專(zhuān)利名稱(chēng)：：類(lèi)異戊二烯的生產(chǎn)的制作方法類(lèi)異戊二烯的生產(chǎn)交叉引用本申請(qǐng)要求2006年5月26日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/808,989和2006年12月18日提交的60/870,592的優(yōu)先權(quán)，這些臨時(shí)申請(qǐng)全文引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
：類(lèi)異戊二烯在自然界中普遍存在。它們包括不同家族的超過(guò)40,000種個(gè)體產(chǎn)物，其中許多對(duì)于活生物體是至關(guān)重要的。類(lèi)異戊二烯用來(lái)維持細(xì)胞流動(dòng)性、電子傳遞和其它代謝功能。大量的天然和合成類(lèi)異戊二烯可用作藥物、化妝品、香料、色素和顏料、殺真菌劑、抗菌劑、營(yíng)養(yǎng)品和精細(xì)化學(xué)中間體。類(lèi)異戊二烯產(chǎn)物通常由重復(fù)的五碳異戊烯二磷酸(IPP)單元組成，盡管也曾報(bào)道了不規(guī)則的類(lèi)異戊二烯和多薛。實(shí)際上，類(lèi)異戊二烯是通過(guò)它們的前體IPP和其異構(gòu)體二曱基烯丙基焦磚酸(DMAPP)連續(xù)縮合而合成的。已知這些前體有兩種途徑。除植物以外，真核生物通常利用依賴(lài)于曱羥戊酸(MEV)的途徑將乙酰輔酶A(乙酰-CoA)轉(zhuǎn)化為IPP，然后IPP纟皮異構(gòu)化為DMAPP。除了部分例外以外，原核生物一般只利用不依賴(lài)于曱羥戊酸的途徑或脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑產(chǎn)生IPP和DMAPP。植物既利用MEV途徑又利用DXP途徑。參見(jiàn)Rohmer等人.(1993)歷ocA亂丄295:517-524;Lange等人.(2000)戶(hù)亂A^/.OS^97(24):13172-13177;Rohdich等人.(2002)尸roc.淑/.JcW.園99:1158-1163。傳統(tǒng)上，類(lèi)異戊二烯通過(guò)從諸如植物、微生物和動(dòng)物的天然來(lái)源中提取來(lái)生產(chǎn)。然而，由于許多嚴(yán)重的限制，提取的產(chǎn)率通常極低。首先，大多數(shù)類(lèi)異戊二烯在自然中只少量積累。其次，來(lái)源生物體通6常不適合大規(guī)模培養(yǎng)，而大規(guī)模培養(yǎng)是商業(yè)生產(chǎn)有效量的所需類(lèi)異戊二烯所必需的。第三，類(lèi)異戊二烯提取需要某些有毒溶劑，這需要特殊的處理步驟，因此使類(lèi)異戊二烯的商業(yè)生產(chǎn)變得復(fù)雜化。MEV和DXP代謝途徑的闡明已經(jīng)使得類(lèi)異戊二烯的生物合成生產(chǎn)成為可行的。例如，已經(jīng)將微生物工程化為過(guò)量表達(dá)甲羥戊酸途徑的一部分或者全部，用于生產(chǎn)被稱(chēng)為紫穗槐-4，11-二烯的類(lèi)異戊二烯(美國(guó)專(zhuān)利7,172,886和7,192,751號(hào))。其它努力集中于平衡甘油醛-3-磷酸和丙酮酸的集合，或者集中于提高l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(dxs)和IPP異構(gòu)酶(idi)的表達(dá)。參見(jiàn)Farmer等人.(2001)肌o&c/mo/.7V。g.17:57-61;Kajiwara等人.(1997)腸cA亂丄324:421-426;和Kim等人.(2001)所o化c/mo/.72:408-415。然而，鑒于許多商業(yè)應(yīng)用需要極大量的類(lèi)異戊二烯產(chǎn)物，仍然需要比現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)生更多類(lèi)異戊二烯的表達(dá)系統(tǒng)和發(fā)酵方法。微生物代謝向類(lèi)異戊二烯生產(chǎn)的最佳重定向需要將引入的生物合成途徑適當(dāng)?shù)毓こ袒?，從而在持續(xù)的時(shí)間期限內(nèi)既能使碳用于有效地產(chǎn)生類(lèi)異戊二烯，又能阻止代謝中間體的毒性水平的建立。本發(fā)明滿(mǎn)足了這一需要并且也提供了相關(guān)的優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供用于在單獨(dú)的或者組合的至少一個(gè)異源調(diào)節(jié)物或發(fā)酵條件控制下利用異戊烯焦磷酸途徑酶大規(guī)模生產(chǎn)類(lèi)異戊二烯的組合物和方法。合適的類(lèi)異戊二烯的非限定性的例子包括半萜類(lèi)(由l個(gè)異戊二烯單元衍生)如異戊二烯；單萜類(lèi)(由2個(gè)異戊二烯單元衍生)如月桂烯；倍半碎類(lèi)(由3個(gè)異戊二烯單元衍生)如紫穗槐-4,11-二烯；二萜類(lèi)(由4個(gè)異戊二烯單元衍生)如紫杉二烯(taxadiene);三萜類(lèi)(由6個(gè)異戊二烯單元衍生)如鯊烯；四碎類(lèi)(由8個(gè)類(lèi)異戊二烯衍生)如j3-胡蘿卜素；和多萜類(lèi)(由8個(gè)以上的異戊二烯單元衍生)如多異戊二烯。一個(gè)方面，一種生產(chǎn)類(lèi)異戊二烯的方法包括以下步驟(a)獲得多個(gè)包含產(chǎn)生異戊烯焦磷酸的酶途徑的宿主細(xì)胞，其中所有途徑酶都在至少一個(gè)異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制之下；和(b)在與為宿主細(xì)胞提供最大比生長(zhǎng)速率的條件相比為亞最佳的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該途徑是甲羥戊酸途徑。在其它實(shí)施方案中，該途徑是DXP途徑。在其它實(shí)施方案中，該至少一種異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是可誘導(dǎo)的。在其它實(shí)施方案中，途徑酶處于單個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制之下。在其它實(shí)施方案中，途徑酶處于多個(gè)異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制之下。在一些實(shí)施方案中，所述途徑包括編碼來(lái)自于具有內(nèi)源曱羥戊酸途徑的原核生物的曱羥戊酸途徑酶的核酸序列。示例性的具有內(nèi)源曱羥戊酸途徑的原核生物包括〗旦不限于腸^求菌屬(^Weracoccw)、j叚單月包菌屬(尸sewdowow(xy)禾口葡萄3求菌屬(^SV"/7/z少/ococcw51)。在一個(gè)實(shí)施方案中，甲羥戊酸途徑酶選自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶和曱羥戊酸激酶。在另一實(shí)施方案中，異源核酸序列編碼II類(lèi)HMG-CoA還原酶。在另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中營(yíng)養(yǎng)物和/或溫度水平保持在低于為宿主細(xì)胞提供最大比生長(zhǎng)速率的水平上。在另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中碳源保持在提供低于最大比生長(zhǎng)速率的大約90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之間的水平上。在另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中氮源保持在提供低于最大比生長(zhǎng)速率的大約90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之間的水平上。在另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中溫度保持在提供最大比生長(zhǎng)速率的低于大約90%、75%、50%、25%、10%或介于90%和10%之間的水平上。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基溫度保持在比提供最大比生長(zhǎng)速率的溫度至少低約2°C、4°C、5°C、6°C、8°C、10。C、15。C或20。C。在又另一實(shí)施方案中，一種生產(chǎn)類(lèi)異戊二烯或類(lèi)異戊二烯前體的方法包括以下步驟(i)進(jìn)行包含發(fā)酵培養(yǎng)基和多個(gè)產(chǎn)生類(lèi)異戊二烯的遺傳修飾的宿主細(xì)胞的發(fā)酵反應(yīng)，其反應(yīng)條件使得(a)發(fā)酵培養(yǎng)基保持在低于提供所述宿主細(xì)胞的最大比生長(zhǎng)速率的溫度的溫度下；(b)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的含量低于提供宿主細(xì)胞的最大比生長(zhǎng)速率的量；和/或(C)發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源的含量低于提供宿主細(xì)胞的最大比生長(zhǎng)速率的量；(ii)回收在(a)至(c)所述的一個(gè)或多個(gè)條件下產(chǎn)生的類(lèi)異戊二烯。在一個(gè)方面，類(lèi)異戊二烯在(a)至(c)所述的至少兩個(gè)條件下產(chǎn)生。在另一方面，類(lèi)異戊二烯在(a)至(c)所述的所有條件下產(chǎn)生。引用參考本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)都引入本文作為參考，如果每一單獨(dú)的出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)具體且單獨(dú)地引入本文作為參考。圖1A是產(chǎn)生異戊烯焦磷酸("IPP")的曱羥戊酸("MEV")途徑的示意圖。圖1B是產(chǎn)生異戊烯焦磷酸("IPP")和二甲基烯丙基焦磷酸("DMAPP")的l-脫氧-D-木酮糖5-二磷酸("DXP")途徑的示意圖。Dxs是1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶；Dxr是l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(也被稱(chēng)為IspC);IspD是4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤蘚糖醇合成酶；IspE是4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶；IspF是2C-曱基-D-赤蘚糖醇2，4-環(huán)二磷酸合成酶；IspG是1-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸合成酶(IspG);ispH是異戊烯基/二甲基烯丙基二磷酸合成酶。圖2是異戊烯焦磷酸("IPP")和二曱基烯丙基焦磷酸脂("DMAPP")向香葉基焦磷酸("GPP")、法尼焦磷酸("FPP")和香葉基香葉基焦磷酸("GGPP")轉(zhuǎn)化和各種類(lèi)異戊二烯合成的示意圖。圖3顯示表達(dá)質(zhì)粒pMBIS-gpps的圖譜。圖4顯示表達(dá)質(zhì)粒pAM408的圖譜。圖5顯示表達(dá)質(zhì)粒pAM424的圖譜。圖6顯示表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-ADS、pTrc99A-FSA、pTrc99A-9LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-GTS、pTrc99A畫(huà)APS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A畫(huà)TS、pTrc99A畫(huà)CS、pTrc99A-SS和pAM373的圖"i普。圖7A-C是質(zhì)粒pAM489-pAM498的構(gòu)建和pAM328的圖示。圖8顯示與酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)截決豆HMG-CoA還原酶(tHMGR)相比，糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)HMGR-CoA還原酶(HMGR)的較高的比活性和提高的穩(wěn)定性。圖9顯示每升細(xì)胞干重("DCW")和OD60()之間的相關(guān)性。圖IOA-B顯示與攜帶釀酒酵母tHMGR和HMGS基因的宿主菌抹相比，攜帶金黃色葡萄5求菌(Stop/少/ococc^)HMGH和HMGS基因的宿主菌抹的紫穗槐-4,11-二烯體積產(chǎn)率和比產(chǎn)率提高。圖11A-B顯示較低的溫度對(duì)大腸桿菌宿主菌抹的紫穗槐-4,ll-二烯產(chǎn)率的影響。圖12A-B顯示降低的葡萄糖水平對(duì)大腸桿菌宿主菌株的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)率的影響。圖13A-B顯示較低的溫度和降低的葡萄糖水平對(duì)大腸桿菌宿主菌抹的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)率的聯(lián)合影響。圖14A-E和15A-E顯示較低的溫度和降低的葡萄糖水平和氮水平對(duì)大腸桿菌宿主菌林的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)率的聯(lián)合影響。圖16顯示大腸桿菌宿主菌林通過(guò)DXP途徑產(chǎn)生紫穗槐-4,ll-二發(fā)明詳述定義除非另外定義，此處使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在此參考大量定義為具有以下含義的術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)"任選的，，或"任選地"意思是隨后描述的特征或結(jié)構(gòu)可以存在也可以不存在，或者隨后描述的事件或狀況可以存在也可以不存在，10并且這種描述包括存在具體特征或結(jié)構(gòu)的情況和不存在該特征或結(jié)構(gòu)的情況，或者發(fā)生該事件或狀況的情況以及不發(fā)生該事件或狀況的情況。此處使用的術(shù)語(yǔ)"代謝途徑"是指分解代謝途徑或合成代謝途徑。合成代謝途徑涉及由較小的分子構(gòu)建較大的分子，這是需要能量的過(guò)程。分解代謝途徑涉及較大分子的分解，通常釋放能量。此處使用的術(shù)語(yǔ)"曱羥戊酸途徑"或"MEV途徑"是指將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為IPP的生物合成途徑。MEV途徑在圖1A中示意性地顯示。此處使用的術(shù)語(yǔ)"脫氧木酮糖5-磷酸途徑"或"DXP途徑"是指將甘油醛-3-磷酸和丙酮酸轉(zhuǎn)化為IPP和DMAPP的途徑。DXP途徑在圖1B中示意性地顯示。詞語(yǔ)"焦磷酸，，在此處與"二磷酸，，可以互換使用。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"或"載體"是指這樣一種核酸，它轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或感染宿主細(xì)胞，從而使細(xì)胞產(chǎn)生除細(xì)胞天然的核酸和/或蛋白質(zhì)以外的核酸和/或蛋白質(zhì)，或者以對(duì)于細(xì)胞而言非天然的方式表達(dá)核酸和/或蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)源"是指自然存在的，例如在非重組宿主細(xì)胞中存在的物質(zhì)或過(guò)程。術(shù)語(yǔ)"生成異戊烯焦磷酸的酶途徑"是指任何能夠產(chǎn)生異戊烯焦磷酸的途徑，包括但不限于甲羥戊酸途徑或DXP途徑。術(shù)語(yǔ)"核酸，，是指任意長(zhǎng)度的核普酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸，也可以是脫氧核苷酸。因此，該術(shù)語(yǔ)包括但不限于單鏈、雙鏈或多4連DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體或包含噤呤和嘧咬堿或其它天然的、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的、非天然的、或衍生化的核苷酸堿基的聚合物。術(shù)語(yǔ)"操縱子"是指兩個(gè)或多個(gè)連續(xù)的核香酸序列，其中每一個(gè)編碼諸如RNA或蛋白質(zhì)的基因產(chǎn)物，其表達(dá)被一個(gè)或多個(gè)控制元件(例如啟動(dòng)子)協(xié)同調(diào)節(jié)。術(shù)語(yǔ)"基因產(chǎn)物"是指由DNA編碼的RNA(或者相反)，或者由RNA或DNA編碼的蛋白質(zhì)，其中基因一般包含一個(gè)或多個(gè)編碼蛋白質(zhì)的核香酸序列，并且也可以包含內(nèi)含子和其它非編碼核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"是指任意長(zhǎng)度的氨基酸的聚合形式，可以包括編碼的和非編碼的氨基酸、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的或衍生化的氨基酸和具有修飾的肽骨架的多肽。此處使用的術(shù)語(yǔ)"異源核酸"是指至少下述之一為事實(shí)的核酸(a)核酸對(duì)于給定宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是外來(lái)的("外源的")(即不是自然存在的)；(b)該核酸包含在給定宿主細(xì)胞中自然發(fā)現(xiàn)的(即，"內(nèi)源的")核普酸序列，但是該核苷酸序列在細(xì)胞中以非自然的(例如高于預(yù)期或者高于自然發(fā)現(xiàn)的)量產(chǎn)生；(c)該核酸包含在序列上不同于內(nèi)源核苷酸序列的核苷酸序列，但是該核苷酸序列編碼相同的蛋白質(zhì)(具有相同或基本相同的氨基酸序列)并且在細(xì)胞中以非自然的(例如高于預(yù)期或者高于自然發(fā)現(xiàn)的)量產(chǎn)生；或者(d)該核酸包含兩個(gè)或多個(gè)核苷酸核酸是重組的)。"轉(zhuǎn)基因，，是指外源導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的基因。它可以包含內(nèi)源或外源的或者異源的核酸。