專利名稱：具有反饋抗性的甲羥戊酸激酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase)，其對(duì)于反饋抑制具有更小的敏感度。該經(jīng)過修飾的酶和編碼該酶的多核苷酸可被用于生產(chǎn)類異戊二烯(isoprenoid)化合物，用于治療具有甲羥戊酸激酶活性降低的特征的疾病，以及用于診斷用途。
甲羥戊酸激酶(MK)是甲羥戊酸途徑中必需的酶，所述途徑導(dǎo)致了大量細(xì)胞內(nèi)類異戊二烯的產(chǎn)生。類異戊二烯途徑的產(chǎn)物異戊烯二磷酸(IPP)，以及同質(zhì)異構(gòu)化合物，二甲基烯丙基二磷酸(DAMPP)是所有生物中類異戊二烯的基本構(gòu)建物質(zhì)。類異戊二烯包括超過23000種天然存在的初級(jí)和次級(jí)代謝物分子。該類天然產(chǎn)物的化學(xué)多樣性反映了它們?cè)谏锵到y(tǒng)中多種多樣的生理作用。類異戊二烯包括，例如細(xì)菌中的植烷三萜、泛醌和甲基萘醌，植物中的類胡蘿卜素、質(zhì)體醌、單/一個(gè)半/雙/三萜以及葉綠素的含異戊二烯基側(cè)鏈，和哺乳動(dòng)物中的血紅素A、醌、多萜醇、固醇/類固醇和類維生素A。此外，類異戊二烯還涉及異戊烯tRNA、蛋白質(zhì)異戊烯化以及膽固醇修飾，例如對(duì)刺猬類細(xì)胞信號(hào)蛋白質(zhì)進(jìn)行的。
人們已在多種生物中于生物化學(xué)及分子水平上對(duì)MK酶進(jìn)行了分析(Houten et al.，Biochim.Biophys.Acta 1529，19-32，2000)。目前，很多甲羥戊酸激酶的DNA和氨基酸序列都是已知的(例如，Swiss-Prot編號(hào)/IDsP07277/kime_yeast；Q9R008/kime_mouse；P17256/kime_rat；Q03426/kime_human；P46086/kime_arath；Q09780/kime_schpo；Q9V187/kime_pyrab；059291/kime_pyrho；Q8UOF3/kime_pyrfu；Q50559/kime_metth；027995/kime_arcfu；Q58487/kime_metia；Q9Y946/kime_aerpe)，并且，每個(gè)月還會(huì)有一些序列被增加到已知甲羥戊酸激酶序列的列表中?；谄渑c已知甲羥戊酸激酶序列的相似性，上述從基因組測(cè)序計(jì)劃中獲得的序列已被賦予了假定的甲羥戊酸激酶功能。但是，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，很容易證明這些序列事實(shí)上能編碼具有甲羥戊酸激酶活性的蛋白質(zhì)。
在調(diào)控的方面，人們普遍認(rèn)為HMG-CoA還原酶是甲羥戊酸途徑中的速度決定酶(例如，Goldstein and Brown，Nature 343，425-430，1990；Weinberger，Trends Endocrinol.Metab.7，1-6，1996；Hampton et al.，TrendsBiochem.Sci.21，140-145，1996；Houten et al.，J.Biol.Chem.278，5736-5743，2003)。與該觀點(diǎn)一致的是，向培養(yǎng)基中添加甲羥戊酸已顯示出能激活Phaffia rhodozyma(Calo et al.，Biotechnol.Lett.17，575-578，1995)和Haematococcus pluvialis(Kobayashi et al.，J.Ferment.Bioeng.71，335-339，1991)中的類胡蘿卜素生產(chǎn)。但是，近年來更多的證據(jù)顯示，甲羥戊酸激酶會(huì)受到反饋抑制，例如下游產(chǎn)物，牻?；姿?geranyldiphosphate)、法呢基二磷酸(farnesyldiphosphate)、雙牻牛基二磷酸(geranylgeranyldiphosphate)所造成的。這種反饋抑制還可在對(duì)甲羥戊酸途徑的調(diào)控和速度限制中發(fā)揮作用，因此，通常對(duì)類異戊二烯的生物合成的調(diào)控和速度限制發(fā)揮作用。
在人類中，甲羥戊酸激酶的缺乏被鑒定為下述人類遺傳疾病的生物化學(xué)和分子誘因，從而顯示出其重要性，所述疾病包括甲羥戊酸尿癥、超免疫球蛋白D癥以及周期性發(fā)熱綜合征(Houten et al.，2000；Nwokoro et al.，Mol.Genet.metab.74，105-119，2001)。上述疾病的病理尚屬未知，但最終將發(fā)現(xiàn)其與甲羥戊酸激酶在體內(nèi)的作用以及與急相反應(yīng)和發(fā)熱有關(guān)的類異戊二烯生物合成有關(guān)。甲羥戊酸激酶缺乏看上去還與(例如)Zellweger綜合征和肢近端型點(diǎn)狀軟骨發(fā)育不良(rhizomelic chondrodysplasia punctata)有關(guān)，這是過氧化物酶生物合成紊亂的疾病，其中，一組過氧化物酶，包括甲羥戊酸激酶，不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到過氧化物酶體中(Kelley and Herman，Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2，299-341，2001)。最后，甲羥戊酸激酶被認(rèn)為在細(xì)胞內(nèi)增殖、細(xì)胞周期調(diào)控和/或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用(見Graef et al.，virology 208，696-703，1995；Hinson et al.，J.Biol.Chem.272，26756-26760.1997)。
目前研究的所有甲羥戊酸激酶都會(huì)受所述途徑下游產(chǎn)物的反饋抑制。目前還沒有報(bào)道過對(duì)反饋抑制具有抗性的甲羥戊酸激酶，例如，法呢基二磷酸或雙牻牛基二磷酸造成的反饋抑制。對(duì)反饋具有抗性的甲羥戊酸激酶可能具有工業(yè)潛力，例如(1)在用生物技術(shù)對(duì)所有類型的類異戊二烯化合物(例如，類胡蘿卜素、輔酶Q10、維生素D、固醇等)進(jìn)行的生產(chǎn)中，(2)作為具有診斷用處的酶，用于，例如，用酶測(cè)量生物流體中的甲羥戊酸濃度，或(3)作為治療用酶，用于降低甲羥戊酸尿癥病患的甲羥戊酸濃度。對(duì)反饋具有抗性的MK特別適于對(duì)類異戊二烯進(jìn)行生物技術(shù)途徑的生產(chǎn)，因?yàn)樗鼈兡苁沟眉琢u戊酸途徑具有更大的通量，因此使得類異戊二烯產(chǎn)量更高。
本文中使用的術(shù)語“甲羥戊酸激酶”將表示任何能夠催化甲羥戊酸酯(甲羥戊酸)磷酸化反應(yīng)的酶，所述反應(yīng)包括甲羥戊酸酯(甲羥戊酸)向5-磷酸甲羥戊酸酯(5-磷酸甲羥戊酸)的轉(zhuǎn)化，或甲羥戊酸類似物(例如，Wilde and Eggerer，Eur.J.Biochem.221，463-473，1994所述的)向其相應(yīng)的磷酸化化合物的轉(zhuǎn)化。為提供對(duì)甲羥戊酸(或甲羥戊酸類似物)的磷酸化，該酶額外需要合適的磷酸供體。不同的化合物都可作為用于甲羥戊酸激酶的磷酸供體。最優(yōu)選的磷酸供體是ATP(5’-三磷酸腺苷)。其它優(yōu)選的磷酸供體是TTP、ITP、GTP、UTP或CTP(見Gibson et al.，Enzyme41，47-55，1989)?！凹琢u戊酸激酶”可以是與SEQ ID NO1至14所示的氨基酸序列中的一種或多種同源的?！巴吹摹敝概cSEQ ID NO1至14和30所示的氨基酸序列中的一種或多種至少約60％相同，優(yōu)選至少70％相同，更優(yōu)選至少約80％相同，進(jìn)一步更優(yōu)選至少約90％相同，最優(yōu)選至少約95％相同。
本領(lǐng)域已知的術(shù)語“％相同”表示多肽或多核苷酸序列間的相關(guān)程度，這可以是通過對(duì)上述序列排列起來達(dá)成的匹配程度進(jìn)行測(cè)定得到的。用已知的方法可對(duì)“相同性”很容易的進(jìn)行測(cè)定，例如用程序GAP(GCGWisconsin Package，version 10.2，Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，SanDiego，CA 92121-3752，USA)來進(jìn)行，其中使用如下參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分8，缺口延伸罰分2(缺省參數(shù))。
“野生型酶”或“野生型甲羥戊酸激酶”將表示與SEQ ID NO1-14和30中的任何一種同源的、并且可作為起點(diǎn)來設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明的對(duì)反饋具有(更多)抗性的突變體的任何甲羥戊酸激酶。實(shí)際上，該定義暗示，此種“野生型酶”或“野生型甲羥戊酸激酶”對(duì)甲羥戊酸途徑下游產(chǎn)物(例如FPP或GGPP)的生理上或工業(yè)上相關(guān)的濃度的抑制敏感。本發(fā)明上下文中，“野生型”不是將本發(fā)明的范圍限制為僅可從自然界獲得的甲羥戊酸激酶/甲羥戊酸激酶序列。在此明確聲明，如果通過本發(fā)明的任何教導(dǎo)，合成的甲羥戊酸激酶的變異體(只要它們與SEQ ID NO1至14和30中的任何一種同源)也可被加工為具有(更多)反饋抗性的，所述合成的甲羥戊酸激酶的變異體也被稱為“野生型”。術(shù)語“野生型甲羥戊酸激酶”和“未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶”在本文中可互換使用。
“突變體”、“突變體酶”或“突變體甲羥戊酸激酶”將表示下述變異體中的任何一種所述變異體是根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)從給定的野生型酶/甲羥戊酸激酶(根據(jù)上述定義)中獲得的，并且，較之分別相應(yīng)的野生型酶，具有(更多)對(duì)反饋的抗性。就本發(fā)明的范圍而言，怎樣獲得突變體是沒有影響的；上述突變體可以通過下述方法獲得，例如，通過定點(diǎn)誘變、飽和誘變、隨機(jī)誘變/直接進(jìn)化、對(duì)整個(gè)細(xì)胞或生物的化學(xué)或UV誘變等。這些突變體還可通過下述途徑來制備，例如，通過設(shè)計(jì)合成基因，和/或體外(無細(xì)胞)翻譯(見，例如，Jermutus et al.，Curr.Opin.Biotechnol.9，534-548，1998；Betton，Curr.Prot.Pept.Sci.4，73-80，2003；Martin et al.，Biotechniques 31，948-，2001)。為測(cè)定反饋抗性，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來制造突變體(例如，通過定點(diǎn)誘變惑通過設(shè)計(jì)合成基因)。
本專利申請(qǐng)文件上下文中的“類異戊二烯”將包括通過自然或非自然途徑(即，自然界中不發(fā)生，但可以通過生物技術(shù)方法來進(jìn)行)，優(yōu)選通過生物化學(xué)途徑，可從甲羥戊酸獲得的任何或全部代謝產(chǎn)物以及異戊烯基大分子。類異戊二烯包括但不限于細(xì)菌中的植烷三萜、泛醌和甲基萘醌，植物中的類胡蘿卜素、質(zhì)體醌、單/一個(gè)半/雙/三萜以及葉綠素的異戊二烯基側(cè)鏈，和血紅素A、醌、輔酶Q10、多萜醇、固醇/類固醇、維生素D、類維生素A等。
一般而言，本發(fā)明的目的是提供已被修飾過的甲羥戊酸激酶，該修飾使得其催化性質(zhì)較之未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶更為有用(即，對(duì)反饋抑制的敏感性更低)。
本發(fā)明涉及經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其展示出的對(duì)反饋抑制的敏感性較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶要低，其中(i)與相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列相比較，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列含有至少一處突變，并且(ii)所述至少一處突變發(fā)生于選自由如下氨基酸位置所構(gòu)成的組中的氨基酸位置中的一處或多處，所述氨基酸位置相應(yīng)于如SEQ ID NO1所示的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列上的17、47、93、94、132、167、169、204和266位。
本文中使用的“反饋抑制”表示，類異戊二烯生物合成中甲羥戊酸的下游代謝產(chǎn)物對(duì)甲羥戊酸激酶的酶活造成的抑制。類異戊二烯生物合成中甲羥戊酸的下游代謝產(chǎn)物包括但不限于5-磷酸甲羥戊酸、異戊烯二磷酸(IPP)、3，3-二甲基烯丙基二磷酸(DAMPP)、牻牛基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、雙牻?；姿?GGPP)、法呢醇、磷酸多萜醇和植基焦磷酸(Dorsey and Proter，J.Biol.chem.243，4667-4670，1968；Flint，Biochem.J.120，145-150，1970；Gray and Kekwick，BioChim.Biophys.Acta279，290-296，1972；Hinson et al.，J.Lipid Res.38，2216-2223，1997)。人們相信對(duì)甲羥戊酸激酶的反饋抑制基于對(duì)甲羥戊酸激酶進(jìn)行的變構(gòu)調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)通過該酶與類異戊二烯生物合成中甲羥戊酸下游的代謝產(chǎn)物的結(jié)合來進(jìn)行。
優(yōu)選地，所述反饋抑制由法呢基二磷酸(FPP)或雙牻牛基二磷酸(GGPP)造成。
根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶展示出較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶要低的對(duì)反饋抑制的敏感性。優(yōu)選地，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶對(duì)反饋抑制的敏感性，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶要低至少5％(關(guān)于對(duì)反饋抗性的測(cè)量和定量見下文)。
反饋抗性將表示，對(duì)“反饋抑制”(如上文定義)的抗性的任何增加?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的不同方法對(duì)反饋抗性進(jìn)行分析。在此對(duì)一種合適的方法進(jìn)行簡短描述用與實(shí)施例2中所述的活性試驗(yàn)類似的方法，測(cè)量甲羥戊酸激酶活性，其中在甲羥戊酸(或甲羥戊酸類似物)和ATP(或另外的磷酸供體)的非飽和濃度下進(jìn)行，即，甲羥戊酸(或甲羥戊酸類似物)和ATP(或另外的磷酸供體)的濃度大約是使得反應(yīng)速率對(duì)上述底物濃度的改變敏感的濃度，例如，在對(duì)上述底物進(jìn)行的研究中，濃度大約為酶的分別的Km值。在其它條件相同情況下，存在及不存在相應(yīng)濃度的反饋抑制劑(即，反饋抑制劑的濃度能提供對(duì)野生型甲羥戊酸激酶的顯著抑制)的情況下，對(duì)野生型甲羥戊酸激酶和該酶的變異體/突變體的活性進(jìn)行測(cè)量。如果反饋抑制劑造成的抑制的程度(例如，％抑制)在突變體中較之野生型的酶有所降低，那么該突變體在本專利申請(qǐng)文件的上下文中就是“對(duì)反饋抑制具有抗性的”。鑒定出“對(duì)反饋抑制具有抗性的”的變異體/突變體之后，再用與上文所述相同的方法來鑒定進(jìn)一步改善的突變體，即，就具有更多反饋抗性的突變體。按照如下方法來計(jì)算反饋抗性(％)如果a和b分別是不存在或存在反饋抑制劑(例如FPP)的情況下測(cè)得的野生型酶的甲羥戊酸激酶活性，如果c和d是分別是不存在或存在相同的反饋抑制劑的情況下測(cè)得的突變體酶的甲羥戊酸激酶活性，那么％反饋抗性就是％抗性＝100((d/c)-(b/a))/(1-(b/a))優(yōu)選地，反饋抗性進(jìn)行于本申請(qǐng)中實(shí)施例2中所述的實(shí)驗(yàn)條件下。大約3-30mU/ml(相應(yīng)于大約1-10μg/ml Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶)，優(yōu)選為大約10-20mU/ml的甲羥戊酸激酶活性，以及可選地，46μM FPP存在于試驗(yàn)混合物中，反應(yīng)在30℃下進(jìn)行。
較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶展示出的反饋抗性為至少5％，優(yōu)選為至少大約10％，更優(yōu)選為至少大約25％，進(jìn)一步更優(yōu)選為至少大約40％，進(jìn)一步更優(yōu)選為至少大約60％，最優(yōu)選為至少大約70％。
較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列含有至少一種突變。該突變可以是添加、缺失和/或取代。優(yōu)選地，該突變是氨基酸取代，其中，本發(fā)明的經(jīng)過修飾的氨基酸序列中，未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列中存在的給定氨基酸被另外的氨基酸所取代。較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列可以含有至少一處氨基酸取代。在其它實(shí)施方式中，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶含有至少兩處、至少三處、至少四處或至少五處氨基酸取代。在本發(fā)明的另外的實(shí)施方式中，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶含有一至十處、一至七處、一至五處、一至四處、二至十處、二至七處、二至五處、二至四處、三至十處、三至七處、三至五處或三至四處氨基酸取代。
一種或多種突變可以發(fā)生于選自由如下氨基酸位置所構(gòu)成的組的氨基酸位置中的一處或多處，所述氨基酸位置相應(yīng)于如SEQ ID NO1所示的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列上的17、47、93、94、132、167、169、204和266位。
優(yōu)選地，所述至少一處突變發(fā)生于選自由如下氨基酸位置所構(gòu)成的組氨基酸位置中的一處或多處，所述氨基酸位置相應(yīng)于如SEQ ID NO1所示的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列上的17、47、93、94、132、167和266位。在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述至少一處突變發(fā)生于選自由如下氨基酸位置所構(gòu)成的組氨基酸位置中的一處或多處，所述氨基酸位置相應(yīng)于如SEQ ID NO1所示的Paracoccuszeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列上的17、47、93、94、132、167和169位。
