人胚胎干細胞衍生的間充質樣干細胞、方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供的公開內容一般涉及間充質樣干細胞“hES-T-MiSC”或“T-MSC”和生產所述干細胞的方法。所述方法包括在以下所述條件培養(yǎng)胚胎干細胞：胚胎干細胞經過中間產物滋養(yǎng)細胞分化而發(fā)育，并且培養(yǎng)所述分化的滋養(yǎng)細胞進而向hES-T-MSC或T-MSC分化。也描述了T-MSC衍生的細胞或細胞系“T-MSC-DL”。在此還公開的是溶液和藥物組合物，其包括所述的T-MSC和/或T-MSC-DL、制備所述T-MSC和/或T-MSC-DL的方法和使用所述T-MSC和T-MSC-DL治療和預防疾病的方法，特別是，T-MSC和T-MSC-DL被用作免疫抑制劑來治療多發(fā)性硬化癥和自身免疫性疾病。
【專利說明】人胚胎干細胞衍生的間充質樣干細胞、方法及其應用
[0001] 相關應用的參考
[0002] 本發(fā)明要求2012年7月11日提交的美國臨時專利申請61/670, 192的優(yōu)先權和 2012年8月17日提交的美國臨時專利申請61/684, 509的優(yōu)先權。在此以其整體引入作為 參考。
[0003] 1.引言
[0004] 本文提供的公開內容大體來說涉及間充質樣干細胞"hES-T-MSC"或"T-MSC"和制 備所述干細胞的方法，所述方法包括在以下條件下培養(yǎng)胚胎干細胞：胚胎干細胞經過中間 產物滋養(yǎng)細胞分化而發(fā)育，并由滋養(yǎng)細胞向hES-T-MSC或T-MSC分化。本文公開的內容是 T-MSC、溶液、藥物組合物（包括T-MSC)、制備T-MSC的方法、使用T-MSC治療和預防疾病的 方法，特別是，使用T-MSC作為免疫抑制劑治療多發(fā)性硬化癥和其它自身免疫性疾病，應用 于組織再生和/或修復，以及使用所述T-MSC穿過血腦屏障以及血脊髓屏障以遞送藥物的 方法。本文公開的內容也包括使用T-MSCs調節(jié)免疫系統(tǒng)、抑制對個體自身抗原的免疫反應 以及修復受損的中樞神經系統(tǒng)。本文公開的組合物包括用于免疫調節(jié)的T-MSCs，因為通過 修飾基因的表達提供免疫抑制能力得到提高的修飾的T-MSC。 2.【背景技術】
[0005] 人間充質干細胞/基質細胞已被廣泛應用于免疫系統(tǒng)調節(jié)和組織修復。人胚胎干 細胞可作為可靠的來源以誘導產生高質量的人間充質干細胞。目前已經有多種方法誘導人 胚胎干細胞向間充質細胞分化，然而目前所用的方法并不能以高效率誘導得到高產量、高 純度的間充質干細胞。
[0006] 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC)，是一種來源于成體小鼠和人類骨 髓、臍帶脂肪等組織、具有多向分化潛能的成體干細胞，這種干細胞在特定條件下能夠誘導 發(fā)育成脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞、成肌細胞、基質細胞和成纖維細胞等成熟 細胞。這些誘導技術非常成熟并且受到專利的保護。例如，參照美國專利號5, 486, 359 (人 間充質干細胞）。
[0007] 然而，當前可利用的成體組織來源的間充質干細胞存在著一些缺陷。第一，供體組 織如骨髓來源有限并且質量不一，限制了 MSCs的研宄和應用，以及阻礙MSCs作為醫(yī)藥產品 大規(guī)模臨床使用的標準化。第二，來源于成體組織的MSCs是高度復雜的細胞群，只有其中 一部分細胞具有強大的免疫抑制能力。臨床應用需要大量的MSCs，通常需要進行體外擴增 MSCs，然而體外擴增下降MSCs的免疫抵制和歸巢能力（Javazon et al.，2004)。第三，臨床 應用成體來源MSCs存在安全問題如惡性轉化（Wong，2011)以及供體潛在傳染性病原體的 傳播。
[0008] 為克服以上缺陷，科學家試圖通過不同方法將hESCs誘導分化為MSCs，其中包括 hESCs與小鼠骨髓基質細胞0P9共培養(yǎng)、使用多重細胞因子和化學試劑誘導并且手動挑選 (Barberi et al. ，2005 ;Chen et al. ，2012 ;Liu et al. ，2012 ;Sanchez et al. ，2011)。近 來研宄報道，TGFf3信號通路抑制劑SB431542被應用于誘導hESCs分化為MSCs，該方法簡 化誘導流程并且提高誘導效率（Chen et al.，2012)，然而MSCs的產量和純度都很低（參見 以下對照試驗）。在2010年，先進細胞技術公司的
【發(fā)明者】研制出另一種方法，誘導成血管細 胞分化為MSCs，盡管該方法使用許多昂貴的細胞因子以及甲基纖維素培養(yǎng)基，但是誘導效 率仍然很低。
[0009] 目前所知的hESCs誘導為MSCs的多種方法具有一種或多種缺點和弱點。其中， hESCs和OP9細胞共培養(yǎng)的誘導方法具有耗時長、產量低、純度低、使用動物的飼養(yǎng)層細胞 和不明確的培養(yǎng)條件等缺點（Barberi et al.，2005);從重鋪板的hESCs形成擬胚體周圍 過度生長細胞中分化的方法，具有耗時長、細胞產量低、培養(yǎng)條件不明確以及花費昂貴等 缺點（Olivier et al.，2006);從培養(yǎng)在膠原包被平板上的hESCs分化方法具有產量低、 培養(yǎng)條件不明確以及耗時長等缺點（Liu et al.，2012);利用TGFI3信號通路抑制劑處理 hESCs的分化方法具有純度低、產量低、耗時長以及所獲得的MSCs免疫抑制能力低下等缺 點（Chen et al.，2012;Sanchez et al.，2011)。因此，迫切需要無限制、實全、高穩(wěn)定性、 高誘導效率和相同來源的MSCs治療和預防各種疾病。
[0010] 多發(fā)性硬化癥（Multiple sclerosis，MS)是一種慢性的自身免疫性疾病，發(fā)病原 因為外圍的免疫細胞通過損傷的血腦屏障或血脊髓屏障滲透進入中樞神經系統(tǒng)，導致神經 軸突周圍的髓鞘發(fā)生炎癥以及脫髓鞘和軸突形成疤痕（McFarland and Martin(2007))。 據(jù)美國國家多發(fā)性硬化癥協(xié)會統(tǒng)計，目前美國食品及藥物管理局批準治療多發(fā)性硬化癥 的藥物超過70種，包括阿沃納斯（Avonex，IFN|3-la)、倍泰龍（Betaseron，IFN|3-lb)、芬 戈莫德（Gilenya，鞘氨醇1-磷酸受體調節(jié)物）、醋酸格拉替雷（Glatiramer acetate或 Copolymer 1)、那他珠單抗（Tysabri，人源化的α-整合蛋白抗體）。然而，這些藥物僅能 緩病情并且產生嚴重的副作用，包括感染增強、心臟病發(fā)作、中風、進行性多病灶腦白質病、 心律失常、疼痛、抑郁、疲勞、黃斑水腫和勃起功能障礙（Johnston and So (2012) ;Weber et al. (2012)) 〇
[0011] 由于間充質干細胞具有免疫調節(jié)和神經再生的功能（Auletta等，（2012); Pittenger等，（1999))以及修復血腦屏障的潛能（Chao等，（2009) ;Menge等，（2012))，因 此移植MSCs治療多發(fā)化硬化癥成為一種潛在的、非常具有吸引力的療法。MSCs具有多能 性，能夠誘導產生多種細胞系，包括脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞和神經元。MSCs存在于 胚胎、新生兒和成體的羊膜、臍帶、骨髓和脂肪等組織中。與當前的藥物效法相比，MSCs具 有多種獨特的優(yōu)點，例如，它們可以做為多重的和潛在的協(xié)同治療因子的載體、以及迀移至 損傷的組織通過分泌作用和細胞相互接觸發(fā)揮局部效應（Uccelli和Prockop (2010a)。重 要的是，MSCs已被證明能夠可以治療小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎，這是一種公認的多 發(fā)性硬化癥小鼠模型（Gordon 等，2008a ;Gordon 等，（2010) ;Morando 等，（2012) ;Peron 等，（2012) ;Zappia等，（2005) ;Zhang等，（2005))，同時，MSCs也應用于多發(fā)性硬化癥的臨 床試驗（Connick 等，（2〇12) ;Karussis 等，（2〇10) ;Mohyeddin Bonab 等，（2〇〇7) ;Yamout 等，（2010))。由于小鼠和人骨髓來源間充質干細胞（bone marrow-derived MSC，BM-MSC) 都能夠有效減緩小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎惡化，因此，MSCs異種移植并不是問題 (Gordon 等，（2〇〇8a) ;Gordon 等，（2〇10) ;Morando 等，（2〇12) ;Peron 等，（2〇12) ;Zappia 等，（2005) ;Zhang等，（2005))。然而，BM-MSC治療小鼠 EAE模型在不同的報道中療效不一 (Gordon 等，（2008a) ;Payne 等，（2012) ;Zappia 等，（2005) ;Zhang 等，（2005))，進而引發(fā) 對BM-MSC治療MS功效的懷疑。
[0012] 因此，迫切需要無限制、實全、高穩(wěn)定性、高誘導效率和來源一致的MSCs治療和預 防MS以及其它疾病。本文揭示通過一種高效的方法誘導hES分化成hES-T-MSCs，該方法滿 足以上要求。本文還揭示的內容是通過微陣列分析和其它分析，鑒定hES-T-MSC與BM-MSC 相比較的在多個關鍵因子的不同表達模式，以及hES分化成MSCs的其它方法。
[0013] 3.發(fā)明概述
[0014] 本文公開了一種通過滋養(yǎng)細胞誘導中間步驟由hESCs衍生間充質樣干細胞的方 法。通過這種方法獲得的間充質干細胞稱為"hES-T-MSC"或"T-MSC"。T-MSC經誘導后能 分化成脂細胞、成肌細胞、神經元細胞、成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、間質細胞等多種 細胞或細胞系。T-MSC分化的細胞或細胞系稱之為"T-MSC衍生的譜系"或"T-MSC-DL"。
[0015] 本文公開了包括T-MSC和/或T-MSC-DL的組合物，它們都具有免疫抑制的性能。 本文公開了基于能夠調節(jié)免疫應答而選擇的T-MSC和/或T-MSC-DL細胞群，和具有調節(jié)免 疫性能的組合物。本文也公開了，與BM-MSC相比較，具有更強的免疫抑制能力的T-MSC和 / 或 T-MSC-DL。
[0016] 本文公開了一種能夠有效地獲得高純度和高產量的T-MSC的方法。和以前的報道 方法相較，所述方法需要更少步驟和更少分化因子。
[0017] 本文公開了使用人胚胎干細胞（hESCs)通過滋養(yǎng)細胞的中間分化衍生間充質樣 干細胞的方法。所述滋養(yǎng)層來源的MSC稱為"hES-T-MSC"或"T-MSC"。該T-MSC被應用于 調節(jié)免疫系統(tǒng)。例如，它們能夠通過阻遏免疫細胞誘發(fā)中樞神經系統(tǒng)的損傷，從而高效地治 療多發(fā)性硬化癥。
[0018] 本文公開了由本文公開方法生產的人胚胎衍生的間充質干細胞。
[0019] 本文公開了誘導T-MSC分化為T-MSC-DL的方法。
[0020] 本文也公開了應用T-MSC和/或T-MSC-DL治療哺乳動物特別是人受試者的多發(fā) 性硬化癥以其它人類自身免疫性疾病。
[0021] 本公開發(fā)明的另一個目的是提供一種細胞產品T-MSC以應用于免疫調節(jié)。例如， 在組織或器官移植中阻止或抑制免疫排斥。所述方法的另一個具體實施例是下調或抑制免 疫應答，所述免疫應答是移植物抗宿主病。在另一個具體實施例中，所述免疫應答是自身免 疫性疾病，例如糖尿病、紅斑狼瘡或風濕性關節(jié)炎。
[0022] 本公開發(fā)明的進一步目的是提供用于治療神經系統(tǒng)疾病的細胞產品T-MSC-DL。
[0023] 所述方法可以采用足夠多本文提供的間充質干細胞在免疫應答中產生可檢測的 抑制作用。例如，用于接觸多種免疫細胞的多種本文提供的干細胞可包括IX i〇5t-msc、 I X 106T-MSC、I X 107T-MSC、I X IO8T-MSC 或更多。
[0024] 在一個實施方式中，本文所述方法是一種從hESCs衍生（在這里也指生產）MSCs 新方法。該方法包括以下步驟：
[0025] a.人胚胎干細胞培養(yǎng)在含有至少一種細胞因子的無血清培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基所含 的細胞因子量足夠誘導胚胎干細胞向滋養(yǎng)細胞分化。在一個實施方式中，分化為滋養(yǎng)細胞 的周期需要約2-5天。在一個實施例中，培養(yǎng)基中包含BMP4,同時在TGF β抑制劑（也就是 SB431542、Α83-01或ALK5抑制劑等等）存在或不存在的情況下，以提高分化效率。
[0026] b.添加至少一種生長因子至含有滋養(yǎng)細胞的培養(yǎng)物中，并且在無血清培養(yǎng)中繼續(xù) 培養(yǎng)，其中所述生長因子的量足夠擴增滋養(yǎng)細胞。在一個實施方式中，培養(yǎng)基含有BMP4 (這 一步驟是任選的）。
[0027] c.分離滋養(yǎng)細胞，然后將該細胞重新鋪至明膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、膠原或基 質膠包被的平板上，并且培養(yǎng)在含有或不含有血清的培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基的量足夠促進滋養(yǎng) 細胞通過前-T-MSC向T-MSC細胞分化。在一個實施方式中，分離的滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)4-10天 后產生T-MSC細胞，其中至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%的細胞表達成體間充干 細胞的表面標記。在一個實施方式中，培養(yǎng)基中包含LIF、bFGF或TOGF以提高擴增效率。
[0028] 在一個具體的實施方式中，人胚胎干細胞衍生的滋養(yǎng)細胞表達Trop-2,但不表達 CD73〇
[0029] 在一個具體的實施方式中，前-T-MSC表達Trop-2和/或CD73。
[0030] 在一個具體的實施方式中，所述T-MSC表達⑶73、⑶105和⑶90。本公開方法的 一個目的是誘導hESCs分化為高純度的MSCs。在一個優(yōu)選的實施方式中，⑶73+、⑶105+和 CD90+的 T-MSC 純度高于 90%、95%、96%、97%、98 %和 99%。
[0031] 通過檢測發(fā)現(xiàn)，高比例的T-MSC細胞表達成體間充質細胞的表面標記，證明T-MSC 具有很高的純度。無論在體內或體外，所述間充質干細胞比其它方法獲得的間充質干細胞 具有更高的免疫抑制能力。當前公開方法衍生的間充質干細胞被命名為人胚胎干細胞一滋 養(yǎng)細胞一衍生的間充質干細胞（hES-trophoblast-derived MSCs)和更簡潔的稱之T-MSC。
[0032] 在某些實施方式中，所述含血清培養(yǎng)基包含胎牛血清或人AB血清，并添加谷氨酰 胺。所所述無血清培養(yǎng)基含有去除血清替代物（knockout serum replacement，KOSR)或牛 血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA) 〇