術(shù)語(yǔ)"重組宿主"(也被稱(chēng)為"遺傳修飾的宿主細(xì)胞"或"遺傳修飾的宿主微生物")是指包含本發(fā)明的異源核酸的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"外源核酸，，是指外源導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的核酸，因此實(shí)際上在給定細(xì)胞中通?；蜃匀坏夭淮嬖诤?或不產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)"調(diào)節(jié)元件"是指轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、多腺苷酸信號(hào)、終止子、蛋白質(zhì)降解信號(hào)等等，它們提供和/或調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中編碼序列的表達(dá)和/或編碼多肽的產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"是指在導(dǎo)入新核酸后在細(xì)胞中誘導(dǎo)的持久的或瞬時(shí)的遺傳改變。遺傳改變("修飾")可以通過(guò)向宿主細(xì)胞基因組中摻入新DNA，或者通過(guò)瞬時(shí)或穩(wěn)定地維-持新DNA作為附加型元件(episomalelement)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在真核細(xì)胞中，永久的遺傳改變通常通過(guò)向細(xì)胞基因組中導(dǎo)入DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。在原核細(xì)胞中，永久的遺傳改變可以被導(dǎo)入染色體中或者通過(guò)染色體外元件如質(zhì)粒和表達(dá)載體導(dǎo)入，該染色體外元件可以含有一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記來(lái)幫助它們保持在重組宿主細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)"有效連接"是指一種并列，其中這樣描述的成分的關(guān)系允許它們以預(yù)期方式起作用。例如，如果啟動(dòng)子影響核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則啟動(dòng)子與該核苷酸序列有效連接。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"和"宿主微生物"在此可以互換使用，是指任何古細(xì)菌(archae)、細(xì)菌或真核活細(xì)胞，其中可以或者已經(jīng)插入了異源核酸。該術(shù)語(yǔ)也涉及原細(xì)胞的后代，由于自然的、意外的或故意的突變，它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)上或者在基因組或總DNA互補(bǔ)上可能不一定與原親本完全相同。術(shù)語(yǔ)"合成的"在用于核酸時(shí)是指化學(xué)合成的寡核苷酸結(jié)構(gòu)單元退火，形成基因片段，然后通過(guò)酶裝配，構(gòu)建完整的基因。通過(guò)"化學(xué)方法"的核酸合成是指組成核苷酸在體外裝配。術(shù)語(yǔ)"天然的"在用于核酸、細(xì)胞或生物體時(shí)，是指在自然中發(fā)現(xiàn)的核酸、細(xì)胞或生物體。例如，可以從自然來(lái)源中分離的并且沒(méi)有在實(shí)驗(yàn)室中人工故意修飾的存在于非病原(非致病)生物體中的多肽或多核苷酸序列，是天然的。術(shù)語(yǔ)"天然存在的"在用于核酸、酶、細(xì)胞或生物體時(shí)，是指天然發(fā)現(xiàn)的核酸、酶、細(xì)胞或生物體。例如，可以從自然來(lái)源中分離的并且沒(méi)有在實(shí)驗(yàn)室中人工故意修飾的存在于生物體中的多肽或多核苷酸序列，是天然存在的。術(shù)語(yǔ)"生物活性片段"在用于蛋白質(zhì)、多肽或酶時(shí)，是指蛋白質(zhì)或多肽或酶的功能部分。功能等價(jià)物可以具有變異的氨基酸序列，可能由于例如已知在核酸序列和這樣編碼的蛋白質(zhì)內(nèi)天然存在的密碼子冗余和功能等價(jià)性而產(chǎn)生?；蛘?，功能等價(jià)的蛋白質(zhì)或肽可以通過(guò)應(yīng)用DNA重組技術(shù)來(lái)構(gòu)建，在該技術(shù)中基于對(duì)所交換的氨基酸性質(zhì)的考慮，可以構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。術(shù)語(yǔ)"類(lèi)異戊二烯"、"類(lèi)異戊二烯化合物"、"類(lèi)異戊二烯產(chǎn)物"、13"辟"、"辟化合物"、"類(lèi)辟"和"類(lèi)辟化合物"在此可互換使用。它們是指能夠由IPP衍生的化合物。單數(shù)形式，如"一種"，包括復(fù)數(shù)的所指物，除非上下文中清楚地表明不是這樣。因此，例如，提到"表達(dá)載體"包括一種表達(dá)載體以及多種表達(dá)載體，而提到"該宿主細(xì)胞"包括一種或多種宿主細(xì)胞，以此類(lèi)推。進(jìn)一步指出，權(quán)利要求可以撰寫(xiě)為不包括任何任選的組件。這樣，該聲明作為在描述權(quán)利要求組件時(shí)使用如"單獨(dú)"、"僅僅"等排他性術(shù)語(yǔ)或者使用"負(fù)面"限制的前提基礎(chǔ)。除非另外指出，本發(fā)明不限于特定序列、表達(dá)載體、酶、宿主微生物或方法，因?yàn)檫@些可能根據(jù)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的理解考慮本文的教導(dǎo)而變化。此處使用的術(shù)語(yǔ)只是用于描述具體實(shí)施方案，而不是限制。任何合適的宿主細(xì)胞都可以在本發(fā)明的實(shí)施中使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是遺傳修飾的宿主微生物，其中核酸分子已經(jīng)插入、刪除或修飾(即突變；例如，通過(guò)核苷酸的插入、刪除、置換和/或倒置)，從而產(chǎn)生所需的類(lèi)異戊二烯化合物或類(lèi)異戊二烯衍生物，或者實(shí)現(xiàn)所需類(lèi)異戊二烯化合物或類(lèi)異戊二烯衍生物的提高的產(chǎn)率。在另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞能夠在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。相反，"對(duì)照細(xì)胞，，是實(shí)驗(yàn)中用于比較目的的替代實(shí)驗(yàn)對(duì)象或樣品，一般是不含對(duì)相應(yīng)宿主細(xì)胞所做的修飾的親本細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞的說(shuō)明性例子包括任何原始細(xì)胞(archaecell)、原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。原始細(xì)胞的例子包括但不限于屬于以下屬的那些細(xì)胞氣熱菌屬(爿eropyrwm)、古生J求菌屬(^n:/meg/c^ws)、鹽桿菌屬(//a/c^a"en'wm)、曱烷3求菌屬(T^fe〃7"/70coc"")>曱-完才干菌屬(AfW/m"o/"c/e廠/w附)、火；求菌屬(尸少racoccws)、石?；~菌屬(5W/o/oZ)M)和熱原體屬(77^/7wo//wma)。原始細(xì)胞抹的說(shuō)明性例子包括但不限于敏捷氣熱菌(;erm'x)、閃爍古生球菌(^4rc/meog7oZt^/w/g7'c/tw)、詹氏曱坑球菌(Afef/ia打ococct(s乂a打打osc/i")、熱自養(yǎng)甲》咒桿菌(Me/77冊(cè)o/)a"en'謂./7zermoflWoro//H'CMm)、尸yracoccw51a6j^s7'、P少racoccws/zor汰o5"/^'、口藍(lán)酉菱熱原體(T7^，o//(3扁flac^/op/H'/w/7),火山^^y^、體(T7zerwop/"smavo/caw/w附)。原核細(xì)胞的例子包括但不限于屬于以下屬的那些細(xì)胞土壤桿菌屬(」gra^ac""'wm)、月旨環(huán)酉臾才干菌屬(爿/z'qyc/o6ac/〃ws)>項(xiàng)圈藻屬y4wa6aewa)、纟且囊藍(lán)纟田菌屬(^wacj^/^)>節(jié)才干菌屬^W/zrc^ac/^廠)、固氮菌屬(Jzo6fl"er)>芽孑包#干菌屬Bac〃/rn1)>短桿菌屬(BreW6ac"",畫(huà))、色素菌屬C7zrow"http://"m)、沖炎菌屬(C7ay^7.<i/wm)、才奉斥f菌屬C(90^7e^ac/^n'wm)、腸4干菌屬(EV^ero/^cer)、區(qū)欠文氏菌屬A，rw/m'a)、^矣希氏菌屬(^^c/^Wc/z/a)>專(zhuān)'L一干菌屬Lactohac〃/ws)、乳3求菌屬(丄actococcM)、才艮瘤菌屬M(fèi)^or/z/zo/)/i,附)、曱基-干菌屬(Afc^y/o/"c,er/w/M)、孩t^干菌屬M(fèi)/cra6acten'wm)、席藍(lán)纟田菌屬(P/zormzWwm)、布支單月包菌屬i^ew^omowfls)、纟工纟田菌屬(WAo<io/7a"￡r)、纟工々I單月包菌屬)、紅螺菌屬(i/o<ic>—n7/謂)、紅球菌屬W/zoti(9coccws)、沙、門(mén)氏菌屬(》Sa/mowe〃a)、Sce"e(iesmw"、沙、雷氏菌屬(^rra"fl)、志賀氏菌屬(57^'ge〃a)、葡萄球菌屬(^SVfl/7/z/ococcw6")、鏈球菌屬(^SV"ram少ces)>5y朋ecocc"5和發(fā)酵單月包菌屬(Z拜o附o冊(cè)s)。原核菌林的說(shuō)明性例子包括但不限于枯草芽孢桿菌(^7"7/w>解淀粉芽孢桿菌(紐/〃m菌(Bre"W/(2cten'wwam附o"Zage"^s1)、5reW/)acten'ww/mm"rz'o//n7wm、拜氏才炎菌(C7oWnWwwhe,'geri"ch7)、阪崎腸沐干菌(￡>^era^"ersafa2za&")、大腸軒菌、乳酸乳球菌(丄a"ococci^1/"c"s)、A/^o廠/nio6/Mm/o"'>4同纟錄，支單月包菌(尸5^wc/omowas1aerwgiwos"a)、尸sei^omowos1meva/ow//、Pseudomonas/w^ca、莢月莫纟工4干菌(7/0(ic^ac,erca/ww/a/iM1)、J求形纟工沐干菌(iAo(i(9Z)a"e廠^s7/men^(ies)、；果纟工纟工蟲(chóng)累菌(i^cxias^/n7/wmn/Zn/m)、腸沙、門(mén)氏菌(iS"/mowe〃")>i另寒;少門(mén)氏菌(Sa/wo"e〃a(y//n')、鼠"f另寒沙門(mén)氏菌(Sa/mowe〃a妙/n'mwn'畫(huà))、痢疾志賀氏菌(5T〖ge〃a(ij^ewten'(2e)、弗氏志賀氏菌(S/z/ge〃"/7ex"en')、索氏志賀氏菌)等。通常，如果使用細(xì)菌宿主細(xì)胞，則優(yōu)選非病原菌^^。非病原菌才朱的說(shuō)明性例子包括但不限于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、嗜酸乳桿菌(丄"c/^a"'〃M5"a"Wo//n7ws)、瑞士乳才干菌(丄a"o6"c/〃ws/w/ve"'cw5)、^同纟錄斗叚單月包菌、/^ew(iomoway附eva/om'/、尸sewtio附o"a5、5求開(kāi)j紅片干菌、i^c/o/(3"erca/^w/Wt^、；果纟工纟工蟲(chóng)累菌，等等。真核細(xì)胞的例子包括但不限于真菌細(xì)胞。真菌細(xì)胞的例子包括但不限于屬于以下屬的那些細(xì)胞曲霉屬(j^erg///^)、假絲酵母屬(G3"AWa)>金小孑包子屬(C7z廠j^os^or/Mw)、CVyc^ococcws、嫌孑包屬(T^an'ww)、嫌刀菌屬(X7i(yvero/"ces)、7Veo妙/iO(i^m、鏈孑包霉屬(臉wms70ra)、青霉屬(Pew/"7/z.wm)、畢赤酵母屬(P/c/z/a)、酵母屬(5VzccAara，ce^)、木霉屬(7Hc/zo(ie，a)和Za"Z/zo;/^〃o附少c^s1(以前一爾為';去夫酵母屬(P/zq/^")),真核菌抹的說(shuō)明性例子包括但不限于構(gòu)巢曲霉(A^w^〃wmWw/a/w)、黑曲霉(A/erg7'〃ws)>米曲霉(v^erg〃/wsor少zae)、白寸叚絲酵母(Cawd/(i(3a/6/caws)、C7廠j^c^pon'wm/wc/(wowewse、禾^一牛*孑包(^Fwsar/wmgram/wea廠wm)、Fwsar/wm乳酸克魯維酵母(幻w"era附y(tǒng)cM/acto)、粗糙脈孢菌(7Vewmypora)、安格斯畢赤酵母(i^c/n'flawgw虛)、尸/c/H'a力'w/awAca、尸z'c/u'a^c(iam(3e、月菱醭畢赤酵母(P/c/n'amem/ra皿e/ac/ms")、尸Zc/n.ameAawo//ca、尸/c/n'"0/廳dae、巴斯德畢赤酵母(P/c/"'apaeon's)、皮杰普畢赤酵母(A'c/n'(3/^)》en')、才樂(lè)畢赤酵母(A'c/由《werc冊(cè)w)、柳畢赤酵母(尸/c/n'asa/z'Cz'")、尸z'c//",/ermc^o/er""s、喜》'每>菜4唐畢赤酵母(尸/c/n'aZre力〃/o/力z7")、才對(duì)干畢赤酵母(尸/c/n'a幼》/to)、產(chǎn)二素鏈霉菌(6^e/7tom少c^am/—cz'e/is1)、金霉素鏈霉菌(/SV，/owyc^薦re—c/e似)、金色鏈霉菌(/SV廠e/^o考c^鹿r6w)、Saccara考c^s16a，wws、iSaccaromyc&s16ow/aniz'、酉良酒酵母、殺真菌素4連審菌(5Vreptom少ce51/wwg/c/A'cws)、灰產(chǎn)色鏈霉菌(<SVrep,om_yce5gr&oc/ramoge"es1)、灰色鏈霉菌(5V廠e/^ow少cesgr&ews)、淺青紫鏈霉菌(iSVr一o"ces//v油ws)、撒攬灰鏈霉菌(o/zVogr^ws)、枝鏈霉菌(5^ep,o"ce51ra膨ws)、田無(wú)鏈霉菌(iSVr一cw少ces她os/n'e腺'5)、酒紅鏈霉菌(5V廠e/^o，ces)、JHcAo(ie削a廠ee^和vYa"^zo//^〃omycesc/e"(iroWzca"(以前稱(chēng)為尸/a^ar/zcxiozjwa).通常，如果使用真核細(xì)胞，則優(yōu)選非病原林。非病原林的說(shuō)明性例子包括^旦不限于禾本-牛鐮孑包、Fi^an'ww、巴斯德畢赤酵母、Saccwom少ces6ow/aniZ禾口酉良酒酵母。另外，某些菌抹已經(jīng)被食品和藥品管理局指定為GRAS或者通常被視為安全的。這些菌林包括枯草芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌(Z^c/^ac〃/wsac/dop/H./i^)、^j士豸L斥干菌和酉良酒酵母。/尸P途徑本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括利用MEV途徑、DXP途徑或這兩種途徑來(lái)合成IPP及其異構(gòu)體DMAPP。通常，除植物以外的真核生物只利用MEV類(lèi)異戊二烯途徑將乙酰-CoA轉(zhuǎn)化為IPP,IPP隨后被異構(gòu)化為DMAPP。除了幾個(gè)例外以外，原核生物利用不依賴(lài)于曱羥戊酸的途徑或DXP途徑通過(guò)分支點(diǎn)分開(kāi)產(chǎn)生IPP和DMAPP。通常，植物利用MEV和DXP兩種途徑來(lái)合成IPP。MfK途徑MEV途徑的示意圖在圖1A中顯示。通常，該途徑包括六步。第一步，兩個(gè)乙酰輔酶A分子通過(guò)酶組合，形成乙酰乙酰-CoA。已知催化該步驟的一種酶是，例如，乙酰-CoA硫解酶(也被稱(chēng)為乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶)。核苷酸序列的"i兌明性例子包括^旦不限于以下GenBank登錄號(hào)和所述序列的來(lái)源生物(NC—000913REGION:172324131..2325315;大腸桿菌)、(D49362;脫氮副球菌(尸,coc，^""ny^aw))和(L20428;釀酒酵母)。MEV途徑的第二步，乙酰乙酰-CoA與另外一個(gè)乙酰-CoA分子酶促縮合，生成3-羥基-3-曱基戊二酰-CoA(HMG-CoA)。已知催化該步驟的一種酶是，例如，HMG-CoA合成酶。核苦酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(NC001145.互補(bǔ)19061..20536;釀酒酵母)、(X96617;酉良酒酵母)、(X83882;4以南芥(Jn^^fo;^^Aa/^ma))、(AB037907;A""a虛os^oragr&eo/a)、(BT007302;人(T7omosop/e似))和(NC—002758,基因座標(biāo)簽SAV2546,基因ID1122571;金黃色葡萄球菌(/SVop/z少/ococcwsawrews))。第三步，HMG-CoA被酶促轉(zhuǎn)化為曱羥戊酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，HMG-CoA還原酶。核苷酸序列的"i兌明性例子包4舌但不限于(NM—206548;黑腹果蠅(Z>oso//n7flme/a"ogaWw))、(NC—002758，基因座標(biāo)簽SAV2545,基因ID1122570;金黃色葡萄球菌)、(NM—204485;紅原雞(Gfl〃Mga〃w))、(AB015627;鏈霉菌屬的種d一謹(jǐn)yc^平)PCO3988),(AF542543;Mco"a麗a"e服(3to)、(AB037907;《"證鄉(xiāng)oragn',/a)、(AX128213，提供編碼截短HMGR的序列；釀酒酵母)和(NC—001145:互補(bǔ)(115734..118898;酉良酒酵母)。第四步，曱羥戊酸被酶促磷酸化，生成甲羥戊酸5-磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，甲羥戊酸激酶。核普酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(L77688;擬南芥)和(X55875;釀酒酵母)。第五步，向曱羥戊酸5-磷酸上酶促添加第二個(gè)磷酸基團(tuán)，生成甲羥戊酸5-焦磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，磷酸曱羥戊酸激酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AF429385;巴西三葉膠(//ewa6m^7&似&))、(NM—006556;人)和(NC—001145.互補(bǔ)712315..713670;釀酒酵母)。第六步，曱羥戊酸5-焦磷酸被酶促轉(zhuǎn)化為IPP。