專利名稱：人甲、乙型流感及新甲型h1n1流感病毒一管多檢方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是人甲型流感、乙型流感及新甲型 HlNl流感病毒一管多檢方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
人流感病毒是一種造成人類患流行性感冒的RNA病毒，在分類學(xué)上，流感病毒屬 于正黏液病毒科，它會(huì)造成急性上呼吸道感染，并借由空氣迅速的傳播，在世界各地常會(huì)有 周期性的大流行。人流感病毒以其核蛋白的抗原性分為A型、B型和C型流感病毒(又稱甲、乙和丙 型流感病毒)。在感染人類的三種流感病毒中，甲型流感病毒有著極強(qiáng)的變異性，乙型次之， 而丙型流感病毒的抗原性非常穩(wěn)定。所以造成大規(guī)模流行的一般都為前兩種。流行性感冒病毒在免疫力較弱的老人或兒童及一些免疫失調(diào)的病人會(huì)引起較嚴(yán) 重的癥狀，如肺炎或是心肺衰竭等。從流行病學(xué)的角度來(lái)說(shuō)，流感引起世界性大流行是流感 病毒抗原變異與人群免疫屏障相互作用的結(jié)果。20世紀(jì)全球共出現(xiàn)四次流感大流行，都是 由變異的甲型流感病毒引起，造成重大的人員和財(cái)產(chǎn)損失。2009年最先由墨西哥發(fā)現(xiàn)的新 甲型Hmi流感病毒就含有豬流感、禽流感和人流感三種流感病毒的基因片段，在全球迅速 傳播開(kāi)來(lái)，造成大規(guī)模的流行。目前全世界各國(guó)為防控新甲流H1N1，都在做積極的努力，同 時(shí)取得了顯著的效果。鑒于甲乙型流感病毒及目前甲型流感中的新甲型Hmi流感病毒對(duì)人類所造成的 嚴(yán)重呼吸道疾病，特別是在兒童中，為診治及防控需要，這就需要醫(yī)療機(jī)構(gòu)提供準(zhǔn)確快速靈 敏的檢測(cè)方法，快速診斷，快速治療。就目前情況，對(duì)甲乙型及新甲型Hmi流感病毒的診斷 主要以下幾種方法(1)病毒的培養(yǎng)分離；(2)血清學(xué)檢測(cè)特異IgG及IgM ； (3) RT-PCR方法 及熒光定量PCR方法。相比較幾種方法，前兩種方法都是早期開(kāi)發(fā)的經(jīng)典方法，PCR方法是 針對(duì)病原體核酸的檢測(cè)方法，克服了前面兩種方法中存在的周期長(zhǎng)、靈敏度不高的問(wèn)題，特 別是熒光定量PCR方法的引進(jìn)，解決了 PCR方法容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的問(wèn)題，使其得到了快速的 發(fā)展，該方法具有高特異性、高靈敏度、周期短、操作簡(jiǎn)單、成本較低等多種優(yōu)點(diǎn)。但目前開(kāi)發(fā)的流感病毒分型試劑基本都為單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑，不能對(duì)這 三種流感病毒進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)；如要同時(shí)檢測(cè)，則需要分別在三管中進(jìn)行，其操作繁瑣、費(fèi)時(shí) 耗力。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的之一是提供一種人甲型流感、乙型流感及 新甲型Hmi流感病毒一管多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，以改進(jìn)目前現(xiàn)有方法，從而使檢測(cè)達(dá)到 靈敏、快速、準(zhǔn)確、節(jié)約材料和試劑的目的。本發(fā)明的人甲型流感、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法包括樣品核酸的制備和多重PCR擴(kuò)增步驟，其中，多重PCR擴(kuò)增步驟中采用了序列如下所 示的引物(見(jiàn)序列表SEQ ID NO 1-6)IFAF GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC ；IFAR TCTTCAAGTCTCTGCGCGATT ；
IFBF CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG ；IFBR GCTTATGGGAAGCACCACTTTG ；AHlF GGTTTGAGATATTCCCCAAGACA ；AHlR :GAGGACATGCTGCCGTTACA。其中，引物IFAF和IFAR用來(lái)檢測(cè)人甲型流感病毒，我們稱之為InfA組引物；引物 IFBF和IFBR用來(lái)檢測(cè)乙型流感病毒，本發(fā)明中稱之為InfB組引物；引物AHlF和AHlR用 來(lái)檢測(cè)新甲型Hmi流感病毒，我們稱之為A(HlNl)組引物。上述方法中，還采用了序列如下所示的探針(見(jiàn)序列表SEQ ID NO :7_10)IFAP CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG ；IFBP CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA ；AHlP :TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA。