專(zhuān)利名稱(chēng)：：通過(guò)從人胚胎干細(xì)胞獲得的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化得到胰和肝內(nèi)胚層細(xì)胞及組織的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從多能干細(xì)胞例如人胚胎干細(xì)胞和定形內(nèi)胚層(definitiveendoderm)細(xì)胞的有效分化，以形成胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。本發(fā)明直接應(yīng)用于制備胰島|3細(xì)胞，所述胰島p細(xì)胞可作為治愈糖尿病的治療的一部分使用。此外，本發(fā)明可用于從人胚胎干細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞。本發(fā)明涉及用于使用無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的確定成分培養(yǎng)基(definedmedia)從干細(xì)胞(優(yōu)選人胚胎干細(xì)胞)制備定形內(nèi)胚層和胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2006年6月2日提交的，標(biāo)題為"通過(guò)從人胚胎干細(xì)胞獲得的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的分化得到胰腺和肝內(nèi)胚層細(xì)胞和組織"的臨時(shí)申請(qǐng)US60/810,424,和2007年3月15日提交的，標(biāo)題為"從人胚胎干細(xì)胞制備定形內(nèi)胚層和胰腺內(nèi)胚層的改進(jìn)方法"的US60/918,100的利益，兩個(gè)申請(qǐng)均在此全部引入作為參考。
背景技術(shù)：
：胚胎干(ES)細(xì)胞代表在早期胚胎內(nèi)多能細(xì)胞生物學(xué)和分化的機(jī)制研究的有效模型系統(tǒng)，并且提供了哺乳動(dòng)物基因操作的機(jī)會(huì)和由此得到的商業(yè)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用。此外，ES細(xì)胞的適當(dāng)增殖和分化可用于制備適于移植的無(wú)限制的細(xì)胞源，用于治療由細(xì)胞損傷或功能障礙引起的疾病。如國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO99/53021中所描述的包括早期原始外胚層樣(EPL)細(xì)胞的其他多能細(xì)胞和細(xì)胞抹、體內(nèi)或體外衍生的ICM/上胚層、體內(nèi)或體外衍生的原始外胚層、原始生殖細(xì)胞(EG細(xì)胞)、畸胎癌細(xì)胞(EC細(xì)胞)、和由分化或核轉(zhuǎn)移衍生的多能細(xì)胞共有部分或全部的這些特性和應(yīng)用。最近，已建立使ES細(xì)胞分化成為定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。本發(fā)明是從人胚胎干細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)月包開(kāi)始。多能細(xì)胞的成功分離、長(zhǎng)期克隆維持、基因操作和種系傳遞(germ-linetransmission)通常很難，并且其原因未知。國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO97/32033和美國(guó)專(zhuān)利No.5,453,357描述了包括來(lái)自除嚙齒類(lèi)外物種的多能細(xì)胞。人ES細(xì)胞已在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO00/27995和美國(guó)專(zhuān)利No.6,200,806中描述，且人EG細(xì)胞已在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/43679中描述。已證明通過(guò)多能細(xì)胞的體外分化，緊密控制分化或形成特殊分化或終末分化細(xì)胞的均一細(xì)胞群的能力是有問(wèn)題的。當(dāng)前的方法包括從多能細(xì)胞以無(wú)控制的方式形成胚胎體，并且不能形成均一的細(xì)胞群?；旌系募?xì)胞群，例如此種類(lèi)型的胚胎體中的細(xì)胞，通常不可能適于治療或商業(yè)用途。調(diào)節(jié)ES細(xì)胞多能性和分化的生物化學(xué)機(jī)制十分不明確。然而，有限可用的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明多能ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的持續(xù)維持依賴于細(xì)胞外血清環(huán)境中存在的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子。已發(fā)現(xiàn)通過(guò)許多這類(lèi)因子例如胰島素、IGF(s)和FGF(s)通過(guò)脂激酶磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)事件(Carpenter&Cantley，(1996)Cwr.(9;/".Ce〃.5z'o/.,8:153-158)。響應(yīng)這些可溶性因子對(duì)特異細(xì)胞表面受體的結(jié)合，PI3-激酶募集至細(xì)胞內(nèi)膜表面，啟動(dòng)第二信號(hào)事件通路，導(dǎo)致幾種下游的細(xì)胞內(nèi)靶分子的功能調(diào)節(jié)，所述靶分子影響多種生物學(xué)過(guò)程。稱(chēng)為'納巴霉素的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn)'(mTOR)的蛋白激酶在PI3-激酶的下游靶點(diǎn)中。mTOR的刺激既在核糖體p70S6激酶激活之前，也是核糖體p70S6激酶激活所必須的，核糖體p70S6激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是調(diào)節(jié)蛋白合成系統(tǒng)的主要激酶(Chung等人，(1994)Nature,370:71-75)。在胚胎發(fā)育期間，從三種主要的細(xì)胞群形成身體組織外胚層、中胚層和定形內(nèi)胚層。這些細(xì)胞群，也稱(chēng)為原代生殖細(xì)胞層，通過(guò)稱(chēng)為原腸胚形成的過(guò)程形成。在原腸胚形成后，每個(gè)原代生殖細(xì)胞層產(chǎn)生特異的細(xì)胞群和組織。中胚層制備血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心臟和骨骼肌和脂肪細(xì)胞。定形內(nèi)胚層產(chǎn)生肝、胰腺和肺。外胚層產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚和腎上腺組織。因此，需要用于制備細(xì)胞譜系豐富的細(xì)胞群，并進(jìn)一步分化定形內(nèi)胚層細(xì)胞成為胰內(nèi)胚層細(xì)胞和/或肝內(nèi)胚層細(xì)胞，從而促進(jìn)這些細(xì)胞的增殖，和這些細(xì)胞進(jìn)一步分化的產(chǎn)物的確定方法和組合物。人多能細(xì)胞，包括從人臍帶血獲得的細(xì)胞，提供了研究人發(fā)育早期和幾種疾病狀態(tài)例如糖尿病和帕金森氏病治療干預(yù)的獨(dú)特機(jī)會(huì)。例如，使用從hESCs衍生的胰島素生成的(3-細(xì)胞可提供對(duì)現(xiàn)有細(xì)胞治療方法的巨大改進(jìn)，現(xiàn)有細(xì)胞治療方法利用來(lái)自供體胰腺的細(xì)胞?，F(xiàn)有的對(duì)糖尿病的細(xì)胞治療，利用來(lái)自供體胰腺的細(xì)胞，受到移植所需高質(zhì)量胰島細(xì)胞缺乏的限制。對(duì)單一I型糖尿病患者的細(xì)胞治療需要約8x108個(gè)胰腺胰島細(xì)胞的移植(Shapiro等人，2000，NEnglJMed343:230-238;Shapiro等人，200la，BestPractResClinEndocrinolMetab15:241-264;Shapiro等人，200lb，Bmj322:861)。像這樣，當(dāng)前對(duì)于成功的移植需要至少兩個(gè)健康的供體器官以獲得足夠的胰島細(xì)胞。自hESCs獲得的定形內(nèi)胚層細(xì)胞，提供了原料源，從原料可發(fā)展出大量的高質(zhì)量的分化的胰腺內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層細(xì)胞，用于在人細(xì)胞治療中使用的進(jìn)一步分化和分化細(xì)胞的制備。人胚胎干細(xì)胞(hESCs)可分化成為3個(gè)胚層(外胚層、中胚層和定形內(nèi)胚層)或胚外內(nèi)胚層，這依賴于所使用的培養(yǎng)條件(圖1)。在多種條件下，hESCs已被成功地分化成為定形內(nèi)胚層(DE)。D'Amour等人(2005)描述了將手動(dòng)傳代的hESCs置于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)，在基因敲除代血清(knockoutserumreplacement)(KSR)存在的培養(yǎng)基中，作為分化起始點(diǎn)。分化成為DE，之后在包含低濃度的FCS或暫時(shí)無(wú)FCS的培養(yǎng)基存在下，加入激活蛋白A(ActivinA)(或相似因子例如Nodal)。另一種我們開(kāi)發(fā)的方法(McLean等人，2007)利用生長(zhǎng)在無(wú)飼養(yǎng)層條件下的hESCs，培養(yǎng)基由補(bǔ)充Fgf2的MEF條件培養(yǎng)基組成。之后通過(guò)加入PI3K信號(hào)抑制劑例如LY294002或雷帕霉素，促進(jìn)分化為DE。兩種方法均制備包含~70-80%DE的細(xì)胞群，通過(guò)包括CXCR4、Soxl7、FoxA2等的DE標(biāo)記分析筌定。DE可進(jìn)一步分化成胰腺內(nèi)胚層(PE),其為胰腺細(xì)胞i普系前體的細(xì)胞類(lèi)型，并且表達(dá)如Pdxl的標(biāo)記。在從DE至PE的轉(zhuǎn)變中，細(xì)胞經(jīng)過(guò)腸管樣狀態(tài)(guttubelikestate)。從hESCs在手動(dòng)傳代的MEF飼養(yǎng)層上的生長(zhǎng)描述PE形成的方法。從DE至PE的分化包括細(xì)胞經(jīng)過(guò)腸管樣狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞表達(dá)例如Tcf2/HNF1B和HNF4A的標(biāo)記，并且包括為了至少部分分化在FCS中的培養(yǎng)(D'Amour等人，2006)。我們也描述了通過(guò)加入視黃酸直接從DE培養(yǎng)物形成PE的方法，也包括在FCS中在基質(zhì)膠(Matrigel)上膠原酶?jìng)鞔募?xì)胞的培養(yǎng)(Dalton和KulikUGARF提交2006)。D'Amour等人，NatureBiotech,2005McLean等人，StemCells,Jan.2007D'Amour等人，NatureBiotech,2006如上文所述的方法，在專(zhuān)利提交中或同級(jí)別的出版物中已經(jīng)報(bào)道了幾種用于從hESCs制備DE的方法。這些方法使用祠養(yǎng)成纖維細(xì)胞或無(wú)祠養(yǎng)層條件，但是胎牛血清和/或KSR總是存在的。這就存在問(wèn)題，因?yàn)橛捎谂蔚牟町?，這些成分產(chǎn)生了實(shí)驗(yàn)的不一致性。因?yàn)镕CS和KSR包含不確定的活性，當(dāng)使用hESCs用于治療開(kāi)發(fā)時(shí)，這就存在問(wèn)題。圖1表示在處理定形內(nèi)胚層后，表達(dá)胚胎肝標(biāo)記物(embryoniclivermarker)甲胎蛋白(AFP)的細(xì)胞的制備。在加入LY294002(50|aM)后4天，BG01hESCs分化成為定形內(nèi)胚層。培養(yǎng)基更換為DMEM/F12,10%FCS，并且細(xì)胞生長(zhǎng)至6天以上。未處理:未處理的hESCs。通過(guò)QRT-PCR分析AFP轉(zhuǎn)錄水平，一式三份，在標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的參照轉(zhuǎn)錄后，轉(zhuǎn)錄水平表示為相對(duì)未處理樣本(hESCs)的倍數(shù)增加。注意盡管在加入FgflO后可見(jiàn)最佳的AFP誘導(dǎo)，但在FgflO存在或不存在時(shí)都可得到此結(jié)果。圖2表明在RA處理后，Pdxl轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的時(shí)程。BG01hESCs使用LY294002(50juM)處理4天，之后換至包含DMEM/F12,10%FCS，50ng/mlFgflO和2MM視黃酸的培養(yǎng)基中至多4天。未處理-未處理的hESCs。通過(guò)QRT-PCR分析轉(zhuǎn)錄水平，一式三份，在標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的參照轉(zhuǎn)錄后，轉(zhuǎn)錄水平表示為相對(duì)未處理樣本(hESCs)的倍數(shù)增加。表明Pdxl轉(zhuǎn)錄水平的倍數(shù)誘導(dǎo)。圖3表明在RA處理后，Pdxl和Isll轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的時(shí)程。用LY294002(50UM)處理BGOIhESCs4天，之后換至由DMEM/F12,10%FCS,50ng/mlFgflO和2ixM視黃酸組成的培養(yǎng)基中至多4天。未處理:未處理的hESCs。通過(guò)QRT-PCR分析轉(zhuǎn)錄水平，一式三份，在標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的參照轉(zhuǎn)錄后，轉(zhuǎn)錄水平表示為相對(duì)未處理樣本(hESCs)的倍數(shù)增加。圖4表明在不同培養(yǎng)條件下，Soxl7、AFP和Pdxl的改變。未處理:在MEF-CM、Fgf2、20。/。KSR存在下，培養(yǎng)在基質(zhì)膠上的未處理的BG01hESCs。LYA:在MEF-CM和Fgf2中生長(zhǎng)在基質(zhì)膠上的hESCs用LY294002處理4天。F106d:用LY294002處理4天的hESCs，換至包含F(xiàn)gf10(50ng/ml)、10%FCS的培養(yǎng)基中6天。RA4d/2d:用LY294002處理4天的hESCs，換至包含F(xiàn)gflO(50ng/ml)、2jxMRA、10%FCS的培養(yǎng)基(DMEM/F12)中4天。隨后在缺少RA和FgflO的相同培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2天。通過(guò)QRT-PCR分析Soxl7、AFP和Pdxl轉(zhuǎn)錄，一式三份，在標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的參照轉(zhuǎn)錄后，轉(zhuǎn)錄水平表示為相對(duì)未處理樣本(hESCs)的倍數(shù)增加。圖5表明用RA處理的Pdxl+細(xì)胞的免疫焚光染色。在加入LY294002(50pM)后4天BG01hESCs分化至定形內(nèi)胚層。培養(yǎng)基換為DMEM/F12，10。/。FCS，并且如下細(xì)胞再生長(zhǎng)至多5天。用LY294002處理4天的hESCs換至包含F(xiàn)gflO(50ng/ml)、2jnMRA、10%FCS的培養(yǎng)基(DMEM/F12)5天。處理和未處理(hESCs)生長(zhǎng)在用4%多聚曱醛包被的LabTec細(xì)胞培養(yǎng)玻片上，與探針兔抗-人Pdxl抗體(Chemicon，1:1,000)—起孵育，隨后與AlexaFluor(594nm)標(biāo)記的山羊抗-兔二抗(紅色)一起孵育。在包含DAPI的培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)細(xì)胞，所述DAPI用于使核DAN(藍(lán)色)可視化。圖6表明當(dāng)在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)，表達(dá)例如Oct4、Nanog、Sox2和Rexl的hESCs可分化成三胚層(中胚層、外胚層和定形內(nèi)胚層)或胚外細(xì)月包類(lèi)型。為了制備定形內(nèi)胚層，hESCs轉(zhuǎn)變首選經(jīng)過(guò)中內(nèi)胚層樣狀態(tài)(T+、MixLl+、Wnt3a+)。在經(jīng)過(guò)中內(nèi)胚層細(xì)胞的轉(zhuǎn)變后，可成為定形內(nèi)胚層(CXCR4+、Soxl7+、GATA4,6+、Gsc+、FoxA2+)。定形內(nèi)胚層是可形成其他內(nèi)胚層譜系的前體細(xì)胞類(lèi)型。圖7表明在hESC確定成分培養(yǎng)基配方(a)中使用accutase酶?jìng)鞔腂G02hESCs。為了DE分化，在~18-24小時(shí)后，替換為分化培養(yǎng)基(a),存在或不存在Wnt3a(25ng/ml)。指定時(shí)間從培養(yǎng)基制備RNA，進(jìn)行T、MixLl、GSC、Soxl7和CXCR4轉(zhuǎn)錄的QRT-PCR分析。Q-PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH對(duì)照。'所需實(shí)驗(yàn)(Assaysondemand)'QRT-PCR反應(yīng)來(lái)自AppliedBiosystems公司，并且之前已有描述(McLean等人，2007)。圖8表明發(fā)生定形內(nèi)胚層分化而排除其他的細(xì)胞譜系。BG02hESCs置于確定條件(a)中,在18小時(shí)后，培養(yǎng)基換為含有Wnt3a(25ng/ml)的分化培養(yǎng)基(a)，首先孵育24小時(shí)。時(shí)程進(jìn)行96小時(shí)。在24、48、72和96小時(shí)，收集分化培養(yǎng)基(a)中的未處理hESCs(96小時(shí))或細(xì)胞，用于QRT-PCR分析。'所需實(shí)驗(yàn)'QRT-PCR反應(yīng)來(lái)自AppliedBiosystems公司，并且之前已有描述(McLean等人，2007)。圖9表明BG02hESCs如圖8中接種并分化。指定時(shí)間(UT，未處理；在分化培養(yǎng)基中「al24、48、72、96小時(shí))，固定細(xì)胞并通過(guò)與識(shí)別T(R&DSystems)和Soxl7的抗體孵育進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)實(shí)驗(yàn)(D'Amour等人，2005)。使用DAPI進(jìn)行DNA染色，并顯示合并的DAPI、T和Soxl7染色。放大20倍。圖10表明nanog陽(yáng)性細(xì)胞在分化期間減少。BG02hESCs如圖8、9中接種并分化。指定時(shí)間(UT，未處理；在分化培養(yǎng)基中「a124、48、72、96小時(shí))，固定細(xì)胞并通過(guò)與識(shí)別Nanog的抗體一起孵育進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)實(shí)驗(yàn)。使用DAPI進(jìn)行DNA染色，并顯示合并的DAPI和Nanog染色。放大20倍。圖11表示在分化培養(yǎng)基(a)中分化96小時(shí)，并用識(shí)別DE細(xì)胞表面標(biāo)記物CXCR4的抗體染色的BG02hESCs。未處理的hESC培養(yǎng)物(BG02)僅有非常少量的CXCR4+細(xì)胞(<3%),但>93%的處理細(xì)胞(BG02d4-DE)為CXCR4陽(yáng)性。圖12表示BG02hESCs的明場(chǎng)照片。