已知催化該步驟的一種酶是，例如，曱羥戊酸焦磷酸脫羧酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例18子包括^旦不限于(X9乃57;釀酒酵母)、(AF290095;屎腸^求菌如果IPP被轉(zhuǎn)化為DMAPP,則需要第七步。已知催化該步驟的一種酶是，例如，IPP異構(gòu)酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(NC—000913，3031087..3031635;大腸桿菌)和(AF082326;雨生紅球藻(i/aew^ococc^))。如果需要轉(zhuǎn)化為DMAPP,貝'J才是高的IPP異構(gòu)酶的表達(dá)確保了IPP向DMAPP的轉(zhuǎn)化不是整個(gè)途徑的限速步驟。DZP途徑DXP途徑的示意圖顯示在圖1B中。通常，DXP途徑包括七個(gè)步驟。第一步，丙酮酸與D-甘油醛3-磷酸縮合，生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶。核苦酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AF035440;大腸桿菌)、(NC_002947,基因座標(biāo)簽PP0527;惡臭4艮單胞菌(尸化wJowo"^pw"t/a)KT2440)、(CP000026,基因座標(biāo)簽SPA2301;腸沙門(mén)氏菌尸flra(y//〃；參見(jiàn)ATCC9150)、(NC一007493,基因座標(biāo)簽RSP—0254;球形紅桿菌2.4.1)、(NC—005296，基因座標(biāo)簽RPA0952;血色紅假單胞菌基因座標(biāo)簽AT5G11380;擬南芥)。第二步，1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸被轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AB013300;大腸桿菌)、(AF148852;擬南芥)、(NC—002947,基因座標(biāo)簽PP1597;惡臭假單胞菌KT2440)、(AL939124，基因座標(biāo)簽SC05694;天藍(lán)色鏈霉菌(Ar印tomyc^coe"co/or)A3(2))、(NC—007493,基因座標(biāo)簽RSP—2709;球形紅桿菌2.4.1)和(NC—007492，基因座標(biāo)簽Pfl—1107;焚光々1單月包菌(i^ei^cwow^w/Zwor^cem1)PfO-l)。.第三步，2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸被轉(zhuǎn)化為4-二磷酸胞苷酰-(f".teracoccws/aec:wm))和(U49260;人)。PD1293;苛養(yǎng)木桿菌2C-甲基-D-赤蘚糖醇。已知催化該步驟的一種酶是，例如，4-二磷酸胞苷酰-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AF230736;大腸桿菌)、(NC007493,基因座標(biāo)簽RSP—2835;球形紅桿菌2.4.1)、(NC—003(T71,基因座標(biāo)簽AT2G02500;擬南芥)和(NC一002947、基因座標(biāo)簽PP1614;惡臭假單胞菌KT2440)。第四步，4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤蘚糖醇被轉(zhuǎn)化為4-二磷酸胞苦酰-2C-甲基-D-赤蘚糖醇-2-磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，4-二磷酸胞苷酰-2C-曱基-D-赤蘚糖醇激酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AF216300;大腸桿菌)和(NC—007493,基因座標(biāo)簽RSP—1779;球形紅桿菌2.4.1)。第五步，4-二磷酸胞普酰-2C-曱基-D-赤蘚糖醇-2-磷酸被轉(zhuǎn)化為2C-甲基-D-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，2C-曱基-D-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合成酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AF230738;大腸桿菌)、(NC_007493,基因座標(biāo)簽RSP—6071;球形紅桿菌2.4.1)和(NC—002947,基因座標(biāo)簽PP1618;惡臭假單胞菌KT2440)。第六步，2C-曱基-D-赤蘚糖醇2，4-環(huán)二磷酸被轉(zhuǎn)化為1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。已知催化該步驟的一種酶是，例如，1-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合成酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AY033515;大腸桿菌)、(NC—002947，基因座標(biāo)簽PP0853;惡臭假單胞菌KT2440)和(NC—007493,基因座標(biāo)簽RSP—2982;球形紅桿菌2.4.1)。第七步，l-羥基-2-曱基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸被轉(zhuǎn)化為IPP或其異構(gòu)體DMAPP。已知催化該步驟的一種酶是，例如，異戊基/二曱基烯丙基二磷酸合成酶。核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AY062212;大腸桿菌)和(NCJ)02947,基因座標(biāo)簽PP0606;惡臭假單胞菌KT2440)。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞自身的代謝過(guò)程和本發(fā)明提供的IPP產(chǎn)生相關(guān)過(guò)程之間的"串?dāng)_"(或干擾)最小化或者完全消除。例如，當(dāng)宿主微生物只依賴(lài)DXP途徑合成IPP并且引入MEV途徑才是供另外的IPP時(shí)，串?dāng)_被最小化或者完全消除。這種宿主生物將不能改變MEV途徑酶的表達(dá)或者處理與MEV途徑有關(guān)的中間體。僅僅或主要依賴(lài)于DXP途徑的生物體包括，例如，大腸桿菌。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞通過(guò)單獨(dú)的MEV途徑或MEV途徑與DXP途徑組合產(chǎn)生IPP。在其它實(shí)施方案中，宿主的DXP途徑在功能上失能，因此宿主細(xì)胞只通過(guò)異源引入的MEV途徑產(chǎn)生IPP。通過(guò)使基因表達(dá)失能或者滅活一種或多種DXP途徑酶的功能，可以使DXP途徑在功能上失能。G化合物本發(fā)明的Cs化合物通常由IPP或DMAPP衍生。這些化合物也被稱(chēng)為半萜，因?yàn)樗鼈儊?lái)自于一個(gè)異戊二烯單元(IPP或DMAPP)。異戊二烯異戊二烯，其結(jié)構(gòu)為在多種植物中發(fā)現(xiàn)。異戊二歸通過(guò)異戊二烯合成酶由IPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AB198190;銀白楊("/z"))和(AJ294819;銀白楊)。C^化合物本發(fā)明的d?；衔锿ǔ?lái)源于由IPP與DMAPP縮合生成的香葉基焦磷酸(GPP)。已知催化該步驟的一種酶是，例如，香葉基焦磷酸合成酶。這些C10化合物也^C稱(chēng)為單辟，因?yàn)樗鼈儊?lái)源于兩個(gè)異戊二烯單元。圖2示意地顯示了IPP和DMAPP如何生成GPP，GPP可進(jìn)一步加工為單辟。香葉基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AF513111;北美冷杉(廟^g認(rèn)dis))、(AF513112;北美冷杉)、(AF513113;北美冷杉)、(AY534686;金魚(yú)草"濾7r/n,"謹(jǐn)m咖))、(AY534687;金魚(yú)草)、(Y17376;擬南芥)、(AE016877，基因座AP11092;蠟狀芽孢桿菌(Sa"7/wcwew);ATCC14579)、(AJ243739;甜橙(C"，W"畫(huà)^))、(AY534745;C/arAr^6re鄉(xiāng)n')、(AY953508;扭—)、(DQ286930;番(丄戶(hù)p簡(jiǎn).畫(huà)e廳/e幽m))、(AF182828;辣薄荷(臉《*xp—n',a))、(AF182827;辣薄荷)、(MPI249453;辣薄荷)、(PZE431697、基因座CAD24425;Pa廠flcoccwszea乂aw^z/m/"dew勻、(AY866498;-卩度古月黃連(i^,crar/n'加Awrao(3))、(AY351862;葡萄(Wm/era))和(AF203881,基因座AAF12843;運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Z少momowwmo6///^))。GPP然后被轉(zhuǎn)化為多種Cm化合物。do化合物的說(shuō)明性例子包括但不限于蒈烯蒈烯，其結(jié)構(gòu)為在許多樹(shù)(特別是松樹(shù))的樹(shù)脂中發(fā)現(xiàn)。蒈烯通過(guò)蒈烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AF461460,REGION43..1926;歐洲云杉(PZcea))和(AF527416,REGION:78..1871;Sa/WflWewop/i_y//a)。香葉醇香葉醇(也被稱(chēng)為rhodnol),其結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>是玫瑰油和掌玫油的主要成分。它也存在于天竺葵、檸檬和香茅中。香葉醇通過(guò)香葉醇合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AJ457070;C/朋a歸聽(tīng)m麵/p/Z謂)、(AY362553;羅勒(Oc,7mm^m///cmw))、(DQ234300;白蘇(尸eW〃a/h^e"'e似)1864抹)、(DQ234299;尸eW〃a1861才朱)、(DQ234298;尸er,〃"">Zodora4935抹)和(DQ088667;尸eh〃a芳樟醇芳樟醇，其結(jié)構(gòu)為在許多花和香料植物如胡荽子中發(fā)現(xiàn)。芳樟醇通過(guò)芳樟醇合成酶由GPP生成。合適的核普酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AF497485;擬南芥)、(AC002294，基因座AAB71482;擬南芥)、(AY059757;擬南芥)、(NM_104793;擬南芥)、(AF154124;黃花蒿(」故脂:"'"a朋冊(cè)))、(AF067603;CYm"A:/a6re，"')、(AF067602;C/fl/^/"c"'w7")、(AF067601;C7a油'a^wvve〃〕、(U58314;C7arh'a^ewen〕、(AY840091;番茄)、(DQ263741;薰衣草(""gwW,/o//a))、(AY083653;檸檬留蘭香(Afe"Aac"ra,e))、(AY693647;羅勒)、(XM—463918;水稻(C^zasa"va))、(AP0(M078,基因座BADOMO5;水稻)、(XM—463918、基因座XP—463918;水稻)、(AY917193;Pe函、(AF271259;白蘇)、(AY473623;歐洲云杉)、(DQ195274;西特喀云杉(尸,'ceaw7'c/ze腦^))和(AF444798;回回蘇(尸wz.〃",wtoceravar.crispa)栽培變種79號(hào))。芋烯')';烯，其結(jié)構(gòu)為23在柑桔類(lèi)水果和薄荷的外皮中發(fā)現(xiàn)。苧烯通過(guò)苧烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(+)-苧烯合成酶(AF514287,REGION:47..1867;檸檬(C/環(huán)//歸"))和(AY055214，REGION:48..1889;藿香(^g"Wac/zen/gwa))和(-)-苧烯合成酶(DQ195275，REGION:1..1905;西特喀云杉)、(AF006193,REGION:73..1986;北美冷杉)和(MHC4SLSP，REGION:29..1828;留蘭香(MeW'/za—ca似))。月桂烯月桂烯，其結(jié)構(gòu)為在多種植物(包括月桂樹(shù)、馬鞭草和由其得名的月桂)的精油中發(fā)現(xiàn)。月桂烯通過(guò)月桂烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(U87908;北美冷杉)、(AY195609;金魚(yú)草)、(AY195608;金魚(yú)草)、(NM一127982;擬南芥TPSIO)、(NM一113485;擬南芥ATTPS-CIN)、(NM—113483;擬南芥ATTPS-CIN)、(AF271259;白蘇)、(AY473626;歐洲云杉)、(AF369919;歐洲云杉)和(AJ304839;羅勒烯a-和P-羅勒烯，其結(jié)構(gòu)分別為在多種植物和水果(包括羅勒)中發(fā)現(xiàn)，并且是通過(guò)羅勒烯合成酶由GPP生成的。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于:(AY195607;金魚(yú)草)、(AY195609;金魚(yú)草)、(AY195608;金魚(yú)草)、(AK221024;擬南芥)、(NM一U3485;擬南芥ATTPS-CIN)、(NM一113483;擬南芥ATTPS-CIN)、(NM—117775;擬南芥ATTPS03)、(NM—001036574;擬南芥ATTPS03)、(NM—127982;擬南芥TPS10)、(ABU0642;C,./簡(jiǎn)騰/z/wCitMTSL4)和(AY575970;百脈才艮(丄o似scorm'cM/a/7^")y.o/om'cM5"變種)。24在松樹(shù)和桉樹(shù)中發(fā)現(xiàn)。a-蒗烯通過(guò)a-蒎烯合成酶由GPP生成。合適的核香酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(+)a-蒎烯合成酶(AF543530，REGION:1..1887;火炬*>(乃'm"to^/a))、(-)a-蒎烯合成酶(AF543527,REGION:32..1921;火炬松)和(+)/(-)a-蒎烯合成酶(AGU87909,REGION:6111892;北美冷杉)。P-蒗烯P-蒗烯，其結(jié)構(gòu)為在松樹(shù)、迷迭香、歐芽、蒔蘿、羅勒和玫瑰中發(fā)現(xiàn)。(3-蒎烯通過(guò)P-蒗烯合成酶由GPP生成。合適的核普酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(_)(3-落烯合成酶(AF276072,REGION:1..1749;黃花蒿)和(AF514288,REGION:26..1834;檸檬)。檢辟檜辟，其結(jié)構(gòu)為在黑胡椒、胡蘿卜子、鼠尾草和茶樹(shù)中發(fā)現(xiàn)。檜萜通過(guò)檜萜合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于來(lái)自藥用鼠尾草(5Vz/Wao，腦fo)的AF051901，REGION:26..1798。是柑桔類(lèi)水果的精油的一種成分。在生物化學(xué)上，Y-萜品烯通過(guò)Y-辟品烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括(來(lái)自檸檬的AF514286,REGION:30..1832)和(來(lái)自C"ra5w"5/n'w的AB110640,REGION1..1803)。薛品油歸薛品油烯，其結(jié)構(gòu)為在黑醋栗、柏樹(shù)、番石榴、荔枝、番木瓜、松樹(shù)和茶中發(fā)現(xiàn)。萜品油烯通過(guò)辟品油烯合成酶由GPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于來(lái)自花旗片公(mewz/as1//)的AY906866,REGION:10..1887。C^化合物本發(fā)明的C15化合物通常來(lái)源于通過(guò)兩分子IPP與一分子DMAPP縮合生成的法尼基焦磷酸(FPP)。已知催化該步驟的一種酶是，例如，法尼基焦磷酸合成酶。這些ds化合物也被稱(chēng)為倍半萜，因?yàn)樗鼈儊?lái)源于三個(gè)異戊二烯單元。圖2示意地顯示了IPP和DMAPP如何組合生成FPP,其可以進(jìn)一步加工成倍半辟。法尼基焦磷酸合成酶的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于:(ATU80605;擬南芥)、(ATHFPS2R;擬南芥)、(AAU36376;黃花蒿)、(AF461050;黃牛(/mm^))、(D00694;大腸桿菌K-12)、(AE009951,基因座AAL95523;具核梭桿菌具核亞種(F^o^cten'wm26"wc/^"冊(cè)皿c/e^wm)ATCC25586)、(GFFPPSGEN;藤倉(cāng)赤霉(GA&"〃a/"乂汰wroZ))、(CP000009,基因座AAW60034;氧化葡糖桿菌(G/wco/^6a"wox少(ia朋)621H)、(AF019892;向日葵(i^/^m^ms))、(HUMFAPS;人(//omo5"甲'ews))、(KLPFPSQCR;乳酸克魯維酵母)、(LAU15777;白羽扇豆(Zw;/"^a腸))、(LAU20771;白松(丄—脂a腸))、(AF309508;小鼠(AT^mw"w/M))、(NCFPPSGEN;粗糙脈孢菌)、(PAFPS1;銀膠菊(~"謂.應(yīng)a廠爐她m))、(PAFPS2;銀膠菊)、(RATFAPS;大鼠(7a故"即n^gz'c^))、(YSCFPP;釀酒酵母)、(D89104;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe))、(CP000003,基因座AAT87386;酉良膿鏈球菌(^re;^ococct^;yogew^))、(CP000017,基因座AAZ51849;釀膿鏈球菌)、(NC—008022,基因座YP—598856;釀膿鏈J求菌MGAS10270)、(NC一008023，基因座YP—600845;酉良膿鏈球菌MGAS2096)、(NC一008024，基因座YP一602832;釀膿鏈球菌MGAS10750)和(MZEFPS;玉米(Zea))?？商娲兀現(xiàn)PP也可以通過(guò)將IPP添加至GPP生成。