[0033] 在某些實施方式中，有一個額外的步驟，該步驟使用從Igy至200gy不等的γ射 線輻射獲得的T-MSC。
[0034] 在本發(fā)明的另一個的實施方式中，所述的方法能夠產生并擴增得到至少10000個 T-MSC、至少 50000 個 T-MSC、至少 100000 個 T-MSC、至少 500,000 個 T-MSC、至少 IX IO6個 1'-]\^(：、至少5\106個1'-]^(：、至少1\10 7個1'-]^(：、至少5\107個1'-]^(：、至少1\108個 T-MSC、至少 5 X IO8個 T-MSC、至少 I X 10 9個 T-MSC、至少 5 X 10 9T-MSC 或至少 I X 101CIT-MSC。 這些方法可以獲得10000至100億個T-MSC細胞。在某些實施方式中，至少約90%、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%人胚胎-間充質干細胞表達一種或更多種 hES-MSC差異標記。在某些實施方式中，所述標記是⑶73、⑶90和⑶105。
[0035] 在一個實施方式中，所述T-MSCs顯著性地降低EAE小鼠的疾病評分，同時伴隨著 減少的脫髓鞘、T細胞滲入和小神經膠質的反應。另外，在體內和體外與骨髓來源間充質干 細胞（bone marrow derived MSCs，BM_MSC)相比較，T-MSCs具有更強的免疫抑制活性。還 提供了在T-MSC和BM-MSC之間差異表達的關鍵蛋白質/分子。本文提供了通過測量蛋白 質/分子標記的表達水平鑒定具有改善的免疫抑制活性的T-MSCs的方法。還提供了遺傳 修飾以提高T-MSCs的免疫抑制活性的方法。
[0036] 本發(fā)明的另一個實施方式是一種包含T-MSC的溶液，T-MSC至少包括至少 10000 個 T-MSC、至少 50000 個 T-MSC、至少 100000 個 T-MSC、至少 500000 個 T-MSC、至少 I X IO6個 T-MSC、至少 5 X 10 6個 T-MSC、至少 I X 10 7個 T-MSC、至少 5 X 10 7個 T-MSC、至少 1父108個1'-]\^(：、至少5\108個1'-]^(：、至少1\10 9個1'-]^(：、至少5\1091'-]^(：或者至少 IXio10T-MSC0
[0037] 在某些實施方式中，2ml體積的培養(yǎng)物中包含至少10000個細胞，IOml體積的培養(yǎng) 物中包含至少100000個細胞，IOOml體積的培養(yǎng)物中包含至少1000000個細胞，IOOOml體 積的培養(yǎng)物中包含至少10000000個細胞，以及4000ml培養(yǎng)基中達到5X IO8個細胞。
[0038] 可以注射這些溶液到受試者?？梢詢龃孢@些溶液?？梢园堰@些溶液用于制造成藥 劑，應用于通過T-MSC給藥來治療疾病。
[0039] 本發(fā)明還提供了一種生產可適合注射入病人體內的T-MSC溶液的方法，所述方法 包括以下步驟：利用前面段落描述的方法分離細胞溶液，然后將細胞接種至可適合注射至 患者的液體中。本發(fā)明還提供了一種可生產適合冷凍的T-MSC溶液的方法，該方法包含以 下步驟：利用前面段落所描述的方法分離細胞溶液，然后將細胞接種至可適合冷凍的溶液 中。
[0040] 還有，本發(fā)明的另一個實施方式是表達一個或者多個細胞表面標記蛋白或其組合 的 T-MSC，所述標記蛋白包括 CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146 和 CD166。 在另一個實施方式中，人胚胎干細胞衍生的間充質干細胞不表達或者低水平表達一個或多 個細胞標記蛋白或其組合，所述標記包括⑶34、⑶31、⑶45。在另一個實施方式中，人胚胎干 細胞衍生的間充質干細胞不表達或者低水平表達一個或多個促炎癥蛋白標記，或者這些促 炎癥蛋白的組合，所述促炎癥蛋白包括MMP2、RAGE、IFNyRl、IFNyR2、IL-12、TNFa、IL-6 和VCAMl。在某些實施方式中，與骨髓間充質干細胞相比，人胚胎干細胞衍生的間充質干細 胞表達上述標記至少一半的水平。
[0041] 本發(fā)明的另一個實施方式是一種包含T-MSC的細胞培養(yǎng)物，其中T-MSC表達一個 或多個細胞標記蛋白，包括⑶73、⑶90、⑶105、⑶13、⑶29、⑶54、⑶144、⑶146和⑶44。在 另一個實施方式中，細胞培養(yǎng)物中的T-MSC不表達或者低水平表達一個或者多個細胞標記 蛋白，包括⑶34、⑶31和⑶45。在另一個實施方式中，細胞培養(yǎng)物中的T-MSC不表達或者 低水平表達一個或者多個促炎癥蛋白，包括MMP2、RAGE、IFNyRl、IFNy R2、IL-12、TNFa、 IL-6 和 VCAM1。
[0042] 在某些實施方式中，所述細胞培養(yǎng)物中包含至少IX IO6個T-MSC，至少IX 10 7個 T-MSC，至少 I X IO8個 T-MSC，至少 I X 109 個 T-MSC，或者至少 I X 10 1(1 個 T-MSC。
[0043] 在另外一些實施方式中，細胞培養(yǎng)物中至少約90%的T-MSC表達⑶73蛋白；至少 多于90 %的T-MSC表達⑶73蛋白；至少約95 %的T-MSC表達⑶73蛋白；或者超過95 %的 T-MSC表達⑶73蛋白。在另一些實施方式中，細胞培養(yǎng)物中至少約96%的T-MSC表達⑶73 蛋白；至少多于97%的T-MSC表達⑶73蛋白；至少約98%的T-MSC表達⑶73蛋白；至少 多于99 %的T-MSC表達CD73蛋白。
[0044] 在另外一些實施方式中，細胞培養(yǎng)物中至少約75%、80%、85%、90%、5%、99%的 T-MSC表達至少一種選自⑶90、⑶105、⑶44和⑶29的細胞標蛋白。
[0045] 在另外一些實施方式中，細胞培養(yǎng)物中至少約80%、85%、90%、95%和99%的 T-MSC不表達或者低水平表達至少一種細胞標記蛋白，包括⑶34、⑶31和⑶45。
[0046] 在另外一些實施方式中，細胞培養(yǎng)物中至少約75%、80%、85%、90%、95%、99% 的T-MSC不表達或者低水平表達至少一種促炎蛋白，包括MMP2、RAGE、IFNyRl、IFNy R2、 IL-12、TNFa、IL-6和VCAM1。在某些實施方式中，所述T-MSC表達高水平的CD24、TGF0 2 或者兩者都高水平表達。
[0047] 在某些實施方式中，使用γ射線輻射本發(fā)明所述的T-MSC或細胞培養(yǎng)物。
[0048] 本發(fā)明的另一些實施方式是藥物制劑，其中藥物制劑包括任何一種本文所述 T-MSC或細胞培養(yǎng)物和藥學上可接受的載體。
[0049] 還有，本發(fā)明的另外一些的實施方式是任何本文所述T-MSC或細胞培養(yǎng)物的冷凍 制劑。
[0050] 本文還提供一種為有需要其治療的受試者治療和預防與T細胞相關的自身免疫 性疾病的方法，該方法包括以下步驟：向有需要其的受試者施用治療有效量的包括先前段 落中所描述T-MSC的溶液、細胞培養(yǎng)物或藥物制劑。與T細胞相關的自身免疫性疾病包括 但不限于克羅恩病、炎癥性腸病、移植物抗宿主疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和風濕性關節(jié)炎，還 有T細胞介導的延遲型超敏反應（屬于第四型過敏反應），即1型糖尿病、MS、RA、橋本甲狀 腺炎、克羅恩病、接觸性皮炎和硬皮病，等等。
[0051] 在某些實施方式中，優(yōu)選的受試者為哺乳動物或者鳥類，最為優(yōu)選的是人類。在某 些實施方式中，所述溶液、細胞培養(yǎng)物和藥物制劑包括已被輻射或未經輻射的T-MSC。
[0052] 在某些實施方式中，所述用于治療和預防疾病的方法包括與一種或多種用于治療 和預防藥物的聯(lián)合治療。
[0053] 在其他某些實施方式中，本發(fā)明為有需要其的受試者提供一種治療和預防多發(fā)性 硬化癥的方法，該方法包括以下步驟：向有需要其受試者給予治療有效量的包括前面段落 描述T-MSC的溶液、細胞培養(yǎng)物或藥物制劑。所述多發(fā)性硬化病可以是復發(fā)/持久型多發(fā) 性硬化癥、進展/復發(fā)型多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性多發(fā)性硬化癥或繼發(fā)性多發(fā)性硬化癥。受試 者優(yōu)選哺乳動物，并且最優(yōu)選為人類。所描述的溶液、細胞培養(yǎng)物或者藥物制劑可以包括輻 射或未經輻射的T-MSC。
[0054] 所述方法包括進一步給予受試者其它治療藥劑，該藥劑包括但不限于芬戈莫德、 促腎上腺皮質素（ACTH)、甲潑尼龍、地塞米松、IFNf3-la、IFN-lb、醋酸格拉替雷、環(huán)磷酰胺、 甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)孢菌素、米托蒽醌和柳氮磺胺吡啶。還有，在另外一個實 施方式中，為了將治療藥劑遞送至中樞神經系統(tǒng)，一種或多種治療藥劑可以連接在T-MSCs 上以便穿過血腦屏障和/或血脊髓屏障。
[0055] 本文提供一種穿過血腦屏障和/或血脊髓屏障遞送藥劑的方法，該方法包括以下 步驟：將藥劑連接或綴合至T-MSC，然后給予有需要其的受試者he-MSC和藥劑復合物，其中 所述的T-MSC能夠透過血腦屏障和/或血脊髓屏障，所述藥劑能夠治療、預防或診斷有需要 其的受試者的疾病或損傷。T-MSC可以是單個細胞、細胞培養(yǎng)物、溶液或藥物制劑的形式。 所述藥劑可以包括但不限于藥物、蛋白質、DNA、RNA和小分子物質。
[0056] 另一個實施方式是包括T-MSC和綴合或連接的藥劑的遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)的目的是 穿過血腦屏障和/或血脊髓屏障。
[0057] 本文描述的方法有許多優(yōu)點。該公開方法的一個目的是使hESCs通過中間滋養(yǎng)細 胞階段以實現(xiàn)分化，這種方法和現(xiàn)有的方法不一樣，并有以下優(yōu)點。
[0058] 本文提供一種選擇臨床級別T-MSC以治療自身免疫性疾病的方法，所述T-MSC具 有以下特征：（i)含有>95 %的細胞表達組-1標記；（ii)含有>80 %的細胞表達組-2標記； (iii)含有〈5 %的細胞表達組_3標記；（iv)表達IL-10和TGF β ;(v)含有〈2 %的細胞表達 IL-6、IL-12和TNFa ; (Vi)表達高水平的CXCR7、CXCL2和CXCL12,但表達低水平的H0XB2、 H0XB3、H0XB5、H0XB7、H0XB9、H0XA5、H0XA9 和其它 HOX 家族的基因；（vii)含有〈0. 001% 的 細胞共表達所有組-4標記。其中組-1標記是：⑶73、⑶90、⑶105、⑶146、⑶166和⑶44。 組-2 標記是：CD13、CD29、CD54 和 CD49E。組-3 標記是：CD45、CD34、CD31 和 SSEA4。組-4 標記是：〇CT4、NANOG、TRA-1-60 和 SSEA4。
[0059] 本文提供一種修飾的T-MSC生產一群修飾的間充質干細胞的方法，所述修飾的間 充質干細胞具有以下特征：（i)含有>95%的細胞表達組-1標記；（ii)含有>80%的細胞 表達組-2標記；（iii)含有〈5%的細胞表達組-3標記；（iv)表達IL-10和TGF β ; (V)含 有〈2 %的細胞表達IL-6、IL-12和TNF a ; (vi)含有少于〇. 001 %的細胞共表達所有組-4 的標記。其中組-1標記是：⑶73、⑶90、⑶105、⑶146、⑶166和⑶44。組-2標記是⑶13、 CD29、CD54 和 CD49E。組-3 標記是 CD45、CD34、CD31 和 SSEA4。組-4 標記是：0CT4、NAN0G、 TRA-1-60 和 SSEA4。
[0060] 本文提供條件培養(yǎng)基、條件培養(yǎng)基濃縮液、細胞裂解物或其它其衍生品，其包括由 所述T-MSC分泌的一種或多種生物分子。
[0061] 本文提供了使用T-MSC作為飼養(yǎng)細胞以擴增骨髓造血干細胞和臍帶造血干細胞 的方法。在某些實施方式中，這些適合公開方法的T-MSC表達Stro3。在某些實施方式中， T-MSC和骨髓造血干細胞和/或臍帶造血干細胞共培養(yǎng)。在某些實施方式中，T-MSC是間充 質干細胞。這里提供了一種由所述T-MSC和骨髓造血干細胞組成的共培養(yǎng)物。這里提供了 一種由所述T-MSC和臍帶造血干細胞組成的共培養(yǎng)物。
[0062] 同樣公開了包括本文所述T-MSC的試劑盒。在某些實施方式中，所述試劑盒包括 T-MSC和細胞遞送載體。
[0063] -方面，本文提供了一種抑制或降低免疫反應的方法，該方法包括將多個免疫細 胞和多個T-MSC相互接觸一段時間，這段時間足夠T-MSC可檢測地抑制免疫反應，其中，在 混合淋巴細胞反應試驗中，T-MSC可檢測出地抑制T細胞的增殖和/或分化。在另一個具 體的實施方式中，細胞相互接觸是在體外進行的。在一個更具體的實施方式中，體內的細胞 相互接觸在哺乳動物如人類中進行。在另一個具體的實施方式中，所述細胞相互接觸包括 靜脈內、肌肉內給予T-MSC或者注射入受試者器官（如胰腺）。
[0064] 本文提供了生產細胞群的方法，所述細胞群包含T-MSC，對這些T-MSC的選擇基于 它們具有調控（如抑制）免疫應答的能力。例如，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種 選擇T-MSC細胞群的方法，這種方法包括：(a)在混合淋巴細胞反應（MLR)試驗中分析多個 T-MSC ; (b)如果多個T-MSC在混合淋巴細胞反應試驗中可檢測地抑制⑶4陽性或⑶8陽性T 細胞的增殖，選擇多個T-MSC。這里所述的T-MSC表達CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54 和⑶44。在一個實施方式中，T-MSC不表達或者表達低水平的⑶34、⑶31和⑶45。在一 實施方式中，T-MSC不表達或表達低水平的MMP2、RAGE、IFNGR2、IL-12A、IL-6和VCAM1。
[0065] 本文提供了 T-MSC分化為多種其它細胞系的方法，所述細胞系包括但不限于脂肪 細胞、成肌細胞、神經細胞系、成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞和間質細胞。
[0066] 本文提供了使用T-MSC及其分化的細胞產物進行組織再生和或組織修復的方法， 這些方法包括：給予足夠量的T-MSC和/或T-MSC衍生的其他細胞系以促進組織再生。組 織生包括但不限于關節(jié)再生、肌腱再生、結締組織再生、神經細胞系再生、脂肪組織再生、骨 再生、皮膚再生、肌肉再生、軟骨再生、平滑肌再生、心肌再生、上皮組織再生和韌帶再生。
[0067] 在具體的實施方式中，混合淋巴細胞反應試驗中T細胞和T-MSC的比例，例如約 20:1、15:1、10:1、5:1、2:2、1:1、1:2、1:5、1:10 或 1:20,優(yōu)選 10:1。
[0068] 本公開方法的另一個目的是通一種高產量的方法實現(xiàn)高效地產生大量的間充質 干細胞。本公開方法可以產生得到是起始hESCs細胞數(shù)約10倍的間充質干細胞。在hESCs 通過滋養(yǎng)細胞分化的過程中有極少的細胞丟失，然而，其它的方法在起始的分化步驟中有 超過90%的起始細胞發(fā)生丟失，從而導致得到比本公開方法更少的細胞量。