在確定條件下制備的DE。DE經(jīng)過(guò)4天的時(shí)間制備。放大10倍。圖13表明在確定成分培養(yǎng)基條件下，使用RA處理DE后，與PE形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄的QRT-PCR分析。BG02hESCs經(jīng)4天分化成為DE,在指定時(shí)間在包含視黃酸和Fgf10的培養(yǎng)基中分裂并分化。QRT-PCR數(shù)據(jù)表示為標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH對(duì)照后的數(shù)據(jù)。時(shí)間點(diǎn)指DE形成后的時(shí)間(天)。圖14表明在確定條件下，從hESC-衍生的DE制備的PE培養(yǎng)物的ICC。如在圖13圖例中所描述的進(jìn)行細(xì)胞分化。細(xì)胞用4%多聚曱醛固定，之后在用RA和Fgfl0處理后的2、6、12天用TritonX-100進(jìn)行滲透化處理，之后用山羊抗-人Pdxl抗體或TCF2抗體(R&DSystems)和DAPI(DNA)染色。放大20倍。圖15表明hESC，s至胰內(nèi)胚層細(xì)胞的分化。在確定條件下，這些細(xì)胞如上所述在步驟l(激活蛋白A、低P13激酶或P13激酶抑制劑)分化3-5天，隨后8-10天(步驟2)，時(shí)間在圖中指明，并且Ngn3和PdxlmRNAs的水平使用TaqMan探針進(jìn)行Q-PCR評(píng)價(jià)。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及胰內(nèi)胚層細(xì)胞(PE)，通過(guò)在包含有效量的胎牛血清(FCS-優(yōu)選約10%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清)中，將定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于有效濃度的視黃酸(至少約0.05-0.1嗎/ml，優(yōu)選約0.1-25嗎/ml，更優(yōu)選約0.1-2.0jxg/ml)至少約2天，優(yōu)選至少約4天，并且更優(yōu)選約4天，隨后將步驟l獲得的細(xì)胞暴露于無(wú)視黃酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的FCS(優(yōu)選約10%)至少1天，優(yōu)選至少約2天，從定形內(nèi)胚層細(xì)胞獲得所述胰內(nèi)胚層細(xì)胞。這種方法優(yōu)選導(dǎo)致在處理樣品中至少約35-50%并且優(yōu)選至少約70-80+%的細(xì)胞表達(dá)胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記物，Pdxl和Isll。使用上述本發(fā)明的方法從定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備的細(xì)胞群PE標(biāo)記物Pdxl和Isll的純度高達(dá)70-80%。使用本發(fā)明的方法，在人定形內(nèi)胚層細(xì)胞(DE)處理后，通常觀察到PdxlmRNA增加從70倍至幾百倍。這種制備的有效性是出人意料的。在現(xiàn)有技術(shù)方法中，從DE制備PE(Pdxl+和Isll+)的有效性通常在約10-20%的范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，可以使用與上述胰內(nèi)胚層細(xì)胞相同的制備方法，定形內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞分化成為肝內(nèi)胚層細(xì)胞，但在此方法中，用有效量10ng/ml-100ng/ml(優(yōu)選，約50ng/ml)的FgflO代替視黃酸。盡管在本發(fā)明中可使用任何定形內(nèi)胚層(DE)，但優(yōu)選的內(nèi)胚層是使用PI3K抑制劑LY294002從人胚胎干細(xì)胞獲得的。在用于從hESC獲得DE的方法中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中hESC，s暴露于LY294002約4-5天，以獲得優(yōu)選用于制備表達(dá)生物標(biāo)記物的胰腺內(nèi)胚層的定形內(nèi)胚層。DE是人細(xì)胞型，具有分化成包括肝、肺、胰腺、胸腺、腸、胃和曱狀腺的細(xì)胞的能力。在本發(fā)明中，用我們方法已能夠制備胰腺內(nèi)胚層(PE)細(xì)胞，從而最終高效率地、持續(xù)地提供胰島(3細(xì)胞。本方法建立了定形內(nèi)胚層分化成為胰腺內(nèi)胚層(PE)的方便的方法。胰腺內(nèi)胚層是具有分化成為包括P細(xì)胞的多種胰腺譜系能力，但不再具有分化成為非-胰腺譜系細(xì)胞的能力的細(xì)月包。一方面，本發(fā)明涉及具有高達(dá)70-80+%胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記物Pdxl和/或Isll的細(xì)胞群。在本發(fā)明中，人胚胎干細(xì)胞(hESCs)經(jīng)過(guò)下列處理以形成定形內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞，在任選包含胎牛血清(FCS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于有效濃度的視黃酸至少約2天，優(yōu)選至少4天，并且更優(yōu)選約4天，隨后使步驟l中的分化細(xì)胞接觸沒(méi)有視黃酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(優(yōu)選包含有效量的FCS)至少一天，優(yōu)選至少約2天。此方法優(yōu)選導(dǎo)致至少約50%和優(yōu)選至少約70-80+o/。的被處理的樣品中的細(xì)胞表達(dá)胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記物Pdxl和/或Isll。除了上述優(yōu)選的用于制備起始的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，在本發(fā)明中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方法制備，包括例如在美國(guó)申請(qǐng)出版物20060003446中G.Keller等人；20060003313中K.D，Amour等人、20050158853中K.D，Amour等人和20050260749中JonOdorico等人建立的方法，相關(guān)部分在此引用作為參考。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及改善hESCs分化成為DE,和之后成為成為PE的方法和條件，其使用確定成分培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基不使用不確定成分，例如胎牛血清或血清補(bǔ)充物例如KSR培養(yǎng)基。DE制備的有效性和培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)固性與之前的報(bào)道相比顯著增大。在這些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下，從哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選人胚胎干細(xì)胞，產(chǎn)生定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，包括使用生長(zhǎng)基質(zhì)或如本文所述的方法，將接種的胚胎干細(xì)胞暴露于確定成分培養(yǎng)基或MEF條件培養(yǎng)基，并且之后將干細(xì)胞暴露于為確定成分的培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基(沒(méi)有胎牛血清或KSR類(lèi)型血清成分并且無(wú)IGF和胰島素)，所述培養(yǎng)基包含有效量的SMAD通路激動(dòng)劑，例如TGF卩超家族成員(濃度為從1ng/ml至100ng/ml，優(yōu)選約25-50ng/ml)，例如激活蛋白A、nodal、TGF(3或其他TGF成分，并且任選的包含PI3激酶信號(hào)抑制劑(如本文所述)。任選的，包括有效量的牛血清白蛋白(約0.5-3%，優(yōu)選約2%)以提供蛋白質(zhì)源。優(yōu)選的，確定成分培養(yǎng)基包含P13K信號(hào)抑制劑。優(yōu)選的，包括有效量的Wnt3a(1ng/ml至約100ng/ml，優(yōu)選約25ng/ml)。優(yōu)選的，生長(zhǎng)基質(zhì)如本文所述為基質(zhì)膠。在此方面，本發(fā)明提供了通過(guò)將干細(xì)胞暴露于包括促進(jìn)分化成為定形內(nèi)胚層細(xì)胞成分的，無(wú)血清或因子(IGF或胰島素)或促機(jī)PI3激酶活性的成分的確定成分培養(yǎng)基(使用有效量的激活蛋白A、nodal或TGFP或如本文所述的其他物質(zhì))，從人胚胎干細(xì)胞(生長(zhǎng)在任何培養(yǎng)基中，優(yōu)選確定成分培養(yǎng)基中)提供高水平定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。在約3-6天之后，優(yōu)選4-5天后獲得的定形內(nèi)胚層細(xì)胞可暴露于在確定成分培養(yǎng)基(優(yōu)選包含Wnt3a和BSA)中有效濃度的視黃酸(至少約0.1-0.2嗎/ml，優(yōu)選至少約l嗎/ml，約2-25jxg/ml，更優(yōu)選約10(ig/ml,并且任選的有效量的FgflO(濃度約1ng/ml至約100ng/ml，優(yōu)選濃度約50ng/ml)約5-12天，優(yōu)選約8-10天，以制備表達(dá)Pdxl和Isll標(biāo)記物的胰腺內(nèi)胚層(PE)細(xì)胞，所述細(xì)胞可再暴露于相同培養(yǎng)基幾天(約1-5天)以制備表達(dá)Ngn3和Nkx6.1標(biāo)記物的內(nèi)分泌胰腺細(xì)胞。本發(fā)明適用于在多種無(wú)飼養(yǎng)層條件下生長(zhǎng)的hESCs的培養(yǎng)，條件包括但不限制于細(xì)胞生長(zhǎng)在1.在基質(zhì)上例如基質(zhì)膠上MEF條件培養(yǎng)基，其包含分化試劑；2.確定成分培養(yǎng)基制劑，其不使用條件培養(yǎng)基、FCS或KSR型血清補(bǔ)充物。如本文所述的方法，代替基質(zhì)膠使用BDCell-TakCell和TissueAdhesive、BDTMFIBROGENHumanRecombinantCollagenI、BDFIBROGENHumanRecombinantCollagenIII、BDMatrigelTMBasementMembraneMatrix、BDMatrigelTMBasementMembraneMatrixHighConcentration(HC)、BDPuraMatrixTMPeptideHydrogel、CollagenI、CollagenIHighConcentration(HC)、CollagenII(Bovine)、CollagenIII、CollagenIV、CollagenV和CollagenVI等，其包括有效量的層粘連蛋白、牛腱蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、膠元、纖連蛋白、vibronectin、多聚賴氨酸、多聚鳥(niǎo)氨酸及其混合物中的一種或多種。本發(fā)明還涉及從胚胎干細(xì)胞優(yōu)選人胚胎干細(xì)胞制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，該方法包括無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞將胚胎干細(xì)胞暴露于分化培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含較高水平的激活蛋白A、nodal或TNF(3,并且任選的包含PD激酶信號(hào)抑制劑，其中分化培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基，無(wú)胎牛血清或KSR類(lèi)型血清成分。在本發(fā)明的一方面，從胚胎千細(xì)胞制備至少約90%的定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施方案中定形內(nèi)胚層細(xì)胞或其他本領(lǐng)域可用的細(xì)胞可進(jìn)一步分化為胰內(nèi)胚層細(xì)胞。發(fā)明詳述下列術(shù)語(yǔ)用于描述本發(fā)明除非另有說(shuō)明，根據(jù)相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解本文使用的術(shù)語(yǔ)。除了下面提供的術(shù)語(yǔ)的定義外，分子生物學(xué)中的常用術(shù)語(yǔ)的定義可見(jiàn)Rieger等人,1991Glossaryofgenetics:classicalandmolecular,第5片反，柏林Springer-Verlag;和CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人，Eds.,CurrentProtocols,GreenePublishingAssociates,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.，(1998Supplement)聯(lián)合出版。應(yīng)當(dāng)理解如在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所使用的"a"或"an"可表示一種或多種，這依賴于所使用之處的上下文。因此，例如"a細(xì)胞"可指至少一種細(xì)胞。參照下列本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案和本文包含的實(shí)施例的詳細(xì)說(shuō)明，可更容易地理解本發(fā)明。然而，在公開(kāi)和描述本發(fā)明的組合物和方法前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限制于特定的條件，或特定的方法等，當(dāng)然本發(fā)明的改變和多種修改和變更對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。對(duì)于生長(zhǎng)細(xì)胞、分離細(xì)胞和相關(guān)克隆、DNA分離、擴(kuò)增和純化，對(duì)于酶反應(yīng)(包括DNA鏈接酶、DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶等)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，和各種分離技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并且是常用的。許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)描述于Sambrook等人，1989MolecularCloning第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Plainview，紐約；Maniatis等人，1982MolecularCloning,冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Plainview，紐約；Wu(Ed.)1993Meth.Enzymol.218,第I部分;Wu(Ed.)1979Meth.Enzymol.68;Wu等人，(Eds.)1983Meth.Enzymol.100和101;Grossman和Moldave(Eds.)1980Meth.Enzymol.65;Miller(ed.)1972ExperimentsinMoleculargenetics,冷泉港實(shí)'瞼室，冷7良港，紐約；Old和Primrose,1981PrinciplesofGeneManipulation,CaliforniaPress大學(xué),Berkeley;Schleif和Wensink，1982PracticalMethodsinMolecularBiology;Glover(Ed.)1985DNACloning,巻I和II,IRLPress,牛津，英國(guó)；Hames和Higgins(Eds.)1985NucleicAcidHybridization,IRLPress,牛津，英國(guó)；以及Setlow和Hollaender1979基因ticEngineering:PrinciplesandMethods,巻1-4，PlenumPress,紐約。使用的縮寫(xiě)和術(shù)語(yǔ)認(rèn)為在本領(lǐng)域中是標(biāo)準(zhǔn)的并且在專(zhuān)業(yè)雜志，例如本文引用的雜志中是常用的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"分化試劑"指誘導(dǎo)細(xì)胞例如hESC，s或定形內(nèi)胚層細(xì)胞部分或最終分化的任何化合物或分子，其中所述分化是至少部分由于PI3-激酶通路(用于定形內(nèi)胚層細(xì)胞的形成)信號(hào)的抑制，包括有效量的視黃酸以形成胰內(nèi)胚層細(xì)胞或包括有效量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10(Fgfl0)以形成肝內(nèi)胚層細(xì)胞。分化試劑為如下描述，但此術(shù)語(yǔ)并不限制于此。本文使用的術(shù)語(yǔ)"分化試劑"包括表現(xiàn)相似生物活性的天然或合成分子的范圍內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"PI3-激酶通路抑制劑"指在接觸抑制劑的細(xì)胞中，降低PI3-激酶活性或PI3-激酶下游的至少一種分子的任何分子或化合物。這些抑制劑是用于制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的優(yōu)選的抑制劑，所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞是本發(fā)明中使用的原料細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)包括，例如PI3-激酶拮抗劑，PI3-激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)的拮抗劑，降低內(nèi)源性PI3-激酶的合成或表達(dá)的化合物，降低內(nèi)源性PI3-激酶釋放的化合物，和抑制PI3-激酶活性激動(dòng)劑的化合物。在上述的一些實(shí)施方案中，抑制劑選自雷帕霉素、LY294002、渥曼青霉素、氯化鋰、Akt抑制劑I、Akt抑制劑II(SH-5)、Akt抑制劑III(SH-6)、NL-71-101，和上述混合物。Akt抑制劑I、II、AktlII和NL-71-101在Calbiochem公司有售。在其他實(shí)施方案中，抑制劑選自雷帕霉素和LY294002。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，抑制劑包括LY294002。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑包括Aktl-II。應(yīng)當(dāng)理解可使用抑制劑的組合，以產(chǎn)生所需的分化效果。