如果經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶，僅含有單個(gè)氨基酸的取代，那么優(yōu)選地，該單個(gè)氨基酸的取代發(fā)生于選自由相應(yīng)于SEQ ID NO1的17、47、93、94、204和266位氨基酸的位置所構(gòu)成的組中的位置。更優(yōu)選地，該取代是I17T、G47D、K93E、V94I、R204H或C266S。
在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，突變是對(duì)相應(yīng)于SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的第17位氨基酸的氨基酸位置產(chǎn)生影響的取代。存在于未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶中的氨基酸優(yōu)選是異亮氨酸。未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶序列中的氨基酸可被轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸或丙氨酸。最優(yōu)選地，對(duì)相應(yīng)于SEQ ID NO1所示的序列的第17位的氨基酸位置進(jìn)行的取代是蘇氨酸對(duì)異亮氨酸的取代。
如果較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶含有至少兩處突變，那么其中一處突變可發(fā)生于相應(yīng)于SEQ ID NO1的375位的氨基酸位置。如果較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶含有兩處突變，那么優(yōu)選地，氨基酸取代發(fā)生于相應(yīng)于SEQ ID NO1的132/375位、167/169位、17/47位或17/93位的組合。最優(yōu)選的是P132A/P375R、R167W/K169Q、I17T/G47D或I17T/K93E的組合。
如果較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶含有三處突變，優(yōu)選地，氨基酸取代發(fā)生于相應(yīng)于SEQ ID NO1的17/167/169位、17/132/375位、92/132/375位或17/47/93位組合的位置。最優(yōu)選的是I17T/R167W/K169Q、I17T/P132A/P375R、K93E/P132A/P375R、I17T/R167W/K169H、I17T/R167T/K169M、I17T/R167T/K169Y、I17T/R167F/K169Q、I17T/R167I/K169N、I17T/R167H/K169Y、I17T/G47D/K93E或I17T/G47D/K93Q的組合。
如果較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶含有四處突變，優(yōu)選地，氨基酸取代發(fā)生于相應(yīng)于SEQ ID NO1的17/47/93/132位組合的位置。最優(yōu)選的是I17T/G47D/K93E/P132A或I17T/G47D/K93E/P132S的組合。
最優(yōu)選的是表1、2、3或4(見下文)中公開的突變的組合。這些例子中指出的氨基酸位置可轉(zhuǎn)至不同來源的甲羥戊酸激酶中。
本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶可通過將突變引入到相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶中來獲得。未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶可以是任何展示出對(duì)反饋抑制的敏感性的甲羥戊酸激酶。未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶包括但不限于可從自然界獲得的甲羥戊酸激酶。未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶還包括與SEQ ID NO1至14和30中所示的氨基酸序列中的任何一種同源的甲羥戊酸激酶。
優(yōu)選的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶包括下述激酶，所述激酶具有選自由如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQID NO9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO12、SEQ IDNO13、SEQ ID NO14和SEQ ID NO30所示的氨基酸序列所構(gòu)成的組的序列。
未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶可以是真核的或原核來源的，優(yōu)選是真菌或細(xì)菌來源的，更優(yōu)選是Aspergillus或Saccharomyces或Paracoccus或Phaffia來源的，最優(yōu)選是Aspergillus niger或Saccharomyces cerevisiae或Paracoccus zeaxanthinifaciens或Phaffia rhodozyma來源的。在一種實(shí)施方式中，未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶是原核來源的，優(yōu)選是細(xì)菌來源的，更優(yōu)選是Paracoccus來源的，最優(yōu)選是Paracoccus zeaxanthinifaciens來源的。
優(yōu)選地，按照實(shí)施例2中所述的試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)量時(shí)(0或46μMFPP)，未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶受到的FPP造成的反饋抑制為至少10％，更優(yōu)選為至少20％，進(jìn)一步更優(yōu)選為至少30％，進(jìn)一步更優(yōu)選為至少40％，最優(yōu)選為至少50％。
本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶可以包含外源氨基酸，優(yōu)選是在其N-或C-末端處。“外源氨基酸”指在天然(自然界中存在的)甲羥戊酸激酶中不存在的氨基酸，優(yōu)選是天然甲羥戊酸激酶中不存在的至少大約3個(gè)、至少大約5個(gè)或至少大約7個(gè)相鄰氨基酸的片斷。優(yōu)選的外源氨基酸的片斷包括但不限于能促進(jìn)重組產(chǎn)生的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的純化的“標(biāo)簽”。此類標(biāo)簽的例子包括但不限于“His6”標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、myc標(biāo)簽等。
在另一種實(shí)施方式中，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶可以含有一處或多處，例如兩處缺失。優(yōu)選地，所述缺失影響相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的N-或C-末端的氨基酸，而不會(huì)顯著減少其功能特性，例如酶的比活性。
本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶通常是自然界不存在的甲羥戊酸激酶。優(yōu)選地，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的比活性為相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的比活性的至少10％，更優(yōu)選為至少20％，進(jìn)一步更優(yōu)選為至少35％，進(jìn)一步更優(yōu)選為至少50％，最優(yōu)選為至少75％。
本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶可以是經(jīng)過分離的多肽。本文中使用的術(shù)語“經(jīng)過分離的多肽”指充分去除了其它多肽的多肽。優(yōu)選地，經(jīng)過分離的多肽超過80％純，優(yōu)選超過90％純，更優(yōu)選超過95％純，最優(yōu)選超過99％純。純度可按照本領(lǐng)域已知的方法來測(cè)定，例如通過SDS-PAGE及隨后的蛋白質(zhì)染色來測(cè)定。然后可以通過密度測(cè)定對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行定量。其它用于測(cè)定純度的方法也在普通技術(shù)的水平范圍內(nèi)。
本發(fā)明還涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列編碼根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶。本文中使用的“多核苷酸”指多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未經(jīng)修飾的RNA或DNA或經(jīng)過修飾的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于單鏈或雙鏈DNA、作為單鏈或雙鏈區(qū)域混合物的DNA、單鏈或雙鏈RNA、作為單鏈或雙鏈區(qū)域混合物的RNA、包含DNA和RNA的雜交分子(其可以是單鏈的，或者更為典型地，是雙鏈的或單鏈或雙鏈區(qū)域的混合物)。術(shù)語“多核苷酸”包括包含一種或多種不常用堿基(例如次黃嘌呤核甙)或一種或多種經(jīng)過修飾的堿基(例如經(jīng)過三苯甲基化的堿基)的DNA或RNA。
本發(fā)明的多核苷酸可以通過對(duì)編碼未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的多核苷酸序列進(jìn)行修飾得到。此類編碼未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的多核苷酸序列的例子如SEQ ID NO16至29和31所示。將突變(例如添加、缺失和/或取代)引入到編碼未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的核苷酸序列中的方法包括但不限于定點(diǎn)誘變和基于PCR的方法。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法的原理如(例如)White et al.，TrendsGenet.5，185-189，1989所述，改進(jìn)方法在，例如Innis et al.[PCR ProtocolsA guide to Mehods and Applications，Academic Press，Inc.(1990)]中有所描述。
可從本領(lǐng)域已知的編碼甲羥戊酸激酶的基因組序列或cDNA序列開始，用體外誘變方法(見，例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)來構(gòu)建本發(fā)明的DNA序列序列信息見，例如，相關(guān)的序列數(shù)據(jù)庫，例如Genbank(Intelligenetics，California，USA)、European Bioinformatics Institute(Hinston Hall，Cambridge，GB)、NBRF(Georgetown University，Medical Centre，Washington DC，USA)和Vecbase(University of Wisconsin，BiotechnologyCentre，Madison，Wisconsin，USA)或附圖和序列表中公布的序列信息。廣泛用于此類“定點(diǎn)誘變”的策略最初由Hutchison和Edgell(J.Virol.8，181-189，1971)所提出，其包括將帶有目標(biāo)核苷酸取代的合成寡核苷酸退火到其中將被引入突變的單鏈DNA序列的目標(biāo)區(qū)域(參見Smith，Annu.Rev.Genet.19，423-462，1985中的綜述；改進(jìn)方法參見Stanssen et al.，Nucl.Acids Res.17，4441-4445，1989的第2-6篇參考文獻(xiàn))。本發(fā)明的應(yīng)用中另外一種優(yōu)選的對(duì)給定DNA進(jìn)行突變的可能方法是用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行的誘變?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法從不同的菌株/生物中分離出作為起始物質(zhì)的DNA，所述方法例如見Sambrook et al.(MolecularCloning)。但是，應(yīng)當(dāng)理解，將按照本發(fā)明來構(gòu)建/突變的編碼甲羥戊酸激酶的DNA也可以在已知DNA序列的基礎(chǔ)上來制備，例如，通過用本領(lǐng)域已知的方法來構(gòu)建合成基因(見例如EP 747 483和Lehmann et al.，Prot.Eng.13，49-57，2000所述)。
編碼根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的多核苷酸的非限制性的例子如SEQ ID NO32和33所示。
本發(fā)明的多核苷酸可以是經(jīng)過分離的多核苷酸。術(shù)語“經(jīng)過分離的多核苷酸”指與已充分除去了其它核酸的多核苷酸，其它核酸例如但不限于其它的染色體或染色體外DNA和RNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的傳統(tǒng)核酸純化方法可用于獲得經(jīng)過分離的多核苷酸。該術(shù)語還包括重組的多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的載體或質(zhì)粒。優(yōu)選地，該載體或質(zhì)粒包含至少一種標(biāo)記基因。該載體和質(zhì)粒還包含與本發(fā)明的多核苷酸可操作地連接的調(diào)控元件。本文中使用的術(shù)語“可操作地連接”指核酸序列與單條核酸片段相連，使得其中一種的功能受另一種影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能影響到編碼序列的表達(dá)的情況下，即編碼序列受啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制的情況下，該啟動(dòng)子就是與編碼序列可操作地連接的。編碼序列可與調(diào)控序列以正義或反義方向可操作地連接。術(shù)語“表達(dá)”指DNA序列向mRNA的轉(zhuǎn)錄和/或mRNA向氨基酸序列的翻譯。術(shù)語“過量表達(dá)”指經(jīng)過修飾的生物(例如，通過轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染修飾過的)中基因產(chǎn)物的產(chǎn)量高于相應(yīng)的未經(jīng)修飾的生物中的生產(chǎn)水平。
獲得本發(fā)明的DNA全序列后，可通過本領(lǐng)域已知的方法(例如Sambrook et al.(s.a.)所述)，將其整合到載體中，以在合適的宿主系統(tǒng)中(過量)表達(dá)被編碼的多肽。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，DNA序列自身也可被用于轉(zhuǎn)化本發(fā)明的合適的宿主系統(tǒng)，以獲得被編碼的多肽的(過量)表達(dá)。合適的宿主系統(tǒng)例如是真菌，例如Aspergilli，例如Aspergillusniger或Aspergillus oryzae，或者例如Trichoderma，例如Trichodermareesei，或者酵母，例如Saccharomyces，例如Saccharomyces cerevisiae或Pichia，例如Pichia pastoris，或Hansenula polymorpha，例如H.polymorpha(DSM 5215)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，上述微生物可從保藏機(jī)構(gòu)獲得，例如American Type Culture Collection(ATCC)、theCentraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)或the Deutsche Sammlung FürMikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)或列于“IndustrialProperty”(vol.1，pages 29-40，1991)刊物或European Patent Office官方刊物(vol.4，pages 155/156，2003)中的任何其它保藏機(jī)構(gòu)。可以使用的細(xì)菌例如是Paracoccus，例如Paracoccus zeaxanthinifaciens、E.coli，Bacilli，例如Bacillus subtilis，或Streptomyces，例如Streptomyces lividans(見，例如Annéand van Mellaert in FEMS Microbiol.Lett.114，121-128，1993)?？梢允褂玫腅.coli例如是，E.coli K12菌株，例如M15(如Villarejo et al.in J.Bacteriol.120，466-474，1974所述的DZ 291)、HB 101(ATCC No.33694)或E.coli SG13009(Gottesman et al.，J.Bacteriol.148，265-273.1981)。
