成員和對應(yīng)于待區(qū)分甲型流感病毒毒株的各擴(kuò)增產(chǎn)物之間的不同解鏈溫度。如同寡核苷酸引物那樣，寡核苷酸探針通常具有相似的解鏈溫度，各探針的長度必須足夠發(fā)生序列特異性雜交，但不應(yīng)過長以免降低序列合成期間的忠實性。寡核苷酸探針長度通常為15-30個(如16、18、20、21、22、23、24或25個)核苷酸。本發(fā)明構(gòu)建物包括含有甲型流感病毒核酸分子(如SEQIDNO:1、2、3或4)的載體。本發(fā)明構(gòu)建物可用作(例如)對照模板核酸分子。適用于本發(fā)明的載體可購得和/或通過本領(lǐng)域的常規(guī)重組核酸技術(shù)生產(chǎn)?？赏ㄟ^(例如)化學(xué)合成、由甲型流感病毒直接克隆或PCR擴(kuò)增獲得甲型流感病毒核酸分子。甲型流感病毒核酸分子或其片段可操作性連接于啟動子或其它調(diào)控元件，如調(diào)節(jié)甲型流感病毒核酸分子表達(dá)的增強(qiáng)子序列、效應(yīng)元件或誘導(dǎo)元件。本文所用的操作性連接指將啟動子和/或其它調(diào)控元件連接于甲型流感病毒核酸分子，以便允許和/或調(diào)節(jié)甲型流感病毒核酸分子的表達(dá)?？衫猛ǔ２恢笇?dǎo)甲型流感病毒表達(dá)的啟動子指導(dǎo)(例如)病毒聚合酶、細(xì)菌聚合酶或真核RNA聚合酶II進(jìn)行的甲型流感病毒核酸的轉(zhuǎn)錄?；蛘?，可利用甲型流感病毒天然啟動子指導(dǎo)甲型流感病毒核酸的轉(zhuǎn)錄。此外，操作性連接可指甲型流感病毒啟動子或調(diào)控元件與異源編碼序列(即非甲型流感病毒編碼序列，例如報道基因)的合適連接，以允許異源編碼序列表達(dá)。除甲型流感病毒核酸分子(如含有SEQIDNO:1、2、3或4中一種或多種序列的核酸分子)外，適用于本發(fā)明方法的構(gòu)建物一般包括編碼用于選擇選擇所需構(gòu)建物和/或轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記物(如抗生素抗性基因)和復(fù)制起點(diǎn)的序列。載體系統(tǒng)的選擇通常取決于幾項因素，包括但不限于宿主細(xì)胞的選擇、復(fù)制效率、選擇性、誘導(dǎo)能力和回收容易程度?？梢栽谒拗骷?xì)胞中增殖含有甲型流感病毒核酸分子的本發(fā)明構(gòu)建物。本文所用術(shù)語宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，例如酵母、植物和動物細(xì)胞。原核宿主可包括大腸桿菌(五.co//)、鼠傷寒沙門菌0^/附0"￡//"/y//n'ww/i/m)、粘質(zhì)沙雷菌0S"e^ror"amarcejce"力禾口枯草芽孢桿菌(5ac/〃wsw6//fc)。真核宿主包括酵母，如釀酒酵母CS.cerev&ae)、粟酒裂殖酵母(S.pom6e)、巴斯德畢赤酵母(尸/c/n'a/^WoW"，哺乳動物細(xì)胞如COS細(xì)胞或中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，以及植物細(xì)胞如擬南芥04ra6/flfo/w/s^^/&加)和煙草(]\^0^7加to6acwm)?？衫帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員通常了解的任何技術(shù)將本發(fā)明構(gòu)建物引入宿主細(xì)胞。例如，磷酸鈣沉淀、電穿孔、熱激、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、顯微注射和病毒介導(dǎo)的核酸轉(zhuǎn)移是將核酸引入宿主細(xì)胞的常用方法。此外，可將裸露DNA直接遞送給細(xì)胞(參見例如，美國專利5，580，859和5,589,466)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)美國專利4,683,202、4,683，195、4，800,159，和4,965,188公開了常規(guī)PCR技術(shù)。PCR—般采用結(jié)合所選核酸模板(如DNA或RNA)的兩種寡核苷酸引物。本發(fā)明所用引物包括能夠用作甲型流感病毒核酸序列中核酸合成起始點(diǎn)的寡核苷酸(如SEQIDNO:l、2、3或4)。可利用常規(guī)方法由限制性消化物中純化引物，或者可通過合成方法生產(chǎn)引物。引物優(yōu)選為在擴(kuò)增中效率最高的單鏈，但引物也可以是雙鏈。雙鏈引物首先被變性，即處理以分離各鏈。一種變性雙鏈核酸的方法是加熱。術(shù)語"熱穩(wěn)定性聚合酶"指對熱穩(wěn)定的聚合酶，即該酶催化形成與模板互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物，在升高溫度以使雙鏈模板核酸變性的過程中不會不可逆地變性。通常，在各引物的3'端開始合成，并沿模板鏈的5'至3'方向進(jìn)行。熱穩(wěn)定性聚合酶分離自黃色棲熱菌(772enm^/7avw)、紅色棲熱菌(r.rw6w)、嗜熱棲熱菌(r.//z^two/7/h7"力、水生棲熱菌(r.^Wfl〃cw)、乳糖棲熱菌(T"./。"ew力、魯賓斯棲熱菌(r.口6e"力、嗜熱脂肪芽孢桿菌(萬ac/〃wWearoAerwo;/n7w力和識熱甲烷嗜熱菌(M"/zawof/zermw51/en^Ww)。然而，PCR實驗中也可采用非熱穩(wěn)定性的聚合酶，只要再補(bǔ)充該酶。如果模板核酸是雙鏈，則需要在用作PCR模板之前使兩條鏈分離開?？赏ㄟ^任何合適的變性方法，包括物理、化學(xué)或酶學(xué)方法使鏈分離。一種分離核酸鏈的方法包括加熱核酸，直到其顯著變性(如大于50%、60%、70%、80%、90%或95%變性)。變性模板核酸所需的加熱條件將取決于(例如)緩沖液鹽濃度以及變性核酸的長度和核苷酸組成，但一般范圍是約9(TC-105'C，變性時間取決于反應(yīng)特征如溫度和核酸長度。變性一般進(jìn)行約30秒-4分鐘(如1分鐘至2分鐘30秒，或1.5分鐘)。如果通過加熱使雙鏈模板核酸變性，則使反應(yīng)混合物冷卻至一定溫度，使各引物退火至甲型流感病毒核酸的靶序列上。退火溫度通常約為35°C-65r(如約40°C-60°C;約45°C-50°C)。退火時間可以是約10秒至約1分鐘(如約20秒至約50秒；約30秒至約40秒)。