最終的結(jié)果為制備大量的定形內(nèi)胚層細(xì)胞，根據(jù)本發(fā)明作為起始細(xì)胞林用于制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞和/或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多能hESC細(xì)胞與有效量的PI3-激酶通路抑制劑接觸(優(yōu)選LY294002,也稱(chēng)為[2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4//-1-苯并吡喃-4-酉同，Calbiochem有售，許多其他的生物化學(xué)制造廠家有售)，以制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞，并且由此制備的定形內(nèi)胚層細(xì)胞與有效量的視黃酸(約0.005-25Hg/ml，更優(yōu)選約0.1-2.0(ag/ml，更優(yōu)選約0.2-2.0嗎/ml)，在包含胎牛血清(約1.0%至約20%,優(yōu)選約10%的胎牛血清)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接觸。定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于包含視黃酸的培養(yǎng)基至少約2天，優(yōu)選至少約4天，更優(yōu)選約4天，此后將細(xì)胞暴露于包含F(xiàn)CS(優(yōu)選約10%)的無(wú)視黃酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基至少l天，優(yōu)選至少約2天。優(yōu)選將細(xì)胞在每步分離，但可不分離而簡(jiǎn)單進(jìn)行。這種方法優(yōu)選導(dǎo)致在處理樣品中至少約30%、至少40%、至少50%、至少60%和優(yōu)選至少約70-80+。/。的細(xì)胞表達(dá)胰腺內(nèi)胚層標(biāo)記物Pdxl和/或Isll。使用上述本發(fā)明的方法從定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備PE標(biāo)記物Pdxl和Isll純度高達(dá)70-80%的細(xì)胞群。使用本發(fā)明的方法，處理人胚胎干細(xì)胞(hESCs)后，通常觀察到PdxlmRNA表達(dá)增加70-倍至幾百倍。并且Isll也顯著增加。制備的有效性是出人意料的結(jié)果。在現(xiàn)有技術(shù)方法中，從hESC，s的PE(Pdxl十和Isll+)制備的有效性在約10-20%的范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，通過(guò)下列相同的方法，定形內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞可分化為肝內(nèi)胚層(LE)細(xì)胞，所述方法使用上述胰內(nèi)胚層細(xì)胞的制備方法，但使用有效量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選FgflO代替視黃酸，所述量?jī)?yōu)選約10ng/ml-100ng/ml，優(yōu)選約25ng/ml-75ng/ml,更優(yōu)選約50ng/ml。在此方法中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，優(yōu)選包含F(xiàn)CS(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中約1%至約20%，優(yōu)選約10。/。的FCS),暴露于一種多種的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，優(yōu)選FgflO,至少1天，優(yōu)選至少約2天，甚至更優(yōu)選至少約4天或更長(zhǎng)，或者優(yōu)選約4天，隨后來(lái)自步驟1的細(xì)胞暴露于基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基任選地包含有效量的胎牛血清(約1%至約20%，優(yōu)選約10%FCS)并且無(wú)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，至少l天，并且優(yōu)選至少約2天，或者優(yōu)選約2天。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于改善使用確定成分培養(yǎng)基使hESCs分化成為DE和之后成為PE的方法和條件，所述確定成分培養(yǎng)基不使用不確定的成分，例如胎牛血清或血清補(bǔ)充物，例如KSR培養(yǎng)基。DE制備的有效性和培養(yǎng)系統(tǒng)的穩(wěn)固性與之前的報(bào)道相比顯著增加。在這些其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下，從哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，優(yōu)選人胚胎干細(xì)胞制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，包括使用生長(zhǎng)基質(zhì)或如本文所述的方法，將接種的胚胎干細(xì)胞暴露于確定成分培養(yǎng)基或MEF條件培養(yǎng)基，并且之后將干細(xì)胞暴露于為確定成分培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基(無(wú)胎牛血清或KSR-型血清成分，并且無(wú)IGF和胰島素)，該培養(yǎng)基包含有效量的SMAD通路激動(dòng)劑，例如TGFP超家族成員(濃度1ng/ml至100ng/ml,優(yōu)選約25-50ng/ml),例如激活蛋白A、nodal、TGF卩或其他TGF成分，和任選的PI3激酶信號(hào)抑制劑(如本文所述)。任選地，包含有效量的牛血清白蛋白(約0.5-3%，優(yōu)選約2%),以提供蛋白質(zhì)源。優(yōu)選的，確定成分培養(yǎng)基包含P13K信號(hào)抑制劑。優(yōu)選的，包含有效量的Wnt3a(1ng/ml至約100ng/ml，優(yōu)選約25ng/ml)。優(yōu)選的，生長(zhǎng)基質(zhì)如本文所述為基質(zhì)膠。此方面，本發(fā)明的方法提供了通過(guò)將干細(xì)胞暴露于包含促進(jìn)分化為定形內(nèi)胚層細(xì)胞的成分(使用有效量的激活蛋白A、nodal或TGFP或如本文所述)的，無(wú)血清或因子(IGF或胰島素)或促進(jìn)PI3激酶活性的成分的確定成分的培養(yǎng)基，從人胚胎干細(xì)胞(生長(zhǎng)在任何培養(yǎng)基中，優(yōu)選確定成分的培養(yǎng)基)得到高水平的定形內(nèi)胚層。在約3-6天后優(yōu)選4-5天后獲得定形內(nèi)胚層細(xì)胞，黃酸(至少約0.1-0.2嗎/ml,優(yōu)選至少約1pg/ml,約2-25昭/ml，更優(yōu)選約10嗎/ml,并且任選的有效量的FgflO(濃度約1ng/ml至約100ng/ml，優(yōu)選濃度約50ng/ml)8-10天，以制備表達(dá)Pdxl和Isll標(biāo)記物的胰腺內(nèi)胚層(PE)細(xì)胞，所述細(xì)胞再暴露于相同的培養(yǎng)基幾天(約1-5天)，以制備表達(dá)Ngn3和Nkx6.1標(biāo)記物的內(nèi)分泌胰腺細(xì)月包。在上述每種方法中，細(xì)胞可通過(guò)用胰蛋白酶或accutase或相似試劑傳代而分離，游離并進(jìn)行本發(fā)明的方法，或任選的，并且優(yōu)選的，來(lái)自每步的層制備的細(xì)胞不用進(jìn)一步分離進(jìn)行下個(gè)步驟。細(xì)胞也可在使用前離心并吹打，從而限制細(xì)胞樣品的大小，從而形成單細(xì)胞或包含較少細(xì)胞的細(xì)胞蔟。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"有效量"指在本發(fā)明中任何用于制備目的結(jié)果的成分或材料的量和濃度。術(shù)語(yǔ)可應(yīng)用于P13-激酶抑制劑例如LY294002，可有利地用于制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞，可應(yīng)用于視黃酸，作為分化試劑使用以從定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞，或應(yīng)用于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，作為分化試劑使用以從定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞等。術(shù)語(yǔ)"視黃酸"指全反式視黃酸。術(shù)語(yǔ)Fgf成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子指生長(zhǎng)因子，用于在無(wú)視黃酸的本發(fā)明的方法中使用，以制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞。盡管一種或多種的各種成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可在本發(fā)明的方法中使用，優(yōu)選的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10(Fgf10)。術(shù)語(yǔ)"基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，，、"基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基"或"基礎(chǔ)培養(yǎng)基"或"細(xì)胞分化培養(yǎng)基"或"穩(wěn)定培養(yǎng)基"用于描述細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞，或任選的，定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化成為胰腺內(nèi)胚層(PE)細(xì)胞或肝內(nèi)胚層(PE)細(xì)胞，或分化后穩(wěn)定。基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基在本領(lǐng)域是眾所周知的，并且包含至少最小量的培養(yǎng)基，和任選的成分例如生長(zhǎng)因子，包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、視黃酸、葡萄糖、非必需氨基酸、鹽(包括微量元素)、谷氨酰胺、胰島素(標(biāo)明，并不排除)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、P巰基乙醇和其他本領(lǐng)域已知的試劑和如本文所述的試劑。優(yōu)選的培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含2%至20%(優(yōu)選，約10。/。)的胎牛血清，或無(wú)胎牛血清和KSR但包含牛血清白蛋白的確定成分培養(yǎng)基。包含10%FCS的DMEM/F12是特別優(yōu)選的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。在本發(fā)明中使用的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基是市售的，并可用市售成分補(bǔ)充，在許多商業(yè)來(lái)源中InvitrogenCorp.(GIBCO)、CellApplicationsInc.和BiologicalIndustries,BethHaEmek以色列有售。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將至少一種分化試劑例如纟見(jiàn)黃酸、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或LY294002加入至細(xì)胞培養(yǎng)基，干細(xì)胞或前體細(xì)胞生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中從而進(jìn)行干細(xì)胞至前體細(xì)胞前體領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠容易地改變細(xì)胞培養(yǎng)基，以根據(jù)本發(fā)明制備前體或胰腺/肝細(xì)胞。細(xì)胞分化培養(yǎng)基基本上與基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基同義，但在本文中用于分化過(guò)程，并且包含細(xì)胞分化試劑，以分化細(xì)胞至其他細(xì)胞。穩(wěn)定培養(yǎng)基是在分化步驟前或后使用的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，以穩(wěn)定細(xì)胞株以備后用。一般而言，如本文所用，細(xì)胞分化培養(yǎng)基和穩(wěn)定培養(yǎng)基可包含基本相似的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的成分，但在不同的地方使用，并且可包含不同的成分從而影響培養(yǎng)基使用的目的結(jié)果。在優(yōu)選的在確定成分的培養(yǎng)基中("確定成分的培養(yǎng)基")形成胰內(nèi)胚層細(xì)胞的案例中，培養(yǎng)基是確定的最低標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(優(yōu)選來(lái)自Gibco的DMEM/F1250:50),其排除了胎牛血清或KSR(基因敲除代血清)、胰島素和IGF，但包括SMAD通路激動(dòng)劑，例如TGF(3超家族成員(濃度1ng/ml至100ng/ml,優(yōu)選約25-50ng/ml)，例如激活蛋白A、nodal、TGF(3或其他TGF成分，和任選的有效量的PI3激酶信號(hào)抑制劑(如本文所述)。任選的包括有效量的牛血清白蛋白(約0.5-3%,優(yōu)選約2%)以提供蛋白質(zhì)源。優(yōu)選確定成分培養(yǎng)基包含P13K信號(hào)抑制劑。優(yōu)選包含有效量的Wnt3a(1ng/ml至約100ng/ml，優(yōu)選約25ng/ml。優(yōu)選生長(zhǎng)基質(zhì)如本文所述為基質(zhì)膠。細(xì)胞優(yōu)選生長(zhǎng)在細(xì)胞支持物上。在本發(fā)明中，基質(zhì)膠作為細(xì)胞支持物使用是優(yōu)選的。細(xì)胞支持物優(yōu)選包含至少一種分化蛋白。術(shù)語(yǔ)"分化蛋白"用于描述使細(xì)胞促進(jìn)胚胎干細(xì)胞或定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化的蛋白(也優(yōu)選attachment)。本發(fā)明中使用的優(yōu)選的分化蛋白包括，例如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其是在細(xì)胞外基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的蛋白，例如層粘連蛋白、生腱蛋白、血小板反應(yīng)蛋白和其混合物，促進(jìn)生長(zhǎng)并包含表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的同源性結(jié)構(gòu)域，表現(xiàn)出生長(zhǎng)促進(jìn)和分化活性?？稍诒景l(fā)明中使用的其他分化蛋白包括例如膠元、纖連蛋白、vibronectin、多聚賴氨酸、多聚鳥(niǎo)氨酸和其混合物。此外，也可可使用包含有效濃度的一種或多種胚胎干細(xì)胞分化蛋白的凝膠和其他材料。包括這些分化蛋白的示例的胚胎干細(xì)胞分化蛋白或材料包括，例如BDCell-TakTMCell和TissueAdhesive、BDTMFIBROGENHumanRecombinantI、BDTMFIBROGENHumanRecombinantCollagenIII、BDMatrigelBasementMembraneMatrix、BDMatrigelBasementMembraneMatrixHighConcentration(HC)、BDTMPumMatrixPeptideHydrogel、CollagenI、CollagenIHighConcentration(HC)、CollagenII(牛)、CollagenIII、CollagenIV、CollagenV和CollagenVI等。用于本發(fā)明的優(yōu)選的分化蛋白材料包括Matrigel材料。包含一種或多種分化蛋白的優(yōu)選的組合物/材料是BDMatrigelBasementMembraneMatrix。它是可溶的基底膜制備物，其乂人Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取，所述肉瘤是ECM蛋白豐富的肺瘤。其主要成分是層粘連蛋白，其次是膠元IV、硫酸乙酰肝素、蛋白聚糖類(lèi)、觸覺(jué)蛋白(entactin)和巢蛋白(nidogen)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"激活，，指Pdxl或Isll表達(dá)的增加，或Pdxl,Isll或肝標(biāo)記物活性的上調(diào)。如本文所用，當(dāng)涉及細(xì)胞、細(xì)胞林、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群，術(shù)語(yǔ)"游離的"指從細(xì)胞的自然來(lái)源大體上分離，從而使細(xì)胞、細(xì)胞抹、細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞群可在體外培養(yǎng)。此外，術(shù)語(yǔ)"游離"指從兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群物理選擇(physicalselection)出一種或多種細(xì)胞，其中的選擇根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和/或各種標(biāo)記物的表達(dá)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"指在細(xì)胞中多聚核苷酸的轉(zhuǎn)錄或多肽的翻譯，從而使表達(dá)分子的細(xì)胞的分子水平顯著高于不表達(dá)分子的細(xì)胞。測(cè)量分子表達(dá)的方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是眾所周知的，并且包括并不限制于Northern雜交、RT-PCT、原位雜交、蛋白免疫印跡和免疫染色。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"接觸"(即定形內(nèi)胚層細(xì)胞與化合物接觸)為了在體外共同孵育化合物和細(xì)胞(例如，在培養(yǎng)物中的細(xì)胞中加入化合物)。術(shù)語(yǔ)"接觸"并不包括細(xì)胞在體內(nèi)暴露于視黃酸、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或其他分化試劑，例如受試者自然制備的PI3-激酶通路抑制劑(即，可能是自然的生理過(guò)程導(dǎo)致的暴露)?？捎萌魏魏线m的方式使細(xì)胞接觸視黃酸或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，或PB-激酶通路抑制劑例如LY294002制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞。例如，細(xì)胞可貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)。應(yīng)當(dāng)理解的是接觸分化試劑的細(xì)胞可進(jìn)一步用其他的細(xì)胞分化環(huán)境處理，以穩(wěn)定細(xì)胞，或進(jìn)一步分化細(xì)胞，例如制備胰島細(xì)胞。申請(qǐng)人已表證在基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中用視黃酸的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的培養(yǎng)制備分化的細(xì)胞，如胰腺或肝內(nèi)胚層細(xì)胞，其中細(xì)胞比自發(fā)分化的細(xì)胞具有更大的均一性。