可用于在真菌中進(jìn)行表達(dá)的載體是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，對(duì)其描述例如見EP 420 358，或者Cullen et al.(Bio/Technology 5，369-376，1087)，Ward(inMolecular Industrial Mycology，Systems and Applications for FilamentousFungi，Marcel Dekker，New York，1991)，Upshall et al.(Bio/Technology 5，1301-1304，1987)，Gwynne et al.(Bio/Technology 5，71-79，1987)或Punt et al.(J.Biotechnol.17，19-34，1991)，對(duì)酵母而言，見Sreekrishna et al.(J.BasicMicrobiol.28，265-278，1988；Biochemistry 28，4117-4125，1989)，Hitzemannet al.(Natuer 293，717-722，1981)或EP183070，EP183071，EP248227，EP263311。可用于在E.coli中表達(dá)的合適的載體由下述文獻(xiàn)提到過，Sambrook et al.[s.a]或Fiers et al.in Proc.8th Int.Biotechnol.Symp.[Soc.Franc.de Microbio.，Paris(Durand et al.，eds.)，pp.680-697，1988]，Bujard et al.(in Meth.Enzymol.，eds.Wu and Grossmann，Academic Press，Inc.，vol.155，416-433，1987)或Stüber et al.(in Immunological Methods，eds.lefkovits andPernis，Academic Press，In.，Vol.IV，121.152，1990)。可用于在Bacilli中表達(dá)的載體是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，其被描述于，例如EP207459或EP405370，Yansura和Henner在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，439-443(1984)或Henner，Le Grice和Nagarajan在Meth.Enzymol.185，199-228，1990中?？杀挥糜谠贖 polymorpha中表達(dá)的載體是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，其被描述于，例如Gellissen et al.，Biotechnology 9，291-295，1991中。
此類載體可以已經(jīng)帶有調(diào)控元件，例如啟動(dòng)子，或者，本發(fā)明的DNA序列可被改造為含有此類元件?？捎玫暮线m的啟動(dòng)子元件是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，例如是用于Trichoderma reesei的cbhl-(Haarki et al.，Biotechnology7，596-600，1989)或pkil-啟動(dòng)子(Schindler et al.，Gene 130，271-275，1993)，用于Aspergillus oryzae的amy-啟動(dòng)子Christensen et al.，Abstr.19th Lunteren lectuers on Molecular Genetics F23(1987)；Christensen et al.，Biotechnology 6，1419-1422，1988；Tada et al.，Mol.Gen.Genet.229，301-306，1991，用于Aspergillus niger的glaA-(Cullen et al.，Bio/Technology 5，369-376，1987；Gwynne et al.，Bio/Technology 5，713-719，1987；Ward在Molecular Industrial Mycology，Systems and Applications for FilamentousFungi，Marcel Dekker，New York，83-106，1991)、alcA-(Gwynne et al.，Bio/Technology 5，718-719，1987)、sucl-(Boddy et al.，Curr.Genet.24，60-66，1993)、aphA-(macRae et al.，Gene 71，339-348，1988；macRae et al.，Gene 132，193-198，1993)、tpiA-(McKnight et al.，Cell 46，143-147，1986；Upshall et al.，Bio/Technology 5，1301-1304，1987)、gpdA-(Punt et al.，Gene 69，49-57，1988；Punt et al.，J.Biotechnol.17，19-37，1991)和pkiA-啟動(dòng)子(de Graaff et al.，Curr.Genet.22，21-27，1992)?？捎糜谠诮湍钢斜磉_(dá)的合適的啟動(dòng)子元件是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，例如，用于在Saccharomycescerevisiae中表達(dá)的pho5-啟動(dòng)子(Vogel et al.，Mol.Cell.Biol.9，2050-2057，1989；Rudolf and Hinnen，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，1340-1344，1987)或gap-啟動(dòng)子，以及，例如，用于Pichia pastoris的aoxl-啟動(dòng)子(Koutz etal.，Yeast 5，167-177，1989；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.28，265-278，1988)，或用于H.polymorpha的FMD啟動(dòng)子(Hollenberg et al.，EPA No.0299108)或MOX啟動(dòng)子(Ledeboer et al.，Nucleic Acids Res.13，3063-3082，1985)。
用于細(xì)菌表達(dá)的合適的啟動(dòng)子和載體包括，例如Giacomini et al.所述的合成啟動(dòng)子(Gene 144，17-24，1994)。對(duì)于通過合適的質(zhì)?；蛲ㄟ^將編碼甲羥戊酸激酶的DNA序列整合到染色體DNA中，在細(xì)菌中表達(dá)所要求保護(hù)的(突變體)甲羥戊酸激酶的合適的教導(dǎo)在很多地方都能發(fā)現(xiàn)，例如，US patent No.6322995。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的載體或質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞的例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，例如鏈球菌、葡萄球菌、腸球菌、E.coli、Streptomyces、藻氰菌、Bacillus subtilis和Streptococcus pneumoniae的細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母Kluyveromyces、Saccharomyces、擔(dān)子菌、Candida albicans和Aspergillus的細(xì)胞；昆蟲細(xì)胞，例如Drosophila S2和Spodoptera Sf9的細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO、COS、Hela、3T3、BHK、293、CV-1；以及植物細(xì)胞，例如裸子植物或被子植物的細(xì)胞。
因此，包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，優(yōu)選地，用于在細(xì)菌、真菌、酵母或植物宿主中表達(dá)所述多核苷酸的載體，以及此類經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)菌或真菌、酵母或植物宿主也是本發(fā)明的目的。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)基中，允許經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶在宿主細(xì)胞中表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；以及(b)可選地，從培養(yǎng)基中分離出類異戊二烯化合物。
上述方法可被用于對(duì)任何類型的類異戊二烯化合物或類異戊二烯衍生化合物進(jìn)行生物技術(shù)方式的生產(chǎn)，所述化合物例如類胡蘿卜素，例如但不限于，八氫番茄紅素、番茄紅素、α-/β-/γ-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、金盞花黃質(zhì)、海膽酮、角黃素、蝦青素及其衍生物(Misawa & Shimada，J.Biotechnol.59，169-181，1998；Miura et al.，Appl.environ.Microbiol.64，1226-1229，1998；Hirschberg，Curr.Opin.Biotechnol.10，186-191，1999；Margalith，Appl.Microbiol.Biotechnol.51，431-438，1999；Schmidt-Dannert，Curr.Opin.Biotechnol.11，255-261，2000；Sandmann，Arch.Biochem.Biophys.385，4-12，2001；Lee & Schmidt-Dannert，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，1-11，2002)；醌，例如但不限于，泛醌(＝輔酶O)、甲基萘醌、質(zhì)體醌和蒽醌，優(yōu)選地，輔酶Q6、輔酶Q7、輔酶Q8、輔酶Q9、輔酶Q10或輔酶Q11，最優(yōu)選地為輔酶Q10(Clarke，Protoplasma 213，134-147，2000；Han et al.，Plant Cell Tissue Organ Culture 67，201-220，2001；Kawamukai，J.Biosci.Bioeng.94，511-517，2002)；橡膠和橡膠衍生物，優(yōu)選地，天然橡膠(＝順式1，4-聚異戊二烯；Mooibroek & Cornish，Appl.Microbiol.Biotechnol.53，355-365，2000)；固醇和固醇衍生物，例如但不限于，麥角固醇、膽固醇、氫化可的松(Ménard Szczebara et al.，NatureBiotechnol.21，143-149，2003)、維生素D、25-羥基-維生素D3、膳食植物固醇(Ling & Jones，Life Sci.57，195-206，1995)和天然表面活性劑(Holmberg，Curr.Opin.Colloid.Interface Sci.6，148-159，2001)；以及大量的其它類異戊二烯，例如但不限于單萜、一個(gè)半萜、雙萜和三萜，例如紫杉醇(Jennewein & Croteau，Appl.Microbiol.Biotechnol.57，13-19，2001)和赤霉素(Bruckner & Blechschmidt，Crit.Rev.Biotechnol.11，163-192，1991)。
合適的宿主細(xì)胞是所有類型的可用于遺傳修飾的生物，其例如但不限于，細(xì)菌、酵母、真菌、藻類、植物或動(dòng)物細(xì)胞。遺傳工程和代謝工程的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如Verpoorte et al.，Biotechnol.Lett.21，467-479，1999；Verpoorte et al.，Transgenic Res.9，323-343，2000；Barkovich &Liao，Metab.Eng.3，27-39，2001)。類似地，針對(duì)類異戊二烯和類異戊二烯衍生化合物和/或分子的(可能)合適的純化方法是精細(xì)化學(xué)生物合成和生產(chǎn)領(lǐng)域中已知的。
應(yīng)當(dāng)理解，用于對(duì)根據(jù)本發(fā)明的類異戊二烯和類異戊二烯衍生化合物和/或分子進(jìn)行生物技術(shù)生產(chǎn)的方法不僅限于上述的全細(xì)胞發(fā)酵方法，還可以使用透性化(permeabilized)宿主細(xì)胞、粗制的細(xì)胞提取物、通過(例如)離心或過濾從細(xì)胞殘余物中分離的細(xì)胞提取物，或者甚至是重構(gòu)反應(yīng)途徑，其中存在經(jīng)過分離的酶。上述方法的組合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在無細(xì)胞生物合成的情況下(例如重構(gòu)反應(yīng)途徑)，無論經(jīng)過分離的酶由宿主細(xì)胞制備或分離自宿主細(xì)胞，或體外轉(zhuǎn)錄/翻譯或通過其它方法來制備分離，都沒有影響。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的方法，所述方法包括(a)在允許本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，以及(b)從細(xì)胞或從培養(yǎng)基中回收經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶。
可從包含表達(dá)系統(tǒng)的經(jīng)過遺傳改造的宿主細(xì)胞來制備本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶。
為對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行重組生產(chǎn)，可對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，以包含進(jìn)本發(fā)明的多核苷酸或載體或質(zhì)粒?？捎煤芏喾N標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中所述的方法，來將多核苷酸或載體引入宿主細(xì)胞(例如Davis et al.，Basic Methodsin Molecular Biology(1986)和Sambrook et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，2nd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989))，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微注射、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、彈道(ballistic)引入和感染。
多種不同的表達(dá)系統(tǒng)可被用于生產(chǎn)本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶。此類載體包括前文所述的等。通常，任何適合于在宿主中維持、遺傳和表達(dá)多核苷酸和/或表達(dá)多肽的系統(tǒng)或載體可被用于本方面的表達(dá)。
在真核重組表達(dá)系統(tǒng)中，為將翻譯出的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、胞質(zhì)間間隙或細(xì)胞外環(huán)境，可將合適的分泌信號(hào)包括進(jìn)被表達(dá)的多肽。上述信號(hào)可以是與多肽是內(nèi)源的，或者它們可以是異源信號(hào)。
通過公知方法，可從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中對(duì)本發(fā)明的多肽進(jìn)行回收及純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸抽提、陰離子或陽離子交換色譜、磷酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、親和色譜以及羥基磷灰石色譜。在一種實(shí)施方式中，用高效液相色譜來進(jìn)行純化。當(dāng)多肽在分離和/或純化期間被變性的情況下，用于蛋白質(zhì)重新折疊的公知技術(shù)可被用于重新產(chǎn)生具有活性的構(gòu)象。蛋白質(zhì)純化的方法被描述于，例如Deutscher，Protein Purification，Academic Press，New York，1990和Scopes，ProteinPurification，Springer Verlag，heidelberg，1994中。
按照例如Pen et al.in Bio/Technology 11，811-814，1994或EP449375所述的方法，還可將本發(fā)明的甲羥戊酸激酶表達(dá)于植物中，優(yōu)選地，表達(dá)于種子中，如，例如EP449376所述。啟動(dòng)子和終止子的一些合適的例子包括來自胭脂氨酸合酶(nos)、章魚堿合酶(ocs)和煙草花葉病毒(CaMV)基因的那些。一種可以使用的有效的植物啟動(dòng)子是高水平植物啟動(dòng)子。與本發(fā)明的遺傳序列可操作地連接的此類啟動(dòng)子，應(yīng)當(dāng)能夠提高本發(fā)明基因產(chǎn)物的表達(dá)?？捎糜诒景l(fā)明的高水平的植物啟動(dòng)子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亞基(small subunit，ss)，例如來自大豆的(Berry-Lowe et al.，J.Mol.Appl.Genet.1，483-498，1982)，以及葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子。已知上述兩種啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中是輕度誘導(dǎo)型的(見，例如Genetic Engineering of Plants，an Agricultural Perspective，A.Cashmore，Plenum Press，NY(1983)，pages 29-38；Coruzzi et al.，J.Biol.Chem.258，1399-1402，1983；和Dunsmuir et al.，J.Mol.Appl.Genet.2，285-300，1983)。
當(dāng)需要對(duì)本發(fā)明的蛋白質(zhì)進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)時(shí)，可以使用一系列的培養(yǎng)方法。例如，對(duì)從重組微生物宿主中過量表達(dá)的特定基因產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)，可以通過分批或連續(xù)的培養(yǎng)方法來進(jìn)行。分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域內(nèi)常用并且公知的，在Thomas D.Brock in BiotechnologyATextbook of Industrial Microbiology，Second Edition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass.，or Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.36，227-234，1992中可以找到例子。對(duì)用于連續(xù)培養(yǎng)的方法的營養(yǎng)物和生長因素進(jìn)行調(diào)節(jié)的方法，以及用于使得產(chǎn)物形成速率最大化的技術(shù)是工業(yè)微生物學(xué)領(lǐng)域中公知的，前文所述的Brock對(duì)一系列方法都進(jìn)行了細(xì)節(jié)描述。
發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有合適的含碳底物。合適的底物可以包括但不限于，單糖，例如葡萄糖和果糖，寡糖，例如乳糖或蔗糖，多糖，例如淀粉或纖維素，或者它們的混合物，以及來自可更新給料的未經(jīng)純化的混合物。用于本發(fā)明的碳源可以包含多種不同的含碳底物，其將僅受對(duì)微生物的選擇的限制。