然后，將反應(yīng)混合物調(diào)整至能提高或優(yōu)化聚合酶活性的溫度，即足以由退火引物延伸產(chǎn)生與模板核酸互補(bǔ)的產(chǎn)物的溫度。該溫度應(yīng)足以由退火至核酸模板的各引物合成延伸產(chǎn)物，但不應(yīng)達(dá)到使延伸產(chǎn)物與互補(bǔ)模板變性的溫度(如，延伸溫度通常為約40。C-80。C(如約50°C-70°C;約60°C)。延伸時間可以是約10秒至約5分鐘(如約30秒至約4分鐘；約1分鐘至約3分鐘；約1分鐘30秒至約2分鐘)。PCR實驗可釆用甲型流感病毒核酸如RNA或DNA(cDNA),.模板核酸不需要純化；它可以是復(fù)雜混合物的一小部分，如人細(xì)胞所含甲型流感病毒核酸?？赏ㄟ^常規(guī)技術(shù)，如Z)/ag7oWcMo/ecM/cro6/o/og乂.尸r/w一/es""c/^7/7"ca/7o"j「珍銜分f微主激學(xué),辰J^浙i^"^)(Persing等(編)，1993，AmericanSocietyforMicrobiology(美國微生物協(xié)會)，華盛頓特區(qū))或美國專利6,811,971所述的技術(shù)由生物樣品提取甲型流感病毒核酸。核酸可獲自各種來源，如質(zhì)粒或天然來源，包括細(xì)菌、酵母、病毒、細(xì)胞器或高級生物如植物或動物。在誘導(dǎo)引物延伸的反應(yīng)條件下將寡核苷酸引物(如SEQIDNO:l或2)與PCR試劑混合。例如，鏈延伸反應(yīng)通常包括50mMKC1、10mMTris-HCl(pH8.3)、15mMMgCl2、0.001%(w/v)明膠、0.5-1.0Tg變性的模板DNA、50皮摩爾各寡核苷酸引物、2.5UTaq聚合酶和10%DMSO。該反應(yīng)通常含有dATP、dCTP、dTTP、dGTP或一種或多種其類似物各150-320pM。新合成的鏈形成可用于后續(xù)反應(yīng)步驟的雙鏈分子?？砂葱柚貜?fù)鏈分離、退火和延伸步驟，以產(chǎn)生所需量的對應(yīng)于靶甲型流感病毒核酸分子的擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)限制因素是反應(yīng)中的引物、熱穩(wěn)定性酶和核苷三磷酸的含量。循環(huán)步驟(即變性、退火和延伸)優(yōu)選重復(fù)至少一次。用于檢測時，循環(huán)步驟的數(shù)量取決于(例如)樣品性質(zhì)。如果樣品是核酸的復(fù)雜混合物，則需要多個循環(huán)步驟來擴(kuò)增足夠檢測的靶序列。通常，循環(huán)步驟至少重復(fù)約20次，但也可重復(fù)多至40次、60次或甚至100次。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)FRET技術(shù)(參見例如，美國專禾ij4，996，143、5,565,322、5,849,489和6，162,603)基于以下理論供體和相應(yīng)受體熒光部分間隔一定距離時，兩個熒光部分之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，可觀察或檢測和/或定量測定這種轉(zhuǎn)移。各自含有熒光部分的兩種寡核苷酸探針(如SEQIDNO:3或4)可在寡核苷酸探針與甲型流感病毒耙核酸序列互補(bǔ)性決定的特定位置上與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。寡核苷酸探針與擴(kuò)增產(chǎn)物核酸在合適位置上雜交后，產(chǎn)生FRET信號。雜交溫度的范圍可以約為35。C-65。C(如，約4(TC-6(TC;約45r-55。C;約50°C)，雜交進(jìn)行約IO秒至1分鐘(如，約20秒至50秒；約30秒至40秒)。可利用光子計數(shù)落射熒光顯微鏡系統(tǒng)(含有合適的分色鏡和濾鏡以監(jiān)測合適范圍的熒光發(fā)射)、光子計數(shù)光電倍增管系統(tǒng)或熒光計進(jìn)行熒光分析。用適當(dāng)過濾以便在所需范圍激發(fā)的氬氣離子激光器、高強(qiáng)度汞(Hg)弧光燈、光纖光源或其它高強(qiáng)度光源激發(fā)，以啟動能量轉(zhuǎn)移。用于供體和相應(yīng)受體熒光部分時，本文所用的"相應(yīng)"指受體熒光部分的發(fā)射譜與受體熒光部分的激發(fā)譜重疊。受體熒光部分的發(fā)射譜的最大波長應(yīng)比供體熒光部分的激發(fā)譜的最大波長高至少100nm。因此，它們之間可以發(fā)生有效的非輻射能量轉(zhuǎn)移。通常選擇具有以下特性的熒光供體和相應(yīng)受體部分(a)高效F6rster能量轉(zhuǎn)移；(b)最終斯托克司頻移大("OOmn);(c)發(fā)射光盡可能移動到可見光譜的紅光部分(>600nm);和(d)發(fā)射光移動到高于供體激發(fā)波長激發(fā)產(chǎn)生的喇曼水熒光發(fā)射光的波長處。例如，可選擇最大激發(fā)波長接近激光譜線(例如，氦-鎘442nm或氬488nm)、高消光系數(shù)、高量子產(chǎn)率和熒光發(fā)射與相應(yīng)受體熒光部分的激發(fā)譜良好重疊的供體熒光部分?？蛇x擇具有高消光系數(shù)、高量子產(chǎn)率、其激發(fā)光譜與供體熒光部分的發(fā)射光譜良好重疊和在可見光譜的紅光部分(>600nm)發(fā)射的相應(yīng)受體熒光部分?？膳c各種受體熒光部分一起用于FRET技術(shù)的代表性供體熒光部分包括熒光素、螢光黃、B-藻紅蛋白、9-吖啶異硫氰酸酯、螢光黃VS、4-乙酰胺基-4，-異硫-氰酰二苯乙烯-2,2，-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4，-異硫氰酰苯基)-4-甲基香豆素、琥珀酰亞胺基1-芘丁酸和4-乙酰胺基-4，-異硫-氰酰二苯乙烯-2,2，-二磺酸衍生物。根據(jù)所用的供體熒光部分，代表性受體熒光部分包括LC-Red640、LCTM-Red705、Cy5、Cy5.5、麗絲胺羅丹明B磺酰氯、四甲基羅丹明異硫氰酸酯、羅丹明x異硫氰酸酯、赤蘚紅異硫氰酸酯、熒光素、二亞乙基三胺五乙酸或鑭系金屬離子(如銪或鋱)的其它螯合物。供體和受體熒光部分可獲自(例如)俄勒岡州章克申城的分子探針公司(MolecularProbes,JunctionCity,OR)或密蘇里州圣路易斯的西格瑪化學(xué)品公司(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)。