編碼能夠進(jìn)行該反應(yīng)的酶的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于(AE000657,基因座AAC06913;y^w/exaeo"ct^VF5)、(NM—202836;擬南芥)、(D84432，基因座BAA12575;枯草桿菌(5腦7/附w磁s))、(U12678基因座AAC28894;大豆十曼生才艮瘤菌(5ra^yr/^加&wmy"/om'cwm)USDA110)、(BACFDPS;Ge(9Zacz7/i"We"廠oAerwo//n7w^)、(NC—002940,基因座NP—873754;杜氏嗜血菌(Haem印/n7wdwcrej^)35000HP)、(L42023，基因座AAC23087;流感嗜血菌(//^mop/H7"s)RdKW20)、(J05262;人)、(YP—395294;丄acto/"c/〃^.vdW23K)、(NC—005823,基因座YP_000273;腎臟鉤端螺旋體血清型(丄一o—raz'"/^mga似serorar)Co戸"/agem.5/r:T^ocrwzLl-130)、(AB003187;藤黃樣￡3求菌(Tl^'crococcw5/w"^))、(NC—002946,基因座YP—208768;淋病奈瑟氏球菌(A^ier/aFA1090)、(U00090,基因座AAB91752;根瘤菌屬的種(腸.油'簡(jiǎn)；)NGR234)、(J05091;釀酒酵母)、(CP000031,基因座AAV93568;^Hte廠po匿—DSS-3)、(AE008481,基因座AAK99890;月市炎鏈球菌(5Vr一ococcws戸e讓om'ae)R6)和(NC—004556,基因座NP779706;苛養(yǎng)木桿菌(A^/e〃G/a幼Wa^)FPP然后被轉(zhuǎn)化為多種ds化合物。ds化合物的說(shuō)明性例子包括但不限于紫穗槐二烯紫穗槐二烯，其結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>是^r^脂;y^a"脂產(chǎn)生的青蒿素的前體。紫穗槐二烯通過(guò)紫穗槐二烯合成酶由FPP生成。合適的核苷酸序列的一個(gè)說(shuō)明性例子是美國(guó)專(zhuān)利7,192,751的SEQIDNO.37。a-法尼烯a-法尼烯，其結(jié)構(gòu)為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>在包括但不限于螞蟻杜氏腺的多種生物來(lái)源和蘋(píng)果和梨皮的外層中發(fā)現(xiàn)。a-法尼烯通過(guò)a-法尼烯合成酶由FPP生成。合適的核苷酸序列的說(shuō)明性例子包括但不限于來(lái)自西洋梨(尸,wscowmwm'5)t/W"乂ow栽培變種的DQ309034(梨；基因名稱(chēng)AFS1)和來(lái)自Ma/t"dome^ca的AY182241(蘋(píng)果；基因AFS1)。Pechouus等人，尸/""^219(1):84-94(2004)。(GenBank登錄號(hào)AF051901REGION:26..1798)作為模板。編碼P-蒗烯、檜烯和(3-水芽烯合成酶的核苷酸序列的側(cè)翼為前導(dǎo)A777"/限制酶切位點(diǎn)和末端J^a/限制酶切位點(diǎn)，編碼芳樟醇和蒈烯合成酶的核苷酸序列的側(cè)翼為前導(dǎo)Wco/限制酶切位點(diǎn)和末端Zma/限制酶切位點(diǎn)，編碼芋烯合成酶的核苷酸序列的側(cè)翼為前導(dǎo)Wco/限制酶切位點(diǎn)和末端尸W/限制酶切位點(diǎn)。DNA合成構(gòu)建體用JTm"/和Zk/(用于f3-蒎烯、檜烯和(3-水芽烯合成酶構(gòu)建體)、#co/和Xm"/限制酶(用于芳樟醇和蒈烯合成酶構(gòu)建體)或A7)a/和尸W/限制酶(用于竽烯合成酶構(gòu)建體)消化完全。反應(yīng)混合物通過(guò)凝膠電泳分離，凝膠提取大約1.7-1.9kbDNA片段，將分離的I)NA片段連接到pTrc99A載體的義w"/限制酶切位點(diǎn)(用于p-蒗烯、檜烯和p-水芽烯合成酶插入片段)、iVco/Xwa/限制酶切位點(diǎn)(用于芳樟醇和蒈烯合成酶插入片段)或1/^/尸^/限制酶切位點(diǎn)(用于宇烯合成酶插入片段)內(nèi)，產(chǎn)生表達(dá)質(zhì)粒pTrc99A-LLS、pTrc99A-LMS、pTrc99A-BPS、pTrc99A-PHS、pTrc99A-CS和pTrc99A畫(huà)SS(質(zhì)粒圖見(jiàn)圖6)。實(shí)施例6該實(shí)施例描述了在本發(fā)明中有用的大腸桿菌宿主菌株的產(chǎn)生。如表1所述，通過(guò)用一種或多種實(shí)施例1至5的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌親本細(xì)胞產(chǎn)生宿主菌抹。表1.大腸桿菌宿主菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>在含有如表1詳述的抗生素的LuriaBertoni(LB)瓊脂上篩選宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。將單菌落從LB瓊脂轉(zhuǎn)移到含有5mLLB液體培養(yǎng)基和抗生素的培養(yǎng)管中。B003、B617、B618、B619、B650、B651、B652和B653宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體在30。C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育30小時(shí)。所有其它宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體在37°C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，直到生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期。通過(guò)用含有0.8%葡萄糖和抗生素的M9-MOPS培養(yǎng)基(M9-MOPS培養(yǎng)基的組成見(jiàn)表2)將細(xì)胞連續(xù)傳代4-5輪，使細(xì)胞適應(yīng)基本培養(yǎng)基。將細(xì)胞以由400uL無(wú)菌50%甘油和600uL液體培養(yǎng)物組成的1mL儲(chǔ)備液等份在冷凍管中貯存在-80。C下。表2-M9-MOPS培養(yǎng)基的組成成分量(每L)Na2HP047H2012.8gKH2P043gNaCl0.5gNH4C1lgMgS042mmolCaC120.1mmol硫胺0.1ugMOPS緩沖液pH7.4100mmol(NH3)6Mo70244H20"ugH3B0425ugCoC127,1ugCuS042.4ugMnC1216ugZnS042.9ugFeS040.28mg實(shí)施例7該實(shí)施例證實(shí)了在不含抗生素的條件下表達(dá)質(zhì)粒在攜帶包含RK2質(zhì)粒復(fù)制、隔離和保持系統(tǒng)的表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌宿主菌林中的穩(wěn)定性。通過(guò)將菌抹的儲(chǔ)備液等份添加到含有40mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜，建立宿主菌抹B255的種子培養(yǎng)物。在初始OD,為大約0.05時(shí)，用種子培養(yǎng)物接種兩個(gè)各自含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、2%葡萄糖和0.5%酵母提取物的250mL搖瓶。1號(hào)培養(yǎng)物還含有100ug/mL羧芐青霉素和34ug/mL氯霉素。2號(hào)培養(yǎng)物不接受任何抗生素。兩種培養(yǎng)物都在37°C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，直到它們達(dá)到大約0.2的OD6。。，此時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)紫穗槐-4,ll-二烯的產(chǎn)生。誘導(dǎo)時(shí)，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋層，以捕獲紫穗槐-4,ll-二烯。在總共72小時(shí)的時(shí)間內(nèi)定時(shí)采樣。2個(gè)培養(yǎng)物中宿主菌抹產(chǎn)生紫穂槐-4,11-二烯如實(shí)施例10所述通過(guò)GC/MS證實(shí)。為了評(píng)價(jià)質(zhì)粒在兩種細(xì)胞培養(yǎng)物中的穩(wěn)定性，在72小時(shí)時(shí)取每種培養(yǎng)物的樣品，在LB瓊脂平板(不含抗生素)上劃線。在37。C下過(guò)夜溫育后，將來(lái)自每個(gè)培養(yǎng)物的50個(gè)菌落復(fù)制接種到LB瓊脂+抗生素(34ug/mL氯霉素、100ug/mL羧千青霉素)平板上和LB瓊脂減抗生素(不含抗生素)平板上。在37。C下再過(guò)夜溫育后，LB瓊脂+抗生素和LB瓊脂減抗生素平板均發(fā)現(xiàn)含有大約50個(gè)菌落，表明在培養(yǎng)基中存在和不存在抗生素的情況下，質(zhì)粒保留均接近100%。實(shí)施例8該實(shí)施例證實(shí)了在大腸桿菌宿主菌4朱中糞腸J求菌HMGR比釀酒酵母tHMGR提高的比活性和穩(wěn)定性。宿主菌抹B61和B62的種子培養(yǎng)物如下建立將每個(gè)菌株的儲(chǔ)備液等份加入到含有20mLM9-MOPS培養(yǎng)基、0.8%葡萄糖和如表5所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)至飽和。種子培養(yǎng)物以1:100稀釋到500mL燒瓶中的140mL新鮮培養(yǎng)基中，再生長(zhǎng)到0055。大約為0.1,此時(shí)向每個(gè)培養(yǎng)物中加入140uL1MIPTG誘導(dǎo)紫穗槐-4,ll-二烯的產(chǎn)生。在誘導(dǎo)后4、12、20、28、36和49小時(shí)，從每個(gè)培養(yǎng)物中采樣，離心沉淀細(xì)胞。細(xì)胞沉淀物在干冰上驟凍，然后貝'±存在—80。C。為了進(jìn)行酶測(cè)定，在冰上融化細(xì)胞沉淀物，然后用含有蛋白酶抑70制齊'h'昆合物弁3(Calbiochem，SanDiego，CA)、benzonase(20fiLoer5mLbugbuster;Novagen,Madison,WI)和溶菌酶(30ug/mL)的Bugbuster(Novagen,Madison,WI)裂解。釀酒酵母tHMGR的酶活性在50mMTrisHCl(pH7.5)、0.2mMNADPH(Sigma,St,Louis,MO)和0.3mMDL-3-羥基-3-曱基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)鈉鹽(Sigma，St.Louis,MO)中測(cè)定。通過(guò)加入細(xì)胞裂解液開(kāi)始測(cè)定，才艮據(jù)340nM處的吸光度監(jiān)測(cè)NADPH的消失。為了說(shuō)明NADPH的非特異性消失，從試驗(yàn)樣品中獲得的結(jié)果中減去缺乏HMG-CoA的對(duì)照試驗(yàn)中獲得的結(jié)果。類(lèi)似地測(cè)定糞腸^t菌HMGR的酶活性，不同之處在于測(cè)定M^沖液含有100mM磷酸鉀緩沖液(pH6.5)、0.4mMNADPH、1.0mMEDTA和100mMKCl。蛋白質(zhì)測(cè)定利用Bradford((1976)J腦/歷oc/^m.72:248-254)的方法進(jìn)行。比活性計(jì)算為AnmolNADPH/min/mg蛋白質(zhì)。如圖8所示，與釀酒酵母tHMGR相比，糞腸5求菌HMGR顯示較高的比活性和提高的穩(wěn)定性。實(shí)施例9該實(shí)施例描述了用細(xì)胞干重("DCW")對(duì)OD,的校正。為了獲得DCW和OD600之間的關(guān)系，代表性菌4朱B32在類(lèi)似于實(shí)施例10-14中所述的高細(xì)胞密度過(guò)程中生長(zhǎng)。在整個(gè)運(yùn)行期間采樣，測(cè)定每個(gè)樣品的OD6oo和DCW。為了確定DCW,將細(xì)胞沉淀并棄去上清液。細(xì)胞沉淀物用水洗一次，然后在80。C烤箱中干燥至少3天。將含有細(xì)胞沉淀物的試管稱(chēng)重，從稱(chēng)得的重量中減去試管的重量，剩余的重量除以每個(gè)樣品的初始體積(0.0015L),得到DCW。圖9顯示在這些實(shí)驗(yàn)中測(cè)量的DCW和OD60()之間的關(guān)系。實(shí)施例10該實(shí)施例證實(shí)了紫穗槐-4,11-二烯在表達(dá)金黃色葡萄球菌HMGR和HMGS的大腸桿菌宿主菌4朱中比在表達(dá)釀酒酵母tHMGR和HMGS的宿主菌抹中的產(chǎn)量增加。通過(guò)將每個(gè)菌4朱的儲(chǔ)備液等卩分加入到含有25mLM9-MOPS培養(yǎng)基、0.8%葡萄糖和如表1所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜，由此建立宿主菌抹B32、B153、B210、B282、B292、B86、B255和B256的種子培養(yǎng)物。在初始OD,大約為0.05時(shí)用種子培養(yǎng)物接種單獨(dú)的含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、2%葡萄糖和抗生素的250mL搖瓶。培養(yǎng)物在30°C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，直到它們達(dá)到大約0.2的OD6(K),此時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)紫穗槐-4,ll-二烯的產(chǎn)生。在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋層(例如，十二烷、油酸曱酯或肉豆蔻酸異丙酯)。有機(jī)覆蓋層和培養(yǎng)液的樣品每天采樣一次，共72小時(shí)。利用培養(yǎng)液樣品測(cè)量OD6QQ。通過(guò)將5uL有機(jī)覆蓋層轉(zhuǎn)移到含有500uL摻有作為內(nèi)標(biāo)的P-或反式丁香烯的乙酸乙酯的干凈玻璃瓶中，測(cè)定紫穗槐-4,11-二烯的濃度。有機(jī)覆蓋物/乙酸乙酯樣品在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質(zhì)譜儀(GC/MS)上分析，只掃描兩種離子分子離子(204m/z)和189m/z離子，^口Martin等人.(2001)B^^c/mo/,5Zoe"g.75:497-503,斤述。為了加快運(yùn)行時(shí)間，改變溫度程序和柱基質(zhì)以達(dá)到最佳峰值分辨率和最短的總運(yùn)行時(shí)間。利用DB-XLB柱(獲自AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto，CA)和氦載氣在GC上分離1|dL樣品。用于分析的溫度程序如下100°C0.75分鐘，以60。C/分鐘升高溫度至300。C，于300°C保持0.5分鐘。解析的樣品用監(jiān)測(cè)離子189和204m/z的Hewlett-Packard5973型質(zhì)量選擇檢測(cè)器分析。以前的質(zhì)譜證實(shí)紫穗槐-4,11-二烯合成酶的產(chǎn)物是紫穗槐-4,11-二烯，使用該GC方案，紫穗槐-4,11-二烯的保留時(shí)間為3.7分鐘。使用P-或反式丁香烯作為定量的內(nèi)標(biāo)?；诩兓淖纤牖?4,ll-二烯(0.63-10mg/LKJF17-109-3)在加有丁香烯的乙酸乙酯中的定量校準(zhǔn)曲線，利用內(nèi)標(biāo)與紫穗;隗-4,11-二烯峰面積的比例，計(jì)算紫穂槐-4,11-二烯的滴度。如圖10A和10B所示，與表達(dá)釀酒酵母tHMGR和HMGS的B32、B210、B255、B256和B292抹相比，表達(dá)金黃色葡萄球菌HMGR和HMGS的B153和B282菌林產(chǎn)生水平升高的紫穗槐-4,11-二實(shí)施例11該實(shí)施例證實(shí)了在亞最佳溫度下生長(zhǎng)的大腸桿菌宿主菌抹產(chǎn)生紫穗槐-4，ll-二烯增多。將菌抹的0.5mL儲(chǔ)備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物在37。C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上生長(zhǎng)過(guò)夜。由此建立宿主菌4朱B32的種子培養(yǎng)在初始OD6。。大約為0.05時(shí)用種子培養(yǎng)物4妻種4個(gè)250mL搖瓶，每個(gè)均含有40mL發(fā)酵分批培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成見(jiàn)表6)、100mMMOPS緩沖液pH7.1和抗生素。培養(yǎng)物在30。C或37。C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，直到它們達(dá)到0.18-0.22的OD6Qo,此時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)生。在誘導(dǎo)時(shí)，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋物，以捕獲紫穗槐-4,11-二烯。每天采樣一次，如實(shí)施例10所述分析。如圖IIA和IIB所示，30°C的發(fā)酵不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，但是導(dǎo)致大腸桿菌宿主菌林產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯的比產(chǎn)率增長(zhǎng)接近50%。實(shí)施例12該實(shí)施例證實(shí)了在限制碳源條件下生長(zhǎng)的大腸桿菌宿主菌抹產(chǎn)生紫穗槐—4，11-二烯增多。用于發(fā)酵運(yùn)行050608-1和050629-1的宿主菌4朱B32的種子培養(yǎng)物如下建立將0.25uL菌抹儲(chǔ)備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且將培養(yǎng)物在37。C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，直到00600達(dá)到1-2。用于發(fā)酵運(yùn)行060403-3的宿主菌^朱B32的種子培養(yǎng)物如下建立將菌抹的儲(chǔ)備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且將培養(yǎng)物在37。C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育過(guò)夜。在初始OD6。。