本發(fā)明還涉及制備對(duì)反饋抑制的敏感性降低的甲羥戊酸激酶的方法，所述方法包括如下步驟(a)提供一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼第一種甲羥戊酸激酶，該激酶展示出對(duì)反饋抑制的敏感性；(b)將一種或多種突變引入到所述多核苷酸序列中，使得經(jīng)過突變的多核苷酸序列編碼第二種甲羥戊酸激酶，較之第一種甲羥戊酸激酶，其含有至少一處氨基酸突變，其中，所述至少一處氨基酸突變發(fā)生于選自由如下氨基酸位置所構(gòu)成的組中的氨基酸位置中的一處或多處，所述氨基酸位置相應(yīng)于如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列上的17、47、93、94、132、167、169、204和266位；(c)可選地，將經(jīng)過突變的多核苷酸插入到載體或質(zhì)粒中；(d)將多核苷酸或載體或質(zhì)粒引入到合適的宿主細(xì)胞中；以及(e)在允許經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
該方法的優(yōu)選的實(shí)施方式與本文中描述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶、編碼它們的多核苷酸、載體和質(zhì)粒、宿主細(xì)胞以及方法的優(yōu)選實(shí)施方式相對(duì)應(yīng)。第一種和第二種甲羥戊酸激酶分別對(duì)應(yīng)于未經(jīng)修飾的和經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶(見上文)。
本發(fā)明的另一方面是本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶或本發(fā)明的多核苷酸在制備用于治療與甲羥戊酸激酶活性降低相關(guān)的疾病的藥物中的用途。此類疾病包括但不限于，甲羥戊酸尿癥、超免疫球蛋白D癥以及周期性發(fā)熱綜合征。將本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶作為治療用酶施用是優(yōu)選的。施用的模式包括口服、腸道外、腹膜內(nèi)和/或皮下施用。本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶或其鹽可被配制為藥物組合物(例如，小粒、酶晶體、藥片、藥丸、膠囊、注射劑、溶液等)，所述組合物包含單獨(dú)存在的此類酶中的至少一種，或者其與藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑的混合物。藥物組合物可按照傳統(tǒng)方法來配制。對(duì)于任何特定病人的特定劑量水平取決于一系列的因素，包括所用的特定化合物的活性、年齡、體重、健康狀況、性別、膳食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄速率、藥物組合以及治療所針對(duì)的特定疾病的嚴(yán)重程度。
本發(fā)明的多核苷酸可被用于基因治療方案。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是本發(fā)明的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶或本發(fā)明的多核苷酸在測(cè)定生物流體中甲羥戊酸濃度中的用途。生物流體的非限制性的例子是血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、淚液、汗液以及其它任何細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間和/或細(xì)胞外的流體。
本發(fā)明的一種目的是提供包含編碼上文所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的核酸序列的多核苷酸、包含此類多核苷酸的載體(優(yōu)選是表達(dá)載體)、經(jīng)過此類多核苷酸或載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、用于制備本發(fā)明甲羥戊酸激酶的方法(其中如前文所述的宿主細(xì)胞被培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)條件下，通過本領(lǐng)域已知的方法將甲羥戊酸激酶從此類宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離出來)以及用于對(duì)類異戊二烯進(jìn)行生物技術(shù)方式的生產(chǎn)的方法，所述方法基于宿主細(xì)胞來進(jìn)行，所述宿主細(xì)胞已經(jīng)過了此類多核苷酸或載體的轉(zhuǎn)化和/或已將此類多核苷酸穩(wěn)定整合進(jìn)其染色體中。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供(i)編碼甲羥戊酸激酶的DNA序列，所述激酶帶有本發(fā)明的特定突變中的至少一種，所述DNA序列能在標(biāo)準(zhǔn)條件下與本發(fā)明的經(jīng)過特定修飾的甲羥戊酸激酶的DNA序列中的任何一種雜交，或(ii)編碼甲羥戊酸激酶的DNA序列，所述激酶帶有本發(fā)明的特定突變中的至少一種，但是由于遺傳密碼子的簡并性，所述DNA序列在標(biāo)準(zhǔn)條件下不能與本發(fā)明的經(jīng)過特定修飾的甲羥戊酸激酶的DNA序列中的任何一種雜交，但其編碼的氨基酸序列與能與本發(fā)明的經(jīng)過特定修飾的甲羥戊酸激酶的DNA序列中的任何一種雜交的DNA序列所編碼的完全相同，或(iii)上述DNA序列的片段，所述片段保留有其來源多肽的活性特征。
用于雜交的“標(biāo)準(zhǔn)條件”在上下文中表示本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常用來檢測(cè)特異性雜交信號(hào)的條件，其被描述于，例如Sambrook et al.，“Molecular Cloning”，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press1989，New York中；或者優(yōu)選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的所謂嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件和非嚴(yán)謹(jǐn)清洗條件，或更優(yōu)選地，嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件和嚴(yán)謹(jǐn)清洗條件，其被描述于Sambrook et al.(s.a.)中。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個(gè)特別的例子是在包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5x Denhardt′s溶液、10％葡聚糖硫酸和20μg/ml變性剪切鮭魚精DNA的溶液中于42℃培養(yǎng)過夜(例如15小時(shí))，接著是在0.1x SSC中于大約65℃對(duì)雜交支持物進(jìn)行清洗。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供可從所謂的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法(PCR)獲得的DNA序列，其中，PCR引物是基于本發(fā)明特別描述的DNA序列來設(shè)計(jì)的。應(yīng)當(dāng)理解，所獲得的DNA序列編碼的甲羥戊酸激酶與作為引物設(shè)計(jì)基礎(chǔ)的、顯示出可相比較的活性特征的激酶具有至少相同的突變。
本文中描述的本發(fā)明的多種實(shí)施方式可以交叉組合使用。


圖1用程序ClustalW對(duì)來自小鼠、大鼠、人、酵母、Arabidopsisthaliana(ARATH)、Schizosaccharomyces pombe(SCHPO)、Pyrococcusabyssi(PYRAB)、Pyrococcus horikoshii(PYRHO)、Pyrococcus furiosus(PYRFU)、Methanobacterium thermoautotrophicum(METTH)、Archaeoglobus fulgidus(ARCFU)、Methanococcus jannaschii(METJA)、Aeropyrum pernix(AERPE)和Paracoccus zeaxanthinifaciens(PARACOCCUS)的甲羥戊酸激酶序列進(jìn)行計(jì)算，得到的多條序列比對(duì)圖。編號(hào)遵從Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列。
圖2將K93E甲羥戊酸激酶突變引入到基于pBBR-K的質(zhì)粒的甲羥戊酸操縱子中，細(xì)節(jié)見文字部分。
下述非限制性的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例1 多條序列的比對(duì)例如，使用程序“PILEUP”(GCG Wisconsin Package，version 10.2，Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752，USA)，可對(duì)不同甲羥戊酸激酶的多條氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算比對(duì)(見圖1)，其中使用下述參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分12，缺口延伸罰分4，以及blosum62.cmp矩陣(缺省參數(shù))；或者用程序ClustalW(Version 1.7，EMBL，Heidelberg，Germany)來進(jìn)行，其中使用BLOSUM交換矩陣。此類序列比對(duì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)操作(例如，Cho et al.，J.Biol.Chem.276，12573-12578，2001)。
本發(fā)明的上下文中，同源甲羥戊酸激酶可展示出與圖1所示的任何甲羥戊酸激酶之間的序列相似性。圖1給出了對(duì)來自下述物種的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列進(jìn)行的多條序列比對(duì)的例子，所述物種是小鼠、大鼠、人、酵母、Arabidopsis thaliana(ARATH)、Schizosaccharomyces pombe(SCHPO)、酵母(YEAST)、Pyrococcus abyssi(PYRAB)、Pyrococcus horikoshii(PYRHO)、Pyrococcus furiosus(PYRFU)、Methanobacterium thermoautotrophicum(METTH)、Archaeoglobusfulgidus(ARCFU)、Methanococcus jannaschii(METJA)、Aeropyrumpernix(AERPE)和Paracoccus zeaxanthinifaciens(PARACOCCUS)，后者的序列還被用作對(duì)其它序列(例如前面命名的那些)的位置進(jìn)行氨基酸編號(hào)的參照物。此外，具有E6V突變的經(jīng)過修飾的大鼠甲羥戊酸激酶表示了這樣一種大鼠甲羥戊酸激酶，其中，在按照上文定義的編號(hào)方法得到的第6位(其實(shí)際上是大鼠甲羥戊酸激酶氨基酸序列的第4位)上，天然存在的Glu(“E”是其標(biāo)準(zhǔn)IUPAC單字母氨基酸編碼)被Val(“V”)所取代。本發(fā)明的所有突變體/變異體都是按照這種方法來命名的。
實(shí)施例2 對(duì)甲羥戊酸激酶活性以及反饋抑制劑造成的抑制的測(cè)量用于測(cè)量甲羥戊酸激酶活性的酶試驗(yàn)被描述于，例如Popják(Meth.Enzymol.15，393-，1969)，Gibson et al.(Enzyme 41，47-55，1989)，Hinson et al.(J.Lipid Res.38，2216-2223，1997)，Schulte et al.(Anal.Biochem.269，245-254，1999)或Cho et al.(J.Biol.Chem.276，12573-12578，2001)中。為制備作為底物的甲羥戊酸，將130mg DL-甲羥戊酸內(nèi)酯(FLUKA Chemie AG，Buchs，Switzerland)溶于5.5ml的0.2M KOH中，并在50℃培養(yǎng)15分鐘。然后在室溫(RT)下通過加入0.1M HCl將溶液的pH調(diào)為7.0。除非另有指明(見實(shí)施例3)，試驗(yàn)混合物由100mM K2HPO4/KH2PO4(pH7.0)、1mM ATP、2mM MgCl2、1mM甲羥戊酸、0.5mM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、0.32mM NADH、20U/ml丙酮酸激酶和27U/ml乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)構(gòu)成。在試驗(yàn)混合物中用作抑制劑的FPP、GGPP、IPP、DMAPP和GPP(濃度為0-100μM之間)全部購自Sigma。加入純化的(His6-標(biāo)記過的)甲羥戊酸激酶后，酶反應(yīng)由NADH的消耗所反映，然后在340nm處進(jìn)行光度測(cè)量。一個(gè)單位(1U)的甲羥戊酸激酶活性每分鐘能催化1μmol甲羥戊酸的磷酸化。
實(shí)施例3 對(duì)酶試驗(yàn)的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)最佳的試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)滿足很多要求，例如與酶濃度成線性并與時(shí)間成線性。此外，在本發(fā)明的上下文中，該試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)能夠?qū)Ψ答佉种苿┰斐傻膶?duì)甲羥戊酸激酶的抑制進(jìn)行定量。在本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中，使用下述實(shí)驗(yàn)條件100mM KH2PO4(pH 7.0)、0.125-4mM ATP、1.125-5mM MgCl2(總是比ATP多1mM)、0.25-3mM甲羥戊酸、0或46μM FPP、0.16mM NADH、0.5mM PEP、20U/ml丙酮酸激酶、27U/ml乳酸脫氫酶，30℃。使用不同的量的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶，所述激酶是經(jīng)過純化和His6-標(biāo)記的。
本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)顯示，甲羥戊酸激酶活性試驗(yàn)實(shí)際上與時(shí)間和酶(甲羥戊酸激酶)濃度成線性，在用于Paracoccus zeaxanthinifaciens的給定條件下，MgATP和甲羥戊酸濃度每種都為1mM，可能對(duì)于對(duì)FPP造成的反饋抑制進(jìn)行可信的測(cè)量來說是最佳的。
實(shí)施例4 對(duì)Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶進(jìn)行誘變以獲得具有反饋抗性的突變體通過PCR擴(kuò)增出來自Paracoccus zeaxanthinifaciens R114的甲羥戊酸激酶的cDNA，其中使用的一種引物編碼伴隨6xHis序列的EcoRI限制性位點(diǎn)以及甲羥戊酸激酶5’-末端序列的一小部分，不含ATG起始密碼子，使用的另一種引物含有甲羥戊酸激酶的3’-末端序列，其中包括終止密碼子和BamHI限制性位點(diǎn)。通過瓊脂糖凝膠電泳純化之后，用EcoRI和BamHI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，將其接連到用同樣的酶消化過的pQE-80L(Qiagen，Hilden，Germany)中。pQE-80L含有受lac操縱子元件調(diào)控的T5啟動(dòng)子，其會(huì)受到也由pQE-80L編碼的lac遏制子的順式抑制。然后按照廠商說明書，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)的E.coliDH5α中。在E.coli的指數(shù)生長期間，OD600nm為0.6時(shí)加入100μMIPTG，在250rpm振蕩下，于30℃對(duì)His6標(biāo)記過的甲羥戊酸激酶進(jìn)行4小時(shí)的誘導(dǎo)。用QIAexpress系統(tǒng)/Qiagen的試劑，通過Ni-NTA色譜，對(duì)His6標(biāo)記過的甲羥戊酸激酶和His6標(biāo)記過的甲羥戊酸激酶突變體進(jìn)行純化。
通過所謂的“兩步PCR”對(duì)His6標(biāo)記過的甲羥戊酸激酶進(jìn)行誘變，其中使用Stratagene(La Jolla，CA，USA)的Turbo-Pfu DNA聚合酶。第一次PCR用含有被突變的密碼子的引物(引物M)和引物pQE-5’來進(jìn)行，后者與pQE-80L的多克隆位點(diǎn)(MCS)5’-末端的一小段序列相對(duì)應(yīng)。模板是pQE-80L-His-Mvk。通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，將其用作為第二次PCR反應(yīng)的引物，第二次反應(yīng)中還含有引物pQE-3’，其包含MCS 3’-末端的一小段序列，野生型pQE-80L-His-Mvk被用作為模板。通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用EcoRI和BamHI進(jìn)行消化，用其將His-Mvk亞克隆進(jìn)pQE-80L。最后，通過瓊脂糖凝膠電泳對(duì)經(jīng)過消化的片段進(jìn)行純化，并將其連接到用同樣的限制性酶線性化過的pQE-80L上。
實(shí)施例5 Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶突變體的反饋抗性按照實(shí)施例2所述來制備甲羥戊酸。試驗(yàn)混合物由100mMK2HPO4/KH2PO4(pH 7.0)、1mM ATP、1mM甲羥戊酸、2mM MgCl2、0.5mM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、0.32mM NADH、20U/ml丙酮酸激酶和27U/ml乳酸脫氫酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)構(gòu)成。在試驗(yàn)混合物中用作為抑制劑的FPP、GGPP、IPP、DMAPP和GPP全部購自Sigma。將92μM的FPP或17.6μM的GGPP用于對(duì)甲羥戊酸激酶突變體進(jìn)行的抑制試驗(yàn)。為對(duì)FPP、GGPP、IPP、DMAPP和GPP造成的抑制進(jìn)行比較，加入138μM的上述中間產(chǎn)物(實(shí)施例9)。加入經(jīng)過純化的(His6-標(biāo)記過的)甲羥戊酸激酶后，酶反應(yīng)由NADH的消耗所反映，然后在340nm處進(jìn)行光度測(cè)量。