供體和受體熒光部分可通過接頭臂連接于合適探針寡核苷酸。各接頭臂的長度很重要，因為接頭臂將影響供體和受體熒光部分之間的距離。出于本發(fā)明目的，接頭臂的長度是以埃(A)計算的核苷酸堿基與熒光部分之間的距離。通常，接頭臂長度約為10-25A(如約15A-20A)。接頭臂可以是WO84/03285所述的種類。WO84/03285也描述了將接頭臂與特定核苷酸堿基相連接以及將熒光部分與接頭臂相連接的方法。可將受體熒光部分如LC-Red640-NHS-酯與C6-亞磷酰胺(獲自加州福斯特城的ABI公司(ABI，F(xiàn)osterCity，CA)或弗吉尼亞州斯特林的格蘭研究公司(GlenResearch,Sterling,VA))混合，以產(chǎn)生(例如)LCTM-Red640-亞磷酰胺。將供體熒光部分如熒光素與寡核苷酸連接的常用接頭包括硫脲接頭(FITC-衍生的，例如，來自格蘭研究公司或馬薩諸塞州阿什蘭的開目基因公司(Chemgene，Ashland，MA)的熒光素-CPG)，酰胺-接頭(熒光素-NHS-酯衍生的，如來自加州圣拉曼的生物基因公司(Biogenex，SanRamon，CA)的熒光素-CPG)或需要在寡核苷酸合成后偶聯(lián)熒光素-NHS-酯的3'-氨基-CPG。甲型流感病毒的檢測通常，采用實驗室方法來診斷甲型流感病毒感染。一種實驗是通過直接免疫熒光(DFA)檢測呼吸道中被病毒感染的細(xì)胞。然而，這種非常耗費(fèi)勞動的DFA方法的靈敏度可能只有細(xì)胞培養(yǎng)的6713/。。此外，結(jié)果的質(zhì)量和解釋可能是困難的、主觀的，并且取決于樣品和顯微鏡設(shè)備的質(zhì)量。在常規(guī)病毒學(xué)實踐中，DFA不是診斷甲型流感病毒感染的獨(dú)立診斷技術(shù)。作為依賴于CPE辨識和/或紅細(xì)胞吸附以檢測流感病毒的常規(guī)試管細(xì)胞培養(yǎng)的替代方式，已開發(fā)出能將流感病毒檢測從樣品收入實驗室后數(shù)天縮短至1或2天的R-Mix圓筒樣品瓶(shellvial)細(xì)胞培養(yǎng)。然而，報道表達(dá)了以下關(guān)注如果用呼吸道樣品接種的兩個R-Mix圓筒樣品瓶細(xì)胞培養(yǎng)物中一個是呼吸道病毒總毒株染色陽性(免疫熒光)，第二個隨后檢測的R-Mix樣品瓶不總是產(chǎn)生可鑒定病毒。由于無法通過染色第二個R-Mix圓筒樣品瓶的細(xì)胞鑒定低效價病毒(引起報道結(jié)果延遲)，這有可能發(fā)生。然而，使用17市售實時PCR設(shè)備(如LIGHTCYCLER,印第安納州印第安納波利斯的羅氏分子生化公司(RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis,IN))時，可將PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測合并在一個封閉的試管中進(jìn)行，從而顯著縮短循環(huán)時間。由于檢測與擴(kuò)增同時進(jìn)行，實時PCR方法不需要操作擴(kuò)增產(chǎn)物，并且消除了擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染的風(fēng)險。實時PCR明顯縮短了周轉(zhuǎn)時間，是非常吸引人的臨床實驗室中常規(guī)PCR技術(shù)的替代方式。本發(fā)明提供檢測個體生物樣品中是否存在甲型流感病毒的方法。本發(fā)明提供的方法避免了樣品污染、假陰性和假陽性的問題?？衫迷摲椒ù_定患者是否需要甲型流感病毒治療。如果是陽性，及時給予該患者合適的治療(如神經(jīng)氨酸酶抑制劑，如TAMIFLU)。立即給藥可減少感染數(shù)量和癥狀數(shù)量?？衫昧⒓唇o藥(prompt)或者甚至是甲型流感病毒篩選前的個體鑒定病毒攜帶者，進(jìn)而可用于降低或消除病毒由攜帶者向非攜帶者傳播。該方法包括進(jìn)行至少一個循環(huán)步驟，該循環(huán)步驟包括用一對甲型流感病毒引物由樣品擴(kuò)增一部分甲型流感病毒核酸分子。各甲型流感病毒引物退火至靶標(biāo)的甲型流感病毒核酸分子內(nèi)或其附近，以使至少一部分各擴(kuò)增產(chǎn)物含有對應(yīng)于甲型流感病毒的核酸序列。更重要的是，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)含有與甲型流感病毒探針互補(bǔ)的核酸序列。如果存在甲型流感病毒核酸，則產(chǎn)生甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物。各循環(huán)步驟還包括使樣品接觸一對甲型流感病毒探針。根據(jù)本發(fā)明，各甲型流感病毒探針對的一個成員用供體熒光部分標(biāo)記，另一個成員用相應(yīng)受體熒光部分標(biāo)記。甲型流感病毒探針與甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物雜交后，檢測第一種甲型流感病毒探針的供體熒光部分和第二種甲型流感病毒探針的相應(yīng)受體熒光部分之間是否存在FRET。各循環(huán)步驟包括擴(kuò)增步驟和雜交步驟，各循環(huán)步驟通常后接FRET檢測步驟。進(jìn)行多個循環(huán)步驟，優(yōu)選在熱循環(huán)儀中進(jìn)行?？捎眉仔土鞲胁《疽锖吞结樈M進(jìn)行本發(fā)明方法，以檢測甲型流感病毒的存在。在甲型流感病毒反應(yīng)中檢測到FRET表明存在甲型流感病毒。本文所用"擴(kuò)增"指合成與模板核酸分子(如甲型流感病毒核酸分子)的一條鏈或兩條鏈互補(bǔ)的核酸分子的過程。擴(kuò)增核酸分子一般包括.使模板核酸變性，在低于引物解鏈溫度的溫度下使引物退火至模板核酸，用酶從引物延長以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增一般需要存在脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶(如PLATINUMT叫)和適合實現(xiàn)最優(yōu)聚合酶活性的緩沖液和/或輔因子(如MgCl2和/或KC1)。如果甲型流感病毒核酸被擴(kuò)增并且產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，那么根據(jù)探針對成員之間的FRET雜交步驟產(chǎn)生可檢測的信號。