[0069] 本公開方法的一個目的是提供一種能夠在相對短時間內生產間充質干細胞的方 法。完成本文所述方法的整個流程需要不超過6-14天，這依起始hES系而定。
[0070] 本公開方法的一個目的是提供一種低成本的方法。所述的分化方法僅需要非常少 量的培養(yǎng)基，僅僅需要一種細胞因子-BMP4,而且BMP4在本方法的使用濃度非常低。
[0071] 本公開方法的一個目的是提供一種低成本的方法。本文所述的分化方法僅需要非 常少量的培養(yǎng)基，僅僅需要一種細胞因子一 BMP4和/或TGFI3抑制劑（如SB431542、A83-01 或ALK5抑制劑等等）。
[0072] 本公開方法的一個目的是提供一種高產量的方法。這里所述分化方法可在30天 內從IX IO5個hESC中生產1-5X10 1(1個T-MSC細胞，然而其它方法在30天內僅能生產達 IX IO8個 MSC0
[0073] 本公開方法的進一步目的是提供具有高免疫抑制效力的間充質干細胞。所述 T-MSC比骨髓（BM)和其它組織來源的間充質干細胞具有更高的免疫抑制能力。所述T-MSC 比人胚胎干細胞通過其它方法衍生的間充質干細胞具有更高的免疫抑制能力。
[0074] 在具體的實施方式中，與不含T-MSC的混合淋巴細胞反應試驗相比較，含T-MSC的 混合淋巴細胞反應試驗抑制至少50%、70%、90%或95%⑶4陽性或⑶8陽性T細胞的增 殖。
[0075] 在另一個具體的實施方式中，上述任何一種組合物包含基質。在一個更具體實施 方式中，所述基質是三維的支架。在另一個更具體的實施方式中，所述基質包括膠原、明膠、 層粘連蛋白、纖連蛋白、果膠、鳥氨酸或玻連蛋白。在另一個更具體的實施方式中，所述基質 是生物材料。在另一個更具體的實施方式中，所述基質包括細胞外膜蛋白質。在另一個更具 體的實施方式中，所述基質包括合成化合物。在另一個更具體的實施方式中，所述基質包括 生物活性物質。在另一個更具體的實施方式中，所述生物活性物質是生長因子、細胞因子、 抗體或小于5000道爾頓的有機分子。
[0076] 本發(fā)明進一步提供冷凍保存的干細胞群，如包含T-MSC的細胞群，其中，所述細胞 群具有如這里所述的免疫調控能力。例如，本發(fā)明提供了一群經鑒定在混合淋巴細胞反應 (MLR)試驗中能夠可檢測性地抑制T增殖和/或分化的T-MSC，其中，所述細胞已經冷凍保 存，并且其中所述細胞群被裝在容器中。
[0077] 在一個具體的實施方式中，保存上述任何一種冷凍保存的細胞群的容器是袋子。 在各種【具體實施方式】中，所述細胞群包括約、至少或最多I X IO6個所述干細胞、5 X 10 6個所 述干細胞、IX IO7個所述干細胞、5 X 107個所述干細胞、IX 108個所述干細胞、5 X 108個所述 干細胞、I X IO9個所述干細胞、5 X 109個所述干細胞、或I X 10 1(1個所述干細胞。在任何上述 冷凍保存的細胞群的其它【具體實施方式】中，所述干細胞已經被傳代的次數(shù)至少或者不超過 5次、不超過10次、不超過15次、不超過20次。在任何上述冷凍保存的細胞群的另一個具 體實施方式，所述干細胞是在容器中擴增。
[0078] 4.附圖簡述
[0079] 圖I (A-B). (A) hESC經過滋養(yǎng)細胞和前-T-MSC階段分化為T-MSCs的流程圖。每 個分化階段相關的關鍵生物標記如圖所示。（B)對比不同MSC制備方法所得到的MSC的產 量和質量：三種不同方法誘導hESCs分化。DT-MSC :在滋養(yǎng)層分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后，再在 MSC生長培養(yǎng)基培養(yǎng)8-10天。2) SB-MSC :在添加 SB431542的分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3-10天后，再 在MSC生長培養(yǎng)基培養(yǎng)12天。3) HB-MSC :hESC經過中間階段成血管細胞分化為MSC，hESC 在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)10-13天分化為成血管細胞，然后在MSC生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天。從 如圖中所示分化方法開始分化后第10天、20天和30天在不同培養(yǎng)基中得到總MSCs數(shù)量 (百萬個細胞）。流式細胞術分析CD73陽性的細胞比率以檢測MSC的純度。
[0080] 圖2 (A-C).在hESCs向T-MSCs分化過程中不同時間點觀察到的細胞形態(tài)變化。 ⑷第二天：滋養(yǎng)細胞；(B)第5天：pre-MSCs (中胚層細胞）；（C)第9天：MSCs。
[0081] 圖3 (A-C).在hESCs向T-MSCs分化過程中不同時間點分析表達滋養(yǎng)細胞標記 Trop-2 (Trp-2)和表達MSC標記CD73的細胞的比率。（A)第2天：滋養(yǎng)細胞；(B)第5天： pre-MSCs (中胚層細胞）；（C)第9天：MSCs。
[0082] 圖4 (A-H).在分化11天后T-MSC表面標記的表達模式。（A) Trp2是滋養(yǎng)細胞的標 記；(B)⑶31是內皮細胞的標記；（C)⑶34是造血干細胞的標記；(D-H)⑶73、⑶90、⑶105、 CD44和CD29是MSC的標記。
[0083] 圖 5 (A-R). T-MSCs 的體外免疫抑制功能。BM-MSCs (G-L)或 T-MSCs (M-R)以 10 :1 的比例與標記CFSE的小鼠淋巴細胞混合。以濃度0. 3或1 μ g/ml的⑶3的抗體和濃度為 1 μ g/ml的⑶28的抗體刺激細胞。經流式細胞術分析通過CFSE的稀釋度指示細胞增殖。 (A-F)圖中所示為不添加 BM-MSC或T-MSC (標記比照）的T細胞。
[0084] 圖6. T-MSC減少EAE小鼠模型的疾病評分。MOG35-55加上佐劑和百日咳毒素處理 C57BL/6構建EAE小鼠模型。EAE小鼠模型誘導的第6天，T-MSC、BM-MSC和經SB431542方 法誘導hESCs得到的MSC (hES-MSC (SB))經腹腔注射小鼠體內。在注射所后的27天記錄疾 病評分（從無疾病〇至嚴重疾病4)。
[0085] 圖7 (A-C).檢測T-MSC多能性，分化為：㈧成骨細胞，⑶軟骨細胞，（C)脂肪細 胞。
[0086] 圖 8. hES-HB-MSC(hES-hemagioblast 來源的 MSC))、T-MSC(hES-trophoblast 來源 的MSC)和BM-MSC(成體骨髓來源的MSC)基因表達模式比對分析。基因表達標準化，并以 任意表達單位展示。
[0087] 5.詳細描述
[0088] 5. 1 定義
[0089] 在本發(fā)明的上下文和每個術語應用的特定上下文范圍內，本說明書中應用的術語 在本領域中一般具有它們的常規(guī)含義。在下文或本發(fā)明的其他部分對某些術語進行了討論 以對本發(fā)明的方法描述及如何使用它們，為實施者提供額外的指導。此外，可以理解為，同 樣的事情可以以一種以上的方式敘述。因此，對本文所論述的任一個或多個術語都可使用 選擇性的語言和同義詞，無論該術語是否詳述或討論于此，對其都沒有任何特殊的意義。本 文提供了某些術語的同義詞。描述一個或多個同義詞并不排除使用其它的同義詞。這些或 其他在本說明書中任何地方的實施方式的用途僅僅是說明性的，并且決不限制本發(fā)明或任 何舉例說明的術語的范圍和含義。
[0090] 術語hESC是人胚胎干細胞，包括從胚胎、內細胞團、卵裂球或細胞系產生的多能 性的干細胞。
[0091] 本文所使用的術語"hES-MSC"或"hES-MSCs"或"人胚胎間充質干細胞"或"人胚胎 干細胞衍生的間充質干細胞"或"hES-MSC群"指人胚胎干細胞或誘導多能干細胞"iPSCs" 使用任何方法衍生的間充質樣干細胞、間充質樣基質細胞、間充質干細胞或間充質基質細 胞。本文使用的hES-MSC包括hES-MSC單細胞、hES-MSC細胞系、一批hES-MSC、大量hES-MSC 或 hES-MSC 群。
[0092] 術語"T-MSC"指人胚胎干細胞（(hESC))或誘導多能干細胞（iPSC)通過中間階段 (該階段的細胞表達Trop-2,并具有滋養(yǎng)細胞形態(tài)）而衍生的MSC或間充質干細胞/間充 質基質細胞。術語"hES-T-MSC"指hESC分化的T-MSC。術語"" iPS-T-MSC"或" iT-MSC"指 iPSC分化的T-MSC。這里所用的術語"T-MSC"不指滋養(yǎng)細胞。如果細胞保持了干細胞中的 至少一種屬性，例如能分化成至少一種其它類型的細胞，或類似的功能，那么這種細胞被認 為是"干細胞"。對這些細胞的描述可基于多種結構和功能特性，包括但不限于，表達或缺乏 表達一種或多種標記。T-MSCs，包括hES-T-MSC和iT-MSC，是多能性的并且能分化產生其它 類型的細胞或細胞系。
[0093] 術語"hES-HB-MSC"或"HB-MSC"指包括hESC和iPSCs的人多能干細胞通過成血 管細胞或血管集落形成中間步驟而衍生的間充質干細胞。
[0094] 本文使用的術語"臨床級別T-MSC"指具有以下特征的MSC :適合在臨床上用于人、 鳥類或其它動物。
[0095] 本文使用的術語"T-MSC群"指一群T-MSC細胞，包括適合用于治療的T-MSC細胞 和不適合用于治療的T-MSC細胞。
[0096] 本文使用的術語"T-MSC衍生的細胞系"或"T-MSC-DL"指T-MSC分化的細胞或細 胞系，包括但不限于脂肪細胞、成肌細胞、神經細胞譜系細胞、成骨細胞、成纖維細胞、軟骨 細胞和基質細胞。
[0097] 本文使用的短語"治療有效量"指其數(shù)量足以引起的改善受試者的臨床顯著癥狀， 或延遲或最小化或減輕一種或多種與所述疾病有關的癥狀，或者導致受試者在生理學上所 希望的有益改變。
[0098] 術語"治療"是指減緩、緩解、改善或減輕至少一種疾病的癥狀，或在發(fā)病后逆轉其 發(fā)作。
[0099] 術語"預防"指在發(fā)病前起作用，以防止形成該疾病或減輕疾病的嚴重程度或延緩 其發(fā)展的過程。
[0100] 本申請中使用的術語"受試者"指具有免疫系統(tǒng)的動物，例如禽類和哺乳動物。哺 乳動物包括犬科動物、貓科動物、嚙齒類動物、牛、馬、豬、羊和靈長類動物。禽類包括但不限 于家禽、鳴禽和猛禽。因此，本發(fā)明可用在獸醫(yī)醫(yī)學中，例如，為了治療玩賞動物、農場動物、 動物公園的實驗動物和在野外動物。本發(fā)明特別適合于人類醫(yī)藥應用。
[0101] 術語"需要其"是受試者已知或懷疑患有或有風險發(fā)展成疾病，包括但不限于多發(fā) 性硬化癥和其他T細胞相關的自身免疫疾病，或與中樞神經系統(tǒng)、血-腦屏障或血一脊髓屏 障相關的疾病。
[0102] 一個需要治療的受治療者是已經發(fā)生疾病的受試者。一個需要預防的受試者是具 有發(fā)生該疾病的風險因素的受試者。
[0103] 本文使用的術語"藥劑"指一種產生或能夠產生效果的物質，可以包括但不限于、 化學品、醫(yī)藥品、藥品、生物制劑、小分子、抗體、核酸、肽類和蛋白質。
[0104] 如本文所使用的，干細胞是特定標記"陽性的"，指該標記是可檢測時。例如，T-MSC 是，例如CD73陽性的，因為在T-MSC中CD73的量是可檢測的，高于背景（例如，同種型對 照）。細胞也可以是標記陽性的，當所述標記可用于區(qū)分至少一種其他類型的細胞，或可用 于選擇或分離該細胞，其中所述標記是存在或表達于這種細胞的。
[0105] 如本文所用的，"免疫調節(jié)"是指引起或有能力引起免疫反應可檢測的變化，以及 引起免疫應答的可檢測變化的能力。
[0106] 如本文所用的，"免疫抑制"是指引起或有能力引起免疫反應可檢測的下降，以及 引起免疫應答的可檢測抑制的能力。
[0107] 本發(fā)明是基于首次發(fā)現(xiàn)間充質干細胞（MSCs)可以從人類胚胎干細胞衍生的滋養(yǎng) 層細胞分化，并且該滋養(yǎng)層來源的MSCs(T-MSC)可用于組織修復和免疫調節(jié)作用。這些由 本公開方法生產的T-MSC在體外顯著地抑制T細胞的增殖和分化，并且在體內減少疾病評 分，然而骨髓來源的間充質干細胞（BM-MSC)在體內完全不具有作用，盡管BM-MSC在體外可 以部分地下調T細胞增殖和分化。本文所述的T-MSC與BM-MSC相比，具有令人驚奇的更高 的免疫抑制活性。本文所公開的方法是高效的，并且能以成本低生產大量高純度的T-MSC。 本文公開的方法是高度可重復的，具有很小的批與批之間差異，并且易于適應臨床需要。
[0108] 因此，本發(fā)明通過提供一種人胚胎干細胞在體外產生間充質干細胞（MSC)的方 法，克服了上述問題。由本文公開方法產生hES-T-MSC的能力允許這些細胞的生產，這些細 胞可用于各種治療應用，包括多發(fā)性硬化癥和其它自身免疫性疾病的治療和預防。另外，由 本文所述方法生產的hES-MSC具有穿過血-腦屏障（BBB)和血-脊髓屏障的能力，進而允 許它們用于各種治療應用，包括藥物遞送。本發(fā)明所述的方法提供進一步的效用，因為它們 能夠大量產生在商業(yè)范圍內可使用的hES-T-MSC。
[0109] 5. 2胚胎干細胞經過滋養(yǎng)細胞分化獲得T-MSC
[0110] 本文公開一種從胚胎干細胞（hES)珩生的滋養(yǎng)細胞產生得到并擴增間充質樣干 細胞（MSCs)的方法。這些產生的細胞定義為T-MSC。可分離和/或純化這些T-MSC。
[0111] 胚胎干細胞已經被報道經不同的方法誘導得到間充質干細胞樣的細胞（Barbieri et al. (2005) ;01ivier et al. (2006) ;Sanchez et al. (2011) ;Brown et al. (2009))。然 而，所有這些方法涉及共培養(yǎng)和手工挑選步驟，限制細胞的產量和純度，因而導致所得細胞 的質量不一。
[0112] 盡管hESC表達低水平的主要組織相容性復合體抗原，但是已經發(fā)現(xiàn)這些抗原在 hESC分化的多種細胞表達水平更高（Draper et al.，2002 ;Drukker et al.，2006 ;Drukker et al.，2002)，因此，將這些分化的細胞移植至患者體內引起對免疫排斥極大的關注。相 反，MSC表達低水平的共刺激分子和主要組織相容性復合體抗原，并且已經被應用于同種 或異種移植模型以治療自身免疫性疾病（Gordon等，2008b ;Grinnemo等，2004 ;Rafei等， 2009a ;Rafei等，2009b ;Tse等，2003)。T-MSC和成體組織來源的MSC-樣，表達低水平的共 刺激分子和主要組織相容性復合體抗原，并且不需要長期移植就能發(fā)揮免疫抑制作用。由 于MSC和患者的主要組織相容性復合體抗原不匹配，因此無需擔憂免疫排斥。一個hESC系 就足以產生無限供應的大規(guī)模的T-MSC，并且容易控制質量，適合工業(yè)化生產，成為治療MS 和其他以T細胞為基礎的自體免疫疾病的患者一種潛在的療法。
[0113] 人滋養(yǎng)細胞可以從人胚胎干細胞中產生。這些胚胎干細胞包括來源或使用，例如 胚泡、接種的ICMs、一個或多個卵裂球，或者植入前階段的胚胎或胚胎樣組織，無論是否通 過受精、體細胞核移植（SCNT)、孤雌生殖、雄核發(fā)育無性繁殖的方法產生。