按照如下方法來計(jì)算反饋抗性(％)如果a和b分別是不存在或存在反饋抑制劑(本情況下，F(xiàn)PP)的情況下測(cè)得的野生型酶的甲羥戊酸激酶活性，如果c和d是分別是不存在或存在相同的反饋抑制劑的情況下測(cè)得的突變體酶的甲羥戊酸激酶活性，那么％反饋抗性就是％抗性＝100((d/c)-(b/a))/(1-(b/a))表1.對(duì)Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的誘變對(duì)該酶的比活性以及反饋抗性的影響
WT表示具有SEQ ID No15(具有His6-標(biāo)記)的甲羥戊酸激酶。
令人吃驚地，上述突變對(duì)甲羥戊酸激酶的反饋抑制具有影響?，F(xiàn)有技術(shù)中，已有研究者提出，人甲羥戊酸激酶第133至156位殘基的保守疏水片斷是類異戊二烯結(jié)合的優(yōu)良候選位點(diǎn)(Riou et al.，Gene 148，293-297，1994；Houten et al.，Biochim，Biophys.Acta 1529，19-32，2000)。但是，上述突變中的任何一種都不定位于Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的相應(yīng)片斷處(殘基137-160)。
有相當(dāng)數(shù)量的突變被認(rèn)為會(huì)降低或者甚至破壞掉甲羥戊酸激酶的活性，因此導(dǎo)致人類疾病甲羥戊酸尿癥、超免疫球蛋白D癥以及周期性發(fā)熱綜合征(例如，K13X、H20P、H20N、L39P、W62X、S135L、A148T、Y149X、S150L、P165L、P167L、G202R、T209A、R215Q、T243I、L264F、L265P、I268T、S272F、R277C、N301T、G309S、V310M、G326R、A334T、V377I和R388X，全部都在人類甲羥戊酸激酶中，Houten et al.，Eur.J.Hum.Genet.9，253-259，2001；Cuisset et al.，Eur.J.Hum.Genet.9，260-266，2001)。其中，僅有兩種(即P165L和R215Q)發(fā)生于氨基酸序列比對(duì)中相應(yīng)于顯示出反饋抗性有影響的Paracoccuszeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶殘基(即，分別為殘基169和204)位置的殘基。但是，以前描述的人類甲羥戊酸激酶中的突變并未顯示出對(duì)反饋抗性具有影響，但是暗示會(huì)對(duì)酶的(比)活性造成負(fù)面影響。
實(shí)施例6 在前文中被鑒定為對(duì)酶的反饋抑制抗性有影響的氨基酸殘基/位置，對(duì)Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶講行飽和誘變按照上文所述用于誘變的方法來進(jìn)行飽和誘變，不同之處在于合成的誘變引物中，要經(jīng)歷飽和誘變的密碼子由隨機(jī)化序列構(gòu)成。
表2.對(duì)Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶突變體I17T的第167和169位殘基進(jìn)行的飽和誘變，以及對(duì)酶的比活性和反饋抗性的影響。
WT表示具有SEQ ID No15(具有His6-標(biāo)記)的甲羥戊酸激酶。
表3.對(duì)Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶突變體I17T、G47D的第93位殘基進(jìn)行的飽和誘變
表4.對(duì)Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶突變體I17T、G47D、K93E的第132位殘基進(jìn)行的飽和誘變
實(shí)施例7 用對(duì)反饋抑制具有抗性的甲羥戊酸激酶，增加對(duì)類異戊二烯化合物輔酶Q10的生產(chǎn)為檢驗(yàn)突變對(duì)甲羥戊酸激酶反饋抑制進(jìn)行影響的體內(nèi)效果，將Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶突變體K93E引入到功能性的甲羥戊酸操縱子中，所述操縱子已被克隆到能在Paracoccuszeaxanthinifaciens中進(jìn)行復(fù)制的廣宿主范圍載體上。對(duì)P.zeaxanthinifaciens的兩種重組菌株(區(qū)別僅在于有或沒有K93E突變)生產(chǎn)類異戊二烯化合物輔酶Q10的情況直接進(jìn)行比較。
質(zhì)粒構(gòu)建圖2中以圖的形式對(duì)質(zhì)粒構(gòu)建進(jìn)行了闡述。克隆的細(xì)節(jié)如下所示。在LB培養(yǎng)基(Becton Dickinson，Sparks，MD，USA)中，于37℃對(duì)E.coli菌株進(jìn)行培養(yǎng)。為在重組的E.coli菌株中維持質(zhì)粒，向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素(100μg/ml)和/或卡納霉素(25-50μg/ml，取決于實(shí)驗(yàn))。對(duì)固體培養(yǎng)基而言，還要加入瓊脂(1.5％的終濃度)。在200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上對(duì)液體培養(yǎng)物進(jìn)行培養(yǎng)。
質(zhì)粒pBBR-K-mev-op-wt(圖2)含有甲羥戊酸操縱子，其中包括插入到質(zhì)粒pBBRlMCS-2的SacI和NsiI位點(diǎn)之間的來自P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588的其啟動(dòng)子區(qū)域(Kovach et al.，Gene 166，175-176，1995)。被克隆的甲羥戊酸操縱子對(duì)應(yīng)于GenBank/EMBL編號(hào)為AJ431696的序列的第2469至9001位核苷酸的序列。在SacI位點(diǎn)和甲羥戊酸操縱子序列之間有一段短的連接序列，其來自質(zhì)粒pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，對(duì)應(yīng)于從SacI位點(diǎn)到PCR片段插入位點(diǎn)之間的序列。應(yīng)當(dāng)注意到，編號(hào)為AJ431696的序列是來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114(ATCC PTA-3335)的，而非來自P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588。P zeaxanthinifaciens菌株ATCC21588和R114的甲羥戊酸操縱子序列的唯一區(qū)別在于來自菌株R114的mvk基因中的突變。該突變導(dǎo)致甲羥戊酸激酶的第265位氨基酸從丙氨酸變?yōu)槔i氨酸(A265V)。因?yàn)閜BBR-K-mev-op-wt中的甲羥戊酸操縱子來自ATCC 21588，其不含突變，因此mvk中的密碼子265是GCC(而非編號(hào)為AJ431696的序列的GTC)。
還構(gòu)建了一種與pBBR-K-mev-op-wt類似但具有來自菌株R114的mvk基因的質(zhì)粒，其被命名為pBBR-K-mev-op-R114。將處于pBBR-K-mev-op-R114的Ecl136 II和SpeI位點(diǎn)之間的crtE啟動(dòng)子區(qū)域控制之下的、來自P.zeaxanthinifaciens菌株ATCC 21588的ddsA基因引入，得到pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt(圖2)。
最后一步是制造與pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt相同但含有mvk基因上的K93E突變的質(zhì)粒。通過將3166bp的XmaI-SpeI片段亞克隆到經(jīng)過XmaI-SpeI切割的載體pBluescript II KS+(Stratagene，La Jolla，CA，USA)中，構(gòu)建出質(zhì)粒pBlu2SP-mvk-mvd(圖2)。質(zhì)粒pBlu2SP-mvk-mvd具有方便的單限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XmaI和AscI，用于將經(jīng)過突變的mvk基因引入到甲羥戊酸操縱子的3’-末端。用XmaI和AscI去切割質(zhì)粒pQE-80L-mvk-K93E，并將帶有mvk中的大部分(包括K93E突變)的l kb片段與XmaI-AscI切割過的pBlu2SP-mvk-mvd主鏈相連，得到pBlu2KSp-mvk-K93E-mvd。為重構(gòu)在mvk上帶有K93E突變的全長甲羥戊酸操縱子，用XmaI和SpeI對(duì)pBlu2KSp-mvk-K93E-mvd進(jìn)行切割，并將3166bp的片段與來自pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt的8.18kb的XmaI-SpeI片段連接起來，得到pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsAwt。該質(zhì)粒中mvk基因的第265位密碼子是GTC，因?yàn)閜QE-80L-mvk-K93E的mvk基因來自P.zeaxanthinifaciens菌株R114(ATCC PTA-3335)。
概括起來，質(zhì)粒pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt和pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsAwt是相同的，只除了在后一個(gè)質(zhì)粒中存在有K93E突變。
構(gòu)建重組的P.zeaxanthinifaciens菌株P(guān).zeaxanthinifaciens菌株被培養(yǎng)于28℃。用于P.zeaxanthinifaciens菌株的培養(yǎng)基組分如下所示。除非另有指明，生長于瓶中的P.zeaxanthinifaciens菌株的全部液體培養(yǎng)物都被震蕩培養(yǎng)于200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上。對(duì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂(2％的終濃度)。通過高壓滅菌對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，在滅菌之后加入葡萄糖(作為濃縮貯液)，以獲得理想的終濃度。F-培養(yǎng)基含有(每升蒸餾水)蛋白胨，10g；酵母提取物，10g；NaCl，30g；D-葡萄糖·H2O，10g；MgSO4·7H2O，5g。在通過過濾或高壓滅菌進(jìn)行滅菌之前，將pH調(diào)至7.0。培養(yǎng)基362F/2含有(每升蒸餾水)D-葡萄糖·H2O，33g；酵母提取物，10g；蛋白胨，10g；NaCl，5g；MgSO4·7H2O，2.5g。在通過過濾或高壓滅菌進(jìn)行滅菌之前，將pH調(diào)至7.4。滅菌之后，加入微量元素溶液、NKP溶液和CaFe溶液，每種均為2.5ml。通過過濾對(duì)后三種溶液進(jìn)行滅菌。微量元素溶液含有(每升蒸餾水)(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，80g；ZnSO4·7H2O，6g；MnSO4·H2O，2g；NiSO4·6H2O，0.2g；EDTA，6g。NKP溶液含有(每升蒸餾水)K2HPO4，250g；(NH4)2PO4，300g。CaFe溶液含有(每升蒸餾水)CaCl2·2H2O，75g；FeCl3·6H2O，5g；濃縮的HCl，3.75ml。
按照如下方法來制備P.zeaxanthinifaciens菌株R114的電感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行電穿孔用1.5ml P.zeaxanthinifaciens菌株R114的穩(wěn)定狀態(tài)培養(yǎng)物對(duì)100ml F培養(yǎng)基進(jìn)行接種，在28℃，200rpm下培養(yǎng)，直到660nm下的光密度達(dá)到大約0.5。通過在4℃、7000xg下離心15分鐘來收獲細(xì)胞，在pH為7的100ml冰冷的HEPES緩沖液中洗兩次。最終的沉淀被重新懸浮于0.1ml冰冷的HEPES緩沖液(pH 7)中，細(xì)胞被立即用于電穿孔或者加入終濃度為15％的甘油，以50μl為一份，將細(xì)胞貯藏于-80℃。向去除了鹽的溶液中加入1至5/μl的質(zhì)粒DNA，在冰冷的1mm小管中，18kV/cm和129Ohms下進(jìn)行電傳孔。典型地，脈沖長度在4至5毫秒之間。加入1ml的F培養(yǎng)基，在28℃對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1小時(shí)的培養(yǎng)。將稀釋液涂布到含有25-50μg/ml卡納霉素的F-瓊脂平板上，在28℃進(jìn)行培養(yǎng)。通過PCR分析，證實(shí)可能的轉(zhuǎn)化子含有想要的質(zhì)粒。
用于評(píng)價(jià)輔酶Q10牛產(chǎn)情況的培養(yǎng)條件在對(duì)P.zeaxanthinifaciens菌株R114/pBBR-K-mev-op-R114-PcrtE-ddsAwt和R114/pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsAwt進(jìn)行的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中來檢測(cè)輔酶Q10的生產(chǎn)情況。所有培養(yǎng)物最初都來自冷凍的細(xì)胞懸浮液(作為25％甘油貯液貯藏于-80℃)。在每瓶含有200ml 362F/2培養(yǎng)基的2升帶擋板搖瓶中來制備用于補(bǔ)料分批發(fā)酵的預(yù)培養(yǎng)物，2瓶。對(duì)每只搖瓶，用2毫升解凍的細(xì)胞懸浮液作為接種體。預(yù)培養(yǎng)物的起始pH為7.2。在250rpm震蕩下，于28℃對(duì)預(yù)培養(yǎng)物進(jìn)行28小時(shí)的培養(yǎng)，這段時(shí)間后，660nm處的光密度(OD660)在14至22個(gè)吸收單位之間，具體取決于所用的菌株。主培養(yǎng)物被培養(yǎng)于Biostat ED生物反應(yīng)器(B.BraunBiotech International，Melsungen，Germany)中，其中含有具有如下組分的培養(yǎng)基(每升蒸餾水)D-葡萄糖·H2O，25g；酵母提取物(Tastone900)，17g；NaCl，4.0g；MgSO4·7H2O，6.25g；(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O，0.5g；ZnSO4·7H2O，0.038g；MnSO4·H2O，0.013g；NiSO4·6H2O，0.001g；CaCl2·2H2O，0.47g；FeCl3·6H2O，0.062g；煙酸，0.01g；NH4Cl，0.5g；消泡劑，0.1ml；KP溶液，3.5ml。KP溶液的組分為(每升蒸餾水)K2HPO4，250g；NaH2PO4·2H2O，200g；(NH4)2HPO4，100g。向用于攜帶有質(zhì)粒的菌株的培養(yǎng)基中加入卡納霉素(終濃度為50mg/l)。用于所有方法中的補(bǔ)料溶液具有如下組分(每升蒸餾水)D-葡萄糖·H2O，550g；KP溶液，18.25ml。生物反應(yīng)器中的初始體積(接種之后)為8.0L。按照需要，用滅菌水對(duì)預(yù)培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋，使得向生物反應(yīng)器中加入400ml能獲得0.5的初始OD660值。發(fā)酵條件被自動(dòng)控制為如下條件28℃，pH 7.2(通過加入28％的NH4OH來控制pH)，溶解氧被控制為最小40％的相對(duì)值(與攪拌級(jí)聯(lián))，攪拌的最小值為300rpm，通氣速率為1v.vm(相對(duì)于終體積而言)。不添加補(bǔ)料溶液的情況下，在上述條件下進(jìn)行20小時(shí)的培養(yǎng)(分批階段)。此段時(shí)間后，攪拌速度降低，基礎(chǔ)消耗終止，pH驟然升高，CO2的產(chǎn)生下降，這是最初的葡萄糖被耗盡的標(biāo)志，開始進(jìn)行補(bǔ)料。標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料方式被定義為如下部分(叢補(bǔ)料起始點(diǎn)開始)17小時(shí)內(nèi)，從50g/h斜線上升至80g/h，在80g/h保持7小時(shí)，然后在11小時(shí)內(nèi)斜線下降至55g/h，在發(fā)酵的剩余時(shí)間內(nèi)保持在55g/h(總發(fā)酵時(shí)間＝70小時(shí))。主培養(yǎng)物的終體積為大約10升。
分析方法試劑。乙腈、二甲基亞砜(DMSO)、四氫呋喃(THF)、四丁基甲醚(TBME)和丁基化羥基甲苯(BHT)是分析純或HPLC級(jí)的，其都獲得自Fluka(瑞士)。輔酶Q10購自Fluka。甲醇(Lichrosolv)購自Merck，Darmstadt，德國。類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)物從Chemistry ResearchDepartment，Roche Vitamins Ltd.，Switzerland獲得。
樣品制備和抽提。將全培養(yǎng)液中的400微升轉(zhuǎn)移到一次性的15ml聚丙烯離心管中。加入4毫升經(jīng)穩(wěn)定的抽提溶液(0.5g/l BHT，處于1∶1(v/v)DMSO/THF)中，在實(shí)驗(yàn)室搖床(IKA，德國)中，對(duì)樣品進(jìn)行20分鐘的混合，以促進(jìn)抽提。最后，對(duì)樣品進(jìn)行離心，將上清液轉(zhuǎn)移到琥珀色玻璃管中，以進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析。
HPLC。開發(fā)了一種反向HPLC方法，用于對(duì)泛醌及其相應(yīng)對(duì)苯二酚同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。該方法能將類胡蘿卜素玉米黃質(zhì)、八氫番茄紅素、β-隱黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和番茄紅素與輔酶Q10清楚地分開。用裝備有溫控自動(dòng)上樣儀和二極管陣列檢測(cè)器的Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)來進(jìn)行色譜分析。該方法的參數(shù)如下所示柱YMC類胡蘿卜素C30柱3微米，鋼，150mm長×3.0mm ID(YMC，Part No.CT99S031503QT)保護(hù)柱Security Guard CI8(ODS，十八烷)4mm長×3.0mm I.D.