本發(fā)明涉及包含游離的分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群，優(yōu)選人胰內(nèi)胚層細(xì)胞的組合物，其中在體外細(xì)胞從多能或定形內(nèi)胚層細(xì)胞分化，其中大于約30%的細(xì)胞表達(dá)Pdxl和/或Isll。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，大于約35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、67%、70%、72%、74%、75%、76%、77%、78%、79°/?；蛏踔?0%的細(xì)胞表達(dá)Pdxl和/或Is11。優(yōu)選的，在包括細(xì)胞群的組合物中，至少50%表達(dá)Pdxl和/或Isll的細(xì)胞，高達(dá)70-80%或更多。本發(fā)明還涉及包含游離的肝內(nèi)胚層細(xì)胞的同源細(xì)胞群的組合物，其中細(xì)胞在體外分化培養(yǎng)，其中大于約350/。、40%、45%、50%、55%、60%、65%、67%、70%、72%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或甚至80%的細(xì)胞是肝內(nèi)胚層細(xì)胞。本發(fā)明還包括分化多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人多能細(xì)胞，成為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，包括(a)提供多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和(b)將多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞與有效量的PI3-激酶信號(hào)通路抑制劑接觸，以至少部分的分化多能細(xì)胞為定形內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞，并且之后使用視黃酸作為分化試劑在包含有效量的FCS(優(yōu)選約10%)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(優(yōu)選DMEM/F12)，分化定形內(nèi)胚層細(xì)胞為胰內(nèi)胚層細(xì)胞。內(nèi)胚層細(xì)胞可為游離的，但優(yōu)選暴露于無(wú)視黃酸的DMEM/F12，任選的包含F(xiàn)CS(優(yōu)選約10%)再1天或更長(zhǎng)(優(yōu)選2天)，其中胰內(nèi)胚層細(xì)胞是游離的。胰內(nèi)胚層細(xì)胞可進(jìn)一步分化為胰腺(3細(xì)胞。在本發(fā)明任選的實(shí)施方案中，肝內(nèi)胚層細(xì)胞的制備與上述步驟相同，但替代用視黃酸分化定形內(nèi)胚層細(xì)胞，去除視黃酸，并且在成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Fgf10)存在下分化，由此制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞而不是胰內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所述的方法，胰內(nèi)胚層細(xì)胞可進(jìn)一步分化為胰腺p-細(xì)胞，并在糖尿病治療中使用(類(lèi)型1)?？紤]到通過(guò)與視黃酸接觸分化定形內(nèi)胚層細(xì)胞以制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中，與視黃酸接觸之前，分離細(xì)胞成基本單個(gè)的細(xì)胞培養(yǎng)物。使用蛋白酶，例如但不限制于胰蛋白酶，分離細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在接種后細(xì)胞與視黃酸接觸12小時(shí)至約6天，接種后接觸12小時(shí)至約48小時(shí)，或接種后接觸約24小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞與視黃酸接觸大于24小時(shí)、大于約48小時(shí)、或大于約72小時(shí)、大于約96小時(shí)、或約96小時(shí)。在暴露于基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基的視黃酸后，可直接分離獲得的胰內(nèi)胚層細(xì)胞(胰蛋白酶作用)，并且之后任選的并且優(yōu)選的暴露于無(wú)視黃酸的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基(任選的，包含F(xiàn)CS)至少12小時(shí)、至少24小時(shí)、至少48小時(shí)或48小時(shí)，或任選的，從暴露于視黃酸獲得的未分離胰內(nèi)胚層細(xì)胞，可再暴露于無(wú)視黃酸的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。優(yōu)選的，在細(xì)胞用組合物培養(yǎng)大于約24小時(shí)，優(yōu)選至少48小時(shí)后，視黃酸有效的引起定形內(nèi)胚層細(xì)胞向胰腺內(nèi)胚層譜系分化?？紤]當(dāng)細(xì)胞接種大于約12小時(shí)，在細(xì)胞與抑制劑接觸前，或當(dāng)細(xì)胞已接種約24小時(shí)，在細(xì)胞接觸抑制劑前，視黃酸有效的引起多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞向內(nèi)胚層譜系的分化。在一些實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞以低于約2.5x106細(xì)胞/35mm平皿的濃度接種，至少約2.5x104細(xì)胞/35mm平皿，在約2.5x105至約2x106細(xì)月包/35mm平皿之間，在約5x105至約2x106細(xì)胞/35mm平皿之間，寸氐于約2xl06細(xì)胞/35mm平皿,或密度大于4x105纟田胞/35mm平亞。在一些優(yōu)選方面，定形細(xì)胞以約7.5x105細(xì)胞/35mm平皿的濃度接種。在從多能細(xì)胞特別是人胚胎干細(xì)胞(hESC)制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞中，如在本發(fā)明可選的實(shí)施方案的第一步中，本發(fā)明還包括使用組合物培養(yǎng)細(xì)胞，包括細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基和分化試劑，所述分化試劑為PI3-激酶通路抑制劑，從而分化胚胎干細(xì)胞為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，抑制劑選自LY294002、雷帕霉素、渥曼青霉素、氯化鋰、Akt抑制劑I、Akt抑制劑II、Akt抑制劑III、NL-71-101,和其混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑是雷帕霉素。在一些實(shí)施方案中，雷帕霉素最初濃度為約0.1nM至約500nM、約0.5nM至約250nM、約1.0nM至約150nM、或約1.5nM至約30nM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑是LY294002。在一些實(shí)施方案中，LY294002最初濃度為約1至約500^M、約2.5至約400^M、約5|_iM至約250iliM、約10|iM至約200|aM或約20至約163(iM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制劑為Aktl-II。在一些實(shí)施方案中，Aktl-II最初濃度為約0.1|iM至約500|uM、約1|LiM至約250|aM、約5pM至約20)liM、約10|aM至約100pM，或約40|aM?；A(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基可還包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。在一個(gè)用于制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF是bFGF。在實(shí)施方案中，bFGF最初濃度約0.1ng/ml至約100ng/ml、約0.5ng/ml至約50ng/ml、約1ng/ml至約25ng/ml、約1ng/ml至約12ng/ml,或最初濃度約8ng/ml。在從定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞的實(shí)施方案中，F(xiàn)GF優(yōu)選FGF10，有效濃度通常在從約lng/ml至約100ng/ml，優(yōu)選約10ng/ml至約90ng/ml，優(yōu)選約25至約75ng/ml,優(yōu)選約50ng/ml的范圍內(nèi)。FGF也包含在用于制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，濃度約1至約100ng/ml,優(yōu)選約10至約50ng/ml。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基為條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基可從飼養(yǎng)層(feedlayer)獲得。考慮祠養(yǎng)層可包含成纖維細(xì)胞，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，包含胚胎成纖維細(xì)胞。當(dāng)有效地制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞時(shí)，這特別相關(guān)。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基可從飼養(yǎng)層獲得?？紤]當(dāng)制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞時(shí)，祠養(yǎng)層包含成纖維細(xì)胞，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，包含胚胎成纖維細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的條件培養(yǎng)基包含DMEM/F-12(50/50)、約20%KSR、約0.1mMNEAA、約2mML-谷氨酰胺、約50U/ml青霉素、約50pg/ml鏈霉素，和約8ng/mlbFGF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)基包括TGF(3家族成員。在一些實(shí)施方案中，TGF(3家族成員選自Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B、TGF-P、BMP2和BMP4。在其他實(shí)施方案中，TGF-卩家族成員是激活蛋白A或Nodal。在特定實(shí)施方案中，激活蛋白A的最初濃度為約1ng/ml至約1mg/ml、約10ng/ml至約500ng/ml、約25ng/ml至約250ng/ml、約50ng/ml至約200ng/ml、或約100ng/ml。在其他實(shí)施方案中，Nodal的最初濃度約100ng/ml至約5mg/ml、約500ng/ml至約2.5mg/ml、約800ng/ml至約1.5mg/ml,或約1mg/ml。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與胰內(nèi)胚層細(xì)胞制備相關(guān)，條件培養(yǎng)基優(yōu)選包含DMEM/F-12(50/50),含有約10。/。FCS,約0.2|im(微摩爾)視黃酸和10-50ng/mlFgflO。在此實(shí)施方案中，游離的定形內(nèi)胚層細(xì)胞(從離心步驟吹打)重懸在上述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中，并以優(yōu)選約7.5x105細(xì)胞/100mm的濃度接種在涂覆基質(zhì)膠的組織培養(yǎng)皿上。培養(yǎng)皿在37。C/5。/oC02孵育，并且每日更換培養(yǎng)基。4天后，培養(yǎng)基換為DMEM/F12、10。/。FBS1-4天(無(wú)視黃酸或Fgf),之后可游離胰內(nèi)胚層細(xì)胞，或可選的，再次進(jìn)行分化，成為胰腺p細(xì)胞，所述胰腺(3細(xì)胞用于治療患有I或II型糖尿病的患者。通過(guò)參考下列本文包括的本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案的詳述和實(shí)施例，可容易的理解本發(fā)明。然而，在本組合物和方法公開(kāi)和描述前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限制于特別的核酸、特別的多肽、特別的細(xì)胞類(lèi)型、特別的宿主細(xì)胞、特別的條件或特別的方法等，當(dāng)然其中的改變和許多修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"內(nèi)胚層"包括，但不限制于定形內(nèi)胚層；體壁內(nèi)胚層、臟壁內(nèi)胚層，和中內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"定形內(nèi)胚層"指早期內(nèi)胚層細(xì)胞，其具有分化成為任何或多種內(nèi)胚層細(xì)胞類(lèi)型的能力，所述內(nèi)胚層細(xì)胞從胚胎中的內(nèi)胚層譜系(即胰腺、肝、肺、胃、腸和曱狀腺)產(chǎn)生。定形內(nèi)胚層細(xì)胞是多能的。因此，本發(fā)明文中使用的術(shù)語(yǔ)"定形內(nèi)胚層"指至少向內(nèi)胚層細(xì)胞類(lèi)型分化多于從其衍生的多能細(xì)胞的分化。并且，如本文所用，制備內(nèi)胚層細(xì)胞包括制備富含內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。如本文所用，"定形內(nèi)胚層"細(xì)胞的特征在于表達(dá)特異的標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄，例如S0X17,伴隨無(wú)標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄的胚胎外內(nèi)胚層，例如AFP和血栓調(diào)節(jié)蛋白。此外這種細(xì)胞可表達(dá)CXCR4、GATA4、GATA4.6和GSC。此外，LY處理導(dǎo)致最初未分化的hES細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞表面CD標(biāo)記物的丟失，包括但不限制于CD9、27、30、46、58和81。在一些本發(fā)明的實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)SOX17標(biāo)記物基因水平高于SOX7的水平，SOX17為臟壁內(nèi)胚層特征的標(biāo)記物基因。此外，在特定的實(shí)施方案中，SOX17標(biāo)記物基因的表達(dá)高于OCT4標(biāo)記物基因的表達(dá)，SOX17為hESCs的特征基因。在其他本發(fā)明的實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)SOX17標(biāo)記物基因，水平高于AFP、SPARC或血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)標(biāo)記物基因水平。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過(guò)本文描述的方法制備的定形內(nèi)胚層細(xì)胞不表達(dá)Pdxl或Isll(Pdxl-陰性或Isll-陰性)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)例如流式細(xì)胞術(shù)確定，定形內(nèi)胚層細(xì)胞表現(xiàn)出血栓調(diào)節(jié)蛋白的低表達(dá)，相似的情況見(jiàn)于多能細(xì)胞群。在特定的本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用的定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物基本上無(wú)表達(dá)OCT4、SOX7、AFP、SPARC、TM、ZIC1或BRACH標(biāo)記物基因的細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，使用的定形內(nèi)胚層細(xì)胞培養(yǎng)物基本上無(wú)表達(dá)SOX7、AFP、SPARC、TM、ZIC1或BRACH標(biāo)記物基因的細(xì)胞。對(duì)于在細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞，術(shù)語(yǔ)"基本上無(wú)，，指特別的細(xì)胞類(lèi)型以低于細(xì)胞總數(shù)的5%的量出現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)物中。術(shù)語(yǔ)"胰腺內(nèi)胚層"指衍生自定形內(nèi)胚層細(xì)胞的內(nèi)胚層細(xì)胞，所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于單獨(dú)的有效量的視黃酸，或和其他生長(zhǎng)因子，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如FgfIO)組合，并且表達(dá)標(biāo)記物Pdxl和Isll標(biāo)記物，并可進(jìn)一步分化為胰腺P細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"肝內(nèi)胚層"指衍生自定形內(nèi)胚層細(xì)胞的內(nèi)胚層細(xì)胞，使定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于生長(zhǎng)因子，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如FgflO),無(wú)視黃酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"分化"指細(xì)胞類(lèi)型的制備，分化的細(xì)胞類(lèi)型多于從其衍生的細(xì)胞類(lèi)型。因此術(shù)語(yǔ)包括部分和最終分化的細(xì)胞類(lèi)型。在特定的本發(fā)明的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"富含"指細(xì)胞培養(yǎng)物包含多于約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的所需的細(xì)胞譜系，這依賴于細(xì)胞類(lèi)型和使用的方法。使用本發(fā)明制備的從胚胎干細(xì)胞在接觸PI3-激酶通路抑制劑后分化的定形內(nèi)胚層細(xì)胞類(lèi)型可根據(jù)本發(fā)明用于制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明制備的細(xì)胞在多種研究領(lǐng)域和開(kāi)發(fā)中有多種用途，包括但不限制于藥物發(fā)現(xiàn)、藥物開(kāi)發(fā)以及檢測(cè)、毒理學(xué)、治療目的的細(xì)胞的制備和移植、以及基礎(chǔ)科學(xué)研究。這些細(xì)胞類(lèi)型表達(dá)在大范圍研究領(lǐng)域中關(guān)注的分子。這包括各種細(xì)胞類(lèi)型發(fā)揮功能所需的已知分子，如標(biāo)準(zhǔn)的參考文獻(xiàn)中所述。