約為1時(shí)用種子培養(yǎng)物接種含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和抗生素的250mL搖瓶，培養(yǎng)物再次73在37。C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，直到OD6。o達(dá)到3-5。對(duì)于所有發(fā)酵過(guò)程，KH2P04,K2HP043H20、EDTA、檸4蒙酸和(NEU)2S04都在生物反應(yīng)器(2LApplikonBioconsoleADI1025s,具有ADI1010控制器，ApplikonBiotechnology,FosterCity,CA)中力口熱滅菌。將其余的培養(yǎng)基成分過(guò)濾除菌作為儲(chǔ)備溶液，并且通過(guò)磁頭板注射。表3顯示了用于發(fā)酵運(yùn)行050608-1和050629-1的最終的培養(yǎng)基組成。表4顯示了用于發(fā)酵運(yùn)行060403-3的最終的培養(yǎng)基組成。運(yùn)行050608-1的開(kāi)始體積為0.8L,050629-1的開(kāi)始體積為1.2L，060403-3的開(kāi)始體積為1L。所有運(yùn)行都通過(guò)經(jīng)》茲頭板注射50mL種子培養(yǎng)物進(jìn)行接種。表3-用于發(fā)酵運(yùn)行050608-1和050629-1的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>表4-用于發(fā)酵運(yùn)行060403-3的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分分批培養(yǎng)基(每L)料液(每L)葡萄糖15g副gKH2P04—K2HP043H2015.7g一檸檬酸1.7g一(NH4)2S042g一MgS047H201.2g12gEDTA8.4mg13mgCoCl26H202.5mg4mgMnCl24H2015mg23.5mgCuCl22H201.5mg2.5mgH3B043mg5mgNa2Mo042H202.5mg4mgZn(CH3COO)22H2013mg16mg水合檸檬酸Fe(III)100mg40mg硫胺HC14.5mg-羧芐青霉素100ug100ug四環(huán)素5ug5ug氯霉素34ug34ug對(duì)于發(fā)酵運(yùn)行050608-1(過(guò)量的碳)，在誘導(dǎo)時(shí)開(kāi)始進(jìn)料，手動(dòng)調(diào)節(jié)進(jìn)料速度，以提供圖12C所示濃度的葡萄糖。對(duì)于發(fā)酵運(yùn)行050629-1(碳限制)，根據(jù)表5所示的方案將物料運(yùn)送到發(fā)酵罐中。對(duì)于發(fā)酵運(yùn)行060403-3(最少的碳)，當(dāng)初始葡萄糖丸(15g)耗盡并且溶解氧達(dá)到峰值時(shí)，自動(dòng)開(kāi)始進(jìn)料?？蛇_(dá)27.6g/hr的最大值，根據(jù)以下方程計(jì)算進(jìn)料速度其中/。是初始葡萄糖被消耗的時(shí)間。在達(dá)到最大速率時(shí)，葡萄糖進(jìn)料限制為9.5g/hr的速率，并且在剩余的運(yùn)行中保持恒定在該速率。表5-發(fā)酵運(yùn)行050629-1的進(jìn)料方案運(yùn)行時(shí)間(小時(shí))葡萄糖進(jìn)料速度(g/hr)0070.37100.74121.11141.48162.22182.96203.69224.80245.91317.39335.54473.69運(yùn)行050608-1和050629-1在37°C下進(jìn)行。生物反應(yīng)器中的氣流設(shè)置為1-2L/min;使用氫氧化銨和/或氫氧化鈉將pH保持在7;開(kāi)始的4覺(jué)拌為500-600rpm;用止泡劑B(Sigma-Aldich,St.Louis，MO)控制泡沫；利用攪拌級(jí)聯(lián)使溶解氧水平保持高于30%。培養(yǎng)5-6小時(shí)后，通過(guò)向運(yùn)行050608-1加入0.8mL1MIPTG,以及向050629-1運(yùn)行加76入1.2mLIPTG，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生紫穗槐-4,ll-二烯。誘導(dǎo)時(shí)，培養(yǎng)溫度降至30。C。運(yùn)行060403-3在30°C下進(jìn)行。生物反應(yīng)器中的氣流設(shè)置為1-2L/min;使用氫氧化銨將pH保持在7。利用攪拌級(jí)聯(lián)和氧富集使溶解氧水平保持高于30%。在OD,接近28時(shí)(接種19小時(shí)后)，通過(guò)加入1mL1MIPTG誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生紫穗槐-4,ll-二烯。按照兩個(gè)不同的方案捕獲和提取紫穗槐-4，11-二烯。對(duì)于運(yùn)行050608-1和050629-1，使廢氣通過(guò)含有200mL庚醇的氣體洗滌器排出，由此捕獲廢氣中存在的揮發(fā)性的紫穗槐-4,11-二歸。然后將庚醇稀釋到乙酸乙酯中，直到樣品中紫穗槐-4,ll-二烯的濃度介于0.63mg/L和20mg/L之間。對(duì)于運(yùn)行060403-3,在誘導(dǎo)時(shí)向發(fā)酵罐中加入200mL有機(jī)覆蓋物在生物反應(yīng)器中捕獲紫穗槐-4，11-二烯。產(chǎn)物濃度如下測(cè)定合并25uL培養(yǎng)液加有才幾覆蓋物和975uL乙腈，在FisherVortexGenie2TM'/'昆合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振搖樣品至少3分鐘，通過(guò)離心從樣品中除去細(xì)胞，用乙酸乙酯稀釋乙腈溶液，直到樣品中紫穗槐-4，11-二烯的濃度介于0.63和20mg/L之間。如實(shí)施例10所述通過(guò)GC/MS分析乙酸乙酯樣口C。如圖12A和12B所示，發(fā)酵運(yùn)行050608-1(過(guò)量的碳)分別導(dǎo)致低最大細(xì)胞密度和低紫穗槐-4，ll-二烯產(chǎn)量，這至少部分與乙酸水平的相對(duì)快速增長(zhǎng)有關(guān)(圖12D)。相比而言，發(fā)酵運(yùn)行050629-1(碳限制)導(dǎo)致紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量提高(圖12B)和乙酸產(chǎn)生的出現(xiàn)延遲。這些結(jié)果符合過(guò)量葡萄糖進(jìn)料導(dǎo)致快速乙酸產(chǎn)生和早期細(xì)胞死亡的假說(shuō)。發(fā)酵運(yùn)行060403-3(最低碳)達(dá)到的進(jìn)一步的葡萄糖限制導(dǎo)致超過(guò)100小時(shí)的低乙酸產(chǎn)生(圖12D),和顯著較高的最大細(xì)胞密度和紫穗槐-4,ll-二烯產(chǎn)量(圖12A和12B)。實(shí)施例13該實(shí)施例證實(shí)了在限制碳源條件下和亞最佳溫度下生長(zhǎng)的大腸桿菌宿主菌林產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯增多。宿主菌抹B153的種子培養(yǎng)物如下建立將菌林儲(chǔ)備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且將培養(yǎng)物在37。C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，直到OD,達(dá)到3.5-4.5。建立2升的生物反應(yīng)器(BiocontrollerADI1010，具有BioconsoleADI1025,ApplikonBiotechnology,FosterCity，CA),對(duì)于運(yùn)行060403-3，除了菌4朱和誘導(dǎo)時(shí)間不同以外，以與實(shí)施例12所述相同的方式運(yùn)4亍。通過(guò)向培養(yǎng)基中加入1mL1MIPTG誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中紫穗斗鬼-4,11-二烯的產(chǎn)生。在圖13A所示的發(fā)酵運(yùn)行中，在OD6加接近2時(shí)誘導(dǎo)紫穗槐_4,11_二烯合成，而發(fā)酵罐仍然含有過(guò)量的葡萄糖。在圖13B所示的發(fā)酵運(yùn)行中，在OD6。q接近33時(shí)誘導(dǎo)紫穗槐-4,ll-二烯合成，這在開(kāi)始葡萄糖限制進(jìn)料之后。按照兩個(gè)不同的方案捕獲和提取紫穗槐-4,11-二烯。對(duì)于圖13A所示的發(fā)酵運(yùn)行，使廢氣通過(guò)含有200mL庚醇的氣體洗滌器排出，由此捕獲廢氣中存在的揮發(fā)性的紫穗槐-4,ll-二烯。然后用乙酸乙酯稀釋庚醇，直到樣品中紫穗槐-4,ll-二烯的濃度介于0.63mg/L和20mg/L之間。對(duì)于圖13B所示的發(fā)酵運(yùn)行，通過(guò)在誘導(dǎo)時(shí)向發(fā)酵罐中加入200mL有機(jī)覆蓋物捕獲紫穗槐-4,ll-二烯。從培養(yǎng)基中提取紫穗槐-4,ll-二烯，包括合并25uL培養(yǎng)液和975uL乙月青,在FisherVortexGenie2TM)'昆合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振搖樣品至少3分鐘，通過(guò)離心從樣品中除去細(xì)胞，用乙酸乙酯稀釋乙腈溶液，直到樣品中紫穗槐-4,11-二烯的濃度介于0.63和20mg/L之間。如實(shí)施例10所述通過(guò)GC/MS分析乙酸乙酯樣品。對(duì)于圖13A所示的發(fā)酵運(yùn)行，紫穗槐-4,11-二烯的總量是通過(guò)將廢氣中存在的量加上培養(yǎng)基中存在的量并用總和除以發(fā)酵罐體積而獲得的。圖13A中所示的發(fā)酵達(dá)到93的最大OD60()和3.2g/L的最大紫穗槐-4,ll-二烯濃度。相反，圖13B中所示的發(fā)酵達(dá)到245的最大OD600和15g/L的最大紫穂槐-4,11-二烯濃度。對(duì)于在兩個(gè)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的培養(yǎng)生長(zhǎng)和紫穂槐-4,11-二烯產(chǎn)生水平的差異，一種可能的解釋是在圖13A所示的發(fā)酵運(yùn)行中，在消耗過(guò)量的葡萄糖之前誘導(dǎo)紫穗槐-4,ll-二烯產(chǎn)生，并且由于甲羥戊酸途徑中間物的毒性水平能夠積累，未限制的葡萄糖可獲得性導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。在圖13B所示的發(fā)酵運(yùn)行中，葡萄糖輸送后發(fā)生的誘導(dǎo)受到限制，這阻止了途徑中間物的積累，導(dǎo)致更高的細(xì)胞密度和紫穗槐-4，11-二烯產(chǎn)生水平。實(shí)施例14該實(shí)施例證實(shí)了在限制碳源和氮源條件下和亞最佳溫度下生長(zhǎng)的大腸桿菌宿主菌抹產(chǎn)生紫穗槐-4，11-二烯增多。宿主菌抹B86的種子培養(yǎng)物如下建立將菌抹儲(chǔ)備液等份加入到含有50mLM9-MOPS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的250mL搖瓶中，并且將培養(yǎng)物在37°C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，次日早晨在OD6oo接近1時(shí)亞培養(yǎng)到相同的培養(yǎng)基中，并在37。C和250rpm下再次生長(zhǎng)，直到OD6。。為3-5.建立4個(gè)2L生物反應(yīng)器(BiocontrollerADI1010,具有BioconsoleADI1025,ApplikonBiotechnology,FosterCity,CA)，對(duì)于運(yùn)行060403-3，除了限制氮的運(yùn)行在物料中不含硫酸銨以外，以與實(shí)施例12所述相同的方式運(yùn)行。當(dāng)開(kāi)始時(shí)的葡萄糖丸(15g)耗盡并且溶解氧達(dá)到峰值時(shí)，自動(dòng)啟動(dòng)具有6小時(shí)加倍時(shí)間的指數(shù)葡萄糖進(jìn)料。最高達(dá)30.4g/hr的最大值，根據(jù)以下方程計(jì)算進(jìn)料速度=0.12min—1其中p是比生長(zhǎng)速率，A)是最初的葡萄糖丸被消耗的時(shí)間。在達(dá)到最大速率時(shí)，葡萄糖進(jìn)料降為11.4g/hr的速率，并且在剩余的運(yùn)行中保持恒定在該速率。在發(fā)酵運(yùn)行060710-4、060724-5和060619-5(石友限制和氮限制)中，當(dāng)氨限制導(dǎo)致培養(yǎng)基中葡萄糖積累時(shí)，進(jìn)一步減少葡萄糖進(jìn)料。發(fā)酵在降低的溫度30°C下進(jìn)行。生物反應(yīng)器中的氣流設(shè)置為1vvm;開(kāi)始的4覺(jué)4半為700rpm;用止泡劑B(Sigma-Aldich,St.Louis，MO)控制泡沫；利用攪拌級(jí)聯(lián)(700-1,200rpm)和富氧使溶解氧水平保持在40%。在發(fā)酵運(yùn)行060327-3(碳限制)中，用20%NH4OH使pH保持在7;在發(fā)酵運(yùn)行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)中，開(kāi)始時(shí)使用20%NH4OH,從72小時(shí)開(kāi)始使用2.5NNaOH和10NNH4OH的50/50混合物，使pH保持在7,以進(jìn)一步限制通往發(fā)酵罐的氨的量。在OD6oo接近30時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)基中加入1mL1MIPTG誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯。通過(guò)在培養(yǎng)基上覆蓋10%(v/v)的有機(jī)覆蓋物捕獲紫穗槐-4,11-二烯。然后通過(guò)合并25uL培養(yǎng)液和975uL曱醛，在FisherVortexGenie2TM混合器(ScientificIndustries,Inc.,Bohemia,NY)上以最大速度振搖樣品至少15分鐘，通過(guò)離心從樣品中除去細(xì)胞，并向990uL含有10uL/L反式丁香烯的乙酸乙酯中加入10uL曱醇溶液，提取紫穗槐-4,11-二烯。如實(shí)施例10所述通過(guò)GC/MS分析樣品。圖14A-E顯示來(lái)自發(fā)酵運(yùn)行060327-3(碳限制)的數(shù)據(jù)。發(fā)酵產(chǎn)生16g/L的紫穗槐-4,11-二烯最大濃度(圖14A)。宿主菌抹的最大體積生產(chǎn)率大于200mg/L/h(圖14B)。宿主菌林的最大比生產(chǎn)率〉2mgZL/h/OD600(圖14C)。培養(yǎng)基中氨的濃度在發(fā)酵運(yùn)行開(kāi)始時(shí)大約為30mM，在指數(shù)生長(zhǎng)期加入料液后上升到大約76mM，運(yùn)行的其余時(shí)間保持高于60mM(圖14D)。達(dá)到的最大OD6。Q大約為2卯(圖14D),對(duì)應(yīng)于116gDCW/L。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度在不到20小時(shí)內(nèi)從15g/L下降至低于1g/L,并且保持低水平(圖14E)。乙酸水平在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中都很低(圖14E)。圖15A-E顯示發(fā)酵運(yùn)行060710-4、060724-5和060619-5(碳限制和氮限制)的數(shù)據(jù)。發(fā)酵產(chǎn)生的紫穗槐-4,ll-二烯最大濃度為約20g/L至30g/L(圖15A)。在所有三個(gè)發(fā)酵運(yùn)行中，宿主菌4朱的最大體積生產(chǎn)率大于400mg/L/h(圖15B)，這顯著高于在不限制氮的發(fā)酵中獲得的最大體積生產(chǎn)率(圖14B)。對(duì)于所有運(yùn)行，宿主菌林的最大比生產(chǎn)率>2mg/L/h/OD6(X),并且在整個(gè)運(yùn)行中保持高水平(圖15C)。在發(fā)酵運(yùn)行開(kāi)始時(shí)培養(yǎng)基中氨的濃度為大約35mM至50mM，在指數(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中加入料液后下降，在運(yùn)行的其余時(shí)間保持低于10mM(圖UD)。(氨水平低于發(fā)酵運(yùn)行060327-3(圖MD)是由于在料液中缺少氨，并且在用來(lái)保持pH的石威中氨減少。發(fā)酵運(yùn)行060710-4和060619-5在運(yùn)行結(jié)束時(shí)顯示氨濃度峰值，但是峰值出現(xiàn)在紫穗槐-4,11-二烯大量生產(chǎn)之后)。達(dá)到的最大OD,為170-220(圖15D)，對(duì)應(yīng)于68g-88gDCW/L。培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度在不到20小時(shí)內(nèi)/人15g/L下降至低于1g/L,并且保持低水平(圖15E)。乙酸水平在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中都很低(圖15E)。實(shí)施例15該實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中通過(guò)DXP途徑產(chǎn)生紫穗槐-4，ll-二烯。宿主菌林B003、B617、B618和B619的種子培養(yǎng)物如下建立將每種菌抹的儲(chǔ)備液等份加入到含有25mLM9-M0PS培養(yǎng)基和如表1所詳述的抗生素的單獨(dú)的125mL搖并瓦中，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜。在初始OD6o。4妻近0.05時(shí)用種子培養(yǎng)物4妻種單獨(dú)的250mL搖瓶，每個(gè)搖瓶均含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、45ug/mL硫胺、微量營(yíng)養(yǎng)物、1.00E-5mol/LFeS04、0.1MMOPS、0.5%酵母提取物、20g/LD-葡萄糖和抗生素。培養(yǎng)物在30。C下在250rpm潮濕溫育搖床上溫育，直到OD,達(dá)到0.2-0.3，此時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)紫穂槐-4，11-二烯的產(chǎn)生。在誘導(dǎo)時(shí)，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋物，以捕獲紫穗槐-4,11-二烯。