[0114] 另外或可供選擇地，滋養(yǎng)細胞可從其它胚胎衍生的細胞產生。例如，滋養(yǎng)細胞（但 不一定需要通過胚胎干細胞這一步驟）可通過來源或使用接種的胚胎、ICMs、胚泡、一個或 多個卵裂球、滋養(yǎng)層干細胞、胚胎生殖細胞、或植入前階段的胚胎或胚胎樣組織，無論是否 通過受精、體細胞核移植（SCNT)、孤雌生殖、雄核發(fā)育無性繁殖的方法產生。相似地，可以使 用從胚胎來源細胞分化的部分細胞或細胞系產生滋養(yǎng)細胞。例如，如果一個人胚胎干細胞 系被用來生產比滋養(yǎng)細胞發(fā)育更原始的細胞，那么就發(fā)育潛力和可塑性而言，這種胚胎來 源的細胞可以產生滋養(yǎng)細胞。
[0115] 另外或可供選擇地，滋養(yǎng)細胞可從其它分娩前和圍產后的原料，包括但不限于臍 帶、臍帶血、羊膜液、羊膜干細胞和胎盤中產生。
[0116] 胚胎干細胞可以作為這種方法的起始材料。胚胎干細胞可以按本領域目前所熟知 的任何一種培養(yǎng)方法，例如有或沒有飼養(yǎng)細胞。
[0117] 在此闡述的實施方式中，共使用了 8種hESC細胞系，分別為H9(WiCell Research Institute)(Thomson 等.(1998))、 CT2(University of Connecticut Stem Cell Core (Lin 等.（2010))、ES03_Envy (Envy，帶 GFP 標簽的細胞系，ES International) (Costa 等·（2005))、ESI-017、ESI-053、ESI-049、ESI-035 和 ESI-051。
[0118] 本方法獲取T-MSC的第一個步驟中，人胚胎干細胞以小團塊或單細胞形式培養(yǎng)在 不含bFGF的無血清培養(yǎng)基，然后將細胞重新鋪至含BMP4(l-200ng/ml)的培養(yǎng)基中繼續(xù)培 養(yǎng)，選擇BMP4是因為僅添加這個細胞因子就能在短時間內（2-5天）獲得高純度的、表達典 型滋養(yǎng)層標記Trop2/TACSTD2(Trp2)的滋養(yǎng)細胞。添加 TGF0抑制劑（SB431542(l-20yM)， Α83-01(0·2-5μΜ)或ALK5抑制劑（1-20μΜ)，等）可以提高滋養(yǎng)細胞的生成率。細胞在 2-5天內擴增并分化為具有滋養(yǎng)層形態(tài)的滋養(yǎng)細胞。在某些實施方式中，超過90%的細胞 表達Trop-2/TACSTD2 (Trp-2) (Xu等，2002)。滋養(yǎng)細胞可以依據(jù)細胞大小分離或采用抗體 純化，如免疫親和柱層析。
[0119] 在一個實施方式中，用胰酶替代物TrypLE、胰酶或膠原酶B將滋養(yǎng)細胞消化成單 細胞。獲得的單細胞在優(yōu)化的間充質干細胞培養(yǎng)基中重懸，如含2-20%胎牛血清（FBS)或 人AB血清（ABHS)的a -MEM培養(yǎng)基、含2-20% FBS或ABHS的高糖DMEM培養(yǎng)基?？捎煤?5-20%血清替代物（KOSR)或牛血清白蛋白（BSA)、或任何其它可用的商業(yè)化無血清MSC培 養(yǎng)基替代FBS。在某些實施方式中，培養(yǎng)基中血清、KOSR或BSA的濃度約為5-20%。在某些 實施方式中，F(xiàn)BS是優(yōu)選的。在某些實施方式中，細胞的培養(yǎng)密度約10-1000細胞/cm 2。在 某些實施方式中，細胞培養(yǎng)在模擬組織的細胞外基質環(huán)境，如明膠、玻連蛋白、層粘連蛋白、 纖連蛋白和膠原I。在某些實施方式中，MSC的培養(yǎng)基添加 LIF(2-20ng/ml)、bFGF(2-100ng/ ml)、或roGF(l-50ng/ml)以提高擴增效率。
[0120] 在重懸約24小時后，許多細胞（50-90% )貼壁于培養(yǎng)皿。約2-3天后，滋養(yǎng)細胞 開始向前-T-MSC分化，這些細胞形態(tài)變長并且邊緣透明。在某些實施方式中，前-T-MSC同 時表達⑶73和Trop-2。在6-10天后，超過80-90%的滋養(yǎng)細胞分化為紡錘樣形態(tài)的間充 質樣干細胞，也就是所謂的T-MSC。T-MSC可通過檢測某些標記的表達鑒定，如表達⑶73、 ⑶90、⑶105、⑶13、⑶29、⑶54、⑶44、⑶146和⑶166,并且不表達或表達低水平的⑶31、 ⑶34和⑶45。在某些實施方式中，T-MSC不表達HOX和HLA-G。在某些實施方式中，T-MSC 表達高水平的 CXCR7、CXCL2 和 CXCL12,但表達低水平的 H0XB2、H0XB3、H0XB5、H0XB7、H0XB9、 H0XA5、H0XA9和HOX家族的其它基因。同時T-MSC也具有以下特征：多能性并能化分為脂 肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經元、成肌細胞、基質細胞和成纖維細胞。
[0121] 本文提供一種分離的細胞群，其中，所述細胞群包含多個具有免疫抑制功能的 T-MSC。這些T-MSC至少表達一種以下標記：CD73、CD90和CD105。
[0122] 在本發(fā)明進一步的實施方式中，額外添加輻射T-MSCs的步驟。該照射可以采用任 何本領域已知的輻射方法，包括但不限于伽馬輻射，如銫-137伽馬輻射，或X-射線光子輻 射。輻射的優(yōu)選量在5和20000gy之間，更優(yōu)選的在50和IOOgy之間，最優(yōu)選的是80gy。
[0123] 在一個實施方式中，本文所述的方法是一種新的hESCs衍生（本文也稱為生產） T-MSC的方法。該方法包括以下步驟：
[0124] a.在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含人胚胎干細胞的細胞培養(yǎng)物，培養(yǎng)基中添加至少一 種生長因子，并且含量足以誘導胚胎干細胞分化為滋養(yǎng)細胞。在一個實施方式中，分化為滋 養(yǎng)細胞的時間周期約為2-5天。在一個實施方式中，培養(yǎng)基含BMP4、添加或不添加 TGFb抑 制劑（例如SB431542、A83-01或ALK5抑制劑，等）能提高分化效率。
[0125] b.至少添加一種長生因子至含滋養(yǎng)細胞的細胞培養(yǎng)物并繼續(xù)在無血清培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，這里添加生長因子的量足夠促進滋養(yǎng)細胞擴增。在一個實施方式中，培養(yǎng)基含有 BMP4(這一步驟可選）。
[0126] c.分離的滋養(yǎng)細胞重新鋪至包被明膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、膠原或 基質膠的培養(yǎng)皿，并培養(yǎng)在含或不含血清的培養(yǎng)基中，其中，這些培養(yǎng)基以的量足以促進滋 養(yǎng)細胞通過前-T-MSC中間階段分化為T-MSC。在一個實施方式中，分離的滋養(yǎng)細胞經培養(yǎng) 6-10天后產生表達成體MSCs標記的T-MSC。其中至少約90%、95%、96%、97%、98%、99% 的T-MSC表達成體MSCs的細胞表面標記。在一個實施方式中，培養(yǎng)基中添加 LIF、bFGF、 PDGF以促進擴增效率。其中，獲得的T-MSC至少約90%、95%、96%、97%、98%、99%表達 成體MSCs細胞表面標記。
[0127] 如圖1和圖2所示，本公開方法首先將hESC打散為小團塊或單細胞，然后將這些 細胞重新鋪并培養(yǎng)在只含一種細胞因子BMP4和一種TGF β抑制劑的培養(yǎng)基。添加的TGF β 抑制劑可以在時間內（2-5天）獲得高度同質的滋養(yǎng)細胞群，這些細胞群表達典型的滋養(yǎng) 細胞標記Trop-2/TACSTD2 (Trp-2) (Xu等，2002)。接著將滋養(yǎng)細胞打散，重新鋪在包被明 膠、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、膠原或基質膠的培養(yǎng)皿，并在MSC生長培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4-10天產生紡錘狀的細胞，這些細胞的形態(tài)與典型的MSCs相類似。
[0128] 本文公開的方法，不同于其它的方法，不需要飼養(yǎng)層細胞、不需要分類揀選或手工 挑選細胞。滋養(yǎng)細胞分化的第一步在是成分明確的、不含bFGF的無血清培養(yǎng)基中進行。整 個分化流程僅需要2個步驟，總耗時6-14天，就能產生高產量和高純度的T-MSC (圖1)。這 是目前報道的hESC分化為MSC方法中時間最短的。與以住的方法相比較，該方法獲得的 T-MSC的產量和純度都很高。在30天內，獲得的T-MSC數(shù)量是初始hESCs的5 X IO5倍，并 且⑶73陽性細胞的比率很高，其中⑶73是MSC所特有的標記。然而，其它方法獲得的MSC 的數(shù)量與起始的hESCs的數(shù)量相比，小于100倍，并且所獲得的細胞中CD73陽性的比率低。 誘導得到的T-MSC中含有CD73/Trp-2雙陽性的、中間階段的細胞，在下文中稱為前-T-MSC。 在經BMP4和TGF β抑制劑處理2-3天后，這些細胞首先表達Trp-2,其中Trp-2陽性的細胞 比率很高，并且顯示滋養(yǎng)細胞形態(tài)同質（圖2和3)。在5-6天后，細胞同時表達Trp-2和 ⑶73 ;在6-14后，細胞不再表達Trp2,但表達MSC典型的細胞表面標記⑶73、⑶90、⑶105、 CD44 和 CD29,并且比率很高：CD73(>98% )、CD90(>95% )、CD105(>90% )、CD44 095% )、 ⑶29 (>80% )，同時這些細胞為⑶31、⑶34和⑶45陰性，其中⑶31為內皮細胞標記，⑶34 和⑶45為造血干細胞標記（圖3和4)。
[0129] 利用在本公開的方法生產的T-MSC能夠分化成下下游的成骨細胞系、軟骨細胞系 和脂肪細胞系。因此，這些T-MSC從形態(tài)和功能都類似于骨髓和其它組織來源的MSC s。
[0130] 5. 3人胚胎干細胞來源的間充質干細胞
[0131] 骨髓來源的間充質干細胞（BM-MSCs)長期以來被用來治療許多自身免疫性疾病 的動物模型和臨床試驗。然而，在一些報道中，BM-MSCs的免疫抑制作用并不一致，表明 BM-MSCs并不能有效地治療某些自身免疫性疾?。═yndall，2011)。本文提供對比BM-MSCs 和T-MSC抑制T細胞增殖和后續(xù)的T細胞受體激活能力的數(shù)據(jù)。如圖7所示，在抗-CD3抗體 以低濃度（〇. 3ug/ml)處理時，BM-MSCs可以同時抑制CD4和CD8陽性細胞的增殖，與T-MSC 的結果相類似。然而，當抗-CD3抗體的濃度提高到lug/ml時，與T-MSC相比較，BM-MSCs抑 制⑶4和⑶8陽性細胞的增殖的能力更低。這里采用CFSE稀釋實驗檢測T細胞的增殖：T 細胞比例的增加伴隨著CFSE信號的減弱，表明增殖加快。如圖5所示，當抗-CD3抗體的濃 度提高到lug/ml時，檢測發(fā)現(xiàn)59%⑶4陽性的T細胞和46%⑶8陽性的T細胞中CFSE的 信號下降。在T-MSC組中，⑶4和⑶8陽性的T細胞的比例都被減少至16% ;在BM-MSC組 中，⑶4和⑶8陽性的T細胞的比例分別減少至32%和36%。
[0132] 和T-MSC體外的免疫抑制活性一致，本公開方法生產的T-MSC能有效地治療實驗 性自身免疫性腦脊髓炎（EAE)，這是一種多發(fā)性硬化癥的小鼠模型。如圖6所示，與對照組 相比較，在EAE小鼠模型誘導后6天注射T-MSC，EAE小鼠的疾病評分顯著地下降。
[0133] 本公開方法生產的細胞另外的特征是：T-MSC比BM-MSCs和來自SB431542處理 的hES-MSCs具有更強的免疫抑制活性（Chen et al.，2012)(圖6)。在幾個重復實驗中， BM-MSCs始終不能下調EAE小鼠的疾病評分。因此，在臨床上應用本公開方法生產的T-MSC 替代BM-MSCs，可以消除侵入性骨髓穿刺所帶來的風險，減少等待骨髓捐贈的時間，減少成 本，減少為不同病人準備的BM-MSCs的批次差異。
[0134] 總之，本文提供了一種利用hESCs高效產生間質樣細胞或MSCs的細胞的方法，并 使用這些MSCs治療自身免疫性疾病，該方法的特征是，hESCs分化過程中經過滋養(yǎng)細胞這 一中間階段。芯片分析結果表明，盡管T-MSC和BM-MSCs都能分化成同樣的下游細胞系（圖 7)，但是T-MSC的基因表達模式和BM-MSCs的并不一致（數(shù)據(jù)未給出）。另外，在體內和體 外，T-MSC的免疫抑制活性比BM-MSCs的更強。
[0135] 現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，本公開方法生產的T-MSC不同于傳統(tǒng)的成體MSCs。由于T-MSC具 有強大的抑制T細胞增殖的能力，T-MSC在治療多發(fā)性硬化癥時可能比使用BM-MSCs有更 好的效果。為了解決潛在的安全問題，將T-MSC注射至免疫缺陷的SCID米色小鼠，在小鼠 中沒有觀察到畸胎瘤形成。
[0136] 本發(fā)明產生的T-MSC是獨特的，而且具有多種治療用途和其它用途。因此，本發(fā)明 包括多種制劑，包括藥物制劑和包括T-MSC的組合物。
[0137] 術語"滋養(yǎng)層-間充質干細胞（T-MSC) "指從人胚胎干細胞（hESC)或誘導多能干 細胞（iPSC)經過滋養(yǎng)細胞中間產物衍生的間充質干細胞或間充質干細胞/基質細胞，所述 滋養(yǎng)細胞表達Trop-2并且具有滋養(yǎng)細胞樣形態(tài)。術語"人胚胎干細胞一滋養(yǎng)層一間充質 干細胞（hES-T-MSC) "指來源于hESC的T-MSC。術語" iPS-T-MSC"和" iT-MSC"指從誘導 多能干細胞分化的間充質干細胞。術語"T-MSC"在這里不是指滋養(yǎng)細胞。如果細胞至少有 一種干細胞的屬性，那么這種細胞被認為是干細胞。所述屬性如，有能力分化為至少一種或 其它類型的細胞，諸如此類。對這些細胞的描述基于眾多結構和功能特性，包括但不限于： 表達或不表達一種或多種標記。特別是，T-MSC具有成纖維細胞形態(tài)的小細胞體的特性。 T-MSCs包括hES-T-MSC和iT-MSC，具有多能性并且能分化產生其它類型的細胞和細胞系。 術語" T-MSC-DL"指T-MSC分化的所有細胞和細胞系。
[0138] 本文所述的分化方法可以在6-14天內獲得從iPS細胞分化的MSC，這是目前報道 的最短時間。因此，這些iT-MSC可用于病人特定的iPS療法，特別是需要在很短時間內生 產MSC的緊急情況下，例如急性心臟梗塞、急性心力衰竭、急性脊髓損傷和急性放射/燃燒 的治療等。
[0139] 可以通過檢測一種或多種標記的DNA、RNA或蛋白的表達或不表達鑒定T-MSC。 T-MSC的鑒定可通過檢測細胞表面標記⑶73或表達至少一種或多種以下細胞表面標記： ⑶90、⑶105、⑶13、⑶29、⑶54、⑶44、⑶146和⑶166,或不表達或低水平表達以下至少一種 細胞表面標記：⑶34、⑶31和⑶45。
[0140] 可選擇地或額外地，T-MSC的鑒定可根據(jù)它們表達低水平的以下一種或多種促炎 蛋白：MMP2、RAGE、IFNGR2、TNFa、IL-12A、IL-6和CAM1。以上所述的基因表達模式是與骨 髓間充質干細胞相比較的。尤其是，IL-6在BM-MSCs的表達量高于T-MSC。IL-6是一種多 效的細胞因子，參與造血細胞、免疫細胞和基質細胞之間的交叉作用，包括炎癥的發(fā)生和終 止。
[0141] 所述T-MSC的特性還在于：它們有能力在體外抑制受到刺激后的T細胞的增殖。 這種特性與BM-MSCs不能在體外抑制受到刺激后的T細胞的增殖形成對比。