這些分子包括，但不限制于細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子受體、細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、分泌多肽(激素)和其他分子，以及生長(zhǎng)因子受體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞是人細(xì)胞，且胰腺內(nèi)胚層和/或肝內(nèi)胚層細(xì)胞是人細(xì)胞。這些細(xì)胞是根據(jù)本發(fā)明的方法使用多能人細(xì)胞衍生的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"多能(pluripotent)人細(xì)胞"或"人胚胎干細(xì)胞"包括獲得自人胚胎、胎兒或成人組織的多能細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多能人細(xì)胞為人多能胚胎干細(xì)胞(hESC)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多能人細(xì)胞為人多能胎兒干細(xì)胞，例如原始干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多能人細(xì)胞為人多能成人干細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"多能，，指細(xì)胞能夠至少發(fā)育成為外胚層、內(nèi)胚層和中胚層的細(xì)胞。如本文所用術(shù)語(yǔ)"多能"指全能和多能的細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"全能(totipotent)細(xì)胞"指能夠發(fā)育成為所有的細(xì)胞語(yǔ)系的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"多能的(multipotent)"指最終分化的細(xì)胞。也如本文所用，術(shù)語(yǔ)"多能的(multipotent)"指沒(méi)有處理(即，核轉(zhuǎn)移或去分化誘導(dǎo))的細(xì)胞，且不能從所有三個(gè)胚層形(中胚層，外胚層和內(nèi)胚層)衍生，形成分化的細(xì)胞類(lèi)型，或者換言之為部分分化的細(xì)胞。多能人細(xì)胞可選自人胚胎干(ES)細(xì)胞;人內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)/上胚層細(xì)胞;人原始外胚層細(xì)胞，例如早期原始外胚層細(xì)胞(EPL);人原始胚(EG)細(xì)胞;和人畸胎癌(EC)細(xì)胞?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，衍生本發(fā)明的人多能細(xì)胞。例如，可使用去分化和核轉(zhuǎn)移方法制備人多能細(xì)胞。此外，本發(fā)明使用的人ICM/上胚層細(xì)胞或原始外胚層細(xì)胞在體內(nèi)或體外衍生。EPL細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)中制備，或作為細(xì)胞聚集物在懸浮培養(yǎng)中制備，如WO99/53021中所描述。此外，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法傳代人多能細(xì)胞，包括手動(dòng)傳代方法和批量(bulk)傳代方法，例如抗體選擇和蛋白酶?jìng)鞔?。在特定的?shí)施方案中，本發(fā)明的胚胎干細(xì)胞具有正常核型，而在另一個(gè)實(shí)施方案中，胚胎干細(xì)胞具有非正常核型。在一個(gè)實(shí)施方案中，大部分胚胎干細(xì)胞具有非正常核型?？紤]大于50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或大于95%的檢測(cè)的中期細(xì)胞表現(xiàn)出非正常核型。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)大于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，或20代后，非正常核型很明顯。在一個(gè)實(shí)施方案中，非正常核型包括至少一個(gè)常染色體的三倍體，其中常染色體選自染色體l、7、8、12、14、和17。在另一個(gè)實(shí)施方案中，非正常核型包括多于一種常染色體的三倍體，其中多于一種的常染色體中的至少一種選自染色體1、7、8、12、14和17。在一個(gè)實(shí)施方案中，常染色體是染色體12或17。在另一個(gè)實(shí)施方案中，非正常核型包括另外的性染色體。在一個(gè)實(shí)施方案中，核型包括兩個(gè)X染色體和一個(gè)Y染色體?？紤]可能發(fā)生的染色體的易位，并且術(shù)語(yǔ)"非正常核型"包括這種易位。本發(fā)明還包括上述染色體異常的組合。如上文所述的方法，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括如第一步，多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分化方法，包括(a)提供多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和(b)多能哺乳動(dòng)物細(xì)胞與有效量的PI3-激酶信號(hào)通路抑制劑接觸，以使至少部分分化的多能細(xì)胞成為內(nèi)胚層譜系細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)包括細(xì)胞分化環(huán)境的使用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)后，細(xì)胞可與細(xì)胞分化環(huán)境接觸。根據(jù)本發(fā)明其他的步驟包括將定形內(nèi)胚層細(xì)胞在細(xì)胞分化環(huán)境中(例如基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基)暴露于視黃酸，以制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞?；蛘?，定形內(nèi)胚層細(xì)胞可在沒(méi)有視黃酸的細(xì)胞分化環(huán)境中(例如基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基)暴露于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如Fgf10)，以制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞分化環(huán)境"指細(xì)胞培養(yǎng)條件(例如通常為基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基)，其中誘導(dǎo)多能細(xì)胞分化，或誘導(dǎo)成為在富含分化細(xì)胞的人細(xì)胞培養(yǎng)物。優(yōu)選的，由生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的分化細(xì)胞譜系本身是均一的。術(shù)語(yǔ)"均一的"指包含大于約50%、60%、70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的所需細(xì)胞譜系的細(xì)胞群?？芍苯訌姆只^(guò)程獲得均一譜系，無(wú)需進(jìn)一步的細(xì)胞純化，或者，流式細(xì)胞術(shù)和其他技術(shù)可用于純化細(xì)胞，特別是胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，誘導(dǎo)多能細(xì)胞分化成為定形內(nèi)胚層譜系的細(xì)胞，所述細(xì)胞可進(jìn)一步分化以制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。優(yōu)選的，誘導(dǎo)多能細(xì)胞分化成為包含大于約50%的定形內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞群包括大于約55%、60%、65%、70°/。、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的定形內(nèi)胚層譜系。可分離內(nèi)胚層細(xì)胞或直接使用，無(wú)需分離或純化，以制備胰腺內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。分化培養(yǎng)基或環(huán)境(通常為基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基)可用于分化本發(fā)明的多能細(xì)胞，可在多能細(xì)胞接觸PI3-激酶抑制劑之前、期間或之后。在制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞時(shí)，分化試劑為有效量的視黃酸，可在定形內(nèi)胚層細(xì)胞接觸分化培養(yǎng)基(基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，如本文所述)之前、期間或之后使用。根據(jù)本發(fā)明，以形成定形胰腺或肝內(nèi)胚層細(xì)胞的細(xì)胞分化培養(yǎng)基(基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基)可包括各種如上述成分，包括例如KODMEM培養(yǎng)基(敲除Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基)、DMEM、Ham，sF12培養(yǎng)基(特別是DMEM/F1250:50)、FBS或FCS(胚胎牛血清或胎牛血清)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子包括FGF2(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2)、FGF8、FGF10(特別用于胰腺或肝內(nèi)胚層細(xì)胞)、KSR或hLIF(人白血病抑制因子)。細(xì)胞分化培養(yǎng)基還可包括補(bǔ)充物例如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/鏈霉素)、N2和P-巰基乙醇(P-ME)。考慮細(xì)胞分化環(huán)境可加入其他的因子，包括但不限制于纖連蛋白、層粘連蛋白、肝素、硫酸肝素、視黃酸、表皮生長(zhǎng)因子家族(EGFs)成員、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員(FGFs)包括FGF2、FGF8和/或FGF10、血小板衍生的生長(zhǎng)因子家族(PDGFs)成員、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)/骨形態(tài)生成蛋白(BMP)/生長(zhǎng)和分化因子(GDF)家族拮抗劑包括但不限制于頭蛋白、促濾泡素抑制素、脊索發(fā)生素、gremlin、cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高劑量激活蛋白和amnionless。也可以TGF/BMP/GDF受體-Fc嵌合體形式加入TGF/BMP/GDF拮抗劑?？杉尤氲钠渌蜃影赏ㄟ^(guò)Notch受體家族激活或失活信號(hào)的分子，包括但不限制于S樣和Jagged家族蛋白和Notch加工或裂解抑制劑。其他生長(zhǎng)因子可包括胰島素樣生長(zhǎng)因子家族(IGF)成員、胰島素、wingless相關(guān)(WNT)因子家族，和hedgehog因子家族?？杉尤肫渌蜃右源龠M(jìn)定形內(nèi)胚層干/前體增殖和存活，以及這些前體衍生物的存活和分化。在其他的實(shí)施方案中，方法包括接種貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"接種(plated)，，和"接種(plating)"指任何使細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的過(guò)程。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"貼壁培養(yǎng)"指細(xì)胞在固體表面上培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，固體表面可順序包被固體物質(zhì)，固體物質(zhì)可順序包被另一種包被材料，例如下列材料，或任何其他的使培養(yǎng)的細(xì)胞增殖活穩(wěn)定的化學(xué)或生物材料。細(xì)胞可以或不能緊貼固體表面或底物。在一個(gè)實(shí)施方案種，優(yōu)選細(xì)胞接種在基質(zhì)膠包被的培養(yǎng)板上。用于貼壁培養(yǎng)的底物可包括一種下述物質(zhì)或下述物質(zhì)的組合多聚鳥(niǎo)氨酸、層粘連蛋白、多聚賴氨酸、純化的膠元、明膠、細(xì)胞外基質(zhì)、纖連蛋白、生腱蛋白、玻連蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖類(lèi)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和飼養(yǎng)層，例如但不限制于原始成纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞細(xì)胞抹。此外，貼壁培養(yǎng)底物可包括細(xì)胞外基質(zhì)，覆蓋飼養(yǎng)層、覆蓋多能人細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物或覆蓋定形內(nèi)胚層細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。本發(fā)明的方法考慮細(xì)胞可用詞養(yǎng)細(xì)胞或飼養(yǎng)層培養(yǎng)。術(shù)語(yǔ)"伺養(yǎng)細(xì)胞"用于描述與靶細(xì)胞共同培養(yǎng)的細(xì)胞，在當(dāng)前分化狀態(tài)穩(wěn)定靶細(xì)胞。飼養(yǎng)層包括在培養(yǎng)物中有多于一種的飼養(yǎng)細(xì)胞。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，條件培養(yǎng)基從穩(wěn)定靶細(xì)胞當(dāng)前分化狀態(tài)的飼養(yǎng)細(xì)胞獲得。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法游離并特征化穩(wěn)定靶細(xì)胞當(dāng)前分化狀態(tài)的飼養(yǎng)細(xì)胞制備的任何和全部因子。這些因子可用于替代祠養(yǎng)層，或可用于補(bǔ)充祠養(yǎng)層。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定"指細(xì)胞的分化狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞或細(xì)胞群被穩(wěn)定時(shí)，其經(jīng)過(guò)多次傳代在培養(yǎng)物中持續(xù)增殖，并且優(yōu)選在培養(yǎng)物中無(wú)限增殖；此外，優(yōu)選每種在培養(yǎng)物中的細(xì)胞為相同的分化狀態(tài)，并且當(dāng)和細(xì)胞分開(kāi)，通常產(chǎn)生相同類(lèi)型的細(xì)胞或產(chǎn)生相同分化狀態(tài)的細(xì)胞。優(yōu)選的，若細(xì)胞培養(yǎng)條件沒(méi)有改變，穩(wěn)定的細(xì)胞或細(xì)胞群不再分化或去分化，并且細(xì)胞持續(xù)傳代并且無(wú)過(guò)度生長(zhǎng)。優(yōu)選的，穩(wěn)定的細(xì)胞能夠在穩(wěn)定狀態(tài)中無(wú)限增殖，或至少多于2次傳代。優(yōu)選的，穩(wěn)定多于5代、多于10代、多于15代、多于20代、多于25代，或最優(yōu)選的，穩(wěn)定多于30代。在特定的實(shí)施方案中，細(xì)胞穩(wěn)定多于l年的持續(xù)培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將分化為定形內(nèi)胚層細(xì)胞的干細(xì)胞(多能細(xì)胞)通過(guò)常規(guī)方法以多能狀態(tài)在培養(yǎng)物中維持，直至細(xì)胞分化為所需定形內(nèi)胚層。在一些實(shí)施方案中，TGFP家族成員聯(lián)合PI3-激酶通路抑制劑給予多能細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"TGF-P家族成員"指通常本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為特征性的屬于TGF-P家族的生長(zhǎng)因子，特征在于與已知TGF-P家族成員相同，或由于與已知TGF-P家族成員功能相似。在一些實(shí)施方案中，TGF-P家族成員選自Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B、TGF-P、BMP2和BMP4。在一個(gè)實(shí)施方案中，TGF-P家族成員為激活蛋白A。此外，生長(zhǎng)因子Wnt3a用于制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在特定的本發(fā)明的實(shí)施方案中，使用上述任何生長(zhǎng)因子的組合。無(wú)需向細(xì)月包同時(shí)加入這些成分。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)傳代在培養(yǎng)物中維持定形內(nèi)胚層細(xì)胞直至理想地分化成為胰腺內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)GF家族成員(例如，優(yōu)選FGFIO)聯(lián)合分化試劑視黃酸給予定形內(nèi)胚層細(xì)胞，以制備胰腺內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。本文描述的分化方法的一些實(shí)施方案中，向細(xì)胞提供上述生長(zhǎng)因子，從胚層細(xì)胞分化成胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞的濃度存在。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上述生長(zhǎng)因子在細(xì)胞培養(yǎng)物中以至少約0.5ng/ml、至少1ng/ml、至少10ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、至少約75ng/ml、至少約100ng/ml、至少約200ng/ml、至少約300ng/ml、至少約400ng/ml、至少約500ng/ml、或至少約1000ng/ml的濃度出現(xiàn)。在本發(fā)明一些實(shí)施方案中，上述生長(zhǎng)因子在加入細(xì)胞培養(yǎng)物后再去除。例如，可在生長(zhǎng)因子加入約1天，約2天，約3天，約4天，約5天，約6天，約7天，約8天，約9天或約10天后去除。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生長(zhǎng)因子在加入后約4天去除。定形內(nèi)胚層細(xì)胞、胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞的培養(yǎng)物可在包含減少的血清或無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在特定的本發(fā)明的實(shí)施方案中，血清濃度在約0.1%至約20。/。(v/v)的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞用血清補(bǔ)充物培養(yǎng)。在其他實(shí)施方案中，定形內(nèi)胚層細(xì)胞在B27存在的條件下生長(zhǎng)。在這些實(shí)施方案中，B27補(bǔ)充物的濃度可在約0.2%至約20%(v/v)的范圍內(nèi)或大于約20%(v/v)。