在不同的時(shí)間點(diǎn)采樣，提取紫穗槐-4,ll-二烯，并如實(shí)施例10所述通過(guò)GC/MS分析。每個(gè)宿主菌株用2個(gè)獨(dú)立的克隆進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。發(fā)現(xiàn)樣品之間的偏差小于10%。81如圖16所示，含有編碼完全工程化的DXP途徑酶的核苷酸序列的大腸桿菌宿主菌抹B619產(chǎn)生大約45mg/gDCW的紫穗槐-4,ll-二實(shí)施例16該實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌林中產(chǎn)生3-甲基-丁-3-烯-l-醇和3-甲基-丁-2-烯-1-醇。宿主菌抹B286、B287、B288和B291的種子培養(yǎng)物如下建立用每個(gè)菌林的儲(chǔ)備液等份在含有如表1詳述的抗生素的LB瓊脂上劃線。每個(gè)菌抹挑取三個(gè)獨(dú)立的菌落，每個(gè)菌落接種到7mL含有抗生素的LB培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在37°C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上生長(zhǎng)過(guò)夜，直到對(duì)數(shù)晚期。然后在OD,接近0.05時(shí)將培養(yǎng)物接種到含有40mlM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL搖瓶中。培養(yǎng)物在37°C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上生長(zhǎng)過(guò)夜，直到它們達(dá)到大約0.2的OD,,此時(shí)加入40uL1MIPTG誘導(dǎo)。培養(yǎng)物在30。C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上生長(zhǎng)72小時(shí)。每天1-2次，測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)物的OD6(K),取700uL樣品。為了從培養(yǎng)液中提取3-甲基-丁-3-烯-l—醇和3-曱基-丁-2-烯-l-醇，向300uL每個(gè)取出的樣品中加入600uL乙酸乙酯。然后將樣品渦旋振蕩15分鐘，將400uL上層的乙酸乙酯相轉(zhuǎn)移到干凈玻璃瓶中進(jìn)行分析。樣品在Hewlett-Packard6890氣相色譜/質(zhì)譜儀(GC/MS)上分析。用DB-5柱(AgilentTechnologies,Inc.，PaloAlto，CA)和氦載氣在GC上分離1uL樣品。用于分析的溫度程序如下60。C3分鐘，以60。C/分鐘升高溫度至300°C，于300°C保持2分鐘?？傔\(yùn)行時(shí)間為9分鐘。解析的樣品用Hewlett-Packard5973型質(zhì)量選4和險(xiǎn)測(cè)器分析。以前的質(zhì)譜證實(shí)，使用該GC方案，3-曱基-3-丁烯-l-醇和3-曱基-2-丁歸-1—醇的保留時(shí)間為2.067分鐘。為了集中檢測(cè)3-甲基-丁-3-烯-l-醇和3-曱基-丁-2-烯-l-醇,采用只監(jiān)測(cè)3-曱基-丁-3-烯-1-醇和3-甲基-丁-2—烯-1—醇中的離子56和68的選4,性離子監(jiān)測(cè)方法。82實(shí)施例17該實(shí)施例描述了釀酒酵母宿主菌林產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯。宿主菌抹EPY224的產(chǎn)生在Ro等人.(A^wre440:940-943;2006)和PCT專(zhuān)利公開(kāi)WO2007/005604中描述。宿主菌抹EPY224由表達(dá)質(zhì)粒pRS425ADS通過(guò)在YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而復(fù)原(MethodsinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual,2005ed.,ISBN0-87969-728-8)，將單菌落接種到Y(jié)PD瓊脂上，然后將單菌落轉(zhuǎn)印(patching)到CSM-MetHis瓊脂和CSM-MetLeu瓊脂上。在CSM-MetHis瓊脂上生長(zhǎng)但在CSM-MetLeu瓊脂上不生長(zhǎng)的克隆復(fù)原(即，已經(jīng)失去了質(zhì)粒pRS425ADS)。一個(gè)這樣的克隆纟皮命名為EPY300。用表達(dá)質(zhì)粒pRS425-ADS-LEU2d轉(zhuǎn)化EPY300,這是一種除了含有LEU2d選擇性標(biāo)記而不是LEU2以外與pRS425-ADS完全相同的質(zhì)粒(Erhart和Hollenberg(1983)/.^"en'o/.156:625-635),產(chǎn)生宿主菌4朱Y185。在含有2%葡萄糖和除組氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸以外的所有氨基酸的合成確定成分培養(yǎng)基(CSM-葡萄糖；MPBiomedicals,Solon，OH)上篩選Y185宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。宿主菌林EPY300對(duì)于亮氨酸生物合成來(lái)說(shuō)是營(yíng)養(yǎng)缺陷的(/ew2),但是Y185中的表達(dá)質(zhì)粒pRS425-ADS-LEU2d恢復(fù)了亮氨酸原養(yǎng)型(丄五t/2)。將單菌落轉(zhuǎn)印到選擇性培養(yǎng)基上(CSM-葡萄糖-組氨酸、亮氨酸和曱硫氨酸)，生長(zhǎng)2天。從平板上刮下細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到凍存管中的1mL25%(v/v)甘油中。將懸浮液混合，然后貯存在-80。C。宿主菌抹Y185的種子瓶如下建立將菌株的儲(chǔ)備液等份加入到含有25mLCSM-葡萄糖、缺少亮氨酸和曱硫氨酸的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜。在初始OD6。o接近0.05時(shí)用培養(yǎng)物接種含有40mL缺少亮氨酸的合成確定成分培養(yǎng)基并且含有0.2%葡萄糖、1.8%半乳糖和1mM曱硫氨酸的250mL帶有檔板的搖瓶。培養(yǎng)物在30°C下在200rpm的旋轉(zhuǎn)搖瓶上溫育。由于培養(yǎng)基中存在葡萄糖阻止了半乳糖對(duì)04丄7啟動(dòng)子的誘導(dǎo)，紫穗槐-4,ll-二烯產(chǎn)生不能被誘導(dǎo)，直到細(xì)胞用完了培養(yǎng)基中的葡萄糖并且切換為使用半乳糖作為其主要碳源。在接種時(shí)，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋物，以捕獲紫穗槐-4，11-二烯。在72小時(shí)時(shí)通過(guò)將5uL有機(jī)溶劑層轉(zhuǎn)移到含有500uL乙酸乙酯的干凈玻璃瓶中采樣，其中含有已知濃度的(3-或反式丁香烯作為內(nèi)標(biāo)。如實(shí)施例IO所述，有4幾覆蓋物/乙酸乙酯樣品在Hewlett-Packard6890氣相/質(zhì)語(yǔ)儀(GC/MS)上分析。生長(zhǎng)72小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)3個(gè)酵母培養(yǎng)物產(chǎn)生60.68、54.48和59.25mg/L的紫穗槐-4，1l-二烯。實(shí)施例18該實(shí)施例描述了釀酒酵母宿主菌抹產(chǎn)生紫穗槐-4,11-二烯，其中該宿主菌林包含天然曱羥戊酸途徑以及處于異源調(diào)節(jié)控制之下的異源曱羥戊酸途徑。酵母抹CEN.PK2-1C(Y002)(MATA;ura3-52;trpl-289;leu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SUC2)和CEN.PK2-ID(Y003)(MATalpha;ura3-52;trpl-289;leu2-3,112;his3Al;MAL2-8C;SUC2)(J.P.vanDijken等人，￡，膨M/cra/>Tec/mo/26,706(Jun1,2000)在標(biāo)準(zhǔn)豐富培養(yǎng)基(YPD)中或在缺少允許篩選整合轉(zhuǎn)化體、質(zhì)粒保持和減數(shù)分裂后代的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物的確定成分合成培養(yǎng)基(.D.Rose,F.Winston,P.Heiter,Me/^ot/s&yeastge"e"c&'a/a^orafo廠少cow廠sem"wwa/.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1990)中培DNA-介導(dǎo)的向釀酒酵母中的轉(zhuǎn)化用如R.H.Schiestl,R.D.Gietz，Cwrr16，339(Dec,1989)所述的醋酸鋰法進(jìn)行。所有基因石皮壞和替換都通過(guò)表型分析、菌落聚合酶鏈反應(yīng)("PCR")和對(duì)擴(kuò)增的基因組DNA進(jìn)行測(cè)序來(lái)證實(shí)。質(zhì)粒pAM489-pAM498用pCR2.1(Invitrogen,CarlsbadCA)構(gòu)建，并且在圖7A-C和表6中顯示。HISMX標(biāo)記序列在M.S.Longtine等人，14，953(Jul,1998)中描述。質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增在大腸桿菌DH5a抹中進(jìn)行。表6菌抹5，HR基因#1Crick啟動(dòng)子Watson啟動(dòng)子基因#2遺傳標(biāo)記3，HRpAM柳TRP1t畫(huà)GRGAUGAUOERG20TRP1TRP1pAM4卯TRP1t畫(huà)GRCUP1CUP1ERG20TRP1TRP1pAN491URA3t固GRGAUGAIJOERG13URA3URA3pAM492URA3IDI1CUP1CUP1tHMGRURA3URA3pAM493ADE1t畫(huà)GRGAL1GAIJOIDI1ADE1URA3pAM494ADE1t固GRCUP1CUP1IDI1ADE1ADE1pAM495HIS3ERG12GAL1GAL10ERG10HISMXHIS3pAM496HIS3ERG12CUP1CUP1ERG10HISMXHIS3pAM497LEU2ERG19GAL1GAUERG8HISMXLEU2pAM498LEU2ERG19CUP1CUP1ERG8HISMXLEU2如下制備釀酒酵母抹Y002和Y003用于引入可誘導(dǎo)的曱羥戊酸途徑基因。通過(guò)使用與天然￡7G9啟動(dòng)子具有45個(gè)堿基對(duì)的同源性的引物50-56-pwlOO-G(SEQIDNO:44)和50-56-pwl01-G(SEQIDNO:45)PCR擴(kuò)增pAM328的KanMX-PMET3區(qū)(SEQIDNO:43)，將E尺G9啟動(dòng)子替換為釀酒酵母ikffiT3啟動(dòng)子。使用40。/。w/w聚乙二醇3350(Sigma-AldrichStLouis,MO)、100mM醋酸鋰(Sigma)、10|iig鮭精DNA(Invitrogen)將10嗎得到的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到指數(shù)生長(zhǎng)的Y002和Y003抹中，在30。C溫育30分鐘，然后于42。C熱休克30分鐘(如Schiestl&Gietz,C紅r,16:339(1989)所述)。陽(yáng)性重組子根據(jù)它們?cè)诤?.5|ag/ml遺傳霉素(InvitrogenCo，Carlsbad，CA)的豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的能力進(jìn)行確定，并且通過(guò)診斷PCR證實(shí)。得到的克隆命名為Y93(MATA)和Y94(MATa)。然后，將AD五7開(kāi)i文閱讀框替換為光滑念珠菌(C""AWag/Wra^)基因(Cg丄五"2)。使用與開(kāi)放閱讀框(ORF)有50個(gè)堿基對(duì)側(cè)翼同源性的引物61-67-CPK066-G(SEQIDNO:46)和61-67-CPK067-G(SEQIDNO:47),由85光滑念珠菌基因組DNA(ATCC，Manassas,VA)擴(kuò)增3.5KBCgZ￡t/2基因組基因座。將10pg得到的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到指數(shù)生長(zhǎng)的如上所述的Y93和Y94內(nèi)。為了在不存在亮氨酸添加的條件下生長(zhǎng)，選擇a^/-抹，并通過(guò)診斷PCR證實(shí)。得到的克隆命名為Y176(MATA)和Y177(MATa)。為了產(chǎn)生釀酒酵母抹Y188,分別用Pmel(NewEnglandBiolabs，Beverly,MA)消化2|iig來(lái)自pAM491(SEQIDNO:48)和pAM495(SEQIDNO:49)的質(zhì)粒DNA過(guò)夜，并且導(dǎo)入指數(shù)生長(zhǎng)的如上所述的Y176內(nèi)。為了在缺乏尿嘧啶和組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，選擇陽(yáng)性重組子。向正確的基因組基因座中的整合通過(guò)診斷PCR證實(shí)。為了產(chǎn)生釀酒酵母抹Y189,分別用Pmel消化2pg來(lái)自pAM489(SEQIDNO:50)和pAM497(SEQIDNO:51)的質(zhì)粒DNA過(guò)夜，并且導(dǎo)入指數(shù)生長(zhǎng)的如上所述的Y177內(nèi)。為了在缺乏色氨酸和組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，選擇陽(yáng)性重組子。向正確的基因組基因座中的整合通過(guò)診斷PCR證實(shí)。大約1X107來(lái)自Y188和Y189的細(xì)胞在室溫下在YPD培養(yǎng)基平板上混合6小時(shí)，以允許繁殖。然后將混合的細(xì)胞培養(yǎng)物接種到缺乏組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的培養(yǎng)基上，以對(duì)二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行選擇。用Pmel消化2pg來(lái)自pAM493(SEQIDNO:52)的質(zhì)粒DNA過(guò)夜，并且導(dǎo)入指數(shù)生長(zhǎng)的如上所述的二倍體細(xì)胞內(nèi)。為了在缺乏腺噤呤的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，選擇陽(yáng)性重組子。向正確的基因組基因座中的整合通過(guò)診斷PCR證實(shí)。得到的菌抹被命名為Y238。為了產(chǎn)生含有導(dǎo)入基因的完全互補(bǔ)體的單倍體菌抹，Y238在2%乙酸鉀和0.02%棉子糖液體培養(yǎng)基中生成孢子。采用SingerInstrumentsMSM300系列顯微操作器(SingerInstrumentCo，LTD.Somerset,UK)分離大約200個(gè)遺傳四分體(四分體是生成四個(gè)孑包子的減數(shù)分裂產(chǎn)物)。含有所引入的遺傳物質(zhì)的適當(dāng)互補(bǔ)體的獨(dú)立的遺傳分離株根據(jù)它們?cè)谌狈ο?。票呤、組氨酸、尿嘧啶和色氨酸的條件下生長(zhǎng)的能力來(lái)確定。所有引入的DNA的整合都通過(guò)診斷PCR來(lái)證實(shí)。得到的菌4朱^皮命名為Y210(MATA)和Y211(MATa)。將2嗎來(lái)自pAM426的質(zhì)粒DNA(SEQIDNO:53)導(dǎo)入指數(shù)生長(zhǎng)的如上所述的Y210和Y211內(nèi)，該質(zhì)粒DNA含有從釀酒酵母啟動(dòng)子表達(dá)的釀酒酵母密碼子優(yōu)化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)。根據(jù)它們?cè)诓淮嬖诹练账嵫a(bǔ)充的條件下生長(zhǎng)的能力篩選含有pAM426質(zhì)粒的釀酒酵母抹。得到的菌抹命名為Y225(MATA)和Y227(MATa)。將2嗎來(lái)自pAM322的質(zhì)粒DNA(SEQIDNO:54)導(dǎo)入指數(shù)生長(zhǎng)的如上所述的Y210和Y211內(nèi)，該質(zhì)粒DNA含有從釀酒酵母表達(dá)的釀酒酵母密碼子優(yōu)化的紫穗槐二烯合成酶(ADS)和細(xì)胞色素P450單加氧酶(AMO)和從釀酒酵母啟動(dòng)子表達(dá)的細(xì)月包色素P450氧化還原酶(CPR)。根據(jù)它們?cè)诓淮嬖诹涟彼嵫a(bǔ)充的條件下生長(zhǎng)的能力篩選含有pAM322質(zhì)粒的釀酒酵母抹。得到的菌株命名為Y222(MATA)和Y224(MATa)。實(shí)施例19該實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌4朱中產(chǎn)生a-法尼歸或(3-法尼烯。宿主菌抹B552和B592的種子培養(yǎng)物如下建立將每個(gè)菌抹的儲(chǔ)備液等份加入到含有25mLM9-MOPS、0.8%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并iU吏培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)在初始OD6oq接近0.05時(shí)用種子培養(yǎng)物接種含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL搖瓶。培養(yǎng)物在30。C下在250rpm潮濕溫育搖床上溫育，直到它們達(dá)到大約0.2的OD6()o，此時(shí)通過(guò)加入40uL1MIPTG在宿主細(xì)月包中"i秀導(dǎo)a-法尼烯或(3-法尼烯的產(chǎn)生。誘導(dǎo)時(shí)，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋物，以捕獲a-法尼烯。每24小時(shí)通過(guò)將2-10uL有機(jī)溶劑層轉(zhuǎn)移到含有加有作為內(nèi)標(biāo)的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的干凈玻璃瓶中，采樣一次。