(Phenomenex，Part No.AJO-4287)典型柱壓 開始時(shí)60bar流速 0.5ml/min移動(dòng)相乙腈(A)∶甲醇(B)∶TBME(C)的混合物
時(shí)間(post time) 4分鐘注射體積10μl柱溫15℃
檢測(cè)按照表5將三種波長用于檢測(cè)特定的化合物表5.HPLC保留時(shí)間和所用的波長
計(jì)算、選擇性、線性、檢測(cè)極限和可重現(xiàn)性。計(jì)算是基于峰的面積來進(jìn)行的。通過向其中注射相關(guān)參照化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)該方法的選擇性進(jìn)行了驗(yàn)證。目標(biāo)化合物(輔酶Q10和泛醌10)完全分開，沒有顯示任何的干擾。對(duì)輔酶Q10在抽提溶液中的一系列稀釋物(見上文)進(jìn)行制備和分析。線性范圍被發(fā)現(xiàn)為5mg/l至50mg/l。相關(guān)系數(shù)為0.9999。用該HPLC方法檢測(cè)輔酶Q10的極限被測(cè)定為4mg/l。對(duì)該方法(包括抽提步驟)的可重現(xiàn)性進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)十份單獨(dú)的樣品制劑進(jìn)行比較。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差被測(cè)定為4％。
關(guān)于輔酶Q10生產(chǎn)情況的結(jié)果在上述補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件下，P.zeaxanthinifaciens菌株R114/pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsAwt生產(chǎn)的輔酶Q10的終濃度比針對(duì)菌株R114/pBBR-K-mev-opR114-PcrtE-ddsAwt觀察到的要高34％。該差異并不能簡單歸結(jié)于兩種菌株的生長差異，菌株R114/pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsAwt較之菌株R114/pBBR-K-mev-opR114-PcrtE-ddsAwt，還顯示出了要高12％的輔酶Q10比產(chǎn)量(單位輔酶Q10/克細(xì)胞干重/小時(shí))。此外，菌株R114/pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsAwt較之菌株R114/pBBR-K-mev-opR114-PcrtE-ddsAwt，其培養(yǎng)基中甲羥戊酸的積累還有31％的降低。該比較顯示，質(zhì)粒pBBR-K-mev-op-(mvk-K93E)-PcrtE-ddsAwt中的突變K93E對(duì)輔酶Q10的生產(chǎn)增加具有直接作用。
實(shí)施例8 I17T突變對(duì)Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酶激酶溶解度的影響對(duì)人類甲羥戊酸激酶而言，對(duì)E.coli轉(zhuǎn)化子進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)后，突變體E19A、E19Q和H20A都顯示出了完全不溶的性質(zhì)(Potter and Miziorko，J.Biol.Chem.272，25449-25454，1997)。加上His6標(biāo)簽的Paracoccuszeaxanthinifaciens R114甲羥戊酸激酶(SEQ ID NO15)還顯示出了明顯的聚集/沉淀趨勢(shì)，尤其是在具有較高的離子強(qiáng)度的緩沖液(例如，50mMNaH2PO4，pH 8.0，300mM NaCl，250mM咪唑)中。令人驚奇地，加上His6標(biāo)簽的Paracoccus zeaxanthinifaciens R114甲羥戊酸激酶突變體I17T在同樣條件下可完全溶解，并且穩(wěn)定，因此該突變體酶更適于需要可溶甲羥戊酸激酶的應(yīng)用。
實(shí)施例9 途徑中不同下游產(chǎn)物對(duì)甲羥戊酸激酶的反饋抑制以前有過報(bào)道，多種甲羥戊酸激酶都對(duì)甲羥戊酸途徑下游產(chǎn)物造成的反饋抑制敏感，所述下游產(chǎn)物包括IPP、DMAPP、GPP、FPP、GGPP、植基-PP、法呢醇、磷酸多萜醇。在138μM的GGPP、FPP、GPP、IPP或DMAPP下，加上His6標(biāo)簽的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶活性分別受到98％、80.1％、18.6％、16.3％和14.7％的抑制。Paracoccuszeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶I17T/G47D/K93E/P132S對(duì)FPP(92μM)或GGPP(17.6μM)造成的反饋抑制的抗性分別為83％和92％。
實(shí)施例10 對(duì)與Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶同源的甲羥戊酸激酶的相應(yīng)殘基的鑒定用序列比對(duì)程序GAP(GCG Wisconsin Package，version 10.2，AccelrysInc.，9685 Scranton Road，San Diego，CA 92121-3752，USA；缺口產(chǎn)生罰分8，缺口延伸罰分2)，鑒定出了下述相應(yīng)于Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(SEQ ID NO1)特定氨基酸位置的殘基
氨基酸編號(hào)根據(jù)SEQ ID NO1-15和30來進(jìn)行。
(-)表示沒檢測(cè)出同源殘基。
未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列的例子包括但不限于下述氨基酸序列(SEQ ID NO1-15和30)。編碼未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶(SEQID NO1-14和30)的核苷酸序列分別展示于SEQ ID NO16-29以及31中。
SEQ ID NO1Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO2人類甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q03426)。
SEQ ID NO3小鼠甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q9R008)。
SEQ ID NO4大鼠甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)P17256)。
SEQ ID NO5Arabidopsis thaliana甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)P46086)。
SEQ ID NO6酵母甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)P07277)。
SEQ ID NO7Schizosaccharomyces pombe甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q09780)。
SEQ ID NO8Pyrococcus abyssi甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q9V187)。
SEQ ID NO9Pyrococcus horikoshii甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q59291)。
SEQ ID NO10Pyrococcus furiosus甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q8UOF3)。
SEQ ID NO11Methanobacterium thermoautotrophicum甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q50559)。
SEQ ID NO12Archaeoglobus fulgidus甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)027995)。
SEQ ID NO13Methanococcus jannaschii甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q58487)。
SEQ ID NO13Methanococcus jannaschii甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q58487)。
SEQ ID NO14Aeropyrum pernix甲羥戊酸激酶的氨基酸序列(Swiss-Prot編號(hào)Q9Y946)。
SEQ ID NO15加上His6標(biāo)簽的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO16Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的DNA序列。
SEQ ID NO17人類甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)M88468)。
SEQ ID NO18小鼠甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)AF137598)。
SEQ ID NO19大鼠甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)M29472)。
SEQ ID NO20Arabidopsis thaliana甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)X77793)。
SEQ ID NO21酵母甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)X06114)。
SEQ ID NO22Schizosaccharomyces pombe甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)AB000541)。
SEQ ID NO23Pyrococcus abyssi甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)AJ248284)。
SEQ ID NO24Pyrococcus horikoshii甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)AB009515；反向)。
SEQ ID NO25Pyrococcus furiosus甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)AE010263；反向)。
SEQ ID NO26Methanobacterium thermoautotrophicum甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)U47134)。
SEQ ID NO27Archaeoglobus fulgidus甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)AE000946；反向)。
SEQ ID NO28Methanococcus jannaschii甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)U67551)。
SEQ ID NO29Aeropyrum pernix甲羥戊酸激酶的DNA序列(Genbank編號(hào)AP000064)。
SEQ ID NO30Phaffia rhodozyma ATCC96594甲羥戊酸激酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO31Phaffia rhodozyma ATCC96594甲羥戊酸激酶的基因(DNA)序列。該甲羥戊酸激酶由4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子構(gòu)成。
外顯子11021-1124內(nèi)含子11125-1630外顯子21630-1956內(nèi)含子21957-2051外顯子32052-2366內(nèi)含子32367-2446外顯子42447-2651內(nèi)含子42652-2732外顯子52733-3188PolyA位點(diǎn)3284SEQ ID NO32加上His6標(biāo)簽的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶突變體I17T的DNA序列。
SEQ ID NO33加上His6標(biāo)簽的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶突變體I17T/G47D/K93E/P132S的DNA序列。
序列表<110>帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司<120>具有反饋抗性的甲羥戊酸激酶<130>case 21788<150>EP 03012294.9<151>2003-06-12<160>33<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>378<212>PRt<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<400>1Met Ser Thr Gly Arg Pro Glu Ala Gly Ala His Ala Pro Gly Lys Leu1 5 10 15Ile Leu Ser Gly Glu His Ser Val Leu Tyr Gly Ala Pro Ala Leu Ala20 25 30Met Ala Ile Ala Arg Tyr Thr Glu Val Trp Phe Thr Pro Leu Gly Ile35 40 45Gly Glu Gly Ile Arg Thr Thr Phe Ala Aan Leu Ser Gly Gly Ala Thr50 55 60Tyr Ser Leu Lys Leu Leu Ser Gly Pbe Lys Ser Arg Leu Asp Arg Arg65 70 75 80Phe Glu Gln phe Leu Asn Gly Asp Leu Lys Val His Lys Val Leu Thr85 90 95His Pro Asp Asp Leu Ala Val Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Leu His Asp100 105 110Lys Pro Pro Gly Thr Ala Ala Met Pro Gly Ile Gly Ala Met His His115 120 125Leu Pro Arg Pro Gly Glu Leu Gly Ser Arg Thr Glu Leu Pro Ile Gly130 135 140Ala Gly Met Gly Ser Ser Ala Ala Ile Val Ala Ala Thr Thr Val Leu
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180 185 190Phe Asp Ala Ile Asp Ala Ile Ser Leu Glu Ala Ser Asp Val Gly Ser195 200 205Ala Glu Arg Leu Glu Glu Leu Ile Ala Ile Asn Gln Ser Leu Leu Arg210 215 220Ala Ile Gly Val Ser Asn Pro Glu Ile Asp Arg Thr Ile Ala Glu Leu225 230 235 240Glu Arg Met Gly Leu Asn Ala Lys Ile Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly245 250 255Cys Ile Phe Gly Leu Phe Lys Gly Glu Lys Pro Lys Gly Ser Phe Ile260 265 270Val Glu Pro Glu Lys Glu Gly Val Arg Ile Glu Glu275 280<210>13<211>312<212>PRT<213>Methanococcus jannaschii<400>13Met Ile Ile Glu Thr Pro Ser Lys Val Ile Leu Phe Gly Glu His Alal 5 10 15Val Val Tyr Gly Tyr Arg Ala Ile Ser Met Ala Ile Asp Leu Thr Ser20 25 30Thr Ile Glu Ile Lys Glu Thr Gln Glu Asp Glu IIe Ile Leu Asn Leu35 40 45Asn Asp Leu Asn Lys Ser Leu Gly Leu Asn Leu Asn Glu Ile Lys Asn50 55 60Ile Asn Pro Asn Asn Phe Gly Asp Phe Lys Tyr Cys Leu Cys Ala Ile65 70 75 80Lys Asn Thr Leu Asp Tyr Leu Asn Ile Glu Pro Lys Thr Gly Phe Lys85 90 95Ile Asn Ile Ser Ser Lys Ile Pro Ile Ser Cys Gly Leu Gly Ser Ser
100 105 110Ala Ser Ile Thr Ile Gly Thr Ile Lys Ala Val Ser Gly Phe Tyr Asn115 120 125Lys Glu Leu Lys Asp Asp Glu Ile Ala Lys Leu Gly Tyr Met Val Glu130 135 140Lys Glu Ile Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Asp Thr Ser Thr Ile Thr145 150 155 160Tyr Lys Gly Ile Leu Glu Ile Lys Asn Asn Lys Phe Arg Lys Ile Lys165 170 175Gly Glu Phe Glu Glu Phe Leu Lys Asn Cys Lys Phe Leu Ile Val Tyr180 185 190Ala Glu Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ala Glu Leu Val Asn Glu Val Ala195 200 205Lys Ile Glu Asn Lys Asp Glu Ile Phe Lys Glu Ile Asp Lys Val Ile210 215 220Asp Glu Ala Leu Lys Ile Lys Asn Lys Glu Asp Phe Gly Lys Leu Met225 230 235 240Thr Lys Asn His Glu Leu Leu Lys Lys Leu Asn Ile Ser Thr Pro Lys245 250 255Leu Asp Arg Ile Val Asp Ile Gly Asn Arg Phe Gly Phe Gly Ala Lys260 265 270Leu Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Val Ile Ile Leu Val Asn Glu275 280 285Glu Lys Glu Lys Glu Leu Leu Lys Glu Leu Asn Lys Glu Asp Val Arg290 295 300Ile Phe Asn Cys Arg Met Met Asn305 310<210>14<211>324<212>PRT<213>Aeropyrum pernix
<400>14Met Arg Arg Ala Ala Arg Ala Ser Ala Pro Gly Lys Val Ile Ile Val1 5 10 15Gly Glu His Phe Val Val Arg Gly Ser Leu Ala Ile Val Ala Ala Ile20 25 30Gly Arg Arg Leu Arg Val Thr Val Arg Ser Gly Gly Lys Gly Ile Val35 40 45Leu Glu Ser Ser Met Leu Gly Arg His Ser Ala Pro Leu Pro Gly Gln50 55 60Gly Ala Ala Ala Lys Val Ser Pro Val Leu Glu Pro Tyr Ile Ala Val65 70 75 80Leu Arg Ser Leu Ala Ala Arg Gly Tyr Ser Val Val Pro His Thr Ile85 90 95Leu Val Glu Ser Gly Ile Pro Pro Arg Ala Gly Leu Gly Ser Ser Ala100 105 110Ala Ser Met Val Ala Tyr Ala Leu Ser Tyr Ser Ala Met His Gly Asp115 120 125Pro Leu Ser Ala Glu Asp Leu Tyr Ser Val Ale Met Glu Gly Glu Lys130 135 140Ile Ala His Gly Lys Pro Ser Gly Val Asp Val Thr Ile Ala Val Arg145 150 155 160Gly Gly Val Leu Ala Tyr Arg Arg Gly Glu Asn Pro Val Asp Ile Arg165 170 175Pro Gly Leu Thr Gly Val Thr Leu Leu Val Ala Asp Thr Gly Val Glu180 185 190Arg Arg Thr Arg Asp Val Val Glu His Val Leu Ser Ile Ala Asp Ala195 200 205Leu Gly Glu Ala Ser Thr Tyr Ile Tyr Arg Ala Ala Asp Leu Ile Ala210 215 220
Arg Glu Ala Leu His Ala Ile Glu Lys Gly Asp Ala Glu Arg Leu Gly225 230 235 240Leu Ile Met Asn Ala Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ser Leu Gly Ala Ser245 250 255Ser Leu Glu Ile Glu Thr Leu Val Tyr Arg Met Arg Ser Ala Gly Ala260 265 270Leu Gly Ala Lys Leu Thr Gly Ala Gly Trp Gly Gly Cys Val Ile Gly275 280 285Leu Phe Lys Glu Gly Glu Val Glu Arg Gly Leu Glu Ser Val Val Glu290 295 300Ser Ser Ser Gln Ala Phe Thr Ala Ser Ile Ala Glu Glu Gly Ala Arg305 310 315 320Leu Glu Glu Phe<210>15<211>387<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>His6-Paracoccus zeaxanthinifaciens<400>15Met Arg Gly Ser His His His His His His Ser Thr Gly Arg Pro Glu1 5 10 15Ala Gly Ala His Ala Pro Gly Lys Leu Ile Leu Ser Gly Glu His Ser20 25 30Val Leu Tyr Gly Ala Pro Ala Leu Ala Met Ala Ile Ala Arg Tyr Thr35 40 45Glu Val Trp Phe Thr Pro Leu Gly Ile Gly Glu Gly Ile Arg Thr Thr50 55 60Phe Ala Asn Leu Ser Gly Gly Ala Thr Tyr Ser Leu Lys Leu Leu Ser65 70 75 80Gly Phe Lys Ser Arg Leu Asp Arg Arg phe Glu Gln Phe Leu Asn Gly