優(yōu)選的，采用Taqman探針檢測(cè)的熒光定量PCR的反應(yīng)模式，上述探針的熒光標(biāo)記 具體如下IFA-TAMRA :TAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2 ；IFB-FAM FAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1 ；AHl-JOE J0E-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1。其中，IFA-TAMRA是用來(lái)檢測(cè)甲型流感病毒的探針，IFB-FAM是用來(lái)檢測(cè)乙型流感 病毒的探針，AHl-JOE是用來(lái)檢測(cè)新甲型Hmi流感病毒的探針。上述三種熒光標(biāo)記的探針 在本發(fā)明中被稱之為FAM/J0E/TAMRA多重?zé)晒馑貥?biāo)記探針。本發(fā)明采用一管多重方式檢測(cè)甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感 病毒時(shí)，將上述InfA、InfB和A(HlNl)三組引物和三條Taqman探針混合在一個(gè)反應(yīng)管中， 使用 ‘PrimeScript—步法RT-PCR試劑盒(Ver. 2)，(TAKARAiPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2')的RT-PCR緩沖液進(jìn)行試劑配制，其中引物使用量為7-15pmol，探針使用量為 0. 5-5pmoL·反應(yīng)總體積為25 μ 1 ；配制試劑體積18 μ 1/反應(yīng)(預(yù)留2 μ 1用于添加酶混合 物；預(yù)留5 μ 1用于模板)，該方法的反應(yīng)條件為50°C 30分鐘，94°C 2分鐘，熱循環(huán)為94°C 10 秒，55°C 35秒，共40個(gè)循環(huán)。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明所說(shuō)的一管多重方式包括在同一反應(yīng) 管內(nèi)同時(shí)檢測(cè)甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感病毒中的任意兩種病毒或 三種病毒。本發(fā)明的目的之二是提供了用于檢測(cè)甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi 流感病毒的引物和探針。引物序列選自與如下序列中的至少一種相同、相似或互補(bǔ)的序列 (見(jiàn)序列表 SEQ ID NO 1-6)IFAF GAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATC ；IFAR TCTTCAAGTCTCTGCGCGATT ；IFBF CCCTGCTTGCTCGTAGTATGG ；IFBR GCTTATGGGAAGCACCACTTTG ；
AHlF GGTTTGAGATATTCCCCAAGACA ；AHlR :GAGGACATGCTGCCGTTACA。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)甲型流感病毒、乙型流感病毒和新甲型Hmi流感病毒 的探針是能與用上述引物擴(kuò)增得到的核酸序列雜交的序列。優(yōu)選的，所述探針選自與如序列SEQ ID NO :7_10中的至少一種相同、相似或互補(bǔ) 的序列。所述相似序列是指與上述序列存在個(gè)別不同的堿基，比如1-5個(gè)堿基，只要不影響 擴(kuò)增效果；不同的堿基表現(xiàn)可以為在原有序列基礎(chǔ)上插入、缺失、替換等方式。本發(fā)明還提供了一種人甲型流感，乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多重?zé)?光PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含序列如SEQ ID NO :1_6所示的引物。該試劑盒還包含如下的熒光標(biāo)記探針RSV-FAM :FAM-TATGAATGCCTATGGTGCAGGGCAAG_BHQ ；ADV-TAMRA :TAMRA-AAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCG_BHQ2 ；HMPl-JOE JOE-AGAGATGTAGGCACCACAAC-MGB ；HMP2-J0E JOE-TGGCCAATTGCCCCAATTTTGC-BHQ1 ；HMP3-J0E JOE-CTAGCCAACTGTCCCAACTTTGCA-BHQl。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方法采用自身設(shè)計(jì)的InfA/InfB/A (HlNl)特異引物及Taqman 探針，使用FAM/J0E/TAMRA多重?zé)晒馑貥?biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)infA、infB、A(HlNl)(簡(jiǎn)稱為M-ABH1) 的多重檢測(cè)，具有特異性高、靈敏度高、快速、操作簡(jiǎn)單方便、成本低廉等多種優(yōu)點(diǎn)，可作為 人甲型流感，乙型流感及新甲型Hmi流感病毒檢測(cè)的試劑，用于科研及臨床應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1 引物、探針的特異性實(shí)驗(yàn)運(yùn)用生物信息學(xué)和設(shè)計(jì)引物探針的生物軟件對(duì)甲、乙型流感病毒及新甲型Hmi 流感病毒序列資料，分別對(duì)甲、乙型流感病毒的保守區(qū)進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)，對(duì)新甲型Hmi 流感病毒的Hl基因的保守區(qū)進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)，其中探針?lè)謩e采用TAMRA、FAM、JOE標(biāo)記。 