本文所用"雜交"指探針退火至擴(kuò)增產(chǎn)物。雜交條件一般包括低于探針解鏈溫度、但能避免探針非特異性雜交的溫度。通常，出現(xiàn)FRET表明樣品中存在甲型流感病毒，不出現(xiàn)FRET表明樣品中不存在甲型流感病毒。然而，樣品收集不足、運(yùn)輸延遲、運(yùn)輸條件不合適或使用某些收集擦拭物(如藻酸鈣擦拭物或鋁柄擦拭物)都是可能影響測試結(jié)果的成功和/或準(zhǔn)確性的條件。使用本文所述方法，在45個循環(huán)步驟中檢測到FRET表明甲型流感病毒感染。本發(fā)明方法也可用于甲型流感病毒疫苗功效研究或流行病學(xué)研究。例如，在個體中仍然存在病毒的期間可利用本發(fā)明方法檢測甲型流感病毒疫苗。.在這類疫苗功效研究中，本發(fā)明方法可用于測定(例如)用于疫苗的甲型流感病毒減毒毒株的持續(xù)性，或者本發(fā)明方法可與其它實驗如血清學(xué)實驗聯(lián)用，以監(jiān)測個體對這類疫苗的免疫應(yīng)答。此外，可利用本發(fā)明方法區(qū)分一種甲型流感病毒毒株與另一種甲型流感病毒毒株，以便對甲型流感病毒核酸爆發(fā)的來源或嚴(yán)重性進(jìn)行流行病學(xué)研究。此外，監(jiān)測流感病毒在感染患者中持續(xù)存在多長時間使得醫(yī)院感染控制小組能夠限制并可能減少醫(yī)院內(nèi)傳播。可用于實施本發(fā)明方法的代表性生物樣品包括但不限于咽喉擦拭物、咽喉洗液、鼻腔擦拭物和下呼吸道樣品。美國專利6,811,971描述了唾液在檢測是否存在甲型流感病毒或乙型流感病毒中的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知生物樣品的收集和儲存方法?？杉庸ど飿悠?例如通過核酸提取和/或本領(lǐng)域已知的試劑盒加工)，以釋放甲型流感病毒核酸，或者在某些情況下，可使生物樣品與PCR反應(yīng)組分和合適的寡核苷酸直接接觸。解鏈曲線分析是循環(huán)概況分析中可包含的額外步驟。解鏈曲線分析是基于以下事實DNA在成為解鏈溫度(Tm)的特征性溫度下解鏈，該溫度被定義為一半DNA雙鏈體分離為單鏈的溫度。DNA的解鏈溫度主要取決于其核苷酸組成。因此，富含G和C核苷酸的DNA分子的Tm高于富含A和T核苷酸的DNA分子。通過檢測信號丟失的溫度，可確定探針的解鏈溫度。相似地，通過檢測信號產(chǎn)生的溫度，可確定探針的退火溫度。甲型流感病毒探針與甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物的解鏈溫度可確認(rèn)樣品中是否存在甲型流感病毒。在各熱循環(huán)輪次中，也循環(huán)處理對照樣品?？衫?例如)對照引物和對照探針由陽性對照樣品擴(kuò)增甲型流感病毒核酸對照模板(如除甲型流感病毒以外的模板)。陽性對照樣品也可擴(kuò)增(含有)含甲型流感病毒核酸分子的質(zhì)粒構(gòu)建物。這類質(zhì)粒對照可內(nèi)部擴(kuò)增(如，在樣品內(nèi)擴(kuò)增)，或者在單獨(dú)的樣品輪次中與患者樣品并行擴(kuò)增。各熱循環(huán)輪次也應(yīng)包括缺少甲型流感病毒模板DNA的陰性對照。這類對照是擴(kuò)增、雜交和/或FRET反應(yīng)成功與否的指示物。因此，對照反應(yīng)不難確定，例如，引物序列特異性退火和啟動延伸的能力，以及探針序列特異性雜交和發(fā)生FRET的能力。在一個實施方式中，本發(fā)明方法包括避免污染的步驟。例如，美國專利5,035,996，5,683,896和5,945,313描述了利用尿嘧啶-DNA糖基化酶以降低或消除熱循環(huán)輪次之間的污染的酶學(xué)方法。此外，進(jìn)行本發(fā)明方法時需要標(biāo)準(zhǔn)實驗室防護(hù)操作和步驟。防護(hù)操作和步驟包括但不限于不同方法步驟使用不同的工作區(qū)域、防護(hù)柜、屏障濾器移液器尖頭和專用排氣尖頭。工作人員必須進(jìn)行一致的防護(hù)操作和步驟，以保證對臨床樣品進(jìn)行診斷實驗室處理時的準(zhǔn)確性。將常規(guī)PCR方法與FRET技術(shù)聯(lián)合用于實施本發(fā)明方法。在一個實施方式中，使用LIGHTCYCLERTM設(shè)備。LIGHTCYCLERTM系統(tǒng)和實時在線監(jiān)測PCR的詳述可參見因特網(wǎng)址biochem.roche.com/lightcycler。以下專利申請描述了用于LIGHTCYCLERTM技術(shù)的實時PCR:WO97/46707、WO97/46714和WO97/46712。LIGHTCYCLERTM設(shè)備是用高質(zhì)量光學(xué)元件與微體積熒光劑聯(lián)用的快速熱循環(huán)儀。這種快速熱循環(huán)技術(shù)使用薄玻璃杯作為反應(yīng)容器。通過改變加熱和環(huán)境空氣控制反應(yīng)室的加熱和冷卻。由于空氣質(zhì)量小和玻璃杯表面積體積比高，所以在LIGHTCYCLERTM熱室內(nèi)可實現(xiàn)非?？焖俚臏囟冉粨Q速率。向反應(yīng)組分中加入所選熒光染料.以便實時在線檢測PCR。而且，玻璃杯用作收集信號的光學(xué)器件(類似于玻璃纖維光學(xué)器件)，將信號集中在玻璃杯頂端。效果是有效發(fā)光和微體積樣品的熒光監(jiān)安置玻璃杯的LIGHTCYCLERTM傳送帶可從該設(shè)備中取出。因此，可以在該設(shè)備外(例如在PCR潔凈室內(nèi))裝載樣品。此外，此種特征使得樣品傳送帶能夠被容易地清潔和滅菌。作為LIGHTCYCLERTM設(shè)備一部分的熒光計裝有光源。過濾發(fā)射光，并通過落射照明透鏡聚焦到玻璃杯上方。然后由同一透鏡聚焦樣品發(fā)出的熒光，通過分色鏡，適當(dāng)過濾，并聚焦到數(shù)據(jù)采集光混合器(photohybrid)上。目前可用于LIGHTCYCLERTM設(shè)備(羅氏分子生物化學(xué)公司，目錄號2011468)的光學(xué)單元包括三個帶通濾光片(530nm、640nm，和710nm)，以提供三色檢測和數(shù)種熒光獲取選擇。數(shù)據(jù)采集選擇包括每個循環(huán)步驟檢測一次，完全連續(xù)的獲取單樣品的解鏈曲線分析，連續(xù)采樣(采樣頻率取決于樣品數(shù)量)和/或確定的溫度間隔后逐步測定所有樣品?？