任選的，加入的B27補(bǔ)充物的濃度可按市售的多種強(qiáng)度的B27儲(chǔ)備液測(cè)定。例如，B27的50X儲(chǔ)備液在Invitrogen(Carlsbad,CA)有售。向充足體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入充足量的這種儲(chǔ)備液可制備補(bǔ)充了所需量的B27的培養(yǎng)基。例如，向卯ml的生長(zhǎng)培養(yǎng)基加入10ml的50XB27儲(chǔ)備液可制備補(bǔ)充5XB27的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中B27補(bǔ)充物的濃度可為約O.IX、約0.2X、約0.3X、約0.4X、約0.5X、約0.6X、約0.7X、約0.8X、約0.9X、約IX、約I.IX、約1.2X、約1.3X、約1.4X、約1.5X、約1.6X、約1.7X、約1.8X、約1.9X、約2X、約2.5X、約3X、約3.5X、約4X、約4.5X、約5X、約6X、約7X、約8X、約9X、約IOX、約IIX、約12X、約13X、約14X、約15X、約16X、約17X、約18X、約19X、約20X和大于約20X。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰內(nèi)胚層細(xì)胞和肝內(nèi)胚層細(xì)胞都優(yōu)選在包含約1%至約20%(體積)胎牛血清，更優(yōu)選約10%的胎牛血清的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。從hESC培養(yǎng)物至定形內(nèi)胚層或從定形內(nèi)胚層至胰腺內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層的過(guò)程可通過(guò)定量這些細(xì)胞特征性的標(biāo)記物基因的表達(dá)和hESCs、定形內(nèi)胚層細(xì)胞(為胰腺或肝內(nèi)胚層細(xì)胞)和其他細(xì)胞類(lèi)型特征性的標(biāo)記物基因的表達(dá)缺失，進(jìn)行4全測(cè)。這些標(biāo)記物基因的基因表達(dá)的定量方法可通過(guò)使用定量PCR(Q-PCR)。進(jìn)行Q-PCR的方法是本領(lǐng)域已知的。其他本領(lǐng)域已知的方法也可用于定量標(biāo)記物基因表達(dá)。標(biāo)記物基因表達(dá)可通過(guò)使用感興趣的標(biāo)記物基因的特異抗體檢測(cè)。使用本文描述的方法，可制備組合物，其包含定形內(nèi)胚層細(xì)胞、胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞，所述細(xì)胞基本沒(méi)有其他的細(xì)胞類(lèi)型?；蛘?，制備的組合物包含hESCs和定形內(nèi)胚層，或定形內(nèi)胚層細(xì)胞和胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞的混合物。例如，制備的組合物中包含每95個(gè)hESCs至少5個(gè)定形內(nèi)胚層細(xì)胞，或每95個(gè)定形內(nèi)胚層細(xì)胞至少5個(gè)胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物中包含每5個(gè)hESCs至少95個(gè)定形內(nèi)胚層細(xì)胞，或每5個(gè)定形內(nèi)胚層細(xì)胞高達(dá)80或更多的胰腺或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。此外，考慮了組合物，其包含定形內(nèi)胚層細(xì)胞和hESCs或胰腺內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在一些本發(fā)明的實(shí)施方案中，可通過(guò)這種細(xì)胞特異性的親合標(biāo)記物游離定形內(nèi)胚層細(xì)胞、胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞。對(duì)定形內(nèi)胚層細(xì)胞、胰內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞特異的親和標(biāo)記物的一個(gè)實(shí)例是特異于標(biāo)記物多肽的抗體，所述多肽存在于需要純化的內(nèi)胚層細(xì)胞表面上，但基本不出現(xiàn)在考慮到在包被PI3-激酶信號(hào)通路抑制劑或視黃酸(任選的，包括FGF例如FGFIO)之前，作為材料使用的多能細(xì)胞或定形內(nèi)胚層細(xì)胞可解離為基本單個(gè)的細(xì)胞培養(yǎng)物，以制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞。如本文所用，"基本單個(gè)的細(xì)胞培養(yǎng)物"是在傳代期間的細(xì)胞培養(yǎng)物，所需生長(zhǎng)的細(xì)胞彼此分離，從而使大部分細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞，或兩個(gè)細(xì)胞相連(雙聯(lián)體)。優(yōu)選，所需成為培養(yǎng)物的細(xì)胞中大于40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的細(xì)胞為單體或雙聯(lián)體。該術(shù)語(yǔ)包括任何現(xiàn)在已知方法的使用，或之后開(kāi)發(fā)的能夠制備基本的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的方法的使用。這些方法的非限制性實(shí)例包括使用細(xì)胞分散緩沖液、和使用蛋白酶，例如胰蛋白酶、膠原酶、分散酶和accutase。這些蛋白酶和一些蛋白酶的組合是市售的。本發(fā)明考慮在傳代期間的任意點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)物可解離成基本單個(gè)的細(xì)胞培養(yǎng)物，并且無(wú)需在傳代期間接觸抑制劑前立即解離細(xì)胞。解離可在一或更多代中發(fā)生?；蛘撸呻x心樣品解離細(xì)胞培養(yǎng)物。使用本發(fā)明的方法制備的細(xì)胞具有多種用途。特別的，細(xì)胞可作為核轉(zhuǎn)移技術(shù)的核材料源使用，并可用于制備用于移植的器官的細(xì)胞、組織或成分。例如，若制備胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞或肝內(nèi)胚層細(xì)胞，可在人細(xì)胞治療或人基因治療中使用，以治療疾病，例如l型糖尿病、肝病和任何其他影響胰腺或肝的疾病。在一個(gè)上述的實(shí)施方案中，胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞用于治療糖尿病或進(jìn)一步分化制備胰腺(3細(xì)胞，在糖尿病治療中使用。此外，細(xì)胞可用于毒性或藥物篩選。在整個(gè)申請(qǐng)中，參考了多個(gè)出版物。所有這些出版物的公開(kāi)內(nèi)容和出版物中引用的參考文獻(xiàn)，在此申請(qǐng)中全部引用，從而更全面地描述本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的狀態(tài)。實(shí)施例實(shí)施例1人ES細(xì)胞的培養(yǎng)人ES細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)在此項(xiàng)工作中可使用人胚胎干細(xì)胞才朱BG01(BresaGen，Inc.,雅典，GA)。BG01細(xì)胞生長(zhǎng)在hES培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基由補(bǔ)充20%敲除血清替代物(knockoutserumreplacer)(KSR;Invitrogen)的DMEM/F-12(50/50)、0.1mMMEM非必需氨基酸(NEAA;Invitrogen)、2mM的L-谷氨酰胺(Invitrogen)、50U/ml青霉素、50|ig/ml鏈霉素(Invitrogen)、4ng/mlbFGF(Sigma)和0.1mM的P-巰基乙醇(Sigma)組成。細(xì)胞在小鼠原代胚胎成纖維飼養(yǎng)層上生長(zhǎng)，飼養(yǎng)層用絲裂霉素c有絲分裂滅活。飼養(yǎng)細(xì)胞以每35mm平亞1.2xl06細(xì)胞接種。BG01細(xì)胞使用膠原酶/胰酶方法傳代。簡(jiǎn)言之，培養(yǎng)基從平皿去除，加入iml的200U/ml的IV型膠原酶(GibcoBRL)，并且細(xì)胞在37°C孵育1-2分鐘。去除膠原酶，并使用1ml的0.05%胰酶/0.53mMEDTA(GIBCO)。細(xì)胞在37°C醉育30秒，之后從飼養(yǎng)層清洗，胰酶在含10%胎牛血清(FBS;Hyclone)的DMEM/F-12中失活。細(xì)胞以每35mm平皿100,000-300,000細(xì)胞的密度重新接種在飼養(yǎng)層上，并且每3天傳代。BG01細(xì)胞在無(wú)飼養(yǎng)層條件中的生長(zhǎng)絲裂霉素處理的MEFs用hES培養(yǎng)基(25mls)過(guò)夜處理，所述MEFs以56,000細(xì)胞/cn^的密度接種在750112培養(yǎng)瓶中。MEFs使用達(dá)1周，每24小時(shí)使用條件培養(yǎng)基(CM)收集。CM在使用前再補(bǔ)充8ng/ml的hbFGF。通過(guò)稀釋生長(zhǎng)因子減少的(GrowthFactorReduced)BD基質(zhì)膠基質(zhì)(BDBiosciences)至在冰冷DMEM/F-12中終濃度1:30而制備基質(zhì)膠包被的平皿。在室溫，將lml/35mm平亞用于包被平亞1-2小時(shí)或至少4°C過(guò)夜。培養(yǎng)板在4°C儲(chǔ)存長(zhǎng)至1周。在臨用前去除基質(zhì)膠溶液。胚狀體形成使用上述膠原酶/胰酶方法解聚(disaggregate)BG01細(xì)胞。約10,000細(xì)胞懸浮在50pl的補(bǔ)充10%FBS(AtlantaBiolabs)、0.1mMNEAA、2mML-谷氨酰胺、50U/ml青霉素和50Mg/ml鏈霉素的EB培養(yǎng)基中(DMEM(Cellgro)),并用p200的槍頭滴于100mmPetri皿蓋(Petridishlid)中。約每個(gè)蓋滴約50滴。將蓋置于平亞上，并在平亞中;^文置10ml的PBS。在第3和第5天，從蓋上清洗EBs，在室溫用胰酶孵育5分鐘，并用拉長(zhǎng)的玻璃吸管解聚。細(xì)胞在lxPBS中清洗一次，在室溫用2。/oPFA/2。/o蔗糖固定10分鐘。之后細(xì)胞在PBS中清洗兩次，并儲(chǔ)存在1%BSA/PBS中，以備抗體染色使用。實(shí)施例2用PI3-激酶抑制劑處理HES細(xì)胞導(dǎo)致HES細(xì)胞分化抑制劑/分化試劑處理干細(xì)胞使用膠原酶/胰酶方法從銅養(yǎng)物中傳代BG01細(xì)胞，并在條件培養(yǎng)基(CM;MEF條件培養(yǎng)基加8ng/mlbFGF)中以lx105細(xì)胞/35mm平皿的密度接種于基質(zhì)膠包被的平皿上。約24小時(shí)后，用新鮮CM、帶有抑制劑的CM(在EtOH中重懸)、帶有EtOH的CM、或用自然分化培養(yǎng)基(SpontaneousDifferentiationmedium)(hES培養(yǎng)基減去bFGF)替換培養(yǎng)基。在其他方法中，在接觸CM、帶有抑制劑的CM和帶有EtOH的CM之前，以不同濃度接種BG01細(xì)胞，細(xì)胞以下列濃度接種約5xl04細(xì)胞/35mm平皿、約lx105細(xì)胞/35mm平皿、約2xl05細(xì)胞/35mm平皿、約4x105細(xì)月包/35mm平皿和約6xl05細(xì)胞/35mm平皿。優(yōu)選使用濃度在約20-163inM范圍的抑制劑LY294002(Biomol)，并且抑制劑雷帕霉素(Calbiochem)在約1.5-30nM的濃度范圍內(nèi)使用。LY294002通過(guò)結(jié)合至ATP?？课稽c(diǎn)(dockingsite)pl10，抑制PI3-激酶通路。雷帕霉素通過(guò)抑制mTOR(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶點(diǎn))抑制一系列PI3-激酶通路。細(xì)胞在此條件生長(zhǎng)約72小時(shí)，每24小時(shí)更換培養(yǎng)基。使用膠原酶/胰酶方法收集細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR分析，并且刮掉細(xì)胞用于生物化學(xué)分析。使用標(biāo)準(zhǔn)的顯樣i鏡，通過(guò)觀察細(xì)胞，注意到當(dāng)LY294002或雷帕霉素存在時(shí)，BG01細(xì)胞經(jīng)歷的形態(tài)學(xué)的改變。這種形態(tài)學(xué)的改變與自然分化經(jīng)歷的細(xì)胞改變顯著不同。在未分化的培養(yǎng)物中，單個(gè)細(xì)胞不容易辨認(rèn)，細(xì)胞相對(duì)小、不規(guī)則并且沒(méi)有清晰的較高密度的細(xì)胞連接。然而，在用LY294002處理后，細(xì)胞經(jīng)歷了顯著的擴(kuò)散和明顯的上皮樣骰狀形態(tài)。在較高密度，由于在相鄰細(xì)胞之間的分離的細(xì)胞連接很清楚，單個(gè)細(xì)胞也更容易辨認(rèn)。jt匕夕卜，纟田月包以j氐于纟々2x105纟田月包/35mm平亞的密度4妾種，當(dāng)包^皮LY294002或雷帕霉素接觸時(shí)表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)改變。細(xì)胞以約4xl05細(xì)胞/35mm平皿或更高的密度接種，當(dāng)接觸LY294002或雷帕霉素時(shí)不表現(xiàn)出相同的形態(tài)學(xué)改變。實(shí)施例3用PI3-激酶抑制劑處理的細(xì)胞的特性抑制劑研究如實(shí)施例2所描述進(jìn)行。流式細(xì)力包術(shù)對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)，在室溫BGOl細(xì)胞用lxPBS清洗，并用2%多聚曱醛/lxPBS固定10分鐘。之后細(xì)胞用lxPBS清洗，約2xl05細(xì)胞與一抗聘育，一抗用P/。BSA/lxPBS稀釋。使用的一抗是抗CD9和抗血栓調(diào)節(jié)蛋白抗體(CymbusBiotechnology),連接FITC的小鼠單克隆抗體，1:10稀釋。細(xì)胞4。C聘育30分鐘，之后用lxPBS清洗兩次。合適時(shí)，將細(xì)胞重懸在二抗中，抗小鼠Alexa-488(MolecularProbes)，在1%BSA/PBS中以1:1000稀釋?zhuān)?°C孵育30分鐘，并且之后用lxPBS中清洗兩次。細(xì)胞重懸在1%BSA/lxPBS中，并使用BeckmanCoulterFC500分析表面表達(dá)。RNA分離和RT-PCR分析總RNA使用TRIzol試劑(GibcoBRL)分離。RNA在1%的包含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上電泳，并使用AlphalmagerTM2200記錄和分析系統(tǒng)觀察以保證RNA完整性。10昭的RNA用DNase(Ambion)處理，使用DNase失活試劑(Ambion)去除DNase。cDNA使用SuperscriptII逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Invitrogen)使用oligo(dT)引物用500ng總RNA制備。PCR反應(yīng)在1的cDNA上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物在包含溴化乙錠的2%的瓊脂糖凝膠上電泳，并使用AlphalmagerTM2200記錄和分析系統(tǒng)觀察。使用的PCR引物組合為GATA4、Mixl、Msxl、AFP、HNF4alpha、eHAND、Nanog、AFP和GAPDH.生物化學(xué)分析PI3-激酶信號(hào)通路的激活可通過(guò)蛋白印跡分析評(píng)價(jià)。簡(jiǎn)言之，去污劑提取物由未處理和處理的細(xì)胞培養(yǎng)物制備，通過(guò)SDS-PAGE分離，在硝酸纖維素膜上形成印跡。之后PI3-激酶細(xì)胞內(nèi)靶分子PKB/Akt、S6激酶和S6蛋白的活性形式表達(dá)通過(guò)結(jié)合每種蛋白磷酸化形式的合適抗體在硝酸纖維素膜上形成的印跡確定。通常，每個(gè)樣品^r測(cè)30ng的總蛋白，一抗1:1000稀釋孵育，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的基于ECL的方法學(xué)檢測(cè)各個(gè)情況下的結(jié)合。O-PCR基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)通過(guò)Q-PCR在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)多個(gè)標(biāo)記物基因的進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析。評(píng)價(jià)理想的和非理想的細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)記物基因特征以獲得對(duì)細(xì)胞群的全部動(dòng)力學(xué)的更好的理解。Q-PCR分析優(yōu)點(diǎn)(strength)包括其高度敏感性和開(kāi)發(fā)必須標(biāo)記物的相對(duì)容易性，因?yàn)榛蚪M序列是容易獲得的。此外，Q-PCR的極高度的敏感性允許來(lái)自在相當(dāng)大的群中的相對(duì)少量的細(xì)胞的基因表達(dá)的檢測(cè)。此外，檢測(cè)非常低的基因表達(dá)水平的能力可提供群中的"分化偏性(differentiationbias)"指征。在細(xì)胞表型明顯的分化之前，使用免疫化學(xué)技術(shù)很可能不能識(shí)別向特殊的分化通路的偏性。因此，Q-PCR提供了補(bǔ)充用于篩選成功分化處理的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的分析方法。此工具提供了評(píng)價(jià)我們的分化流程的方法，成功用于半高通量分析的定量形式。通常使用SYBRGreenchemistry在RotorGene3000儀器(CorbettResearch)和兩步RT-PCR形式進(jìn)行此方法的相對(duì)定量。設(shè)計(jì)引物處于外顯子-外顯子邊界，或當(dāng)可能時(shí)跨越至少800bp的內(nèi)含子，這可減少污染的(contaminating)基因組DNA的擴(kuò)增。當(dāng)使用不包含內(nèi)含子的標(biāo)記基因時(shí)，或標(biāo)記基因含有假基因(pseudogenes)時(shí)，可用DNaseI處理的RNA樣品。與hESC分化早期相關(guān)的標(biāo)記物(特別是外胚層、中胚層、定形內(nèi)胚層和胚胎外內(nèi)胚層)，和驗(yàn)證的引物提供在表1中。也表明了這些引物的人特異性。這很重要因?yàn)閔ESCs經(jīng)常在小鼠祠養(yǎng)層上生長(zhǎng)。通常，在各條件下，采用三份樣品，重復(fù)獨(dú)立分析以評(píng)價(jià)每個(gè)定量測(cè)定相關(guān)的生物變異性。4吏用RNeasy(Qiagen)分離總RNA，并使用RiboGreen(MolecularProbes)定量。使用iScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(BioRad)從350-500ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄，試劑盒包括oligo-dT和隨機(jī)引物的混合物。隨后每個(gè)20nL的反應(yīng)稀釋至100|iL總體積，并且在每個(gè)10|aL的Q-PCR反應(yīng)物中使用3(iL，反應(yīng)物包括400nM的正和反引物和5pL2XSYBRGreenmastermix(Qiagen)。