詳細(xì)序列見(jiàn)表1所示，表1為人甲型流感、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒引物及探針序 列。表 1InfAIFAFGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCIFARTCTTCAAGTCTCTGCGCGATT[FA-TAMRATAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2InfBIFBFCCCTGCTTGCTCGTAGTATGGIFBRGCTTATGGGAAGCACCACTTTGIFB-FAMFAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1A(HlNl)AHlFGGTTTGAGATATTCCCCAAGACAAHlRGAGGACATGCTGCCGTTACAAHl-JOEJOE-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1為驗(yàn)證所設(shè)計(jì)的引物和探針的特異性，首先設(shè)計(jì)單重?zé)晒釶CR反應(yīng)，對(duì)引物和探 針進(jìn)行評(píng)估，即分別檢測(cè)InfA、InfB和A(HlNl)三組引物及相應(yīng)探針單獨(dú)反應(yīng)的特異性。 實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)分離的陽(yáng)性株進(jìn)行，陽(yáng)性株來(lái)源于廣州呼吸疾病研究所、呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)，分別選擇流感A、流感B，另外用副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、 腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠狀病毒229E、0C43、肺炎支原體MP、肺炎衣原體 CP作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)分別取100μ 1培養(yǎng)物標(biāo)本，通過(guò)常規(guī)RNA/DNA提取方法提取，得 到50 μ 1核酸產(chǎn)物，使用DEPC水對(duì)核酸提取產(chǎn)物100倍稀釋后作為模板(其中H5W不進(jìn) 行稀釋，冠狀病毒及偏肺病毒產(chǎn)物稀釋10倍)。使用‘PrimeScript —步法RT-PCR試劑盒 (Ver. 2) ’ (TAKARA iPrimeScript One Step RT-PCR KitVer. 2')中的 RT-PCR 緩沖液進(jìn)行 試劑配制，其中引物使用量為7-15pmol，探針使用量為0. 5-5pmol。反應(yīng)總體積為25 μ 1 ； 配制試劑體積18 μ 1/反應(yīng)(預(yù)留2 μ 1用于添加酶混合物；預(yù)留5 μ 1用于添加模板)，在 八排管中分別加入18 μ L流感Α、流感B、新甲流Hmi的單重反應(yīng)液，最后放置于熒光定量 PCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)條件如下50°C 30分鐘，94°C 2分鐘，熱循環(huán)為94°C 10秒，55°C 35秒， 共40個(gè)循環(huán)，表2為單重infA、infB、A(HlNl)試劑檢測(cè)80株陽(yáng)性病毒株的情況，其中流 感A(H3N213株、普通HmilO株、新甲流Hmill株、H5N1滅活標(biāo)本1株、H9亞型株1株)、 流感B 20株，另外有副流感1、副流感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒 HRV、偏肺病毒HMP、冠狀病毒229E、0C43、肺炎支原體MP、肺炎衣原體CP各2株作為陰性對(duì) 照。表2
單重試劑檢測(cè)結(jié)果InfAInfBA(HlNl)陽(yáng)性362011陰性446069總計(jì)808080 實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，陽(yáng)性結(jié)果與預(yù)期完全符合，與其他常見(jiàn)呼吸道病原體副流感1、副流 感2、副流感3、呼吸道合胞病毒RSV、腺病毒ADV、鼻病毒HRV、偏肺病毒HMP、冠狀病毒229E、 0C43、肺炎支原體MP、肺炎衣原體CP等無(wú)交叉反應(yīng)，infA-infB、A (HlNl)-infB之間亦無(wú)交 叉反應(yīng)，infA-A (HlNl)在普通流感A時(shí)無(wú)交叉反應(yīng)，特異性高。