[0142] 因此，這里所描述的T-MSC至少有以下一種特性：（1)分化為脂肪細胞、軟骨細胞、 神經元、成肌細胞、基質細胞和成纖維細胞；（2)具有成纖維樣細胞的形態(tài)；（3)不表達或 表達低水平的⑶34、⑶31和/或⑶45 ; (5)不表達或表達低水平的MMP2、RAGE、IFNy Rl、 IFNyR2、IL-12、TNFa、IL-6和/或VCAM1，特別是 IL-6 ;(6)表達低水平的 MHC 抗原HLA-G 和/或HLA-ABC，或不表達HLA-DR和/或CD80 ; (7):在體外抑制受到刺激后的T細胞的增 殖。在某些實施方式中，所述T-MSCs具有至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6 種、或所有7種特性。
[0143] 在某些實施方式中，T-MSC區(qū)別于先前報道的HB-MSC。T-MSC的CXCR7、CXCL2和/ 或 CXCL12 的表達水平比 HB-MSC 至少高一倍。但是 T-MSC 的 H0XB2、H0XB3、H0XB5、H0XB7、 H0XB9、H0XA5、H0XA9和HOX家族其他基因的表達水平至少比T-MSC少一半。
[0144] 此外，T-MSC具有獨特的、穿過血腦屏障和血脊髓屏障的能力，這種穿透能力使該 細胞特別適合治療和診斷應用。本發(fā)明的T-MSC具有迀移進出脊髓的血管、穿過血脊髓屏 障的能力，以在中樞神經系統(tǒng)發(fā)揮作用，這種作用包括但不限于遞送用于治療和診斷的藥 物。這與BM-MSCs不具有此功能形成反差。
[0145] 本發(fā)明的另一個實施方式是輻射T-MSC。這個實施方式的特征在于，被輻射的 T-MSC具有以上所列舉的至少1種特性、至少2種特性、至少3種特性、至少4種特性、至少 5種特性、至少6種特性或至少所有7種特性。
[0146] 在另一個實施方式中，所述細胞培養(yǎng)物包括T-MSC。在某些實施方式中，所述 T-MSC分化成脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經元、成肌細胞、基質細胞和成纖維細胞。在 某些實施方式中，所述 T-MSC 表達 CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146 和 / 或 ⑶166。在某些實施方式中，所述細胞表達低水平或不表達⑶34、⑶31和/或⑶45。在某些 實施方式中，所述細胞表達低水平或不表達MMP2、RAGE、IFNyRl、IFNy R2、IL-12、TNFa、 IL-6和/或VCAMl，特別是IL-6。在某些其他的實施方式中，所述細胞表達主要組織相容性 復合體抗原HLA-G和/或HLA-ABC，并且表達低水平或不表達HLA-DR和/或⑶80。在某些 實施方式中，所述細胞在體外抑制受到刺激后的T細胞的增殖。在某些實施方式中，所述細 胞可以穿過血腦屏障和血脊髓屏障。在某些實施方式中，所述細胞被輻射。
[0147] 在另一方面，本文公開一種包括T-MSC.的藥物制劑。在某些實施方式中，所述 T-MSC分化成脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經元、成肌細胞、基質細胞和成纖維細胞。在 某些實施方式中，所述 T-MSC 表達 CD73、CD90、CD105、CD13、CD29、CD54、CD44、CD146 和 / 或 ⑶166。在某些實施方式中，這些細胞表達低水平或不表達⑶34、⑶31和/或⑶45。在某些 實施方式中，所述細胞表達低水平或不表達MMP2、RAGE、IFNyRl、IFNy R2、IL-12、TNFa、 IL-6和/或VCAMl，特別是IL-6。在某些實施方式中，所述細胞表達主要組織相容性復合體 抗原HLA-G和/或HLA-ABC，并且表達低水平或不表達HLA-DR和/或⑶80。在某些實施方 式中，所述細胞可以穿越血腦屏障和血脊髓屏障。在某些實施方式中，所述細胞被輻射。可 以使用任何藥學可接受的載體和輔藥制備所述藥物制劑。
[0148] 本文提供多種T-MSC，其中，這些T-MSC直接從人胚胎干細胞系獲得和分離。這些 人胚胎干細胞系已經被傳代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30或更多代數(shù) 或其組合。
[0149] 在某些實施方式中，本文提供一種冷凍的T-MSC、或部分或終末分化的細胞。
[0150] 在某些實施方式中，本文提供T-MSC的醫(yī)療用途，或T-MSC組合物，或T-MSC制劑， 包括被輻射的T-MSC。這些細胞和藥劑可以用于治療所述的疾病，也可以應用于遞藥系統(tǒng)， 這些藥物需要穿越血腦屏障和血脊髓屏障。
[0151] 在某些實施方式中，本發(fā)明提供制備的冷凍保存的滋養(yǎng)細胞、前-T-MSC、部分或其 中終末端分化的T-MSC。
[0152] 在某些實施方式中，本發(fā)明提供了 T-MSC的醫(yī)療用途，或組合物，或T-MSC制劑，包 括被輻射的T-MSC。這些細胞和藥劑可以用于治療任何所述的癥狀或整個說明書中詳述的 疾病，也可以應用于遞藥系統(tǒng)，這些藥物需要穿過血腦屏障和血脊髓屏障。
[0153] 5· 4選擇和生產T-MSC群
[0154] 這里提供一種鑒別具有高度免疫抑制效力的T-MSC的方法，其中，通過鑒別T-MSC 的生物標記的表達模式，所述的T-MSC是具有高度免疫抑制效力的、臨床級別的并且應用 于治療。在某些實施方式中，這些臨床級別的T-MSC具有以下特性：（i)包含>95%的細胞 表達組-1標記；（ii)包含>80%的細胞表達組-2標記；（iii)包含〈5%的細胞表達組-3 標記 ；（丨￥)表達11^-1〇和了6?0;(￥)包含〈2%的細胞表達11^-6、幾-12和了即€1 ;(^^)包含 〈0.001 %的細胞共表達所有組-4的標記。這里的組-1標記是：⑶73、⑶90、⑶105、⑶146、 CD166 和 CD44。組-2 標記是：CD13、CD29、CD54 和 CD49E。組-3 標記是：CD45、CD34、CD31 和 SSEA4。組-4 標記是：0CT4、NANOG、TRA-1-60 和 SSEA4。
[0155] 在某些實施方式中，所述方法包含檢測編碼抗炎癥因子（AIF)和促炎癥因子 (PIF)標記的差異表達。在某些實施方式中，所述抗炎癥因子是IL-10和TGFI3 2。在某些 實施方式中，促炎癥因子的表達上調。在某些實施方式中，以上標記在T-MSC的表達量至少 是BM-MSC的1. 5倍。在某些實施方式中，促炎癥因子是IL-6、IL-12、TNFa、CCL2、VCAM1、 RAGE和MMP2。在某些實施方式中，促炎癥因子的表達下降。在某些實施方式中，以上標記 在T-MSC的表達量至少比BM-MSC的少一半。在另一個實施方式中，具有高度免疫抑制能力 的T-MSC的IL-6陽性的細胞比率少于5%、4%、3%、2%或1%。在某些實施方式中，T-MSC 可能表達高水平的TGF β 2和IL-10。在某些實施方式中，所述標記的表達是以BM-MSC為對 照。
[0156] 這里提供臨床級別的T-MSC群的鑒定程序。為了確定T-MSC群是否適合應用治 療，需要檢測細胞群特異性生物標記的表達。這些生物標記包括例如，（1)間充質干細胞的 標記：⑶73、⑶90、⑶105、⑶166和⑶44 (第一組）；（2)間充質干細胞的標記：⑶13、⑶29、 ⑶54、⑶49Ε、SCA-I和STRO-I (第二組）；（3)造血干/祖細胞的標記：⑶45、⑶34,以及內 皮細胞的標記CD31 ; (4)免疫標記：HLA-ABC、HLA-G、CD80和CD86 ; (5)細胞因子：IL-10、 TGF0、IL-6 和 IL-12 ; (6)多能性的標記：0CT4、NAN0G、TRA-l-60 和 SSEA-4。在某些實施方 式中，T-MSC群包含超過95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的細胞表達至少一個組-1標記。在某 些實施方式中，T-MSC群包含超過80 %、85 %、90 %、95 %或99 %的細胞表達至少一個組-2 標記。在某些實施方式中，在某些實施方式中，T-MSC群包含少于0. 1 %、0. 08%、0. 05%、 0.03%、0. 02%或0.01 %的細胞表達至少一個組-3標記。在某些實施方式中，T-MSC群包 含超過80 %、85 %、90 %、95 %或99 %的細胞表達IL-10和/或TGF β。在某些實施方式 中，T-MSC群包含少于5%、4%、3%、2%、1%的細胞群表達IL-6和/或IL-12。在某些實 施方式中，T-MSC群包含少于0.001 %的細胞表達至少一個第六組標記。在某些實施方式 中，臨床前級別的T-MSC作為陽性對照，與臨床級別的T-MSC相比較。在某些實施方式中， 通過多色流式細胞術和/或免疫熒光分析T-MSC的特點。在某些實施方式中，T-MSC群表達 CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF a、TGF β、IFN γ、 GM-CSF、G-CSF、bFGF、CXCL5、VEGF、TPO或其組合。在某些實施方式中，也對T-MSC群作以 下分析：（1)存在外源性材料如內毒素和殘留的細胞因子/生長因子，和/或（2)基因異常 (利用核型分析和全基因組測序）。
[0157] 這里提供另外一種對臨床級別T-MSC群的鑒定程序。擁有更好再生潛力和免疫抑 制功能的T-MSC可能表達更低水平的⑶29。在這里，1-2代T-MSC的⑶29的表達量作為本 底水平，如果在后續(xù)的某一代和程序中，T-MSC的表達水平升高2倍，那么這些細胞將被停 止傳代。
[0158] 對T-MSC的基因表達模式的檢測方法是本領域已知的。這些方法包括但不限于： 流式細胞術、多重芯片、RT-PCR、RNA印跡和蛋白質印跡。在某些實施方式中，對MSC的基 因表達模式的分析采用基于多種細胞因子分析的流式微球檢測、基于多種細胞因子分析的 Iuminex系統(tǒng)、基因表達的高通量分析、定量RT-PCR、酶聯(lián)免疫斑點測定法、細胞因子酶聯(lián) 免疫吸附測定、熒光素酶報告系統(tǒng)、流式細胞術、熒光報告系統(tǒng)、組織染色和免疫熒光染色。
[0159] 5. 4. 1檢測核酸生物標記的方法
[0160] 在具體的實施方式中，核酸屬于生物標記譜中的一種生物標記。這些生物標記和 生物標記譜相應的特征可能通過以下所述產生，如檢測一個或多個生物標記的基因表達產 物（如多核苷酸和多肽）。在一個具體的實施方式中，這些生物標記和生物標記譜相應的特 征的獲得渠道是：利用本領域所熟知的任何方法檢測和/或分析這里公開的一種標記所表 達的一種或多種核酸，所述的方法包括但不限于雜交、芯片分析、RT-PCR、核酸酶保護測定 和RNA印跡分析。
[0161] 在某些實施方式中，檢測和/或分析核酸的方法和本發(fā)明的組合物包括RNA分子， 例如表達的RNA分子（包括mRNA分子）、mRNA的可變剪切、調控RNA、cRNA分子（如RNA分 子在體外轉錄為cDNA分子）和其識別片段。
[0162] 在具體的實施方式中，在體外制備的核酸來自存在細胞培養(yǎng)物核酸，或從細胞培 養(yǎng)物分離的、或部分分離的核酸，所述細胞培養(yǎng)物是本領域所熟知的。以上所述一般描述在 如，Sambrook等，2001，分子克隆，實驗手冊，第三版，冷泉港實驗室出版社（紐約冷泉港）， 該文件全部內容在此引入作為參考。
[0163] 5. 4. 1.1 核酸陣列
[0164] 在某些實施方式中，核酸陣列通過檢測任何一個或多個這里所述的生物標記，獲 得生物標記譜的生物標記的特征。在本發(fā)明的一個實施方式中，利用微陣列如cDNA微陣列 檢測生物標記譜的生物標記的特征值。以下描述cDNA微陣列分析的示例方法和實施方式。
[0165] 在某些實施方式中，通過與陣列上可檢測的標記的核酸雜交獲取生物標記譜的生 物標記的特征值，所述標記的核酸代表生物樣本中存在的mRNA轉錄本的核酸序列，或與這 些序列一致。所述生物樣品（如合成來自樣本的熒光標記的cDNA)與包含一個或多個探針 斑點的微陣列相雜交。
[0166] 有不同的方法制備核酸陣列如微陣列，在本文下面描述其中一些方法。優(yōu)選地，陣 列是可再復制的，允許生產給定陣列的多個拷貝并相互比較。優(yōu)選地，陣列由在結合（例 如，核酸雜交）條件下穩(wěn)定的材料制造。本領域技術人員將會知道在陣列上雜交測試探針 至探針斑點所用的適宜支持物、基質或載體，或將能利用普通實驗確定這些適合的載體。
[0167] 陣列如微陣列在使用時可包括一個或多個測試探針。在某些實施方式中，每一個 這樣的測試探針包含一個與所要檢測的RNA或DNA的亞序列互補的多核苷酸序列。每個探 針通常具有不同的核酸序列，并且每個探針在陣列的固體表面上的位置通常是已知的或可 確定的。對本發(fā)明有用的陣列可包括，例如寡核苷酸微陣列、基于cDNA的陣列、單核苷酸多 態(tài)性陣列、可變剪切體陣列和任何其他能夠提供本文所述的標記的表達的定性、定量或半 定量的陣列。某些類型的微陣列是可尋址的陣列。更具體地，一些微陣列是定位的可尋址 的陣列。在一些實施方式中，陣列的每一個探針的位置是已知的。已知固體載體上的預定 位置，從而每個探針的身份（例如，序列）可以從其在陣列上（例如，載體或表面上）的位 置確定。在某些實施方式中，這些陣列是有序的陣列。微陣列一般描述于Draghici，2003， DNA微陣列數(shù)據(jù)分析工具，Chapman和Hal 1/CRC，該文件全部內容在此引入作為參考。
[0168] 5. 4. I. 2RT-PCR
[0169] 在某些實施方式中，為確定在一個或多個本文所述標記的表達水平的生物標記譜 中的生物標記的特征值，該特征值是通過使用逆轉錄（RT)，并結合了從樣品中擴增RNA的 聚合酶鏈式反應（PCR)。按照該實施方式，反轉錄可以定量或半定量的。本文所教導的，所 述RT-PCR方法可以與上述的微陣列的方法結合使用。例如，可以進行一個批量的PCR反應， 并且PCR產物可被解析和用作微陣列上探針斑點。
[0170] 使用總RNA或mRNA作模板，并且與標記（或多個）轉錄部分特異性配對的引物用 于啟動逆轉錄。RNA逆轉錄為cDNA的方法是眾所周知的，參照上文Sambrook等（2001年） 所著。引物設計可以根據(jù)已發(fā)表的或可從任何可公開獲得的序列數(shù)據(jù)庫，如GenBank中的 已知核苷酸序列來實現(xiàn)?？稍O計針對本文所述的任何標記的引物。另外，可利用商購的軟 件設計引物（例如，Primer Designer LO和Scientific Software等）。反轉錄的產物隨 后被用作PCR的模板。
[0171] PCR提供了一種通過使用由熱穩(wěn)定的、依賴DNA的DNA聚合酶催化的DNA復制的多 個循環(huán)來擴增感興趣的靶序列的快速擴增特定核酸序列的方法。PCR反應需要存在：被擴 增的核酸、被擴增的核酸側翼的兩條單鏈寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸 緩沖液和鹽離子。PCR技術的方法是本領域所熟知的技術。對PCR的使用可參考如Mullis 和Faloona，1987年，酶學方法，155:335。該文件全部內容在此引入作為參考。
[0172] PCR擴增需要模板DNA或cDNA (至少10fg，更有效地，I-IOOOng)和寡核苷酸引物 (至少25pmol)。典型的反應混合物包括：2 μ I DNA、25pmol的寡核苷酸引物、2. 5 μ I IOM PCR 緩沖 I (Perkin-Elmer，福斯特城，加利福尼亞州）、0· 4 μ I I. 25Μ 的 dNTP、0. 15 μ 1 (或 2. 5units)Taq DNA聚合酶（Perkin-Elmer，福斯特城，加利福尼亞州）和添加去離子水至總 體積25 μ 1。礦物油覆蓋PCR反應體系，在用可編程熱循環(huán)儀進行PCR反應。