舍娪肞C工作站操作LIGHTCYCLERtm，并可利用WindowsNT操作系統(tǒng)。隨著該機(jī)器依次將毛細(xì)管置于光學(xué)單元上，獲得樣品信號。各次測定后，軟件可立即實時顯示熒光信號。熒光獲取時間是10-100毫秒(msec)。各個循環(huán)步驟后，可連續(xù)定量更新所有樣品的相對于循環(huán)數(shù)的熒光。將產(chǎn)生的數(shù)據(jù)儲存起來進(jìn)一步分析。作為FRET的替代方式，可用雙鏈DNA結(jié)合染料如熒光DNA結(jié)合染料(如SYBRGREEN1⑧或SYBRGOLD(分子探針公司))檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。與雙鏈核酸相互作用后，用合適波長的光激發(fā)后這類熒光DNA結(jié)合染料發(fā)出熒光信號?？刹捎秒p鏈DNA結(jié)合染料，如核酸嵌入染料。釆用雙鏈DNA結(jié)合染料時，通常進(jìn)行解鏈曲線分析，以確認(rèn)存在擴(kuò)增產(chǎn)物。如本文所述，也可利用FRET技術(shù)的標(biāo)記雜交探針檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。FRET技術(shù)的常見形式利用兩種雜交探針。可用不同熒光部分標(biāo)記各探針，通常通過設(shè)計使其在靶DNA分子(如擴(kuò)增產(chǎn)物)中的雜交位置緊鄰。LIGHTCYCLERTM設(shè)備光源以470nm激發(fā)供體熒光部分，例如熒光素。在FRET期間，熒光素將其能量轉(zhuǎn)移至受體熒光部分如LIGHTCYCLER-Red640(LC-Red640)或LIGHTCYCLERTM-Red705(LCTM-Red705)。然后，受體熒光部分發(fā)出較長波長的光，通過LIGHTCYCLERTM設(shè)備的光學(xué)檢測系統(tǒng)檢測該發(fā)射光。只有當(dāng)熒光部分直接緊鄰且供體熒光部分的發(fā)射光譜與受體熒光部分的吸收光譜重疊時，才可發(fā)生有效的FRET。發(fā)射信號的強(qiáng)度可能與初始靶核酸分子的數(shù)量(如甲型流感病毒基因組數(shù)量)有關(guān)。另一種FRET形式利用TAQMAN⑧技術(shù)檢測是否存在擴(kuò)增產(chǎn)物，從而檢測是否存在甲型流感病毒。TAQMAN技術(shù)利用兩種熒光部分標(biāo)記的一種單鏈雜交探針。用合適波長的光激發(fā)第一種熒光部分時，按照FRET原理吸收的能量轉(zhuǎn)移給第二種熒光部分。第二種熒光部分通常是淬滅分子。在PCR反應(yīng)的退火步驟中，標(biāo)記的雜交探針結(jié)合于靶核酸(即擴(kuò)增產(chǎn)物)，在后續(xù)延伸期間被Taq聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性所降解。結(jié)果是，激發(fā)的熒光部分和淬滅物部分在空間上相互隔離開。因此，在不存在淬滅物時第一種熒光部分被激發(fā)后，可檢測到第一種熒光部分的熒光發(fā)射。例如，ABIPRISM7700序列檢測系統(tǒng)(加州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,CA))利用TAQMAN⑧技術(shù)，適合以本文所述方法以檢測甲型流感病毒。有關(guān)利用ABIPRISM770系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和檢測的信息可參見因特網(wǎng)址appliedbiosystems.com/products。分子信標(biāo)也可與FRET聯(lián)合用于本發(fā)明實時PCR方法，以檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。分子信標(biāo)技術(shù)采用第一種熒光部分和第二種熒光部分標(biāo)記的雜交探針。第二種熒光部分通常是淬滅物，熒光標(biāo)記一般位于探針的末端。分子信標(biāo)技術(shù)采用含有能夠形成二級結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾)的序列的探針寡核苷酸。在探針內(nèi)形成二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果是，探針在溶液中時，兩個熒光部分在空間上相互靠近。與靶核酸(即擴(kuò)增產(chǎn)物)雜交后，探針的二級結(jié)構(gòu)被破壞，熒光部分相互分離，使得用合適波長的光激發(fā)后，可檢測到第一種熒光部分的發(fā)射光。應(yīng)理解，本發(fā)明不受一種或多種市售設(shè)備結(jié)構(gòu)的限制。制品/試劑盒22本發(fā)明還提供檢測甲型流感病毒的制品。本發(fā)明制品可包括用于檢測甲型流感病毒的引物和探針，以及合適的包裝材料。檢測甲型流感病毒的代表性引物和探針能夠與甲型流感病毒核酸分子雜交。本文公開了設(shè)計引物和探針的方法，提供了擴(kuò)增和雜交流感病毒核酸分子的引物和探針的代表性例子。本發(fā)明制品也可包含一種或多種標(biāo)記探針的熒光部分，或者，該試劑盒提供的探針是經(jīng)過標(biāo)記的探針。例如，制品可包括標(biāo)記一種甲型流感病毒探針的供體熒光部分和標(biāo)記另一種甲型流感病毒探針的受體熒光部分。上文提供了合適的FRET供體熒光部分和相應(yīng)受體熒光部分的例子。本發(fā)明制品也可包含寫有使用甲型流感病毒引物和探針檢測樣品中甲型流感病毒的說明的包裝說明書或包裝標(biāo)簽。制品還可包含迸行本文所述方法的試劑(如緩沖液、聚合酶、輔因子后防止污染的試劑)。這類試劑可能是本文所述市售設(shè)備之一專用的試劑。以下實施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這些實施例不限制權(quán)利要求書所述的本發(fā)明范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可將上述各種其它特征一起后單獨(dú)整合到所述方法和/或制品/試劑盒中。實施例實嚴(yán)劍7—伊潛魔減瘋毒在薪者^游辨婆絲本研究包括本研究所自2004年12月至2005年2月收治的18歲及以上的有流感病毒感染臨床癥狀的住院患者。