另外，離心培養(yǎng)物的1mL等份，將細(xì)胞沉淀物重懸浮在250uL無(wú)菌水中，將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到含有摻有作為內(nèi)標(biāo)的反式87丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。整個(gè)培養(yǎng)液樣品通過(guò)渦^走振蕩玻璃瓶10分鐘用乙酸乙酯萃取，之后將600uL乙酸乙酯萃取物轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃瓶中。有機(jī)覆蓋物/乙酸乙酯樣品和乙酸乙酯萃取的整個(gè)培養(yǎng)液樣品在裝備有Agilent5975質(zhì)譜儀的Agilent6890N氣相色譜儀(GC/MS)上以全掃描模式(50-500m/z)分析。為了加快運(yùn)行時(shí)間，改變溫度程序和柱基質(zhì)以達(dá)到最佳峰值分辨率和最短的總運(yùn)行時(shí)間。利用HP-5MS柱(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA)禾口氦載氣分離1iiL才羊品。用于分析的溫度程序如下150。C保持3分鐘，以25。C/分鐘升高溫度至200。C,以60。C/分鐘升高溫度至300。C，于300。C保持1分鐘。以前的質(zhì)譜證實(shí)p-法尼烯合成酶的產(chǎn)物是(3-法尼烯，使用該GC方案，卩-法尼烯的保留時(shí)間為4.33分鐘。通過(guò)比較產(chǎn)生的峰面積和純化p-法尼烯(Sigma-AldrichChemicalCompany,St.Louis,MO)在力口有反式丁香烯的乙酸乙酯中的定量校準(zhǔn)曲線，計(jì)算法尼烯的滴度。宿主林B592在120小時(shí)時(shí)產(chǎn)生大約400mg/L的p-法尼烯(平均3個(gè)以上的獨(dú)立克隆)，并且具有約46mg/L/OD6Q。的最大比生產(chǎn)率。宿主菌林B552在120小時(shí)時(shí)產(chǎn)生大約1.1g/L的P-法尼烯(平均3個(gè)以上的獨(dú)立克隆)，并且具有約96mg/L/OD6。。的最大比生產(chǎn)率(1個(gè)代表克隆)。實(shí)施例20該實(shí)施例描述了大腸桿菌宿主菌株中通過(guò)DXP途徑產(chǎn)生P-法尼宿主菌抹B650、B651、B652和B653的種子培養(yǎng)物如下建立將每個(gè)菌林的儲(chǔ)備液等份加入到單獨(dú)的含有25mLM9-MOPS和如表1所詳述的抗生素的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜。在初始OD6。。接近0.05時(shí)用種子培養(yǎng)物接種含有40mLM9-MOPS基本培養(yǎng)基、45ug/mL硫胺、微量營(yíng)養(yǎng)物、1.00E-5mol/LFeS〇4、0.1MMOPS、0.5%酵母提取物、20g/LD-葡萄糖和抗生素的單獨(dú)的250mL搖瓶。培養(yǎng)物在30。C下在潮濕溫育搖床上250rpm88溫育，直到它們的OD6oo達(dá)到0.2-0.3,此時(shí)向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG誘導(dǎo)在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生P-法尼烯。誘導(dǎo)時(shí)，在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的有機(jī)覆蓋物以捕獲p-法尼烯。在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)將100uL有機(jī)覆蓋上層的樣品轉(zhuǎn)移到干凈試管中采樣。離心該試管以分離出任何剩余的細(xì)胞或培養(yǎng)基，并將10uL有機(jī)覆蓋層樣品轉(zhuǎn)移到千凈玻璃GC瓶中的加入P-或反式丁香烯作為內(nèi)標(biāo)的500uL乙酸乙酯中。將混合物渦旋振蕩30秒，然后如實(shí)施例18所述分析。大腸桿菌宿主菌才朱B653產(chǎn)生大約7mg/gDCW(3-法尼烯。實(shí)施例21該實(shí)施例描述了釀酒酵母宿主菌抹中a-法尼婦或P-法尼烯的產(chǎn)生。菌林EPY300的產(chǎn)生是通過(guò)在豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)而從釀酒酵母EPY224抹中除去表達(dá)質(zhì)粒(Ro等人.(2006)A^wre440:940-943;PCT專(zhuān)利公開(kāi)WO2007/005604)。然后用表達(dá)質(zhì)粒pRS425-FSA或pR425-FSB轉(zhuǎn)化菌4朱EPY300，分別產(chǎn)生宿主菌林Y166和Y164。宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體在含有2%葡萄糖和除亮氨酸以外的所有氨基酸的合成的確定成分培養(yǎng)基(SM-glu)上篩選。宿主菌林EPY300對(duì)于亮氨酸生物合成來(lái)說(shuō)是營(yíng)養(yǎng)缺陷的(7ew2)，但是表達(dá)質(zhì)粒pRS425-FSA或pRS425-FSB恢復(fù)了亮氨酸原養(yǎng)型f^72)。將單菌落轉(zhuǎn)移到含有5mL缺乏亮氨酸的液體SM-glu的培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)物通過(guò)在30°C振搖溫育，直到生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期。細(xì)胞以由40050%甘油和600/iL液體培養(yǎng)物組成的lmL冷凍等份，在凍存管中貯存于-80。C。種子培養(yǎng)物如下建立將儲(chǔ)備液等份加入到含有25mL缺乏亮氨酸的SM-glu的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜。在00600約為0.05時(shí)用種子培養(yǎng)物接種含有40mL缺乏亮氨酸的合成的確定成分培養(yǎng)基、0.2%葡萄糖和1.8%半乳糖的250mL帶檔板的搖瓶中。培養(yǎng)物在30。C下在200rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上溫育。由于培養(yǎng)基中存在葡萄糖阻止了半乳糖對(duì)G"〃啟動(dòng)子的誘導(dǎo)，法尼烯的產(chǎn)生不能被誘導(dǎo)，直到細(xì)胞用完了培養(yǎng)基中的葡萄糖并且切換為使用半乳糖作為其主要碳源。在培養(yǎng)物上覆蓋8mL的油酸曱酯或豆蔻酸異丙酯。每24小時(shí)通過(guò)將2-10uL有機(jī)溶劑層轉(zhuǎn)移到含有500uL乙酸乙酯的干凈玻璃瓶中采樣，該乙酸乙酯中摻有已知濃度的(3-或反式丁香烯作為內(nèi)標(biāo)。另外，將整個(gè)培養(yǎng)液的0.5mL等份加入到含有摻有作為內(nèi)標(biāo)的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。整個(gè)培養(yǎng)液樣品通過(guò)渦旋才展蕩玻璃瓶10分鐘用乙酸乙酯中萃取，之后將600uL乙酸乙酯萃取物轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃瓶中。宿主4朱Y166在120小時(shí)時(shí)產(chǎn)生大約9.8mg/L的a-法尼烯(平均超過(guò)3個(gè)獨(dú)立克隆)，并且具有大約3mg/L/OD6(K)的最大比生產(chǎn)率(1個(gè)代表性克隆)。宿主菌抹Y164在120小時(shí)時(shí)產(chǎn)生大約56mg/L的P-法尼烯(平均超過(guò)3個(gè)獨(dú)立克隆)，并且具有大約20mg/L/OD6。o的最大比生產(chǎn)率(l個(gè)代表性克隆)。實(shí)施例22該實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中產(chǎn)生y-萜品烯、a-蒎烯和薛品油歸。用于產(chǎn)生y-萜品烯(大腸桿菌DH1-Tlr[pMevT，pMevB-Gpps，pAM445])、a-蒗烯(大腸桿菌DH1-Tlr[pMevT,pMevB-Gpps,pAM443或pAM442])或碎品油烯(大腸桿菌DH1-Tlr[pMevT,pMevB-Gpps,pAM444]的宿主菌株的種子培養(yǎng)物通過(guò)將每種菌抹的貯備液等份加入到單獨(dú)的含有25mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和如表1所詳述的抗生素的125mL搖^f瓦中，并且通過(guò)將培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜至對(duì)數(shù)后期而建立。種子培養(yǎng)物用來(lái)以大約0.05的初始OD,接種含有40mLM9-MOPS、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物和抗生素的250mL搖瓶。在接種時(shí)，培養(yǎng)物上也覆蓋有4mL十六烷。培養(yǎng)物在200-250rpm的旋轉(zhuǎn)搖床上30。C溫育，直到它們達(dá)到大約0.2的OD6QQ,此時(shí)添加40uL1MIPTG誘導(dǎo)在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo)化合物。每天通過(guò)將200uL十六烷層轉(zhuǎn)移到0.6mL微量離心管中采樣一次，共96小時(shí)。為進(jìn)行分析，在1.8mLGC瓶中將十六烷層用摻有作為內(nèi)標(biāo)的反式丁香烯90的乙酸乙酯1:1或1:10稀釋。另外，離心每J分1mL的培養(yǎng)物，將細(xì)胞沉淀物重懸浮在250uL無(wú)菌水中，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到加有作為內(nèi)標(biāo)的反式丁香烯的1mL乙酸乙酯的玻璃瓶中。通過(guò)渦旋振蕩玻璃瓶15分鐘將細(xì)胞沉淀物在乙酸乙酯中提取，之后將500uL乙酸乙酯提取物轉(zhuǎn)移到干凈的玻璃瓶中。十六烷/乙酸乙酯樣品和乙酸乙酯提取的細(xì)胞沉淀物樣品在全掃描模式(50-500m/z)的裝備有Agilent5975質(zhì)譜4義的Agilent6890N氣相色譜儀(GC/MS)上分析。為了加快運(yùn)行時(shí)間，改變溫度程序和柱基質(zhì)以達(dá)到最佳峰值分辨度和最短的總運(yùn)行時(shí)間。分成1樣品(基于樣品濃度選4奪1:2至1:50的分配比)，然后用HP-5MS柱(AgilentTechnologies,Inc.,PaloAlto,CA)和氦載氣分離。用于分析的溫度程序如下75。C保持3分析，以20。C/分鐘升高溫度至115。C,以60。C/分鐘升高溫度至300。C，于300。C保持0.5分鐘。各種產(chǎn)物，y-萜品烯、oc-蒗烯和碎品油烯，分別在5.4、4.1、5.4和5.9分鐘時(shí)觀察。通過(guò)將產(chǎn)生的峰面積與純化標(biāo)準(zhǔn)在加有反式丁香烯的乙酸乙酯中的定量校準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算滴度。實(shí)施例23該實(shí)施例描述了在大腸桿菌宿主菌抹中生產(chǎn)芳樟醇、芋烯、P-蒗烯、P-水芽烯、蒈烯或檜烯。種子培養(yǎng)物如下建立將每種菌林的儲(chǔ)備液等份加入到含有25mLM9-MOPS培養(yǎng)基、0.5%酵母提取物、2%葡萄糖和如表1所詳述的抗生素的單獨(dú)的125mL搖瓶中，并且使培養(yǎng)物生長(zhǎng)過(guò)夜。在初始OD6。。接近0.05時(shí)用種子培養(yǎng)物接種250mL帶有檔板的搖瓶，每個(gè)搖瓶均含有40mLM9-MOPS培養(yǎng)基、0.5%酵母提取物，2%葡萄糖和抗生素。培養(yǎng)物在30°C下在250rpm旋轉(zhuǎn)搖床上溫育，直到它們達(dá)到大約0.2的OD6。。，此時(shí)通過(guò)向培養(yǎng)基中加入40uL1MIPTG在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)目標(biāo)化合物的產(chǎn)生。通過(guò)溶劑-溶劑萃取從培養(yǎng)基中分離目標(biāo)化合物，或者如果目標(biāo)化合物的滴度大到足以使培養(yǎng)基飽和并且形成第二相，則通過(guò)沉降和潷析分離目標(biāo)化合物。序列表SE(JIDNO:1MevT66操縱子AGCAAAAGCGTGAAGTCTGTCTTAATGCAGCTGTTCGGCGAGAACACGGATGTCGAGGGTATCGACACCGCGTCTTACATGGAGCACGCCTACGACTTTTACAAGCCGGACTTCACGAGCGAATACCCGTACGTGG92ACATGCAGCGAATCTGGTTACGGCGGTTTTCTTAGCCTTAGGTCAGGACCCAGCCCAAAATGTCGAGAATCGAGGTCGGCACGATCGGCGGCGGCACCGTTTTAGAACCGCAAGGTGCGATGCTGGA丁CTGCTGGGSE(JIDNO:2引物4-49mvaASpelSEQIDNO:3引物4-49mvaARXbal5'-GCTTCTAGACTATTGTTGTCTAATTTCTTGTAAAATGCG-3'SEQIDNO:4引物HMGS5'SamvaS-SSE(JIDNO:5引物HMGS.3'SanwaS-AS93SEQIDNO:6引物19-25atoBSfil-S5'-GCTAGGCCATCCTGGCCATGAAGAACTGTGTGATTGTTTCTG-3'SEQIDNO:7引物19-25mvaA-AsiSI-AS5'-GCTTGCGATCGCCGGCGGATTTGTCCTACTCAG-3'SE<JIDNO:8引物9-70C5'-CCACCTCGAGATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTG-3'SE(IDNO:9引物26-39B5，-TGGTGGAGCTCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAGATAATCG-3'SECJIDNO:10引物26-39A5'-TTCTTGAGCTCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCTTTGCG-3'SEQIDNO:11引物4-40nwaEFBamHISEQIDNO:12引物4-40mvaERHindIII5'-AGCTAAGCTTTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC—3，SEQIDNO:13引物4-40mvaSFBglIISEQIDNO:14引物4-39mvaSRBamHI5'-TTTGGATCCTTAGTTTCGATAAGAGCGAACGG—3'SEQIDNO:15用于PCR擴(kuò)增dxs基因的編碼序列的引物67-1A-CSE(JIDNO:1694用于PCR擴(kuò)增dxs基因的編碼序列的引物67-1B-CSEQIDNO:17用于PCR擴(kuò)增dxr基因的編碼序列的引物67-1C-CSEQIDNO:18用于PCR擴(kuò)增dxr基因的編碼序列的引物67-1D-CSE(JIDNO:19用于PCR擴(kuò)增ispD基因的編碼序列的引物67-1E-CSEQIDNO:20用于PCR擴(kuò)增ispD基因的編碼序列的引物67-1F-C5'-TATTGTTCATATGTTATGTAT丁CTCCTGATGGATGGTTCG-3'SEgIDNO:21用于PCR擴(kuò)增ispE基因的編碼序列的引物67-1G-CSEQIDNO:22用于PCR擴(kuò)增ispE基因的編碼序列的引物67-1H-C5'-TGTTAGTTACGCGTTTAAAGCATGGC'SEQIDNO:23用于PCR擴(kuò)增ispF基因的編碼序列的引物67-2A-C5'-SEQIDNO:24用于PCR擴(kuò)增ispF基因的編碼序列的引物67-2B-C5'-TTTAGTTGGGCCCTCATTTTGTTGCCTTAATGAGTAGCGCC-3'SECIDNO:25用于PCR擴(kuò)增ispG基因的編碼序列的引物67-2C-CSECIDNO:26用于PCR擴(kuò)增ispG基因的編碼序列的引物67-2D-C95SEQIDNO:27用于PCR擴(kuò)增ispH基因的編碼序列的引物67-2E-CSEqIDNO:28用于PCR擴(kuò)增ispH基因的編碼序列的引物67-2F-CSEQIDNO:29用于PCR擴(kuò)增idi基因的編碼序列的引物67-2G-CSEQIDNO:30用于PCR擴(kuò)增idi基因的編碼序列的引物67-2H-CSE(JIDNO:31用于PCR擴(kuò)增ispA基因的編碼序列的引物67-2l-C5'-CAGTAAAGCTTAGGAGGAAATAATGGACTTTCCGCAGCAACTCG-3'SEgIDNO:32用于PCR擴(kuò)增ispA基因的編碼序列的引物67-2J-C5'-TAGTTCCATGGTTATTTATTACGCTGCSEQIDNO:33用于PCR擴(kuò)增RK2par基因座的引物9-156A5'-ACATAGACGTCGGGAAAGCGAGGATCTAGGTAGGG-3'SEQIDNO:34用于PCR擴(kuò)增RK2par基因座的引物9-156B5'-TTCCCGCTCGAGGTGGCGGACCATATAGGCAGATCAG-3'SE(JIDNO:35引物19-137cml-pAM37-AS5'-GACGTCGATATCTGGCGAAAATG-3'SE(IDNO:36引物19-137cml-pAM37-S5，—TACTAGTGCTTGGATTCTCACC-3'SEQIDNO:37用于PCR擴(kuò)增編碼P-法尼烯合成醉的核苷酸序列的引物5'-CCATGGACACTCTGCCGATCTCTTCCGTAAGC-3'SE(JIDNO:38用于PCR擴(kuò)增編碼P-法尼烯合成酶的核苦酸序列的引物5'-GAGCTCTCATACGACCATAGGG丁GTACG-3'SEQIDNO:39用于PCR擴(kuò)增編碼a-法尼烯合成酶的核苷酸序列的引物5'-CCATGGACCTGGCAGTAGAAATTGC'3'SEQIDNO:40用于PCR擴(kuò)增編碼a-法尼烯合成醉的核苦酸序列的引物5，-GAGCTCTTACATCGGTACCGGCTCCAG-3'SEQIDNO:41atofl(opt),//A/G>S(opt),/nvI^操縱子GATGGTCAGGTGTACGACGTCATCTTACGCGATGGCTTAATGTGCGCGACCCACGGTTACCACATGGGGAATCAGACTGGCGGATTTAAAACGGTATCTTCTGAACGTATTATGATAGGTCAAATCGTCTTTGATGACGATTTTAGAGGCCATAACTGCATTTTTAAAAAATGAATCTCCACAAAGCGACATTTTAATGAGTATTSE(JIDNO:42rt'CA8(opt).謂flS(opt).