[0173] 定量RT_PCR( "QRT-PCR"）本質是定量的，也可以提供對標記表達水平的定量測 量。QRT-PCR的逆轉錄和PCR反應可以分兩步進行，或者這兩個反應可以同時發(fā)生。其中 一項技術使用特異轉錄的反義探針，通常有市售的試劑盒，如Applied Biosystems (福斯特 城，加利福尼亞州）的Taqman試劑盒（Perkin Elmer，福斯特城，加利福尼亞州）。該探針 是特異性的PCR產物（例如，來自基因的核酸片段），并且含有猝滅基團和絡合至所述寡核 苷酸5'末端的熒光報告基團。不同的熒光標記連接到不同的探針上，從而允許在一個反應 中測量兩種探針。當Taq DNA聚合酶被激活時，它利用其5'至3'外切酶活性清除結合于 模板上的熒光報告基團。在不存在所述淬滅基團時，報告基團發(fā)光。探針顏色的變化與每 一個特異性產物的含量成正比，并通過熒光計進行測量。因此，可以測量每種顏色的量以及 對PCR產物進生定量。所述PCR反應在96孔板中進行，以便同時檢測許多不同來源的樣品。 所述的Taqman系統(tǒng)具有不需要凝膠電泳的附加優(yōu)點，并且使用標準曲線時可以定量分析。
[0174] 第二種技術，使用嵌入染料定量地檢測PCR產物。這種染料如市售的QuantiTect SYBR Green PCR(Qiagen公司，瓦倫西亞，加利福尼亞州）。在PCR反應階段，SYBR Green染 料摻入雙鏈的PCR產物中，并且產生的熒光信號與PCR產物的量成正比。
[0175] RNA逆轉錄后都可以使用Taqman和QuantiTect SYBR。逆轉錄既可以在相同的反 應體系作為PCR的步驟（一步法），也可以在PCR擴增之前完成（兩步法）。此外，已知的 其它定量檢測mRNA表達的系統(tǒng)包括Molecular Beacons，該系統(tǒng)使用的探針具有熒光分子 和猝滅劑分子，這種探針可以形成發(fā)夾結構，當發(fā)夾形成時，熒光分子淬滅；當探針雜交至 PCR產物時，發(fā)出熒光信號，根據(jù)雜交熒光信號的強度定量地檢測基因表達。
[0176] 5. 4. I. 3RNA 印跡試驗
[0177] 本領域任何已知的雜交技術可用于產生生物標記譜的生物標記的特征值。在其他 具體實施中，可通過RNA印跡分析獲得生物標記譜中的生物標記的特征值，RNA印跡分析和 定量特異的RNA分子。一個標準的RNA印跡可用于確定一種RNA轉錄物的大小，鑒定選擇 性剪接的RNA轉錄物，鑒定本文所述的一個或多個基因在樣品中的相對量（尤其是mRNA)。 按照本領域普通技術人員所知的常規(guī)RNA雜交技術，在RNA印跡中，RNA樣本首先在變性的 瓊脂糖凝膠上電泳，根據(jù)大小分離RNA，然后將RNA轉印至膜上，與標記的探針交聯(lián)和雜交。 可以使用非同位素或高活性的放射性標記的探針，包括隨機引發(fā)的、缺口翻譯的、或PCR產 生的DNA探針和在體外轉錄的RNA探針和寡核苷酸。另外，僅部分同源的序列（例如，來自 不同的物種的cDNA或基因組DNA片段可能含有一個外顯子）可以用作探針。標記的探針， 例如放射性標記的cDNA，要么包含全長、單鏈的DNA，要么是該DNA序列的片段，其中長度可 以是至少20個、至少30個、至少50個或至少連續(xù)100個核苷酸?？赏ㄟ^任何本【技術領域】 技術人員所熟知的許多不同方法標記探針。最常用于這些研宄的標記是放射性元素、酶、暴 露于紫外時會發(fā)出熒光的化學物質以及其它。許多熒光物質是已知的并且可以用作標記。 這些包括但不限于熒光素、羅丹明、金胺、得克薩斯紅、AMCA藍和熒光黃。放射性標記可以 通過任何目前可用的計數(shù)方法來檢測。同位素包括但不限于 3H、14C、32P、35S、36Cl、 51Cr、57C〇、 58C〇、 59Fe、9°Y、125I、131I和186Re。酶標記也是可用的，并且可以通過任何現(xiàn)有的比色法、分光 光度法、熒光光度法、電流分析法或氣體定量技術檢測。酶通過與橋接分子如碳化二亞胺、 二異氰酸酯、戊二醛等反應，偶聯(lián)于選擇的粒子?？梢允褂帽绢I域技術人員已知的任何一種 酶。這些酶的實例包括但不限于過氧化物酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、過氧 化物酶和堿性磷酸酶?？蓞⒖济绹鴮＠?654090、3850752和4016043。
[0178] 5. 4. 2檢測蛋白的方法
[0179] 在本發(fā)明的【具體實施方式】中，可以通過檢測蛋白質獲得生物標記譜的生物標記特 征值，例如，通過檢測本文所述的一種或多種標記的表達產物（如核酸或蛋白質）、或翻譯 后修飾的蛋白質、或其它修飾的蛋白質、或經加工的蛋白質。在一個具體的實施方式中，可 通過檢測和/或分析一種或多種蛋白質和/或本文公開的標記表達的識別片段產生生物標 記譜，其中，檢測蛋白的方法是本領域技術人員所知的任何方法，包括但不限于蛋白質微陣 列分析、免疫組織化學和質譜分析。
[0180] 免疫分析的標準技術可用于檢測檢測蛋白質的量和細胞培養(yǎng)物中感興趣的蛋白。 例如，先進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，然后進行蛋白質印跡和免 疫共沉淀檢測蛋白質的量和樣本中感興趣的蛋白，其它檢測方法還有免疫細胞化學等。用 于檢測目的蛋白質的一種示例性試劑是能夠特異性結合到感興趣的蛋白的抗體。優(yōu)選可檢 測標記的抗體，不管是直接還是間接標記。
[0181] 對于這樣的檢測方法，利用本領域所熟知的技術很容易分離得到在細胞培養(yǎng)物中 想要分析的蛋白質。蛋白質分離方法可參考，例如Harlow和Lane，1988年，抗體：實驗室手 冊，冷泉港實驗室出版社（冷泉港，紐約），該文件全部內容在此引入作為參考。
[0182] 在某些實施方式中，檢測蛋白質或目的蛋白的方法涉及蛋白質一特異性抗體的相 互作用。例如，抗體針對感興趣的蛋白?？梢岳帽绢I域熟知的標準技術產生抗體。在具 體的實施方式中，抗體可以是多克隆的，或更優(yōu)選的是單克隆抗體?？梢允褂猛暾目贵w或 抗體片段（例如，單鏈抗體，F(xiàn)ab或F(ab'） 2。
[0183] 例如，能特異性結合目的蛋白的抗體或片段可以用來定量或定性檢測蛋白質的存 在。以上所述可以通過例如免疫熒光技術實現(xiàn)。另外，可以使用抗體（或其片段）在組織 學中原位檢測目的蛋白，如免疫免疫熒光或免疫電鏡術?？赏ㄟ^從病人取的生物樣本（如 活檢樣本），并對其添加針對感興趣蛋白的抗體完成原位檢測。施用抗體（或片段）優(yōu)選使 抗體（或片段）覆蓋生物樣本。通過使用這樣的方法，在特定的樣本中有可能不僅檢測目 標蛋白是否存在，還檢測其分布。多種已知的組織學的方法（如染色方法）可實現(xiàn)這種原 位檢測。
[0184] 檢測目的蛋白的免疫測定法通常包括可檢測標記的抗體與樣本溫育，該抗體能夠 鑒定目的蛋白。此外，免疫測定法還包括利用本領域所熟知的任何技術檢測結合的抗體。為 下面更詳細地討論，術語"標記"可以指直接標記抗體，如耦合（也就是物理上連接）可檢 測的物質到抗體上，也可指間接標記抗體，該抗體通過與其它直接標記的物質反應。間接標 記的實例包括用熒光標記第二抗體對第一抗體進行檢測。
[0185] 樣品可接觸固相支持物或載體如硝酸纖維素，或能固定細胞、細胞顆?；蚩扇艿?白的其他固相支持物或載體。然后用適宜的緩沖液洗滌所述支持物，接著用可檢測標記的 指紋基因一特異性抗體處理。緊接著用緩沖液第二次洗滌固相支持物，以除去未結合的抗 體。最后可以通過常規(guī)的方法來檢測結合在固相支持物上標記的量。
[0186] "固相支持物或載體"是指能夠結合抗原或抗體的任何支持。熟知的支持物或載體 包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙稀、聚乙稀、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和改性纖維素、聚丙烯酰 胺和磁鐵礦。載體的性質在一定程度上是可溶的，或對于本發(fā)明的目的是不可溶的。所述 載體材料可以具有任何可能的結構構型，只要偶聯(lián)的分子能夠結合抗原或抗體。因此，支撐 結構可以是球形，如珠子、或圓柱形的，如在試管的內表達，或棒的外表面。優(yōu)選的支持物包 括聚苯乙烯珠。那些熟練的技術人員將知道很多其它合適的、用于結合抗體或抗原的載體， 或將能夠通過常規(guī)實驗來確定。
[0187] 特異地針對目的蛋白的抗體能夠可檢測地標記的一種方法是將該抗體與酶相連， 然后用于酶免疫分析（EIA)(可參照 Voller，1978，〃The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)〃， Diagnostic Horizons 2:1-7， Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md. ;Voller et al.，1978，J. Clin. Pathol. 31:507-520 ; Butler，J. E.，1981，Meth.Enzymol. 73:482-523 ;Maggio(ed.)，1980, Enzyme Immunoassay， CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la. ;Ishikawa 等，（eds.)，1981，Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo.每一個文件的全部內容在此引入作為參考）。與抗體結合的酶將與合適的 底物反應，優(yōu)選為顯色底物。通過以這樣的方式，如過分光光度法、熒光法或視覺手段檢測 產生可檢測的化學物質。可以用于可檢測標記抗體的酶包括但不限于蘋果酸脫氫酶、葡萄 球菌核酸酶、S-5-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、 辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲 酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。所述檢測可以通過 使用比色方法完成，該方法采用酶的顯色底物。還可以通過將酶與底物反應的程度與類似 制備的標準物進行肉眼比較以完成檢測。
[0188] 還可以用任何各種其它免疫方法完成檢測。例如，利用放射性標記的抗體或抗 體片段，有可能通過使用放射免疫測定法（RIA)來檢測目的蛋白（參見，例如，溫特勞布， 1986,放射免疫測定原理，第七次培訓課程放射性檢測技術，內分泌學會，在此通過引用將 其整體并入本文）。放射性同位素（例如 125I、131I、35S或3H)可以通過諸如使用γ計數(shù)器 或閃爍計數(shù)器或通過放射自顯影來檢測。
[0189] 另外，也可以用熒光化合物標記抗體。當熒光標記的抗體暴露于適當波長的光，就 能通過熒光檢測抗體的存在。其中最常用的熒光標記化合物是異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻 紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰-苯二醛和熒光胺。
[0190] 也可以用發(fā)出熒光的金屬可檢測性地標記抗體，如152Eu或其它鑭系元素。這些金 屬可以通過金屬螯合基團如二亞乙基三乙酸（DTPA)或乙二胺四乙酸（EDTA)連接到抗體。
[0191] 還可以通過將抗體偶聯(lián)到化學發(fā)光的化合物上實現(xiàn)可檢測性地標記抗體。檢測在 化學反應過程中產生的光就可以確定化學發(fā)光標記的抗體。特別有用的化學發(fā)光標記化合 物是魯米諾、異魯米諾、染色吖啶酯、咪唑、叮啶鹽和草酸酯。
[0192] 同樣地，生物發(fā)光化合物可用于標記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是在生物系統(tǒng)中發(fā) 現(xiàn)的一種化學發(fā)光，其中催化性蛋白提高了化學發(fā)光反應的效率。可通過檢測發(fā)光的存在 來確定生物發(fā)光蛋白的存在。用于標記目的重要的生物發(fā)光化合物是螢光素、螢光素酶和 水母發(fā)光蛋白。
[0193] 在另一個實施方式中，除了抗體，特異性結合的分子如核酸適配體可用于結合生 物標記。在另一個實施方式中，生物標記譜可包括傳染性病原體中可檢測的部分（例如，月旨 多糖或病毒蛋白）或其組分。
[0194] 在某些實施方式中，蛋白質芯片測定法（例如，PreteinChip?生物標志物系 統(tǒng)，賽弗吉，弗里蒙特，加州）用于檢測生物標記譜中的生物標記特征值。也參見，例 如，Lin2004， Modern Pathology，1-9 ;Li，2004， Journal of Urology，171，1782-1787 ; Wadsworth，2004， Clinical Cancer Research，10,1625-1632 ;Prieto,2003， Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies 26,2315-2328 ;Coombes，2003, Clinical Chemistry 49,1615-1623 ;Mian，2003， Proteomics 3,1725-1737 ;Lehre 等，2003， BJU International 92,223-225 ;和 Diamond，2003，Journal of the American Society for Mass Spectrometry，14, 760-765。其每一個在此通過引用以其整體并入本文D
[0195] 在一些實施方式中，珠測定法用于檢測生物標記譜中的生物標記特征值。Becton Dickinson公司的流式微球陣列法系統(tǒng)（CBA)就是一個珠測定法。CBA使用一系列顆粒與離 散的熒光強度來同時檢測多種可溶性分析物。CBA與流式細胞術結合創(chuàng)建多路試驗。Becton Dickinson公司CBA的系統(tǒng)，具體的例子如Becton Dickinson人炎癥試劑盒，在基于顆粒的 免疫測定中，使用流式細胞術放大熒光檢測的靈敏度檢測可溶性分析物。CBA中的每顆珠提 供特異性蛋白的捕獲表面，類似于一個ELISA平板的、單獨包被的孔。BD公司的CBA捕獲珠 復合物是懸浮的，以致于容許檢測多種小體積的化合物。
[0196] 在一些實施方式中，多重分析方法在美國專利5981180(下稱"' 180專利"）描述， 通過引用將其整體并入，特別是用于教導通用方法、珠技術、系統(tǒng)硬件和抗體檢測，并且用 來檢測生物標記譜的生物標記。為了這種分析，合成微粒的基質，其中所述基質包含由不同 組的微粒組成。每組微?？梢杂袛?shù)千個不同的抗體俘獲試劑的分子固定在微粒表面并且是 顏色便編碼的，因為摻入了不同量的兩種熒光染料。兩種熒光染料的比率為每組微粒提供 了一個不同的發(fā)射光譜，因此鑒定微粒群中的微粒。美國專利號6268222和6599331也都 通過引用的方式整體并入，特別是用于教導標記的微粒進行多重分析的各種方法。
[0197] 5. 4. 3使用的其它檢測方法
[0198] 在一些實施方式中，分離方法可以用于檢測生物標記譜的生物標記特征值，這樣 就能分析標本中生物標記的一個子集。例如，被分析的生物標記可以是來自細胞提取物的 mRNA。這些細胞提取物已經被分餾，僅僅獲得核酸生物標記，或者這些生物標記可以來自樣 本中蛋白總補體的一部分，這些樣本已經通過色譜技術分餾。