首先通過實時PCR測定患有流感樣疾病(ILI，定義為發(fā)熱、咳嗽和/或咽喉痛)的住院患者的樣品的甲型流感病毒感染情況。如果最初的實時PCR測定是陽性，在最初實驗室診斷后的四個時間點(diǎn)(取決于住院時間)上獲得后續(xù)咽喉擦拭物48小時、72小時、5天和7天。最初樣品檢測之后進(jìn)行的所有測試均獲得了患者的知情同意書。該研究排除了無法提供連續(xù)咽喉擦拭物的患者。實嚴(yán)樹2—^攻樣麼帶f7r-尸Ci用自動或手動提取方法由咽喉擦拭物提取病毒核酸。用MagNAPure自動設(shè)備(印第安納州印第安納波利斯的羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN))和MagNAPure血液/血清/血漿提取程序提取200Hl患者樣品中的RNA。此外，提取自甲型流感病毒培養(yǎng)物的核酸用作陽性對照，提取自含有1x103大腸桿菌(￡.^//)的緩沖液的核酸用作陰性對照。將該樣品稀釋至100(_il。自動核酸提取的替代方式是，用HighPure(羅氏公司)由200pi患者樣品提取RNA，并用100(il洗脫緩沖液洗脫。將5pl樣品提取物放入15pl主混合物中，并由RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。表1顯示了用于實時PCR的主混合物。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>乙酸錳；b，MagNAPure緩沖液或HighPure緩沖液所用引物序列為為引物l:5'-TAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCT-3，；引物:25，-GGCATTTTGGACAAAGCGTCTA-3，；所用探針序列為探針-FL5，-CGAAATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-3，；探針-Red5，-TTGCTGGGAAAAACACAGATCTTGAGGC-3，。然后擴(kuò)增產(chǎn)物，并用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)監(jiān)測實時PCR(LIGHTCYCLER⑧，羅氏公司)循環(huán)期間退火步驟后靶核酸序列的出現(xiàn)。用LIGHTCYCLER⑧軟件分析實時PCR擴(kuò)增和探針解鏈曲線。通過比較本文所述的PCR方法與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)(R-mix細(xì)胞，診斷雜交公司(DiagnosticHybrids);參見下述實施例3)確定用于檢測甲型流感病毒RNA的引物和探針的性能特征。表2顯示用于擴(kuò)增和檢測甲型流感病毒核酸的實時PCR條件。表2實時PCR條件<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>冷卻1400:0020在557個呼吸道樣品中，49個樣品經(jīng)PCR和R-mix細(xì)胞培養(yǎng)檢測為陽性。43個樣品僅為PCR陽性，2個樣品僅為R-mix陽性。463個樣品經(jīng)這兩種方法檢測為陰性。從這種比較可看出，與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)相比PCR檢測方法有以下特征靈敏度，96%;特異性，92%;陽性預(yù)測值，53%;陰性預(yù)測值，100%。實蕭j—細(xì)綠將咽喉樣品提取到2mLM5培養(yǎng)基中。將樣品等份(0.2mL)分別接種到12mm圓形蓋玻片(俄亥俄州雅典的診斷雜交公司(DiagnosticHybrids,Athens,OH)上含有R-mix細(xì)胞單層(人腺癌細(xì)胞(A549)和貂肺細(xì)胞(MvlLu)的混合單層細(xì)胞)的兩個圓筒樣品瓶細(xì)胞培養(yǎng)物中。接種后，通過低速離心[700xg(2000RPM)]40分鐘增加細(xì)胞的感染。35-37'C培育48小時后，將甲型流感病毒的單克隆抗體(加州特美克拉的開米康國際公司(ChemiconInternational,Inc.，Temecula，CA))加到蓋玻片上。用甲型流感病毒抗血清染色后，通過直接免疫熒光法在顯微鏡下(100x放大)觀察到病毒特異性病灶。0.2ml來自研究患者的各樣品的提取物也被接種到原代獼猴腎(PRMK)試管細(xì)胞培養(yǎng)物中，在35-37'C培育至多14天(俄亥俄州雅典的診斷雜交公司；和明尼蘇達(dá)州明尼阿波利斯的病毒醫(yī)學(xué)實驗室公司(ViromedLaboratories,Minneapolis,MN))。通過培養(yǎng)過程中隨機(jī)地形成形狀有些不規(guī)則的大粒細(xì)胞、且細(xì)胞碎片漂浮在培養(yǎng)基中，來觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。最初用豚鼠紅細(xì)胞進(jìn)行血細(xì)胞吸附測定，以檢測常規(guī)試管培養(yǎng)物中是否存在甲型流感病毒，具體用BinaxNOW甲型/乙型流感病毒試劑盒(緬因州波特蘭的比那司公司(BinaxInc.，Portland,ME))鑒定。實藤4一碧菜由樣品進(jìn)入實驗室的時間至實時PCR和圓筒樣品瓶實驗報告結(jié)果的時間，或完成試管細(xì)胞培養(yǎng)的時間計算周轉(zhuǎn)時間。實時PCR實驗的平均周轉(zhuǎn)時間(14.S小時)明顯短于圓筒樣品瓶實驗(49.3小時；p〈0.001)和試管細(xì)胞培養(yǎng)的時間(199.2小時；pO.OOl)?；颊哌M(jìn)入該研究需要有PCR陽性實驗室結(jié)果。最初為PCR陽性的50位患者中有43位(86%)經(jīng)圓筒樣品瓶實驗和細(xì)胞培養(yǎng)實驗測定為陽性。最初陽性檢驗48小時和72小時后，通過PCR分別在34/50(68%)和13/41(31.7%)的患者中檢測到甲型流感病毒核酸。在48小時(分別為22/50,44%和18/50，36%;pO.001)和72小時(分別為6/41，14,6%和4/41，9.8%;pO.05)時間點(diǎn)上，圓筒樣品瓶檢測和細(xì)胞培養(yǎng)檢測結(jié)果明顯較低。在第5天甲型流感病毒的檢測僅限于PCR，在(2/8)25%患者中發(fā)現(xiàn)該病毒。