兩步循環(huán)參數(shù)在85-94。C變性5秒(特別根據(jù)每個(gè)引物對(duì)的擴(kuò)增子的熔解溫度選擇)，隨后在60。C退火/延伸45秒。每個(gè)延伸相的最后15秒收集熒光數(shù)據(jù)。三點(diǎn)、10-倍稀釋以制備每個(gè)循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，起始循環(huán)閾值(Ct，s)轉(zhuǎn)換為定量值。每個(gè)樣品的定量值對(duì)看家基因標(biāo)準(zhǔn)化，之后計(jì)算三份樣品的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。PCR循環(huán)后，進(jìn)行熔解曲線分析，以確定反應(yīng)特異性。在適合PCR擴(kuò)增子的Tm處的單峰說(shuō)明單個(gè)的特異性產(chǎn)物。此外，進(jìn)行的不含逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)可作為陰性對(duì)照，并且沒(méi)有擴(kuò)增。使用環(huán)孢素G(CyclophilinG)和GUS對(duì)所有樣品計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化因子。多個(gè)HGs的使用同時(shí)減少標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程本身的變異性，并增加相對(duì)基因表達(dá)值的可靠性(Vandesompele，等人，2002，GenomeBiol"3:RESEARCH0034)。使用Q-PCR確定許多接受不同實(shí)驗(yàn)處理的交叉樣品的標(biāo)記基因的相對(duì)的基因表達(dá)水平。使用標(biāo)記基因，因?yàn)闃?biāo)記基因在早期胚胎層代表性的特異群中富集，并且特別集中于基因集合(setsofgenes)中，所述基因集合在定形內(nèi)胚層細(xì)胞中表達(dá)不同。這些基因和其相對(duì)富集的情況在表1中顯示。它們有助于分離和表征定形內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)胚層或肝內(nèi)胚層細(xì)胞的形成。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>NODAL上胚層和前臟壁內(nèi)胚層外胚層ZIC1神經(jīng)管、神經(jīng)前體(progenitors)SOX1神經(jīng)前體中胚層BRACH新生中胚層(nascentmesoderm)FOXF1免疫組織化學(xué)SOX17抗體SOX17在整個(gè)定形內(nèi)胚層表達(dá)，在原腸胚形成期間形成，并且它在腸管內(nèi)維持表達(dá)(盡管表達(dá)水平沿A-P軸改變)，直至大約開(kāi)始器官形成。SOX17也在一組胚胎外內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)。在中胚層或外胚層中沒(méi)有觀察到這種蛋白的表達(dá)。因此，SOX17是定形內(nèi)胚層譜系合適的標(biāo)記物，當(dāng)與標(biāo)記物綴合使用時(shí)以排除胚胎外譜系。SOX17抗體可如2003年12月23日提交的標(biāo)題為"定形內(nèi)胚層"美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/532,004中所述生產(chǎn)，在此全部引入作為參考。簡(jiǎn)言之，人SOX17部分cDNA對(duì)應(yīng)SOX17蛋白羧基末端氨基酸172-414,所述人SOX17部分cDNA用于在抗體生產(chǎn)公司GENOVAC(Freiberg,Germany),根據(jù)開(kāi)發(fā)的流程，通過(guò)基因免疫大鼠用于生產(chǎn)SOX17抗體?；蛎庖叩牧鞒炭梢?jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5，830，876、5,817,637、6,165,993、6，261，281和國(guó)際出版物No.W099/13915,其公開(kāi)在此全部引用作為參考。通過(guò)蛋白免疫印跡和ICC在hSOX17cDNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞抹上確定抗體對(duì)SOX17的特異性。免疫染色的細(xì)胞可在細(xì)胞培養(yǎng)玻片上生長(zhǎng)，并用1XPBS清洗一次，并在室溫在4%PFA/4%蔗糖的pH7.4的PBS中固定10分鐘。之后在1XPBS中清洗3次，之后在室溫用3%山羊血清和0.1%Triton-XlOO的PBS溶液封閉1小時(shí)。一抗在3%山羊血清的PBS溶液稀釋?zhuān)⑶以?°C過(guò)夜該溶液。使用的一抗是兔抗-人AFP(Zymed)，1:50稀釋?zhuān)痛笫罂?人SOX17(購(gòu)自Cythera，Inc.),1:1000稀釋使用。細(xì)胞用更換3次的1XPBS清洗1小時(shí)。在室溫使用二抗2小時(shí)。使用的二抗為山羊抗-兔AlexaFluor488和山羊抗-大鼠AlexaFluor594(MolecularProbes),均以1:1000在3%山羊血清的1XPBS中稀釋。細(xì)胞用更換3次的1XPBS清洗1小時(shí)。去除小室，用帶有DAPI的(Vector)VectaShield包埋培養(yǎng)基包埋載玻片。結(jié)果使用流式細(xì)胞術(shù)，值得注意的是CD9的表達(dá)在LY294002或雷帕霉素處理的BG01細(xì)胞中的降低顯著快于貼壁培養(yǎng)的自然分化細(xì)胞或胚狀體。此外，之前通過(guò)其他觀察得知CD9的表達(dá)影響細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)和粘附。通過(guò)RT-PCR分析，值得注意的是在用LY294002和雷帕霉素處理的細(xì)胞中可檢測(cè)到早期分化指征的大量標(biāo)記物。值得注意的是，當(dāng)PI3-激酶信號(hào)阻斷時(shí)，檢測(cè)到的標(biāo)記物可能不同于自然分化的貼壁BG01細(xì)胞培養(yǎng)物中所檢測(cè)到標(biāo)記物。例如，和與自然分化分化培養(yǎng)物相比，阻斷PI3-激酶可導(dǎo)致HNF4a、GATA4、Mixl、和Msxl表達(dá)的增加，AFP水平的下降。此外，PCR數(shù)據(jù)支持隨多能(pluripotent)細(xì)胞密度改變而顯現(xiàn)的細(xì)胞形態(tài)上的不同。在一些情況下用LY294002或雷帕霉素處理的作用可依賴于細(xì)胞密度。生物化學(xué)分析，值得注意的是LY294002在細(xì)胞中的保持出現(xiàn)抑制了Akt、S6激酶和S6的激活。相似的，雷帕霉素的出現(xiàn)消除S6激酶和S6的活性。所有的觀察表明當(dāng)這些抑制藥物出現(xiàn)時(shí)，至mTOR的PI3-激酶信號(hào)在BG01細(xì)胞中下調(diào)。S6(在此信號(hào)通路中的遠(yuǎn)端靶信號(hào))的激活在經(jīng)歷自然分化的貼壁培養(yǎng)的BG01細(xì)胞中減少，但在抑制劑處理的細(xì)胞中消除。實(shí)施例4從人胚胎干細(xì)胞制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞方法基質(zhì)膠培養(yǎng)物來(lái)自mef飼養(yǎng)培養(yǎng)板的人ES細(xì)胞，細(xì)胞60-90%匯合，用IXPBS清洗，并向每個(gè)100mm組織培養(yǎng)板加入5ml的在DMEM/F12中的200-400U/ml的膠原酶IV，在37。C/5。/。CC)2孵育30-120分鐘，直至克隆從培養(yǎng)板表面取出。通過(guò)輕柔研磨收集細(xì)胞，置于15ml的錐形管中，并以200Xg離心5分鐘。從細(xì)胞沉淀(pellet)中吸出培養(yǎng)基并在帶有8ng/mlbFGF的10ml20%KSR的條件培養(yǎng)基(CM20K)中重懸。將所述細(xì)胞種于之前準(zhǔn)備好的基質(zhì)膠培養(yǎng)板上(1:30稀釋的基質(zhì)膠的DMEM/F12溶液)，該細(xì)胞用帶有8ng/mlbFGF的CM20K以1:1至1:6稀釋。定形內(nèi)胚層分化在基質(zhì)膠上的人ES細(xì)胞培養(yǎng)物用PBS清洗2X。加入2-3ml胰酶/EDTA溶液，研磨細(xì)胞并在15ml錐形管中收集細(xì)胞。加入帶有10%FBS的DMEM/F12以終止胰酶消化，并且細(xì)胞以200Xg離心5分鐘。細(xì)胞沉淀，現(xiàn)在大部分為單細(xì)胞，具有2-4個(gè)細(xì)胞簇的小細(xì)胞群，在帶有8ng/mlbFGF的CM20K中重懸，4.5x105細(xì)胞/100mm接種在基質(zhì)膠包被的組織培養(yǎng)板上。培養(yǎng)板在37°C/5%C02孵育16-24小時(shí)。孵育后，培養(yǎng)基更換為帶有8ng/mlbFGF、50ng/ml激活蛋白A和25ug/mlLY294002的CM20K。培養(yǎng)基每日更換，共4-6天。胰腺內(nèi)胚層分化定形內(nèi)胚層細(xì)胞(來(lái)自上述處理)使用PBS清洗2X。加入2-3ml胰酶/EDTA溶液，研磨細(xì)胞，并在15ml錐形管中收集。加入帶有10%FBS的DMEM/F12以終止胰酶消化，并且細(xì)胞以200Xg離心5分鐘。細(xì)胞沉淀，現(xiàn)在大部分為單細(xì)胞，具有2-4個(gè)細(xì)胞蔟的小細(xì)胞群，在DMEM/F12、10%FBS、2uM全反式視黃酸和10-50ng/mlFGF10中重懸。將細(xì)胞以7.5x105細(xì)胞/100mm接種在基質(zhì)膠包被的組織培養(yǎng)板上。培養(yǎng)板在37°C/5%C02孵育，每天更換培養(yǎng)基。在4天后，培養(yǎng)基替換為DMEM/F12、10。/。FBS,共1-4天。在肝內(nèi)胚層分化時(shí)，如果使用上述胰腺內(nèi)胚層分化條件，除了不包含視黃酸并且增加FGF10的量(替代不包含的視黃酸)外，以上述相同條件制備肝內(nèi)胚層。其他實(shí)施例第一個(gè)實(shí)施例涉及處理定形內(nèi)胚層后，表達(dá)胚胎肝標(biāo)記物的曱胎蛋白(AFP)的細(xì)胞的制備。加入LY294002(50uM)后，BG01hESCs分化成為定形內(nèi)胚層4天。培養(yǎng)基換為DMEM/F12、10%FCS,并且細(xì)胞生長(zhǎng)至多再6天(uptosixmoredays)。未處理:未處理hESCs。AFP轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)QRT-PCR分析，一式三份，在對(duì)GAPDH的參照轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)化后，轉(zhuǎn)錄水平表示為相對(duì)未處理樣本(hESCs)的增加倍數(shù)。注意盡管在加入FgflO后可見(jiàn)AFP誘導(dǎo)，但此結(jié)果可在無(wú)Fgfl0(inthepresenceofabsenceofFgflO)時(shí)實(shí)現(xiàn)，圖1。第二個(gè)實(shí)施例觀察RA處理后，Pdxl轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的時(shí)程。BGOlhESCs用LY294002(50uM)處理4天，之后更換為包含DMEM/F12、10%FCS、50ng/mlFgflO和2uM視黃酸的培養(yǎng)基至多4天。未處理-未處理hESCs。轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)QRT-PCR分析，一式三份，在對(duì)GAPDH的參照轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)化后，轉(zhuǎn)錄水平表示為相對(duì)未處理樣本(hESCs)的增加倍數(shù)。表示除Pdxl轉(zhuǎn)錄水平的倍數(shù)誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。第三個(gè)實(shí)施例觀察RA處理后，Pdxl和Isll轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的時(shí)程。BG01hESCs使用LY294002(50uM)處理4天，之后更換由DMEM/F12、10%FCS、50ng/mlFgflO和2uM視黃酸組成的培養(yǎng)基至多4天。未處理:未處理hESCs。轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)QRT-PCR分析，一式三份，在對(duì)GAPDH的參照轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)化后，轉(zhuǎn)錄水平表示為相對(duì)未處理樣本(hESCs)的增加倍數(shù)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。第四個(gè)實(shí)施例觀察對(duì)不同培養(yǎng)條件對(duì)應(yīng)的Soxl7、AFP和Pdxl的表達(dá)。未處理:未處理BG01hESCs在MEF-CM、Fgf2、20%KSR存在的基質(zhì)膠上培養(yǎng)。L^:hESCs生長(zhǎng)在MEF-CM和Fgf2和基質(zhì)膠上，用LY294002處理4天。F106d:用LY294002處理hESCs4天，換為包含F(xiàn)gflO(50ng/ml),10%FCS的培養(yǎng)基再6天。RA4d/2d:使用LY294002處理hESCs4天，更換為包含F(xiàn)gflO(50ng/ml)、2PMRA、10%FCS的培養(yǎng)基(DMEM/F12)再4天。之后在無(wú)RA和FgflO的相同培養(yǎng)基中再培養(yǎng)2天。Soxl7、AFP和Pdxl轉(zhuǎn)錄通過(guò)QRT-PCR分析，一式三份，在對(duì)GAPDH的參照轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)化后，轉(zhuǎn)錄水平表示為相對(duì)未處理樣本(hESCs)的增加倍數(shù)。圖4表示Soxl7、AFP和Pdxl對(duì)不同培養(yǎng)條件的反應(yīng)。第五個(gè)實(shí)施例表明處理RA后Pdxl十細(xì)胞的水平。在此實(shí)驗(yàn)中，在加入LY294002(50yM)后，BG01hESCs分化成為定形內(nèi)胚層4天。培養(yǎng)基更換為DMEM/F12,10%FCS，并且細(xì)胞生長(zhǎng)至多再5天。用LY294002處理hESCs4天，更換含F(xiàn)gflO(50ng/ml)、2uMRA、10%FCS的培養(yǎng)基(DMEM/F12)再5天。處理和未處理(hESCs)在LabTec細(xì)胞培養(yǎng)玻片生長(zhǎng)，使用4%多聚曱醛固定，孵育兔抗-人Pdxl抗體(Chemicon，1:1,000)，隨后孵育AlexaFluor(594nm)標(biāo)記的山羊抗-兔二抗(紅色)。細(xì)胞包埋在包含DAPI的培養(yǎng)基中，所述DAPI用于觀察核DNA(藍(lán)色)。圖5表明用RA處理的Pdxl十細(xì)胞免疫熒光染色。hESCs的培養(yǎng)方法hESCs優(yōu)選在MEF-CM(詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)之前的文檔)或確定成分培養(yǎng)基使用基質(zhì)膠(1:200稀釋)(例如)作為生長(zhǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)細(xì)胞，手動(dòng)或通過(guò)使用酶方法例如膠原酶或accutase傳代，并通常以1x106每60mm平皿在hESC培養(yǎng)基中接種12-24小時(shí)，之后培養(yǎng)基換為促進(jìn)DE分化(見(jiàn)如下'分化培養(yǎng)基')培養(yǎng)基。在分化期間，每日更換'分化培養(yǎng)基'。兩個(gè)用于hESC培養(yǎng)的確定成分培養(yǎng)基的實(shí)施例如下所述(a)DMEM:F12(Gibco)、2%BSA(Seriologicals、#82-047-3)、lxPen/Strep(Gibco)、lx非必需氨基酸(Gibco)、lx微量元素A、B和C(Cellgro;#99-182-Cl、#99-176-Cl、#99-175-Cl)、50ug/ml抗壞血酸(Sigma、#A4034)、10ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Gibco、##11107-018)、O.lnM卩-疏基乙醇、8ng/mlFgf2(Sigma、#F0291)、200ng/mlLR畫(huà)IGF(JRHBiosciences,#85580)、10ng/ml激活蛋白A(R&DSystems、#338-AC)、10ng/mlHeregulinP(Peprotech;#100-03)。(b)第二種確定成分培養(yǎng)基包括DMEM/F12、lxPen/Strep、lx非必需氨基酸(Gibco)、Fgf2(10ng/ml)、IGF1(或LR-IGF;10ng/ml)、激活蛋白A(10ng/ml)、牛血清白蛋白(片段V或相似)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(10yg/ml、Gibco)、lx微量元素(Cellgro)、P-巰基乙醇。其他的確定成分培養(yǎng)基在Ludwig等人，2006;NatureBiotech,249(2),185-187,2006中描述。生長(zhǎng)在無(wú)飼養(yǎng)層條件下的細(xì)胞通過(guò)更換成包含不支持高PI3K信號(hào)的升高含量的(至少約5ng/ml、至少約5-10ng/ml、至少約15ng/ml、至少約25ng/ml、至少約50ng/ml、約50-100ng/ml)激活蛋白A、nodal、TNF卩或來(lái)自TNF家族的其他因子的確定成分培養(yǎng)基(無(wú)胎牛血清或KSR-型血清補(bǔ)充物)。在正常情況下，需要因子通過(guò)促進(jìn)PI3K活性促進(jìn)hESCs的自我更新。之前已表明(McLean等人，2007)通過(guò)減少KSR或FCS或通過(guò)加入抑制劑的PI3K的抑制使激活蛋白A、nodal、TNF卩或其他成分的條件可以促進(jìn)DE分化。例如，分化培養(yǎng)基不應(yīng)具有促進(jìn)PI3K信號(hào)的高水平的胰島素、IGF或EGF家族成員(如heregulin)。這種DE分化培養(yǎng)基的實(shí)施例是:(a)DMEM:F12(Gibco)、2%BSA(Seriologicals、#82-047-3)、lxPen/Strep(Gibco)、lx非必需氨基酸(Gibco)、lx微量元素A、B和C(Cellgro;#99-182-Cl、#99-176-Cl、#99-175-Cl)、50ug/ml抗壞血酸(Sigma、#A4034)、10ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Gibco、##11107-018)、O.lnMp-巰基乙醇、8ng/mlFgf2(Sigma、#F0291)、100ng/ml激活蛋白A(R&DSystems,#338-AC)、Wnt3a(25ng/ml、R&DSystems)。(b)第二種確定的分化培養(yǎng)基包含DMEM/F12、Fgf2(10ng/ml;Sigma、#F0291)、Wnt3a(25ng/ml、R&DSystems)、激活蛋白A(100ng/ml、R&DSystems)、牛血清白蛋白(2%、Seriologicals、#82-047-3)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(10ug/ml、Gibco、##11107-018)、微量元素、P-巰基乙醇也作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用，之后可加入特異信號(hào)。最佳的，在更換分化培養(yǎng)基后最初24-36小時(shí)包含Wnt3a。