[0199] 生物標記譜的生物標記的特征值也可以通過使用如下所述的一種或多種方法產 生。例如，可以包括核磁共振（NMR)波譜、質譜法，如電噴霧電離質譜（ESI-MS)、ESI-MS/MS、 ESI-MSAMS)n(n是一個整數(shù)大于零）、激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS)、表面 增強激光解吸/電離飛行時間質譜（SELDI-T0F-MS)、解吸/電離上硅（DI0S)、二次離子質 譜（SIMS)、四極桿飛行時間串聯(lián)質譜（Q-TOF)、大氣壓化學電離質譜（APCI-MS)、APCI-MS/ MS、APCI-(MS)n、大氣壓光電離質譜（APPI-MS)、APPI-MS/MS和APPI-(MS) n。其它質譜方法 可包括，尤其是四極、傅里葉變換質譜（FTMS)和離子阱。其它合適的方法可包括化學提取 分配、柱層析、離子交換層析、疏水（反相）液相色譜法、等電聚焦、一維聚丙烯酰胺凝膠電 泳（PAGE)、二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（2D-PAGE)或其它色譜法，例如薄層、氣相或液相色譜 法，或其任意組合。在一個實施方式中，所述生物樣品可在應用分離方法前先分餾。
[0200] 在一個實施方式中，激光解吸/電離飛行時間質譜用于檢測生物標記譜中的生 物標記的特征值，其中所述生物標記是蛋白或蛋白片段，它們被離子化，并被激光輻射而 蒸發(fā)至固定的支持物。特征值是峰表示存在與否，而所述峰代表這些碎片在質譜的模 式。各種激光解吸/離子化技術是本領域所熟知的，可參見Guttman et等，2001，Anal. Chem. 73:1252-62和Wei等，1999,Nature 399:243-246。每個內容通過引用的方式將其整 體并入。
[0201] 激光解吸/電離飛行時間質譜能夠在一段相對短的時間內生成大量的信息。將生 物樣品加至不同樣的載體上，所述生物樣品或其子集結合所有的生物標記。經過或未經過 純化或分餾的細胞裂解物或樣品，以體積低至〇. 5 μ L直接施加到這些載體表面。在施加至 載體表面之前，可將裂解物或樣品濃縮或稀釋。然后用于生成激光解吸/電離質譜的樣本 或樣品，所用時間只需要短短3小時。
[0202] 5. 4. 4數(shù)據(jù)分析算法
[0203] T-MSC生物標記的表達譜是區(qū)分臨床級別和非臨床級別T-MSC的參考因素。這些 生物標記的身份及其相對應的功能（例如，表達）可用于建立一個或多個的決策規(guī)則。特 定數(shù)據(jù)分析算法建立的一個或多個決策規(guī)則，可區(qū)分臨床級別和非臨床級別T-MSC。一旦使 用這些典型數(shù)據(jù)分析算法或本領域中已知的其它技術建立決策規(guī)則，這些決策規(guī)則將用于 將T-MSC群分類為兩個或更多的級別（例如臨床級別和非臨床級別）。這是通過將決策規(guī) 則應用于從細胞培養(yǎng)物獲得的生物標記譜實現(xiàn)的。因些，這樣的決策規(guī)則在定義T-MSC時 具有巨大的價值。
[0204] 在某個實施方式中，本文提供了一種用于比較從待測和對照細胞培養(yǎng)物獲得的生 物標記譜的評價方法。在某些實施方式中，從對照群或待測細胞培養(yǎng)物獲得的每種生物標 記譜構成多個生物標記譜中的其中一項特征值。在某些實施方式中，這種比較是通過：（i) 使用對照群的生物標記建立一種決策規(guī)則；（ii)將所述決策規(guī)則應用于待測細胞培養(yǎng)物 的生物標記譜。這樣，本發(fā)明的一些實施方式中應用的決策規(guī)則用于確定待細胞是臨床級 別或非臨床級別。在其它實施方式中，對照群是BM - MSC。
[0205] 在本發(fā)明的一些實施方式中，當應用決策規(guī)則鑒定待測細胞培養(yǎng)物是臨床級別 T-MSC，可用作治療。如果鑒定結果發(fā)現(xiàn)是非臨床級別，那么不能用作治療。
[0206] 5. 5T-MSC 的修飾
[0207] 本文提供一種修飾的間充質干細胞生產一群免疫抑制功能獲得提升的改良的MSC 群的方法。所述MSC具有以下特征：（i)含有>95%的細胞表達組-1標記；（ii)含有>80% 的細胞表達組-2標記；（iii)含有〈5%的細胞表達組-3標記；（iv)表達IL-10和TGF β ; (V)含有〈2 %的細胞表達IL-6、IL_12和TNFa ; (Vi)含有〈0.001 %的細胞共表達所有組-1 標記。這里所述組-1標記是：⑶73、⑶90、⑶105、⑶146、⑶166和⑶44 ;組-2標記是：⑶13、 CD29、CD54 和 CD49E ;組-3 標記是 CD45、CD34、CD31 和 SSEA4 ;組-4 標記是：0CT4、NANOG、 TRA-1-60 和 SSEA4。
[0208] 本文提供一種通過提高AIF表達而提升T-MSC的免疫抑制功能的方法。在一個實 施中，所述方法包括PIF的表達下調。在一個實施方式中，所述方法包括IL6、IL12、TNFa、 RAGE和其他PIF在T-MSC的表達下調。在一個實施方式中，所述方法包括TGF β和IL-10 在T-MS的表達上調。
[0209] 在某些實施方式中，所述方法包括T-MSC的遺傳和表觀遺傳修飾，所述修飾是本 領域已知的。在某些實施方式中，遺傳修飾和表觀遺傳修飾包括但不限于敲除、小發(fā)夾 RNA( "shRNA"）、微小非編碼RNA( "miRNA"）、非編碼RNA( "ncRNA"）、嗎啉寡聚核苷酸、誘 餌RNA、DNA甲基化調控、組蛋白甲基化調控、翻譯抑制和/或抗體封閉。在某些實施方式 中，通過轉座子、toll樣受體配體或小分子修飾MSC。
[0210] 在某些實施方式中，使用小分子靶向作用IL-6信號通路的任何元件。在某些實施 方式中，RN SYP靶標包括但不限于gpl30、STAT3、Cath印sin S、NFkappaB和IRF5。在某些 實施方式中，通過以下方式使T-MSC的IL-12表達減少：前列腺素 E2信號通路激活；胞內環(huán) 腺苷酸（cAMP)以及cAMP激動劑包括但不限于毛喉素、霍亂毒素 、β 1和β 2腎上腺腎上腺 素受體的水平上升；NF-κ B Rel-B信號通路被抑制；使用凋亡細胞處理T-MSC ;使用磷脂酰 絲氨酸處理T-MSC ;使用丁酸鹽處理T-MSC ;使用雷公藤甲素或雷公藤提取物或合成的雷公 藤甲素（即Minnelide)處理T-MSC。
[0211] 在某些實施方式中，可利用重組基因領域所熟知的技術修飾MSC使其表達某一標 記。在某些實施方式中，可通過轉染編碼標記的核酸序列修飾MSC。所述標記可插入至適當 的表達載體，即含有對插入的編碼序列的轉錄和翻譯所必需的元件的載體。必要的轉錄和 翻譯元件也可以存在。調節(jié)區(qū)和增強子元件可以是各種來源的，天然的和合成的。各種宿 主-載體系統(tǒng)可用于表達所述標記。這些包括但不限于感染病毒（如病毒、牛痘病毒、腺病 毒等）的哺乳動物細胞系統(tǒng)；感染病毒（如桿狀病毒）的昆蟲細胞系統(tǒng)；微生物如包含酵母 載體的酵母和轉化噬菌體、DNA、質粒DNA、粘粒DNA的細菌；通過轉化可選擇標記的穩(wěn)定細 胞系。載體表達元件的優(yōu)勢和特點各不相同。根據(jù)使用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用許多 合適的轉錄和翻譯元件中的任何一個。
[0212] -旦合成編碼合適標記的載體，可將感興目的載體轉化或轉染MSC。
[0213] 可使用標準方法將目的核酸序列引入MSC。任何已知的轉化方法可將多核苷酸引 入宿主細胞，包括如將多核苷酸包裝入病毒并將病毒轉導至宿主細胞，或直接攝入多核苷 酸。哺乳動物轉化（即轉染），可通過磷酸媽沉淀法（參見Graham和Van der Eb，1978， Virol. 52:546，）或已知修飾的病毒直接攝入。將重組多核苷酸引入細胞，尤其是哺乳動物 細胞的方法，包括葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣介導的轉染、聚凝胺介導的轉染、原生質體融 合、電穿孔、將多核苷酸包裝于脂質體、將多核苷酸在顯微鏡下直接注射至細胞核。這些方 法是本領域技術人員所熟知的。
[0214] 在一個優(yōu)選的實施中，含有目的載體的穩(wěn)定細胞系用于高通量篩選。這種穩(wěn)定細 胞系的制備可通過引入包含選擇性的標記載體，允許細胞在完全培養(yǎng)基生長1 一 2天，然后 使細胞生長在選擇性培養(yǎng)基中。重組質粒中的選擇性標記用于選擇，并且允許在染色體中 穩(wěn)定插入該重組質粒的細胞長生，進行形成克隆和擴增為細胞系。
[0215] 可以使用的選擇系統(tǒng)有多種，包括但不限于單純皰瘆病毒胸苷激酶（參見 Wigle等.，1977, Cell 11:223)、次黃嘌呤-鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶（參見Szybalska和 Szybalski，1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)和腺嘌呤轉磷酸核糖基酶（參見 Lowy，et al.，1980, Cell 22:817)，這些基因可分別在tk敲除、hgprif敲除或aprt敲除的 細胞中使用。另外，可以將抗代謝物抗性用作選擇，例如，dhfr能產生氨甲蝶呤的抗性（參 見 Wigler 等.，1980，Natl. Acad. Sci. USA 77:3567 ;0' Hare，等，1981，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 78:1527) ;gpt 能產生對霉酚酸的抗性（參見Mulligan*Berg，1981，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 78:2072) ;neo 能產生對氨基糖苷 G418 的抗性（Colberre-Garapin 等， 1981，J. Mol. Biol. 150:1) ;hygro 能產生對潮霉素的抗性（參見 Santerre 等·，1984, Gene 30:147)〇
[0216] 5. 6干細胞采集組合物
[0217] 干細胞采集組合物可包括任何生理上可接受的適合于收集和/培養(yǎng)干細胞的溶 液，例如鹽溶液（如磷酸鹽緩沖液、Kreb溶液、改良的Kreb溶液、Eagle溶液、0. 9% NaCl溶 液等）和培養(yǎng)基（如DMEM、H. DME等），等等。
[0218] 干細胞采集組合物可包含保護干細胞的一種或多種組分，即從收集到培養(yǎng)之間， 防止干細胞免于死亡，或延遲干細胞的死亡，減少死亡細胞群的干細胞的數(shù)量，等等。這樣 的組件可以是，例如凋亡抑制劑（例如半胱天冬酶抑制劑或JNK抑制劑）；血管擴張劑（例 如硫酸鎂、抗高血壓藥物、心房利鈉肽（ANP)、促腎上腺皮質激素、促腎上腺皮質激素釋放激 素、硝普鈉、肼苯噠嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸鎂、磷酸二酯酶抑制劑等）；壞死 抑制劑（例如，2-(1Η-吲哚-3-基）-3-戊氨基-馬來酰亞胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯或 氯硝西泮）；TNF-a抑制劑；攜氧全氟化碳（如全氟辛基溴、全氟癸基溴等）。
[0219] 干細胞采集組合物可包含一種或多種組織降解酶，例如金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白 酶、中性蛋白酶、核糖核酸酶或脫氧核糖核酸酶，等等。這類酶包括但不限于膠原酶（例如 膠原酶I、II、III或IV，來自溶組織梭菌的膠原酶等）、分散酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、 胰蛋白酶、釋放酶、透明質酸酶，等等。
[0220] 干細胞采集組合物可包括殺菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性的實施方 式中，所述抗生素是大環(huán)內酯（例如妥布霉素）、頭孢菌素（例如頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢 呋辛、頭孢丙烯、頭孢克洛、頭孢克肟或頭孢羥氨芐）、克拉霉素、紅霉素，青霉素（例如青霉 素 V)或喹諾酮類（例如氧氟沙星、環(huán)丙沙星或諾氟沙星）、四環(huán)素、鏈霉素等。
[0221] 干細胞采集組合物還可以包括以下的一種或多種化合物：腺苷（約ImM至約 50mM) ;D-葡萄糖（約20mM至約IOOmM);鎂離子（約ImM至約50mM);分子量大于20000道 爾頓的大分子。在一個實施方式中，以下物質的含量足以維持內皮完整性和細胞活性，例 如，合成的或天然的膠體，多糖例如葡聚糖或聚乙二醇，約25g/l至約100g/L，或約40g/L至 約60克/L ;抗氧化劑，例如丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、谷胱甘肽、維生素 C或維生素 E 約25 μ M至約100 μ M ;還原劑，例如約0. ImM至約5mM的N-乙酰半胱氨酸；阻止鈣離子進 入細胞的藥齊II，例如維拉帕米，約2微米至約25微米；抗凝血劑。在一個實施方式中，以下 物質的含量足以幫助防止殘留的血液凝固，例如肝素或水蛭素，約1000單位/1至約100000 單位/1 ;或含阿米洛利化合物，例如阿米洛利、乙基異丙基氨氯吡咪、六亞甲基氨氯吡脒、 二甲基氨氯啦咪或異丁基氨氯啦咪，約1. 〇 μΜ至約5 μΜ。
[0222] 5. 7使用T-MSC免疫調節(jié)
[0223] 本文提供一個或多個免疫細胞活性的調節(jié)（例如，下調細胞增殖、降低細胞存活、 阻礙細胞迀移至受炎癥位點、下調細胞促進或延長炎癥的能力、提高細胞促進健康組織或 器官的恢復體內平衡的功能）。這是通過免疫細胞（或細胞群）與多個T-MSC或iT-MSC 接觸實現(xiàn)的。在一個實施方式中，調節(jié)免疫應答的方法，包括多個免疫細胞和多個T-MSC或 iT-MSC接觸足夠長的時間以使T-MSC或iT-MSC可檢測地抑制免疫反應。其中，在混合淋巴 細胞反應（MLR)中，T-MSC或iT-MSC可檢測地抑制T細胞增殖。
[0224] 因為BM-MSC或其它成體組織來源的MSC已經被用來治療許多自身免疫性疾病， BM-MSC還通過限制炎癥、分泌生長因子、分泌保護因子和替換受損組織應用于組織修復。如 后面的例子所示，T-MSC比BM-MSC具有更優(yōu)良的免疫抑制功能。因此，T-MSC可以應用于當 前BM-MSC應用的所有領域和疾病。
[0225] 用于免疫調節(jié)的T-MSC或的iPS-MSC可以分別從胚胎干細胞系或誘導的多能干細 胞系衍生或獲得。用于免疫調節(jié)的T-MSC或的iPS-MSC還可以來自與活性要被調節(jié)的免疫 細胞相同的物種；或者來自與活性要被調節(jié)的免疫細胞不同的物種。