到第7天，(2/10)20%患者為PCR陽性；(1/10)10%患者經(jīng)圓筒樣品瓶實驗檢測為陽性。在第5天以后，試管細(xì)胞培養(yǎng)就無法檢測到陽性樣品。在住院治療7天后，通過靈敏的實時PCR技術(shù)在50位研究患者中的10位(20%)中檢測到甲型流感病毒感染(表3)。相反，7天后50位患者中只有5位(10%)經(jīng)圓筒樣品瓶實驗檢測為陽性，而用常規(guī)的試管細(xì)胞培養(yǎng)法沒有檢測到陽性樣品(表3)。這些數(shù)據(jù)表明，在CDC推薦的5天飛沫隔離期后，患者仍可排出甲型流感病毒。重要的是，PCR結(jié)果可能不等同于活病毒；然而，陽性分子結(jié)果事實上間接表明了感染性或活病毒的存在，因為與PCR相比細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的靈敏度較低。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>其它實施方式應(yīng)理解，雖然結(jié)合詳述描述了本發(fā)明，但上述描述旨在說明而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明范圍由所附權(quán)利要求書的范圍確定。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修改屬于所附權(quán)利要求書的范圍。權(quán)利要求1.一種檢測來自個體的生物樣品中是否存在甲型流感病毒的方法，所述方法包括進(jìn)行至少一個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴(kuò)增步驟和雜交步驟，所述擴(kuò)增步驟包括使所述樣品接觸一對甲型流感病毒引物，以便在所述樣品中存在甲型流感病毒核酸分子時產(chǎn)生甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述雜交步驟包括使所述樣品接觸一對甲型流感病毒探針，所述甲型流感病毒探針對的成員在不超過五個核苷酸上互相雜交，所述甲型流感病毒探針對的第一種甲型流感病毒探針用供體熒光部分標(biāo)記，所述甲型流感病毒探針對的第二種甲型流感病毒探針用相應(yīng)受體熒光部分標(biāo)記；和檢測所述第一種甲型流感病毒探針的所述供體熒光部分和所述第二種甲型流感病毒探針的所述受體熒光部分之間是否存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，其中存在FRET表明所述樣品中存在甲型流感病毒，而不存在FRET表明所述樣品中不存在甲型流感病毒。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲型流感病毒引物對包括第一種甲型流感病毒引物和第二種甲型流感病毒引物，所述第一種甲型流感病毒引物包含序列5，-TAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCT-3，(SEQIDNO:l)，所述第二種甲型流感病毒引物包含序列5'-GGCATTTTGGACAAAGCGTCTA-3,(SEQIDNO:2)。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一種甲型流感病毒探針包含序列5，-CGAAATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-3，(SEQIDNO:3)，所述第二種甲型流感病毒探針包含序列5'-TTGCTGGGAAAAACACAGATCTTGAGGC-3，(SEQIDNO:4)。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲型流感病毒探針對的成員在不超過2個核苷酸上互相雜交。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲型流感病毒探針對的成員在不超過1個核苷酸上互相雜交。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述供體熒光部分是熒光素。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述相應(yīng)受體熒光部分選自LC隱Red640、LC-Red705、Cy5或Cy5.5。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測步驟包括以所述供體熒光部分的吸收波長激發(fā)所述樣品和觀察和/或測定所述相應(yīng)受體熒光部分發(fā)射的波長。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測包括定量測定所述FRET。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述檢測步驟是在各循環(huán)步驟后進(jìn)行的。11.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述檢測步驟實時進(jìn)行。12.如權(quán)利要求l所述的方法，還包括測定所述甲型流感病毒探針中一種或兩種和所述甲型流感病毒擴(kuò)增弓I物之間的解鏈溫度，所述解鏈溫度確認(rèn)是否存在所述甲型流感病毒。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在45個循環(huán)步驟內(nèi)出現(xiàn)所述FRET表明所述個體中存在甲型流感病毒感染。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在40個循環(huán)步驟內(nèi)出現(xiàn)所述FRET表明所述個體中存在甲型流感病毒感染。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在35個循環(huán)步驟內(nèi)出現(xiàn)所述FRET表明所述個體中存在甲型流感病毒感染。16.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括防止污染核酸的擴(kuò)增。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述防止包括在尿嘧啶存在下進(jìn)行所述擴(kuò)增步驟。