85 90 95Asp Leu Lys Val His Lys Val Leu Thr His Pro Asp Asp Leu Ala Val100 105 110Tyr Ala Leu Ala Ser Leu Leu His Asp Lys Pro Pro Gly Thr Ala Ala115 120 125Met Pro Gly Ile Gly Ala Mer His His Leu Pro Arg Pro Gly Glu Leu130 135 140Gly Ser Arg Thr Glu Leu Pro Ile Gly Ala Gly Met Gly Ser Ser Ala145 150 155 160Ala Ile Val Ala Ala Thr Thr Val Leu Phe Glu Thr Leu Leu Asp Arg165 170 175Pro Lys Thr Pro Glu Gln Arg Phe Asp Arg Val Arg Phe Cys Glu Arg180 185 190Leu Lys His Gly Lys Ala Gly Pro Tle Asp Ala Ala Ser Val Val Arg195 200 205Gly Gly Leu Val Arg Val Gly Gly Asn Gly Pro Gly Ser Ile Ser Ser210 215 220Phe Asp Leu Pro Glu Asp His Asp Leu Val Ala Gly Arg Gly Trp Tyr225 230 235 240Trp Val Leu His Gly Arg Pro Val Ser Gly Thr Gly Glu Cys Val Ser245 250 255Ala Val Ala Ala Ala His Gly Arg Asp Ala Ala Leu Trp Asp Ala Phe260 265 270Ala Val Cys Thr Arg Ala Leu Glu Ala Ala Leu Leu Ser Gly Gly Ser275 280 285Pro Asp Ala Ala lle Thr Glu Asn Gln Arg Leu Leu Glu Arg Ile Gly290 295 300Val Val Pro Ala Ala Thr Gln Ala Leu Val Ala Gln Ile Glu Glu Ala305 310 315 320
Gly Gly Ala Ala Lys Ile Cys Gly Ala Gly Ser Val Arg Gly Asp His325 330 335Gly Gly Ala Val Leu Val Arg Ile Asp Asp Ala Gln Ala Met Ala Ser340 345 350Val Met Ala Arg His Pro Asp Leu Asp Trp Ala Pro Leu Arg Met Ser355 360 365Arg Thr Gly Ala Ala Pro Gly Pro Ala Pro Arg Ala Gln Pro Leu Pro370 375 380Gly Gln Gly385<210>16<211>1137<212>DNA<213>Paracoccus zeaxanthinifaciens<400>16atgtcgaccg gcaggcctga agcaggcgcc catgccccgg gcaagctgat cctgtccggggaacattccg tgctctatgg tgcgcccgcg cttgccatgg ccatcgcccg ctataccgaggtgtggttca cgccgcttgg cattggcgag gggatacgca cgacattcgc caatctctcgggcggggcga cctattcgct gaagctgctg tcggggttca agtcgcggct ggaccgccggttcgagcagt tcctgaacgg cgacctaaag gtgcacaagg tcctgaccca tcccgacgatctggcggtct atgcgctggc gtcgcttctg cacgacaagc cgccggggac cgccgcgatgccgggcatcg gcgcgatgca ccacctgccg cgaccgggtg agctgggcag ccggacggagctgcccatcg gcgcgggcat ggggtcgtct ccggccatcg tcgcggccac cacggtcctgttcgagacgc tgctggaccg gcccaagacg cccgaacagc gcttcgaccg cgtccgcttctgcgagcggt tgaagcacgg caaggccggt cccatcgacg cggccagcgt cgtgcgcggcgggcttgtcc gcgtgggcgg gaacgggccg ggttcgatca gcagcttcga tttgcccgaggatcacgacc ttgtcgcggg acgcggctgg tactgggtac tgcacgggcg ccccgtcagcgggaccggcg aatgcgtcag cgcggtcgcg gcggcgcatg gtcgcgatgc ggcgctgtgggacgccttcg cagtctgcac ccgcgcgttg gaggccgcgc tgctgtctgg gggcagccccgacgccgcca tcaccgagaa ccagcgcctg ctggaacgca tcggcgtcgt gccggcagcgacgcaggccc tcgtggccca gatcgaggag gcgggtggcg cggccaagat ctgcggcgcaggttccgtgc ggggcgatca cggcggggcg gtcctcgtgc ggattgacga cgcgcaggcg
atggcttcgg tcatggcgcg ccatcccgac ctcgactggg cgcccctgcg catgtcgcgc 1080acgggggcgg cacccggccc cgcgccgcgt gcgcaaccgc tgccggggca gggctga 1137<210>17<211>1191<212>DNA<213>homo sapiens<400>17atgttgtcag aagtcctact ggtgtctgct ccggggaaag tcatccttca tggagaacat60gccgtggtac atggcaaggt agcactggct gtatccttga acttgagaac attcctccggcttcaacccc acagcaatgg gaaagtggac ctcagcttac ccaacattgg tatcaagcgggcctgggatg tggccaggct tcagtcactg gacacaagct ttctggagca aggtgatgtcacaacaccca cctcagagca agtggagaag ctaaaggagg ttgcaggctt gcctgacgactgtgctgtca ccgagcgcct ggctgtgctg gcctttcttt acttatacct gtccatctgccggaagcaga gggccctgcc gagcctggat atcgtagtgt ggtcggagct gccccccggggcgggcttgg gctccagcgc cgcctactcg gtgtgtctgg cagcagccct cctgactgtgtgcgaggaga tcccaaaccc gctgaaggac ggggattgcg tcaacaggtg gaccaaggaggatttggagc taattaacaa gtgggccttc caaggggaga gaatgattca cgggaacccctccggagtgg acaatgctgt cagcacctgg ggaggagccc tccgatacca tcaagggaagatttcatcct taaagaggtc gccagctctc cagatcctgc tgaccaacac caaagtccctcgcaatacca gggcccttgt ggctggcgtc agaaacaggc tgctcaagtt cccagagatcgtggcccccc tcctgacctc aatagatgcc atctccctgg agtgtgagcg cgtgctgggagagatggggg aagccccagc cccggagcag tacctcgtgc tggaagagct cattgacatgaaccagcacc atctgaatgc cctcggcgtg ggccacgcct ctctggacca gctctgccaggtgaccaggg cccgcggact tcacagcaag ctgactggcg caggcggtgg tggctgtggcatcacactcc tcaagccagg gctggagcag ccagaagtgg aggccacgaa gcaggccctgaccagctgtg gctttgactg cttggaaacc agcatcggtg cccccggcgt ctccatccactcagccacct ccctggacag ccgagtccag caagccctgg atggcctctg a<210>18<211>1188<212>DNA<213>小鼠<400>18
atgttgtcag aagccctgct ggtgtccgcc ccggggaagg tcatcctcca tggagaacac 60gctgtggtcc atggcaaggt cgctctggca gcggccttga acttgagaac tttcctcctg120ctgcgaccgc agagcaatgg gaaagtgagc gtcaatttac ccaacatcgg tattaagcag180gtgtgggatg tgggcatgct tcagcgactg gacacgagct ttcttgagca aggtgatgtc240tcggtaccca ccttggagca actggagaag ctaaagaaga tgggggacct ccccagagac300cgtgcaggca atgaaggcat ggctctgctt gcctttctct acctgtacct ggcaatctgc360cggaagcaga ggacactccc gagcctggac atggtggtgt ggtcggaact tccccccggg420gcaggcttgg gctccagcgc cgcctactct gtgtgtctgg cagccgccct cctgactgcctgtgaggagg tctccaaccc gctcaaggac ggggtctccg tcagcaggtg gcccgaggaagatctgaagt caatcaacaa gtgggccttc gaaggggaga gagtgatcca tgggaacccttctggtgtgg acaatgccgt cagcacctgg ggcggagccc tgcgcttcca gcaagggacgatgtcttcct tgaagagcct cccgtctctg cagatcctgc tcaccaacac caaggtcccgcggagtacca aggcccttgt ggctgctgtc agaagcaggc tgaccaagtt ccctgagattgtggccccgc tgctgacctc cattgacgca atatccctgg agtgtgagcg cgtgctaggggagatggtgg cagctccagt tccggaacag tacctcgtac tagaagagct gatagacatgaaccagcacc atctgaatgc tctcggggtg ggccacaact ccctggacca gctctgccaagtaacggcag cacacggact gcacagcaag ctgacgggcg ctggcggtgg cggctgtggcatcaccctcc tgaagccagg tctagagcaa gccacagtgg aggcagccaa gcaggccctgaccagctgcg ggtttgactg ctgggagacc agcatcggcg cacccggagt ttccacacactcagctgcag ctgtagggga ccctgtccga caagccctgg gcctctga<210>19<211>1188<212>DNA<213>大鼠<400>19atgttgtcag aagtcctgct ggtgtctgct ccagggaaag tcattctcca tggagaacatgctgtggtcc atggcaaggt agctctggcg gtggccttga acttgagaac atttctcgtgctgcgaccgc agagcaatgg gaaagtgagc ctcaatttac caaacgtcgg tattaagcaggtctgggatg tggccacact tcagctgctg gacacaggct ttcttgagca aggcgatgtcccggcaccca ccttggagca actggagaag ctgaagaagg tggcgggcct cccccgagactgtgtaggca acgaaggcct gtctctgctt gcctttctgt acctgtacct ggctatctgc
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<211>1008<212>DNA<213>Pyrococcus abyssi<400>23atgccaaggt tagtgctggc gtcagctcca gcaaagataa tactcttcgg ggaacacagc 60gttgtgtatg gaaagcctgc catagcatct gctattgact tgagaactta cgttagggcg120gagtttaatg attcgggaaa tataaagata gaagcccatg acataaaaac ccctgggcta180atagtttctt tttcagaaga caaaatttac ttcgagactg actatggaaa ggcagctgaa240gtgctgagtt acgttagaca cgccatagag ctcgtccttg aagaggctga taagaggact300ggggtcagcg tttcaataac gtctcaaatt ccagtaggtg ctggcctagg ttcttcagctgccgtcgccg ttgctaccat cggtgccgtc tccaagttac ttgacctcga gcttagtaaagaggagatag ctaagatggg ccataaggtt gaactcctgg ttcagggagc ttcgagtggcatagatccga cggtctcggc aataggaggg ttcttgtact ataagcaagg tgaatttgagcacctaccat tcgtggagct tccaatagta gttggatata ccggctcaag tggctccacaaaggaattag ttgcgatggt taggagaagg tacgaggaga tgcccgagtt aattgaacccattctagagt caatgggtaa gctcgtggat aaagctaagg aggtaataat atctaagctcgatgaggagg aaaagttcct gaaattggga gagctcatga acataaatca tggccttctcgatgccctag gtgtttcaac caaaaagcta agcgaactcg tctatgccgc tagaactgctggagcaattg gagccaagct aacgggggct gggggaggtg gatgcatgta cgctttagctcctgggaagc agagggaggt tgctacggcc ataaagatag ctggcggaac tcccatgataacgaggataa gcaaggaggg gcttagaata gaggaggtaa gggaatga<210>24<211>1008<212>DNA<213>Pyrococcus horikoshii<400>24tcatcttgaa acctcctcta ttctcaatcc ttccctactt accctcgtta tcattggaattccaccagct atctttattg ccgtggcgac ttccctctgt ctcccagggg ccaaggcatacatacaccct ccaccaccag cacccgtaag ttttgcccca attgcaccag ccgttctagcagcgtaaact aactcaccaa gcttcttcgt agacaccccc aaagcatcta aaagcccatgatttatgttc attaactctc caagcttagt aagcttctcc tcttcatcga gctttgaaagtattatctcc ttggccttat ccactaattt tcccattgcc tccaatatag gctccacaagttcgggcatt tcctcgtacc ttttccttac cattgccact aattctttag ttgaaccagt
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tccaaaaaga ataacttttg cgggagctga ggctataact ttcat1005<210>26<211>912<212>DNA<213>Methanobacterium thermoautotrophicum<400>26ttgaagtcgt cggcatccgc acctgccaag gccattcttt ttggtgaaca cgcagtggtc 60tacagcaagc cggcaatagc agccgccata gaccgcaggg tgactgtaac cgtaagtgaa120tccagcagca cccatgtaac catcccctcc ctgggtatac gccacagttc agagagaccatccggtggca tcctggacta catcgggagg tgcctcgagc tttaccatga cgcatcaccccttgacatca gggtggagat ggagataccc gccggttcag gcctaggttc atcggctgcactcaccgttg cactgatagg tgccctcgac aggtaccatg gaagggatca tggacccggggagacagcag ccagggccca cagggtggag gttgatgtac agggagccgc cagcccccttgacacagcca tcagcaccta tgggggcctt gtataccttg acagccagag gagggtgaggcagtttgagg ccgacctggg ggaccttgta atagcacacc ttgactattc aggggaaacagccaggatgg ttgccggcgt agctgaaagg ttcaggagat tcccggatat catggggaggataatggaca cagttgagtc cataaccaat acagcataca gggaacttct aaggaacaacacagaacccc tgggggagct catgaacctc aaccaggggc tgctggactc catgggcgtttccacacgtg aactttcaat gatggtctat gaggcaagga acgccggggc agcaggttcaaagatcacag gagccggcgg cggcgggagc ataatagccc actgcccggg atgtgtggatgatgttgtca cggcccttaa caggaactgg aaagccatga gggcagagtt ttcggttaagggactcatct aa<210>27<211>855<212>DNA<213>Archaeoglobus fulgidus<400>27tcactcttca attctgacac cctcottttc gggctcgact atgaagctcc ctttcggcttctctcccttg aacaggccga atatacaccc cccaccaccc gctccagtta ttttcgcattcaaacccatc ctttcgagct ctgcaatggt tctgtcgatt tcgggattgc tcacccctatcgccctcaga agcgactggt ttatggctat gagctcctca agtctttcag cgctgccaacatcgctcgcc tcaagggaga ttgcgtcgat agcgtcaaat attttatcca caacctcagg
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<210>29<211>975<212>DNA<213>Aeropyrum pernix<400>29atgaggaggg ctgctagggc gtctgccccg gggaaagtta taatcgttgg agaacacttc 60gtcgtcagag gctccctggc gatagtggcg gccataggca gaaggctccg cgtcaccgtg120agaagcgggg gcaaggggat tgtgcttgag agcagcatgc taggccgcca cagcgccccg180ctaccaggcc agggtgcagc ggctaaggta agccccgtcc tcgagccgta catagcagtg240ttgagaagtc tggctgcaag gggctatagc gtagtgcccc atacaatatt ggtggagagcggcatacccc ctagggcagg tctcggtagc agcgccgcca gcatggtagc ctatgctctatcatactcgg ccatgcatgg tgaccccctc tcggctgagg acctctacag tgttgctatggagggcgaga agatagcgca tggtaagccg agcggtgttg acgtaaccat agccgttagggggggagtcc tggcttacag gaggggcgag aacccggtgg atataaggcc ggggcttacaggtgtcactc tgcttgttgc cgacacgggt gtcgagaggc gtactaggga tgttgtcgagcatgttctct ccattgcgga cgccttggga gaggcatcga cctacatata tagggcggcagacttgatag cgagagaagc cctccatgcg atagaaaagg gagacgccga gaggctaggtcttataatga atgcagccca gggccttctc tcatctcttg gggcgtcgtc actagaaatagaaacactag tatatcggat gaggagtgcc ggggccctgg gtgcaaagct aacgggagctggatgggggg gctgtgtgat agggcttttc aaggagggtg aggtcgaacg ggggctagagtctgtggtag agagttcaag ccaggctttc accgcgtcaa tagcagagga gggtgctagactcgaggagt tctag<210>30<211>432<212>PRT<213>Phaffia rhodozynma ATCC 96594<400>30Lys Glu Glu Ile Leu Val Ser Ala Pro Gly Lys Val Ila Leu Phe Gly1 5 10 15Glu His Ala Val Gly His Gly Val Thr Gly Ile Ala Ala Ser Val Asp20 25 30Leu Arg Cya Tyr Ala Leu Leu Ser Pro Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ser35 40 45