，"操縱子98<formula>formulaseeoriginaldocumentpage99</formula>SEQIDNO:43pAM328-ERG9-KANMX-MET3啟動(dòng)子-ERG9(不包括載體骨架)CAA丁ACCGACT丁ACCATCCTATTTGCITTGCCCTTTTTCTTTTCCACTGCATGGCGGCGTTAGTATCGAAGTGAGTCTTTTCCTTACCCATGGTTGTTTATGTTCGGATGTGATGTGAGAACTGTATCCTAGCAAGATTATACTATTACACTTCATTTACCACCCTCTGATCTAGATTTTCCAACGATATGTACGTAGTGGTATAAGG:TTTTTTAGCTGCAATGCCAATTGTAATAGCTTTCCCATGTTAATTATACTTTATTCTTSE(JIDNO:44SEQIDNO:45CGTGTATACGTTTTCCGCTTCTGCTCTTCGTCTTTTCTCTTCTTCCGATATCACAACTGTTACGASE(JIDNO:46GGTAAGACGGTTGGGTTTTATCTTTTGCAGTTGGTACTATTAAGAACAATCACAGGAAACAGCTATGACCSE(JIDNO:47SE(JIDNO:48pAM491序列(不包括栽體骨架)101AAAGTTCCJGAAAUJCJAt;TA(J'丄'CJ(JUUJ'r(JTmi.(JATAC:(JA'lXJ(J'r丄'A(J丄丄AAAA(JAUirU'r丄'Ci(JA(JUALC;CAAGCTTTCAATATCGCGGGAATCATCTTCCTCACTAGATGATGAAGGTCCTGATGAGCTCGATTGCGCGACGTCCAACATATTATCAAGGAATTAGATATTACTAACAAATTAGCCAAGAGAATCACCGAAACTCCTTTTGGCAGCCTGCTTmTTAGCTGTCA'rn'AA'l'AUAUTAUTrn丁丄'AA.l'(J.l'AiA'JA(jrA(JUAAAA(J.l'CJAGCCGCTAAAGGCATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGGGTTTAAACSEQIDNO:49pAM492序列(不包括栽體骨架)TAAGAAGAGTATTGAGAAGGGCAACGGTTCATCATCTCATGGATCTGCACATGAACAAACACCAGAGGGGCGCTATACGTGCATATGTTCATGTATGTATCTGTATTTAAAACACTTTTGTATTATTTTTCCTCATA104<formula>formulaseeoriginaldocumentpage105</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage106</formula>SE(JIDNO:51pAM497序列(不包括栽體骨架)丁ATTTTAATCAAATCi—iTACiCG]'(JArrJ'AM'ATn.n.i.n.L'UCXTL'UAUA'l.(JA'JL'J'UUJUAUA-i'"UUAAUTJ'UTGCTACn.A(JCiCiUAU丄AAA(Ji(JUUCiC;ATlTU"l'lAA'llJAAUAACjAL'ICj(JAAlAlAACUAJ1AAAAU1SEQIDNO:52pAM493序列(不包括栽體骨架)ATrCTCAAATCACCGTCCACTTCTTTCATCAATGTTATACAGTTGGAACTTTCGACATTTTGTGCAGGAT109CCAGCCATTGCAGATCCAACCAAATTTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTAAGATAATGGGGCTCTTTACATTTCCACAACATATAAGTAAGATTAGATATGGATATGTATATGGTGGTATTGCCATGTAATATGATTATTAAACTTCTTTGTTGATGACGAATTAGGTTTGAAGGGTAAGCTAGACGATAAGATTAAGGGCGCTATTACTGCGGCGGTGTGGGTTTCACCAAATGATTTGAAAACTATGTTTGCTGACCCAAGTTACAAGTTTACGCCTTGGTTTAAGAAATCC'n'A(JTAATA'lXiTAAA(JTri.ATn-l'UriTAm'AUJ(JtJ(JUAU丄(JA(Ji'CrUAC丄C'riUCJUAUAUAAGGTAGACGCTGGTACGTTGCTGTTTGTTGCTACGGATCGTATCTCTGCATATGACGTTATTATGGAAAAAGGAGAAGGGCATCATCATCGCAGACACTAAATTGTTTAAACSEQIDNO:53pAM426序列AAAGTTTATGTACAAATATCATAAAAAAAGAGAATCTTTTTAAGCAAGGATTTTCTTAACTTCTTCGGC1TGGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTACiCiCiCiCAUAC:A.ri'ACAA'j;CiU-l'A'rA'l'(J(J'ri'UAAAiA.rATAATCAGGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTGATGGGGAAAGAGAAAAGAAAAAAATTGATCTATCGATTTCAATTCAATTCAATTTATTTCmrCGGGGATCGTGCTCTTCAGTTGTCGGTATGTGTCCTTCATTAGCCCATTTCGCTTCTACCATTAGATTCCTTACCATTTCTGTGTAGGTATCCATGAATAATTTGTAAATAGGCTTCATGTATTCCGGCAACGTGTCTAAGCAGATTGAACTCCAGTTTAGCTAACTTTAGCAGAGTTTTATTATGGGAGTCTTGTTGCTGATAGAAGGGTCAACTGTCTTACTTCCT丁CTTTAGATCGTTTAC丁ATTTGCTCCACACCCTGTTCAACTTGTTTCTCATAAAAGGCCATTGTTTTCTGCAGATCCGGGGTTTTTTCTCCTTGACGTTAAAGTATAGAGGTATATTAACAATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGCiTTA(JTCiCX'AA'rnTr(JCT(JT丄IJA'丄AA(JC;Al'AAAACJ(JJlAU'iA1—m丄'A(JATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAG丁GG八ACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGSEQIDNO:54pAM322序列〕TTGATAAATGTATGTAGATTGCGTATATAGTTTCGTCTACCCTATGAACATATTCCATTTTGTAATTTCGTGTCGTTTCTATTATGAATTTCATTTATrCTTCGGC114TGGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTAGGGCiCAqAL'ATTACAATUCi'丄.ATA丄CCJ'rrUAAATATATAATAAGAAAGCAACACCTGGCAATTCCTTACCTTCCAATAATTCCAAAGAAGCACCACCACCAGTAGAGATAACAGCCATAAGTAAAGGTCTTGGGATATTCTTTGTTGTTAAATACTCTCTGTTTATGTCTTTCCAA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage116</formula>.ri'AA'lA'rAUJ丄'e;丄'ArA(jrriAAL"丄UftA"UAAjAAAAAAU^HAA(jLTJ!LCACAGGGAATTGCTTATGATATTAACAACCAGTGTGGCCGTTTTAATTGGTTGTGTGGTTGTATTGGTATTTACACAGTCCCTTATCCGATAGGAGTTGTACTCATTTAGAATTTGATATTTCCAATACTGGACTATCGATTCTATTCTTTGGTTGTCGTAATAGAAAAGTTGACTTTATATACGAAGATGAGTTAAACAACTTCGTTATGTTTGGTGAGCTAGCTAAGATCCGCTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTAGGTTAGAAGAAGGCTACTTTGGTGTCTATTTTCTCTrCCATAAAAAAAGCCTGACTCCACTTCCCGCGTTTACTGATTACTAGCGAAGCTGCGGGTGCATTTTTTCAAGATAAAGGCATCCCCGATTATATTCTATA、TTGGTCAGAAATTCGATTCACTCTATGAATAGTTCTTACTACAATTTTTTTGTCTAAAGAGTAATACTAGAGATAAACATGGATATAGCACAGAGATATATAGCAAAGAGATACTTTTGAGCAATGTTTGTGGAAGCGGTATTCGCAACCATTCCATGCGGGGTATCGTATGCTTCCTTCAGCACTACCCTTTAGCTGTTCTATATGCTGCC八CTCCTCAATTGGATTAGTCTCATCCTTCAATGCTATCATTTCCTTTGATATTCiCJATCATACTAAUAAACCATTAT118權(quán)利要求1.一種生產(chǎn)類(lèi)異戊二烯的方法，包括(a)獲得多個(gè)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含用于生成異戊烯焦磷酸的酶途徑，并且其中所有的途徑酶都在至少一個(gè)異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制下；和(b)在與提供該宿主細(xì)胞的最大比生長(zhǎng)速率的條件相比為亞最佳的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述途徑是曱羥戊酸途徑。3.權(quán)利要求l的方法，其中所述途徑是DXP途徑。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種異源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物是可誘導(dǎo)的。5.權(quán)利要求1的方法，其中所述途徑酶在單個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制下。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述途徑酶在多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物的控制下。7.權(quán)利要求l的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核生物。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。9.權(quán)利要求l的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核生物。10.權(quán)利要求l的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真菌。11.權(quán)利要求9的方法，其中所述宿主細(xì)胞是釀酒酵母。12.權(quán)利要求2的方法，其中所述途徑包括編碼來(lái)自具有內(nèi)源曱羥戊酸途徑的原核生物的曱羥戊酸途徑酶的核酸序列。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述原核生物是選自腸球菌屬、假單胞菌屬和葡萄球菌屬的屬的原核生物。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述核酸序列選自乙酰-CoA硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶和曱羥戊酸激酶。15.權(quán)利要求12的方法，其中所述核酸序列編碼II類(lèi)HMG還原酶。16.權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中營(yíng)養(yǎng)物或溫度或此兩者的水平保持低于提供該宿主細(xì)胞的最大比生長(zhǎng)速率的水平。17.權(quán)利要求1的方法，其中培養(yǎng)基的溫度至少比提供最大比生長(zhǎng)速率的溫度低大約2-20。C。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述宿主細(xì)胞在至少比提供最大比生長(zhǎng)速率的溫度低大約5°C的溫度下培養(yǎng)。19.權(quán)利要求17的方法，其中培養(yǎng)基的溫度至少比提供最大比生長(zhǎng)速率的溫度低大約10。C。20.權(quán)利要求1的方法，其中所述培養(yǎng)基包含碳源，并且碳源的量將提供最大比生長(zhǎng)速率的大約90%或更低。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述碳源的量將提供最大比生長(zhǎng)速率的大約75%或更低。22.權(quán)利要求20的方法速率的大約50%或更^^。23.纟又利要求20的方法速率的大約25。/?；蚋黬氐。24.權(quán)利要求20的方法速率的大約75%-10%。25.權(quán)利要求1的方法其中所述碳源的量將提供最大比生長(zhǎng)其中所述碳源的量將提供最大比生長(zhǎng)其中所述碳源的量將提供最大比生長(zhǎng)其中所述培養(yǎng)基包含氮源，氮源的含量低于提供最大比生長(zhǎng)速率的大約90%或更低的量。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述氮源的量將提供最大比生長(zhǎng)速率的大約75%或更低。27.權(quán)利要求25的方法，其中所述氮源的量將提供最大比生長(zhǎng)速率的大約50%或更低。28.權(quán)利要求25的方法，其中所述氮源的量將提供最大比生長(zhǎng)速率的大約25%或更{氐。29.權(quán)利要求25的方法，其中所述氮源的量將提供最大比生長(zhǎng)速率的大約75%-10%。30.權(quán)利要求1的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯以大于大約每升培養(yǎng)基IO克的量產(chǎn)生。31.權(quán)利要求1的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯以高于大約每克細(xì)胞千量50mg的量產(chǎn)生。32.權(quán)利要求30或31任一的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯的量在不到大約150小時(shí)的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。33.權(quán)利要求30或31任一的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯的量在不到大約96小時(shí)的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。34.權(quán)利要求30或31任一的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯的量在不到大約72小時(shí)的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。35.權(quán)利要求1的方法，其中所述宿主細(xì)胞在低于提供最大比生長(zhǎng)速率的溫度的溫度下培養(yǎng)，并且其中所述宿主細(xì)胞在碳源水平保持低于提供最大比生長(zhǎng)速率的水平的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。36.權(quán)利要求1的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯選自半萜、單辟、二辟、三薛、四莊和多碎。37.權(quán)利要求1的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯不是類(lèi)胡蘿卜素。38.權(quán)利要求1的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯是C5-C2o類(lèi)異戊39.權(quán)利要求1的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯選自松香二烯、紫穗槐二烯、蒈烯、a-法尼烯、(3-法尼烯、法尼醇、香葉醇、香葉基香葉醇、異戊二烯、芳樟醇、苧烯、月桂烯、橙花叔醇、羅勒烯、薄荷醇、(3-蒗烯、檜薛、y-碎品烯、萜品油烯和瓦4侖烯。40.—種生產(chǎn)類(lèi)異戊二烯的方法，包括(a)荻得多個(gè)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含編碼來(lái)自具有內(nèi)源曱羥戊酸途徑的原核生物的甲羥戊酸途徑酶的核酸序列；和(b)在與為宿主細(xì)胞提供最大比生長(zhǎng)速率的條件相比為亞最佳的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。41.一種宿主細(xì)胞，當(dāng)其在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠以大于每升培養(yǎng)基大約IO克的量產(chǎn)生類(lèi)異戊二烯。42.—種宿主細(xì)胞，當(dāng)其在含有碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠以大于每克細(xì)胞干重大約50mg的量產(chǎn)生類(lèi)異戊二烯。43.權(quán)利要求40或41任一項(xiàng)的方法，其中所述類(lèi)異戊二烯的量在不到大約150小時(shí)的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生。全文摘要本發(fā)明提供通過(guò)一種或多種生物合成途徑大量生產(chǎn)類(lèi)異戊二烯的方法。本發(fā)明還提供用于實(shí)施所述方法的核酸、酶、表達(dá)載體和遺傳修飾的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供從遺傳修飾的宿主細(xì)胞高產(chǎn)率地生產(chǎn)類(lèi)異戊二烯的發(fā)酵方法。文檔編號(hào)C12P7/40GK101484584SQ200780019353公開(kāi)日2009年7月15日申請(qǐng)日期2007年5月25日優(yōu)先權(quán)日2006年5月26日發(fā)明者C·J·帕登,J·紐曼,K·K·賴(lài)林,N·S·倫寧格,R·里根廷申請(qǐng)人:阿米瑞斯生物技術(shù)公司