18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述防止還包括在第一個擴(kuò)增步驟前用尿嘧啶-DNA糖基化酶處理所述樣品。19.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物樣品選自咽喉擦拭物、咽喉洗液、鼻腔擦拭物或下呼吸道樣品。20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在對照樣品上進(jìn)行所述循環(huán)步驟。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述對照樣品包含所述甲型流感病毒核酸分子的所述部分。22.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述循環(huán)步驟使用一對對照引物和一對對照探針，其中所述對照引物和所述對照探針不同于所述甲型流感病毒引物和甲型流感病毒探針，所述擴(kuò)增步驟產(chǎn)生對照擴(kuò)增產(chǎn)物，所述對照探針與所述對照擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。23.—種制品，其包含一對甲型流感病毒引物；一對甲型流感病毒探針；和供體熒光部分和相應(yīng)受體熒光部分。24.如權(quán)利要求23所述的制品，其特征在于，所述甲型流感病毒引物對包含第一種甲型流感病毒引物和第二種甲型流感病毒引物，其中所述第一種甲型流感病毒引物包含序列5'-TAACCGAGGTCGAAACGTATGTTCT-3'(SEQIDNO:l)，所述第二種甲型流感病毒引物包含序列5，-GGCATTTTGGACAAAGCGTCTA-3，(SEQIDNO:2)。25.如權(quán)利要求23所述的制品，其特征在于，所述甲型流感病毒探針對包含第一種甲型流感病毒探針和第二種甲型流感病毒探針，其中所述第—種甲型流感病毒探針包含序列5，-CGAAATCGCGCAGAGACTTGAAGATGT-3，(SEQIDNO:3)，所述第二種甲型流感病毒探針包含序列5'-T丁GCTGGGAAAAACACAGATCTTGAGGC陽3，(SEQIDNO:4)。26.如權(quán)利要求25所述的制品，其特征在于，所述第一種甲型流感病毒探針用所述供體熒光部分標(biāo)記，所述第二種甲型流感病毒探針用所述相應(yīng)受體熒光部分標(biāo)記。27.如權(quán)利要求23所述的制品，還包括寫有使用所述甲型流感病毒引物對、所述甲型流感病毒探針對檢測樣品中是否存在甲型流感病毒的指南的包裝說明書。28.—種檢測來自個體的生物樣品中是否存在甲型流感病毒的方法，所述方法包括進(jìn)行至少一個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴(kuò)增步驟和雜交步驟，所述擴(kuò)增步驟包括使所述樣品接觸一對甲型流感病毒引物，以便在所述樣品中存在甲型流感病毒核酸分子時產(chǎn)生甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述雜交步驟包括使所述樣品接觸一對甲型流感病毒探針，所述甲型流感病毒探針是用供體熒光部分和相應(yīng)受體熒光部分標(biāo)記的；和檢測所述甲型流感病毒探針的所述供體熒光部分和所述受體熒光部分之間是否存在熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，其中是否存在熒光表明所述樣品中是否存在甲型流感病毒。29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增采用具有5'至3'外切核酸酶活性的聚合酶。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種熒光部分在所述探針上相距不超過5個核苷酸。31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述第二種熒光部分是淬滅物。32.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述甲型流感病毒探針包含能夠形成二級結(jié)構(gòu)的核酸序列，所述二級結(jié)構(gòu)的形成導(dǎo)致第一種和第二種熒光部分在空間上接近。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述第二種熒光部分是淬滅物。34.—種檢測來自個體的生物樣品中是否存在甲型流感病毒的方法，所述方法包括進(jìn)行至少一個循環(huán)步驟，其中循環(huán)步驟包括擴(kuò)增步驟和染料結(jié)合步驟，所述擴(kuò)增步驟包括使所述樣品接觸一對甲型流感病毒引物，以便在所述樣品中存在甲型流感病毒核酸分子時產(chǎn)生甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述染料結(jié)合步驟包括使所述甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物接觸雙鏈DNA結(jié)合染料；和檢測所述雙鏈DNA結(jié)合染料是否結(jié)合到所述擴(kuò)增產(chǎn)物中，其中存在結(jié)合表明所述樣品中存在甲型流感病毒，而不存在結(jié)合表明所述樣品中不存在甲型流感病毒。35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述雙鏈DNA結(jié)合染料是溴化乙錠。36.如權(quán)利要求34所述的方法，還包括測定所述甲型流感病毒擴(kuò)增產(chǎn)物和所述雙鏈DNA結(jié)合染料之間的解鏈溫度，其中所述解鏈溫度確認(rèn)是否存在所述甲型流感病毒。全文摘要本發(fā)明提供用實時PCR檢測生物樣品中的甲型流感病毒的方法。本發(fā)明提供用于檢測甲型流感病毒的引物和探針。本發(fā)明還提供含有用于檢測甲型流感病毒的這類引物和探針的制品。文檔編號C12P19/34GK101443453SQ200780017669公開日2009年5月27日申請日期2007年4月11日優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日發(fā)明者M(jìn)·J·艾斯派,T·F·史密斯申請人:梅約醫(yī)學(xué)教育與研究基金會