分化實(shí)驗(yàn)如每個(gè)之前的文檔和McLean等人，2007(Stemcell)所述。結(jié)果描述為了表明真正的定形內(nèi)胚層從hESCs的制備，表明沒(méi)有制備胚外譜系是十分重要的，因?yàn)榧?xì)胞類(lèi)型例如胚外譜系也表達(dá)用于鑒別DE的幾種標(biāo)記物(例如Soxl7、GATA4，6、FoxA2)。分化的特征為在經(jīng)過(guò)成為中內(nèi)胚層的中間期細(xì)胞轉(zhuǎn)變后形成分化。這種細(xì)胞類(lèi)型通常表達(dá)T、MixLl和Wnt3a,重要的是通過(guò)T+狀態(tài)表明預(yù)定的DE形成，如McLean等人2007和D'Amour等人2005所述?；痟ESCs成為CXCR4+Soxl7+DE。圖7表明TmRNA水平在12小時(shí)增加，到24小時(shí)表現(xiàn)出最大水平(相對(duì)未處理hESCs70-倍誘導(dǎo))。MixLl轉(zhuǎn)錄峰在48小時(shí)((>400-倍誘導(dǎo))。DE相關(guān)轉(zhuǎn)錄例如Soxl7、Gsc和CXCR4增加直至處理的72小時(shí)，分別表現(xiàn)出高達(dá)800、230和200倍增加。在Wnt3a存在或無(wú)Wnt3a時(shí)進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，表明+Wnt3a條件促進(jìn)處理72小時(shí)后CXCR4mRNA的量，但并不重要(notessential)。圖8表明標(biāo)記物轉(zhuǎn)錄的Q-PCR分析以評(píng)價(jià)是否制備胚外(AFP,THBD)或中胚層(FoxFl)。分析表明在處理96小時(shí)后無(wú)胚外內(nèi)胚層標(biāo)記物(AFP，THBD)的增加，表明Soxl7表達(dá)與DE形成相關(guān)。當(dāng)DE轉(zhuǎn)錄增加，例如Soxl7(400-倍)、CXCR4(~275畫(huà)倍)、Gsc(260-倍)、GATA4(~90-倍)Nanog水平(ESC標(biāo)記物)減少。中內(nèi)胚層轉(zhuǎn)錄水平增加(T,MixLl)在24-48小時(shí)的DE轉(zhuǎn)錄增加之前，與向DE轉(zhuǎn)變的通過(guò)中內(nèi)胚層的細(xì)胞群轉(zhuǎn)變一致。通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)，分別使用Soxl7和T抗體評(píng)價(jià)分析分化成為DE和中內(nèi)胚層的細(xì)胞％(圖9)。在24和48小時(shí)，更換為分化培養(yǎng)基之后，幾乎100%的細(xì)胞用T抗體染色為陽(yáng)性，表明在這些時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)接近均一群的中內(nèi)胚層。到處理的48小時(shí)，Soxl7陽(yáng)性細(xì)胞的％開(kāi)始增加，并且檢測(cè)到許多Soxl7-T雙陽(yáng)性細(xì)胞(~20%)。到72小時(shí)，培養(yǎng)物由~>95%Soxl7十細(xì)胞組成，<5%的細(xì)胞T+。96小時(shí)后，在這些培養(yǎng)物中〉95。/。的細(xì)胞Soxl7染色陽(yáng)性，沒(méi)有可檢測(cè)的T染色。在整個(gè)分化的最初24小時(shí)，Nanog染色維持高水平，但從24小時(shí)至96小時(shí)顯著暴跌(圖10)。為了確認(rèn)在這些培養(yǎng)物中DE的高百分率，我們進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析CXCR4染色的細(xì)胞(圖6)。通過(guò)文檔中描述的方法，我們始終獲得包含>93%CXCR4陽(yáng)性細(xì)胞的培養(yǎng)物。這優(yōu)于至今任何其他報(bào)告的方法。表示出了在我們的條件下的hESCs的明場(chǎng)圖片和制備的DE(圖11)。我們開(kāi)發(fā)了從hESCs制備DE的改進(jìn)方法。此方法與之前的方法相比具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括更穩(wěn)固、可重復(fù)的培養(yǎng)系統(tǒng)，此系統(tǒng)更適于細(xì)胞治療的開(kāi)發(fā)。圖8表明通常的用于分化hESCs成為DE和之后成為后腸/胰腺內(nèi)胚層(Pdxl+細(xì)胞)的策略。腸管標(biāo)記物Tcf2和胰腺內(nèi)胚層/后側(cè)前腸(posteriorforegut)標(biāo)記物Pdxl的增加在DE重接種于包含RA和Fgfl0的培養(yǎng)基后的12天表現(xiàn)出(圖1"。通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄。Tcf2轉(zhuǎn)錄峰在~第6天，比hESCs中增加~60-倍，并且Pdxl轉(zhuǎn)錄峰~第10天，表現(xiàn)出與hESCs中相比幾乎2,000倍的增加。之后在接種的DE上進(jìn)行ICC，RA和Fgfl0存在2、6和12天(圖14)。Tcf2陽(yáng)性細(xì)胞在處理2天后檢測(cè)(25%陽(yáng)性)但到6天增加到100%，到12天稍孩i降低到50%。在第2和第6天沒(méi)有4企測(cè)到Pdxl陽(yáng)性細(xì)胞，但在第12天培養(yǎng)物〉80%。*這些通常的方法對(duì)所有檢測(cè)的細(xì)胞4朱有效，包括BG01、BG02、H7、H9。從定形內(nèi)胚層制備胰腺內(nèi)胚層的方法一旦通過(guò)上述一種方法制備0乂014+DE，細(xì)胞使用accutase或膠原酶(或相似的)傳代，并接種在基質(zhì)膠上(U00;或相似基質(zhì))。DE通常以0.5xl06/60mm平皿在PE分化培養(yǎng)基中接種長(zhǎng)達(dá)12天(見(jiàn)下)。胰腺內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基0)DMEM:F12(Gibco)、2%BSA(Seriologicals、#82-047-3)、lxPen/Strep(Gibco)、lx非必需氨基酸(Gibco)、lx微量元素A、B和C(Cellgro;#99-182-Cl、#99-176-Cl、#99-175-Cl)、50ug/ml抗壞血酸(Sigma、#A4034)、10ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Gibco、##11107-018)、O.lnMe-巰基乙醇、10ng/ml激活蛋白A(R&DSystems,#338-AC)、10ng/mlHeregulinP(Peprotech;#100-03)、200ng/mlLR-IGF(JRHBiosciences、#85580)、全反式視黃酸(0.2-2.0jiM;Sigma-Aldrich)、50ng/ml重組人FgflO(R&DSystems)。當(dāng)補(bǔ)充有效量的視黃酸和FgflO時(shí)，其他確定成分培養(yǎng)基制劑的用途(見(jiàn)上述人ESC確定成分培養(yǎng)基)可用于分化步驟。實(shí)施例為了促進(jìn)(高效的/可控的/特異的結(jié)果)hESCs的分化，包括特異譜系的制備，包括內(nèi)胚層譜系，包括但不限制于定形內(nèi)胚層或胰腺內(nèi)胚層。用于治療和非治療目的。與上述相同，但為應(yīng)用其他(即成人)干細(xì)胞或前體。當(dāng)肺瘤細(xì)胞去分化時(shí)、當(dāng)癌癥細(xì)胞為干-細(xì)胞樣時(shí)，和當(dāng)癌癥細(xì)胞不發(fā)生分化時(shí)，為在癌癥申請(qǐng)。在各種疾病狀態(tài)下在前體或部分定型的細(xì)胞分化失敗的情況下?？芍苯酉騂ESC培養(yǎng)基加入本發(fā)明使用，或存在低濃度的血清或聯(lián)合其他生長(zhǎng)因子使用，例如細(xì)胞因子，其他因子包括TGF和超家族成員。當(dāng)需要制備特殊細(xì)胞類(lèi)型時(shí)，作為藥物篩選的一部分。權(quán)利要求1.從定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備人胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，其包括a.在細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，將人定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于有效量的視黃酸至少一天的時(shí)間；并且b.通過(guò)將所述細(xì)胞暴露于不含視黃酸的穩(wěn)定培養(yǎng)基而穩(wěn)定由步驟a獲得的分化細(xì)胞。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞從暴露于P13K抑制劑的人胚胎干細(xì)胞獲得。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述細(xì)胞分化培養(yǎng)基包含濃度約0.05昭/ml至約25ng/ml的視黃酸。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述細(xì)胞分化培養(yǎng)基包含濃度約0.1嗎/ml至約2嗎/ml的視黃酸。5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞分化培養(yǎng)基還包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中所述細(xì)胞分化培養(yǎng)基還包含濃度約2嗎/ml至約100嗎/ml的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10。7.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中所述細(xì)胞分化培養(yǎng)基還包含濃度約2(ig/ml至約100昭/ml的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10。8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞分化培養(yǎng)基為包含約2%至約20%胎牛血清的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞分化培養(yǎng)基包含約10%胎牛血清。10.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述穩(wěn)定培養(yǎng)基為包含約2%至約20%胎牛血清的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。11.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述穩(wěn)定培養(yǎng)基為包含約10%胎牛血清的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基。12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述暴露步驟發(fā)生至少約2天的時(shí)間。13.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述暴露步驟發(fā)生至少約4天的時(shí)間。14.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述暴露步驟發(fā)生至少約4天的時(shí)間。15.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述穩(wěn)定步驟發(fā)生至少約1天的時(shí)間。16.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述穩(wěn)定步驟發(fā)生至少約2天的時(shí)間。17.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基是DMEM和F12的混合物。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基是DMEM和F12以50:50混合的混合物。19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在定形內(nèi)胚層細(xì)胞或所述分化細(xì)胞在包含分化蛋白的支持物上生長(zhǎng)期間，發(fā)生所述暴露步驟或所述穩(wěn)定步驟。20.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在定形內(nèi)胚層細(xì)胞或所述分化細(xì)胞在包含基質(zhì)膠的支持物上生長(zhǎng)期間，發(fā)生所述暴露步驟或所述穩(wěn)定步驟。21.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞或所述分化細(xì)胞在包含分化蛋白的支持物上生長(zhǎng)期間，發(fā)生所述暴露步驟和所述穩(wěn)定步驟。22.從定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，其包括a.在細(xì)胞分化培養(yǎng)基中將定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于有效量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子至少一天的時(shí)間；并且b.通過(guò)將所述細(xì)胞暴露于穩(wěn)定培養(yǎng)基，穩(wěn)定由步驟a獲得的分化細(xì)胞。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子IO。24.制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，其包括a.將通過(guò)將人胚胎干細(xì)胞暴露于包含有效量的作為分化試劑的P13K抑制劑的基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基，從人胚胎干細(xì)胞制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞；b.穩(wěn)定所述的來(lái)自步驟a的定形內(nèi)胚層細(xì)胞；c.在步驟b后，在細(xì)胞分化培養(yǎng)基中將定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于有效量的視黃酸至少一天；并且d.通過(guò)將所述細(xì)胞暴露于無(wú)視黃酸的穩(wěn)定培養(yǎng)基，穩(wěn)定從步驟a獲得的分4b細(xì)l包。25.在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下，從胚胎干細(xì)胞制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法,包括使用生長(zhǎng)基質(zhì)將接種的胚胎干細(xì)胞暴露于確定成分培養(yǎng)基或MEF條件培養(yǎng)基，并且之后將干細(xì)胞暴露于分化培養(yǎng)基，所述分化培養(yǎng)基為確定成分培養(yǎng)基，其包含有效量的激活蛋白A、nodal、TGF(3或其他TGF成分，并且任選的包含PI3激酶信號(hào)抑制劑。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中確定成分培養(yǎng)基包括PI3K信號(hào)抑制劑。27.根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的方法，其中所述生長(zhǎng)基質(zhì)為基質(zhì)膠.。28.從胚胎干細(xì)胞制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，包括將無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的所述干細(xì)胞暴露于包含升高濃度的激活蛋白A、nodal或TNF卩和任選的PI3激酶信號(hào)抑制劑的分化培養(yǎng)基，其中所述分化培養(yǎng)基是不含胎牛血清或KSR-型血清成分的確定成分培養(yǎng)基。29.根據(jù)權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞以至少約90%的水平從所述胚胎干細(xì)胞制備。30.根據(jù)權(quán)利要求24-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞進(jìn)一步分化為胰內(nèi)胚層細(xì)胞。31.根據(jù)權(quán)利要求24-29所述的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。32.—種從人胚胎干細(xì)胞制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法，所述方法包括在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下，從胚胎干細(xì)胞制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞，包括使用生長(zhǎng)基質(zhì)將胚胎干細(xì)胞暴露于確定成分培養(yǎng)基或MEF條件培養(yǎng)基中，并且之后將所述干細(xì)胞暴露于分化培養(yǎng)基至少約3-6天的時(shí)間，所述分化培養(yǎng)基為確定成分培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含有效量的SMAD通路激動(dòng)劑，和任選的PI3激酶信號(hào)抑制劑，以制備定形內(nèi)胚層細(xì)胞，并且之后再將所述定形內(nèi)胚層細(xì)胞暴露于包含有效量的視黃酸和任選的有效量的FGF10的確定成分培養(yǎng)基約5-12天，優(yōu)選8-10天，以制備胰內(nèi)胚層細(xì)胞。33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述SMAD通路激動(dòng)劑選自激活蛋白A、nodal、TGF卩、TGF成分或其混合物。34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包括有效量的wnt3a。35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述生長(zhǎng)基質(zhì)為基質(zhì)膠。全文摘要本發(fā)明涉及允許從多能干細(xì)胞例如人胚胎干細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞的有效分化，以形成胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。本發(fā)明直接應(yīng)用于制備終代胰島β細(xì)胞，所述胰島β細(xì)胞可作為治愈糖尿病的部分治療使用。此外，本發(fā)明可用于從人胚胎干細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞制備肝內(nèi)胚層細(xì)胞。本發(fā)明涉及使用沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的確定成分培養(yǎng)基，從干細(xì)胞，優(yōu)選人胚胎干細(xì)胞，制備定形內(nèi)胚層和胰內(nèi)胚層細(xì)胞的方法。從胚胎干細(xì)胞提供胰內(nèi)胚層細(xì)胞的簡(jiǎn)單的兩個(gè)步驟代表了本發(fā)明的其他實(shí)施方案。文檔編號(hào)C12N5/08GK101541953SQ200780028903公開(kāi)日2009年9月23日申請(qǐng)日期2007年6月4日優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日發(fā)明者戴維·雷諾茲,斯蒂芬·達(dá)爾頓,邁克爾·庫(kù)利克申請(qǐng)人:佐治亞大學(xué)研究基金會(huì)