實(shí)施例2 =M-ABHl多重檢測(cè)試劑的特異性實(shí)驗(yàn)多重檢測(cè)試劑使用TAKARA iPrimeScript 一步法RT-PCR試劑盒 (Ver. 2) ‘ (TAKARA iPrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver. 2')的 RT-PCR 緩沖液進(jìn)行 試劑配制，其中引物的使用量為7-15pmol，探針的使用量為0. 5-5pmol。將表1中的InfA/ InfBA(HlNl)引物及各條探針配制為一管反應(yīng)液(M-ABHl)。反應(yīng)總體積為25 μ 1/反應(yīng)， 配制試劑體積18 μ 1/反應(yīng)，預(yù)留2 μ 1用于添加酶混合物；預(yù)留5 μ 1用于添加模板。分別 使用單陽(yáng)性模板(普通流感A ；流感B或新甲流Hmi)；雙陽(yáng)性模板(普通流感A-流感B; 普通流感A-新甲流Hmi ；流感B-新甲流Hmi)；三陽(yáng)性模板(普通流感A-流感B-新甲流 Η1Ν1)對(duì)多重檢測(cè)試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)使用單重?zé)晒釶CR試劑進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3， 表3是各種模板情況下多重M-ABHl流感病毒檢測(cè)試劑與單重檢測(cè)的對(duì)比。表權(quán)利要求
人甲、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多檢方法，包括樣品核酸的制備和多重PCR擴(kuò)增步驟，其特征在于，所述多重PCR擴(kuò)增步驟中采用了序列如SEQ ID NO1 6所示的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多檢方法，其特征在于，所述多重PCR擴(kuò)增步驟中還采用了序 列如SEQ ID N0:7-9所示的探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多檢方法，其特征在于，所述多重PCR擴(kuò)增步驟中還采用了如 下熒光標(biāo)記的探針I(yè)FA-TAMRA :TAMRA-CATCAGGCCCCCTCAAAGCCG-BHQ2 ；IFB-FAM :FAM-CGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGA-BHQ1 ；AHl-JOE JOE-TTCATGGCCCAATCATGACTCGAACA-BHQ1。
4.用于人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多檢的引物，其特征在于，所述引 物序列選自與如SEQ ID NO :1-6序列中的至少一種相同、相似或互補(bǔ)的序列。
5.用于人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多檢的探針，其特征在于，所述探 針能與用權(quán)利要求4所述的引物擴(kuò)增的核酸序列雜交的序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其特征在于，所述探針選自與如SEQIDN0:7-9序列中 的至少一種相同、相似或互補(bǔ)的序列。
7.一種人甲、乙型流感及新甲型Hmi流感病毒一管多檢試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒包含如權(quán)利要求1所述的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多檢試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含如權(quán)利要求3所 述的熒光標(biāo)記探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的一管多重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法，該方法采用了序列如SEQ ID NO1-6所示的引物，還采用了序列如SEQ ID NO7-9所示的探針。本發(fā)明還提供了一種人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒一管多重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含上述引物和探針。本發(fā)明采用InfA/InfB/A(H1N1)特異引物及Taqman探針，使用FAM/JOE/TAMRA多重?zé)晒馑貥?biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)人甲型流感、乙型流感及新甲型H1N1流感病毒的多重檢測(cè)，具有特異性高、靈敏度高、快速、操作簡(jiǎn)單方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，可作為多重檢測(cè)試劑，用于科研及臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101942525SQ20101017135
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者劉文寬, 周榮, 蘇曉波, 高文娟 申請(qǐng)人:廣州市華南醫(yī)學(xué)病毒學(xué)研究所;廣州呼吸疾病研究所