Ser Ser Leu Ser Ser Thr Asn Ile Thr Ile Ser Leu Thr Asp Leu Asn50 55 60Phe Thr Gln Ser Trp Pro Val Asp Ser Leu Pro Trp Ser Leu Ala Pro65 70 75 80Asp Trp Thr Glu Ala Ser Ile Pro Glu Ser Leu Cys Pro Thr Leu Leu85 90 95Ala Glu Ile Glu Arg Ile Ala Gly Gln Gly Gly Asn Gly Gly Glu Arg100 105 110Glu Lys Val Ala Thr Met Ala Phe Leu Tyr Leu Leu Val Leu Leu Ser115 120 125Lys Gly Lys Pro Ser Glu Pro Phe Glu Leu Thr Ala Arg Ser Ala Leu130 135 140Pro Met Gly Ala Gly Leu Gly Ser Ser Ala Ala Leu Ser Thr Ser Leu145 150 155 160Ala Leu ValPhe Leu Leu His Phe Ser His Leu Ser Pro Thr Thr Thr165 170 175Gly Arg Glu Ser Thr Ile Pro Thr Ala Asp Thr Glu Val Ile Asp Lys180 185 190Trp Ala Phe Leu Ala Glu Lys Val lle His Gly Asn Pro Ser Gly Ile195 200 205Asp Asn Ala Val Ger Thr Arg Gly Gly Ala Val Ala Phe Lys Arg Lys210 215 220Ile Glu Gly Lys Gln Glu Gly Gly Met Glu Ala Ile Lys Ser Phe Thr225 230 235 240Ser Ile Arg Phe Leu Ile Thr Asp Ser Arg Ile Gly Arg Asp Thr Arg245 250 255Ser Leu Val Ala Gly Val Asn Ala Arg Leu Ile Gln Glu Pro Glu Val260 265 270Ile Val Pro Leu Leu Glu Ala Ile Gln Gln Ile Ala Asp Glu Ala Ile
275 280 285Arg Cys Leu Lys Asp Ser Glu Met Glu Arg Ala Val Met Ile Asp Arg290 295 300Leu Gln Asn Leu Val Ser Glu Asn His Ala His Leu Ala Ala Leu Gly305 310 315 320Val Ser His Pro Ser Leu Glu Glu Ile Ile ArG Ile Gly Ala Asp Lys325 330 335Pro Phe Glu Leu Arg Thr Lys Leu Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys340 345 350Ala Val Thr Leu Val Pro Asp Asp Phe Ser Thr Glu Thr Leu Gln Ala355 360 365Leu Met Glu Thr Leu Val Gln Ser Ser Phe Ala Pro Tyr Ile Ala Arg370 375 380Val Gly Gly Ser Gly Val Gly Phe Leu Ser Ser Thr Lys Ala Asp Pro385 390 395 400Glu Asp Gly Glu Asn Arg Leu Lys Asp Gly Leu Val Gly Thr Glu Ile405 410 415Asp Glu Leu Asp Arg Trp Ala Leu Lys Thr Gly Arg Trp Ser Phe Ala420 425 430<210>31<211>4135<212>DNA<213>Phaffia rhodozyma ATCC96594<400>31actgactcgg ctaccggaaa atatcttttc aggacgcctt gatcgttttg gacaacaccatgatgtcacc atatcttcag cggccgttgg agctaggagt agacattgta tacgactctggaacaaagta tttgagtgga caccacgatc tcatggctgg tgtgattact actcgtactgaggagattgg gaaggttcgt gcttgcttgc tttgaatgtc gtgcctaaag ccattgccataagacagagt ctgatctatg tcgtttgcct acaacagaga atggcctggt tcccaaatgctatgggaaat gcattgtctc cgttcgactc gttccttctt ctccgaggac tcaaaacacttcctctccga ctggacaagc agcaggcctc atctcacctg atcgcctcgt acttacacac
cctcggcttt cttgttcact accccggtct gccttctgac cctgggtacg aacttcataa480ctctcaggcg agtggtgcag gtgccgtcat gagctttgag accggagata tcgcgttgag540tgaggccatc gtgggcggaa cccgagtttg gggaatcagt gtcagtttcg gagccgtgaa600cagtttgatc agcatgcctt gtctaatgag gttagttctt atgccttctt ttcgcgcctt660ctaaaatttc tggctgacta attgggtcgg tctttccgtt cttgcatttc agtcacgcat720ctattcctgc tcaccttcga gccgagcgag gtctccccga acatctgatt cgactgtgtg780tcggtattga ggaccctcac gatttgcttg atgatttgga ggcctctctt gtgaacgctg840gcgcaatccg atcagtctct acctcagatt catcccgacc gctcactcct cctgcctctg---attctgcctc ggacattcac tccaactggg ccgtcgaccg agccagacag ttcgagcgtgttaggccttc taactcgaca gccggcgtcg aaggacagct tgccgaactc aatgtagacgatgcagccag acttgcgggc gatgagagcc aaaaagaaga aattcttgtc agtgcaccgggaaaggtcat tctgttcggc gaacatgctg taggccatgg tgttgtgagt gagaaatgaaagctttatgc tctcattgca tcttaacttt tcctcgcctt ttttgttctc ttcatcccgtcttgattgta gggatgcccc cctttgcccc tttccccttc ttgcatctgt ctatatttccttatacattt cgctcttaag agcgtctagt tgtaccttat aacaaccttt ggttttagcatcctttgatt attcatttct ctcatccttc ggtcagaggc tttcggccat ctttacgtctgattagattg taatagcaag aactatcttg ctaagccttt tctcttcctc ttcctcctatataaatcgaa ttcactttcg gacatgttta ttttggggaa atcatcaagg ggtggggggccaatcccgac actaattttc tgctcacgtc aaaactcagc gttcagaatc agtcactgaccctgatacgt gtctctatgt gtgtgggtgt acgtgcgaat tgtgactcga cgttctacgcttaaaaacag accgggatcg ctgcttccgt tgatcttcga tgctacgctc ttctctcacccactgctacg acaacaacat catcgtcgtt atcgtctaca aacattacca tctccctaacggacctgaac tttacgcagt cttggcctgt tgattctctt ccttggtcac ttgcgcctgactggactgag gcgtctattc cagaatctct ctgcccgaca ttgctcgccg aaatcgaaaggatcgctggt caaggtggaa acggaggaga aagggagaag gtggcaacca tggcattcttgtatttgttg gtgctattga gcaaagggaa gccaaggtag gttttttctg tctcttctttttgcctataa agactcttaa ctgacggaga aagtgttggg tttcttcctt cgggggttcaatcaattaaa gtgagccgtt cgagttgacg gctcgatctg cgcttccgat gggagctggtctgggttcat ccgccgctct atcgacctct cttgccctag tctttcttct ccacttttctcacctcagtc caacgacgac tggcagagaa tcaacaatcc cgacggccga cacagaagta
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caacatgagt caaggattag atcatcacgt gtctcatttg acgggttgaa agatatattt 4020agatactaac tgcttcccac gccgactgaa aagatgaatt gaatcatgtc gagtggcaac 4080gaacgaaaga acaaatagta agaatgaatt actagaaaag acagaatgac tagaa4135<210>32<211>1164<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Paracoccus zeaxanthinifaciens I17T<400>32atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac tcgaccggca ggcctgaagc aggcgcccatgccccgggca agctgaccct gtccggggaa cattccgtgc tctatggtgc gcccgcgcttgccatggcca tcgcccgcta taccgaggtg tggttcacgc cgcttggcat tggcgaggggatacgcacga cattcgccaa tctctcgggc ggggcgacct attcgctgaa gctgctgtcggggttcaagt cgcggctgga ccgccggttc gagcagttcc tgaacggcga cctaaaggtgcacaaggtcc tgacccatcc cgacgatctg gcggtctatg cgctggcgtc gcttctgcacgacaagccgc cggggaccgc cgcgatgccg ggcatcggcg cgatgcacca cctgccgcgaccgggtgagc tgggcagccg gacggagctg cccatcggcg cgggcatggg gtcgtctgcggccatcgtcg cggccaccac ggtcctgttc gagacgctgc tggaccggcc caagacgcccgaacagcgct tcgaccgcgt ccgcttctgc gagcggttga agcacggcaa ggccggtcccatcgacgcgg ccagcgtcgt gcgcggcggg cttgtccgcg tgggcgggaa cgggccgggttcgatcagca gcttcgattt gcccgaggat cacgaccttg tcgcgggacg cggctggtactgggtactgc acgggcgccc cgtcagcggg accggcgaat gcgtcagcgc ggtcgcggcggcgcatggtc gcgatgcggc gctgtgggca gccttcgcag tctgcacccg cgcgttggaggccgcgctgc tgtctggggg cagccccgac gccgccatca ccgagaacca gcgcctgctggaacgcatcg gcgtcgtgcc ggcagcgacg caggccctcg tggcccagat cgaggaggcgggtggcgcgg ccaagatctg cggcgcaggt tccgtgcggg gcgatcacgg cggggcggtcctcgtgcgga ttgacgacgc gcaggcgatg gcttcggtca tggcgcgcca tcccgacctcgactgggcgc ccctgcgcat gtcgcgcacg ggggcggcac ccggccccgc gccgcgtgcgcaaccgctgc cggggcaggg ctga<210>33<211>1164
<212>DMA<213>人工序列<220>
<223>Paracoccus zeaxanthtnifaciens I17T、G47D、K93E、P132S<400>33atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac tcgaccggca ggcctgaagc aggcgcccat 60gccccgggca agctgaccct gtccggggaa cattccgtgc tctatggtgc gcccgcgctt120gccatggcca tcgcccgcta taccgaggtg tggttcacgc cgcttgacat tggcgagggg180atacgcacga cattcgccaa tctctcgggc ggggcgacct attcgctgaa gctgctgtcg240gggttcaagt cgcggctgga ccgccggttc gagcagttcc tgaacggcga cctaaaggtgcacgaggtcc tgacccatcc cgacgatctg gcggtctatg cgctggcgtc gcttctgcacgacaagccgc cggggaccgc cgcgatgccg ggcatcggcg cgatgcacca cctgccgcgatccggtgagc tgggcagccg gacggagctg cccatcggcg cgggcatggg gtcgtctgcggccatcgtcg cggccaccac ggtcctgttc gagacgctgc tggaccggcc caagacgcccgaacagcgct tcgaccgcgt ccgcttctgc gagcggttga agcacggcaa ggccggtcccatcgacgcgg ccagcgtcgt gcgcggcggg cttgtccgcg tgggcgggaa cgggccgggttcgatcagca gcttcgattt gcccgaggat cacgaccttg tcgcgggacg cggctggtactgggtactgc acgggcgccc cgtcagcggg accggcgaat gcgtcagcgc ggtcgcggcggcgcatggtc gcgatgcggc gctgtgggac gccttcgcag tctgcacccg cgcgttggaggccgcgctgc tgtctggggg cagccccgac gccgccatca ccgagaacca gcgcctgctggaacgcatcg gcgtcgtgcc ggcagcgacg caggccctcg tggcccagat cgaggaggcgggtggcgcgg ccaagatctg cggcgcaggt tccgtgcggg gcgatcacgg cggggcggtcctcgtgcgga ttgacgacgc gcaggcgatg gcttcggtca tggcgcgcca tcccgacctcgactgggcgc ccctgcgcat gtcgcgcacg ggggcggcac ccggccccgc gccgcgtgcgcaaccgctgc cggggcaggg ctga
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其展示出的對(duì)反饋抑制的敏感性較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶要低，其中(i)較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列含有至少一處突變，并且(ii)所述至少一處突變發(fā)生于選自由如下氨基酸位置所構(gòu)成的組中的氨基酸位置中的一處或多處，所述氨基酸位置相應(yīng)于如SEQ ID NO1所示的Paracoccus zeaxanthinifaciens甲羥戊酸激酶的氨基酸序列上的17、47、93、94、132、167、169、204和266位。
2.如權(quán)利要求1所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中所述反饋抑制是由法呢基二磷酸和雙牻?；姿嵩斐傻姆答佉种?。
3.如權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中所述經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶，展示出的反饋抗性為至少10％
4.如權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中所述的突變是氨基酸取代。
5.如權(quán)利要求1至4中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列含有至少兩處氨基酸取代。
6.如權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列含有至少3處氨基酸取代。
7.如權(quán)利要求1至6中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列含有至少4處氨基酸取代。
8.如權(quán)利要求1至7中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中，較之相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列，經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列含有下述取代，其中，所述取代發(fā)生于如SEQ IDNO1所示的序列的第17位氨基酸處。
9.如權(quán)利要求8所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中，發(fā)生于如SEQ ID NO1所示的序列的第17位氨基酸處的取代由蘇氨酸對(duì)異亮氨酸的替代組成。
10.如權(quán)利要求1至9中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其中，相應(yīng)的未經(jīng)修飾的甲羥戊酸激酶的氨基酸序列選自由如SEQ ID NO1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和30所示的氨基酸序列所構(gòu)成的組。
11.一種多核苷酸，其包含編碼如權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的核苷酸序列。
12.如權(quán)利要求11所述的多核苷酸，其中所述編碼如權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的核苷酸序列選自由SEQ IDNO32和33所構(gòu)成的組。
13.一種載體或質(zhì)粒，其中包含如權(quán)利要求11或12所述的多核苷酸。
14.如權(quán)利要求13所述的載體或質(zhì)粒，還包含至少一種標(biāo)記基因。
15.一種宿主細(xì)胞，其中包含如權(quán)利要求13或14所述的載體或質(zhì)粒。
16.如權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，其是E.coli或Paracoccuszeaxanthinifaciens或Rhodobacter或Saccharomyces cerevisiae細(xì)胞。
17.一種生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)如權(quán)利要求15或16所述的宿主細(xì)胞；以及(b)可選地，從培養(yǎng)基中分離出類異戊二烯化合物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的類異戊二烯化合物是輔酶Q10。
19.一種用于生產(chǎn)如權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶的方法，所述方法包括(a)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)如權(quán)利要求15或16所述的宿主細(xì)胞的群落，以及(b)可選地，從所述細(xì)胞或從所述培養(yǎng)基中回收經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶。
20.一種用于制備對(duì)反饋抑制的敏感性降低的甲羥戊酸激酶的方法，所述方法包括如下步驟(a)提供一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼第一種甲羥戊酸激酶，該激酶展示出對(duì)反饋抑制的敏感性；(b)將一種或多種突變引入到所述多核苷酸序列中，使得經(jīng)過突變的多核苷酸序列編碼第二種甲羥戊酸激酶，較之第一種甲羥戊酸激酶，其含有至少一處氨基酸突變，其中，所述至少一處氨基酸突變發(fā)生于選自由如下氨基酸位置所構(gòu)成的組中的氨基酸位置中的一處或多處，所述氨基酸位置相應(yīng)于如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列上的17、47、93、94、132、167、169、204和266位；(c)可選地，將經(jīng)過突變的多核苷酸插入到載體或質(zhì)粒中；(d)將多核苷酸或載體或質(zhì)粒引入到合適的宿主細(xì)胞中；以及(e)在允許經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶或如權(quán)利要求11或12所述的多核苷酸在制備用于治療與甲羥戊酸激酶活性降低相關(guān)的疾病的藥物中的用途。
22.如權(quán)利要求21所述的用途，其中所述與甲羥戊酸激酶活性降低相關(guān)的疾病選自由甲羥戊酸尿癥、超免疫球蛋白D癥以及周期性發(fā)熱綜合征所構(gòu)成的組。
23.如權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶或如權(quán)利要求11或12所述的多核苷酸用于檢測(cè)生物流體中甲羥戊酸濃度的用途。
24.如權(quán)利要求1至10中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶或如權(quán)利要求11或12所述的多核苷酸用于提高類異戊二烯化合物生產(chǎn)的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)過修飾的甲羥戊酸激酶，其對(duì)于反饋抑制具有更小的敏感度，還涉及能編碼它們的多核苷酸。本發(fā)明還涉及包含這些多核苷酸的載體以及包含這些載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)經(jīng)修飾的酶的方法以及用于生產(chǎn)類異戊二烯化合物的方法。
文檔編號(hào)C12P7/02GK1806042SQ200480016384
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2004年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者白仁羽楠, 馬卡斯·哈波林, 馬丁·萊瑪恩, 如爾·羅帕斯-烏里巴瑞, 馬卡斯·維斯 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司