[0226] 本方法的上下文中，"免疫細胞"是指免疫系統(tǒng)中任何的細胞，特別是T細胞和 NK(自然殺傷）細胞。因此，在本方法的不同實施方式中，T-MSC和多個細胞細胞接觸。其 中所述的多個細胞，是或者包括多個T細胞（例如，多個的CD3+T細胞，CD4+T細胞和/或 CD8+T細胞）和/或自然殺傷細胞。在方法的上下文中，"免疫應答"可以是免疫細胞對由免 疫細胞發(fā)出的通常可感知刺激的任何反應，例如對抗原出現(xiàn)的反應。在各種實施方式中，免 疫應答可以是T細胞增殖應答外來抗原。其中，T細胞例如CD3+T細胞、CD4+T細胞和/或 CD8+T細胞；外來抗原例如在自身免疫性疾病中，輸血或移植物的抗原。免疫應答也可以是 包含在移植物內的T細胞的增殖。免疫應答也可以是自然殺傷細胞任何活性、樹突細胞的 成熟，等等。免疫應答也可以是活躍的一種或多種免疫細胞在局部、組織或器官中特異性的 或系統(tǒng)性的作用。免疫應答可以是移植物抗宿主病、炎癥、形成炎癥相關瘢痕組織、自身免 疫癥狀（例如類風濕性關節(jié)炎、I型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等），等等。
[0227] 在此上下文中的"接觸"包括：把T-MSC細胞和免疫細胞一起放在單個容器（例如 培養(yǎng)皿、燒瓶、小瓶等）或在體內，例如同一個體（例如哺乳動物，例如人）。在一個優(yōu)選實 施方式中，接觸的時間是足夠長的，并且T-MSC細胞和免疫細胞數(shù)量足夠多，以致免疫細胞 的免疫功能的改變是可檢測的。更優(yōu)選地，在各種實施方式中，所述接觸足以抑制免疫功能 (如T細胞增殖響應抗原例），與不存在T-MSC相比較，T-MSC至少抑制50 %、60 %、70 %、 80 %、90 %或95 %的免疫功能。這種在體內的抑制可在體外測定，也就是說，可以在體外的 試驗中推測特定數(shù)量的T-MSC在接受者體內對若干免疫細胞的抑制程度，。
[0228] 在一些實施方式中，本發(fā)明提供使用T-MSC在體外調節(jié)一種或多種類型免疫細胞 的多個免疫反應或活性的方法。T-MSC和多個免疫細胞接觸可以包括T細胞和免疫細胞在 同樣的實體空間，這樣，至少多個T-MSC的其中一部分和多個免疫細胞的其中一部分相互 作用；或可以包括，來自T-MSC或免疫細胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基和其它類型細胞接觸（例如，從 T-MSC的培養(yǎng)物得到的培養(yǎng)基和在這個培養(yǎng)基中重新懸浮的分離免疫細胞）。在一個具體 實施方式，接觸是一個混合淋巴細胞反應（MLR)。
[0229] 例如，這樣的接觸可以發(fā)生在一個檢測T-MSC免疫調節(jié)（如免疫抑制）程度的 試驗裝置。這樣的試驗裝置可以是，例如混合淋巴細胞反應（MLR)或回歸分析?；旌狭?巴細胞反應和回歸分析是本領域所熟知的，可參見如：Schwarz，"The Mixed Lymphocyte Reaction:An In Vitro Test for Tolerance, ^J. Exp. Med. 127(5):879-890 (1968)； Lacerda 等，〃Human Epstein-Barr Virus (EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted C. B_17Scid/Scid Mice，〃J. Exp. Med. 183:1215-1228(1996)。在一個優(yōu)選的實施方式中，混合淋巴細胞反應在多個T-MSC和 多個免疫細胞（如淋巴細胞，例如CD3+CD4+和/或CD8 +的T淋巴細胞）接觸中進行。
[0230] 該MLR可用來測定多個T-MSC的免疫抑制能力。例如，可以在MLR中檢測多個 T-MSC，該MLR包括按，例如約10:1:2的比率結合CD4+或CD8+T細胞、樹突細胞（DC)以及 T-MSC，其中利用染料，例如分配進入子細胞的CFSE (作為舉例），對該T細胞染色，以及其 中允許該T細胞增殖約6天。如果存在T-MSC時6天的T細胞増殖，與存在DC以及不存 在T-MSC時的T細胞増殖相比，可檢測到是降低的，則該多個T-MSC受到免疫抑制。在這樣 的混合淋巴細胞反應中，T 一 MSC可以是解凍的，也可以是從培養(yǎng)物中收集的。約10000個 T-MSC重懸在IOOrnl培養(yǎng)基中（RPMI1640, ImM HEPES緩沖液、抗生素和5%混合人血清），并 使其附著到皿底2小時。利用免疫磁珠從全外周血單核細胞分離⑶4+和/或⑶8 +T細胞。 這些細胞是CFSE染色的，并且總共100000個T細胞（僅添加⑶4+，僅添加⑶8+，或等量的 ⑶4+和⑶8 +T細胞）添加至每個孔。每個孔液體的體積補至200 μ 1，并允許進行混合淋巴 細胞反應。
[0231] 在一個實施方式中，因此，本發(fā)明提供一種抑制免疫細胞反應的方法，其中，在混 合淋巴細胞反應中，多個免疫細胞和多個T-MSC接觸足夠長的時間以使T-MSC可檢測地抑 制T細胞增殖。
[0232] 從不同胚胎干細胞系獲得的T-MSC群的可以在調節(jié)免疫細胞活性的能力方面有 所不同，例如可以在抑制T細胞活性或増殖或NK細胞活性的能力方面不同。因此，需要在 使用前測定特定的T-MSC群的免疫抑制能力。這類能力可以，例如在MLR或回歸分析中通 過檢測該羊膜來源貼壁細胞群的樣本來測定。在一個實施方式中，用所述樣本執(zhí)行MLR以 及在所述分析中測定該T-MSC群引起的免疫抑制程度。然后，可以將該免疫抑制程度歸因 于所取樣的T-MSC群。因此，該MLR可以用作一種測定特定的T-MSC群抑制免疫功能的絕 對和相對能力的方法。MLR參數(shù)可以是多祥化，以提供更多數(shù)據(jù)或更好地測定T-MSC樣本的 免疫抑制能力。例如，因為T-MSC產生的免疫抑制看起來以與該分析中存在的T-MSC的數(shù)量 成比例的方式粗略增長，因此，在一個實施方式中，可以用兩種或更多數(shù)量的T-MSC群（例 如每個反應IX l〇3、3X 103、1X IO4和/或3X 10 4個T-MSC)執(zhí)行該MLR。該分析中，T-MSC 與T細胞的相對數(shù)量還可以是多變的。例如，雖然可以使用相對大量的T-MSC或T細胞，但 是，該分析中，T-MSC和T細胞可以按任何比率（例如約100:1至約1:100,優(yōu)選地約1:5) 存在。
[0233] 本發(fā)明也提供在體內使用T-MSC調節(jié)免疫反應或調節(jié)一種或多種免疫細胞的多 個活性的方法。T-MSC和免疫細胞可以，例如在作為多個T-MSC的接受者的個體中接觸。當 該接觸在個體中進行時，在一個實施方式中，該接觸發(fā)生在T-MSC (也就是，T-MSC并非來源 于該個體）和對該個體來說是內源性的多個免疫細胞之間。在具體的實施方式中，該個體 的免疫細胞是CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和/或自然殺傷細胞。
[0234] 使用T-MSC帶來的免疫抑制對于任何情況引起的或惡化的、或相關的、或不期望 的免疫反應是有好處的。T-MSC介導的免疫調節(jié)，如免疫抑制，將，例如有利于抑制不適當?shù)?免疫反應，該免疫反應是由個體免疫系統(tǒng)對抗一個或多個它自己的組織所引起。因此，本發(fā) 明提供了一種抑制免疫反應的方法，其中，所述免疫反應是自身免疫性疾病，如全身性紅斑 狼瘡、糖尿病、風濕性關節(jié)炎或多發(fā)性硬化癥。
[0235] 多個T-MSC和一種或多種類型的多個免疫細胞的接觸可發(fā)生在接受者個體內，該 接受者被嫁接或移植一種或多種組織，或者這些細胞作為附加物一并嫁接或移植。這些組 織可以是，例如骨髓或血液、器官、特異的組織（如皮膚移植）、復合組織（如移植物包含二 種或多種組織）等等。就這一點而言，T-MSC可以用于抑制一個或多個免疫細胞的一個或 多個免疫反應，所述免疫細胞包含在接受者個體、或移植組織、或嫁接組織或兩個組織。這 種接觸可發(fā)生在嫁接或移植之前、期間和/或之后。例如，可以在移植或嫁接的時候給予 T-MSC處理?；蚩蛇x擇性地，也可在移植或嫁接給予T-MSC處理，例如約移植或嫁接前1、2、 3、4、5、6、7天。優(yōu)選地，在免疫反應的任何可檢測的信號或癥狀出現(xiàn)前，就要使多個T細胞 和多個T-MSC相接觸。這種可檢測信號或癥狀可以是接受者個體或移植組織或嫁接物的， 如移植物抗宿主病或可檢測的炎癥的可檢測的信號或癥狀。
[0236] 在另一個實施方式中，在個體內的接觸主要是外源的T-MSC和內源的祖細胞或干 細胞，如內源的祖細胞或干細胞分化成的免疫細胞。例如，處于部分或全部的免疫凈化療法 或骨髓細胞清除的個體，可接受T-MSC結合一種或多種類型的干細胞或祖細胞作為癌癥治 療的附屬物。例如，T-MSC可結合多個⑶34+細胞，如⑶34+造血干細胞。這些⑶34+細胞可 以是例如來自組織，比如周邊血液、臍帶血、胎盤血或骨髓。這些⑶34+細胞可從以上所述 組織分離，或來源整個組織（例如，整個臍帶血或骨髓）或組織的部分純化的樣品（例如來 自臍帶的白細胞），這些細胞可與T-MSC結合。
[0237] 該T-MSC可以施用至個體，其中該T-MSC與該個體中已知或期望的免疫細胞（例 如T細胞）數(shù)量的比率從約10:1至約1:10,優(yōu)選地約1: 5。然而，在非限制性實施方式中， 多個 T-MSC 可以按，約 10,000:1、約 1,000:1、約 100:1、約 10:1、約 1:1、約 1:10、約 1:100、 約1:1,000或約1:10,000的比率施用至個體。一般地，可以施用約IX IO5至約IX 10 8個 T-MSC/kg (接受者體重），優(yōu)選地約I X IO6至約I X 10 7個T-MSC/kg (接受者體重），以產生 免疫抑制。在各種實施方式中，施用至個體或對象的T-MSC包括至少、約或不多于，IX 105、 3 X 105, 1 X 106, 3 X 106, 1 X 107, 3 X 107, 1 X 108, 3 X 108, 1 X 109, 3 X IO9個 T-MSC 或更多。
[0238] T-MSC也可和一種或多種第二類型的干細胞一起施用，如骨髓間充質干細胞。這種 第二類型的干細胞可施用給個體，它們和T-MSC的比例如約1:10至約10:1。
[0239] 為了便于T-MSC和免疫細胞接觸，該T-MSC可以按任何足以使該T-MSC和免疫細 胞彼此接觸的途徑施用至個體。例如，該T-MSC可以通過，例如靜脈內、肌內、腹膜內、眼內、 腸胃外、鞘內或直接進入器官（例如胰臟）的途徑施用至個體。對于體外施用，T-MSC可作 藥物制劑而執(zhí)行。
[0240] 所述免疫抑制方法還可以包括加入一種或多種免疫抑制劑，特別是在體內環(huán)境。 在一個實施方式中，多個T-MSC在個體體內接觸多個免疫細胞，并且組合物包括免疫抑制 藥物施用給個體。免疫抑制藥物是本領域所熟知的，包括但不限于抗T細胞受體抗體（如 單克隆或多克隆抗體，或抗體片段或其衍生物）、抗IL-2受體抗體（例如，巴利昔單抗 (SIMULECT? )或賽尼哌（ZENAPAX? )、抗T細胞受體抗體（例如莫羅單抗CD3)、硫唑 嘌呤、皮質類固醇、環(huán)孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯、西羅莫司、鈣調磷酸酶抑制劑等。在一個

【具體實施方式】中，所述免疫抑制劑是針對巨噬細胞炎性蛋白（MIP)-Ia和MIP-I β的中和 抗體。
[0241] 5. 8T-MSC 和 / 或 T-MSC-DL 的保存
[0242] T-MSC和/或T-MSC-DL可以被保存，也就是將它們長期存儲，或者抑制由例如凋亡 或壞死引起的細胞死亡?？梢允褂没衔锉４鎀-MSC和/或T-MSC - DL，這些化合物包含凋 亡抑制劑和壞死抑制劑。在一個實施方式中，本發(fā)明提供一種保存干細胞群的方法，其中， 干細胞群接觸含有凋亡抑制劑的干細胞采集組合物，其中所述凋亡抑制劑存在的量存在和 存在的時間足以減少或阻止干細胞群凋亡（與沒有接觸該凋亡抑制劑的細胞群相比）。在 一個具體的實施方式中，凋亡抑制劑是半胱天冬酶抑制劑。在另一個實施方式中，凋亡抑制 劑是JNK抑制劑。在更進一步的實施方式中，JNK抑制劑不調控所述干細胞的增殖和分化。 在另一實施方式中，所述細胞收集組合物包括所述凋亡抑制劑以及分離相的所述攜氧全氟 化碳。在另一實施方式中，所述細胞收集組合物包括所述凋亡抑制劑以及含于乳劑的所述 攜氧全氟化碳。在另一實施方式中，該細胞收集組合物附加地包括乳化劑，例如卵磷脂。在 另一實施方式中，所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳在接觸該細胞時，處于約〇°C到約25°C 之間。在另一更具體的實施方式中，所述凋亡抑制劑和所述全氟化碳在接觸該細胞時，處于 約2°C到10°C之間或約2°C到約5°C之間。在另一更具體的實施方式中，所述接觸在移送所 述細胞群期間執(zhí)行。在另一更具體的實施方式中，所述接觸在冷凍和融解所述干細胞群期 間執(zhí)行。
[0243] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供一種保存T-MSC和/或T-MSC - DL群的方法，其 中，干細胞群接觸凋亡抑制劑和保存器官的組合物，其中，凋亡抑制劑存在的量和時間足以 下調減少和阻止干細胞群的凋亡（相比于干細胞群未接觸凋亡抑制劑）。
[0244] 通常，在T-MSC和/或T-MSC-DL收集、富集和分離期間，優(yōu)選最小化或消除由于缺 氧和機械應力引起的細胞應激。因此，在該方法的另一個實施方式中，在干細胞或干細胞群 保存期間，干細胞或干細胞群暴露于低氧環(huán)境中，對它們的收集、富集和分離的時間不超過 6小時。其中，低氧環(huán)境指氧氣的濃度度低于正常血氧的濃度。在一個更具體的實施方式 中，干細胞在保存期間暴露于低氧環(huán)境少于2小時。在另一個更具體的實施方式中，干細胞 群在保存期間暴露于低氧環(huán)境少于1小時或少于30分鐘，或在收集期間、富集期間或分離 期間不暴露于低氧環(huán)境。在另一個更具體的實施方式中，干細胞群在收集、富集或分離期間 不暴露于剪應力。
[0245] T-MSC和/或T-MSC - DL可冷凍保存在含如冷凍保存培養(yǎng)基的小容器（例如安 瓶）。合適的冷凍保存培養(yǎng)基包括但不限于，包括如下的培養(yǎng)基：例如，生長培養(yǎng)基或細胞 凍存培養(yǎng)基，例如，商購的細胞凍存培養(yǎng)基，如C2695、C2639或C6039 (Sigma)。冷凍保存培 養(yǎng)基優(yōu)選包含濃度例如約10% (V/V)的二甲基亞砜（DMSO)。冷凍保存培養(yǎng)基可以包含其 它試劑，例如甲基纖維素和/或甘油。T-MSC和/或T-MSC - DL在冷凍保存過程中，優(yōu)選的 冷卻速度是約1°C/分鐘。優(yōu)選的冷凍保存溫度為約_80°C至約_180°C。在融化使用之前， 優(yōu)選地，約-125°C至約-140°C凍存的細胞可以轉移到液氮中。在一些實施方式中，例如，一 旦安瓶的溫度達至約_90°C，將它們轉移至含液氮儲存區(qū)域。冷凍保存的細胞解凍時優(yōu)選約 在25 °C至約40 °C的溫度下，優(yōu)選的溫度約37 °C。
[0246] 5. 9 冷凍保存的 T-MSC 和 / 或 T-MSC-DL
[0247] 本文公開的T-MSC和/或T-MSC-DL可以被保存，例如冷凍保存以備后用。冷凍 保存細胞，例如干細胞的方法是本領域所熟知的。T-MSC和/或T-MSC-DL能以一種方便施 用給個體的方法保存。例如，本文提供裝在容器里的T-MSC和/或T-MSC-DL，該容器適用 于醫(yī)療用途。這種容器可以是，例如無菌的塑料袋、燒瓶、罐，或其它可容易處置T-MSC和/ 或T-MSC-DL的容器。例如，所述容器可以是血袋或其它塑料的、適合用于給受體靜脈內輸 送液體的醫(yī)學上可接受的袋。該容器優(yōu)選允許冷凍保存干細胞群。冷凍保存的T-MSC和/ 或T-MSC-DL可包括T-MSC和/或T-MSC-DL來自一個捐贈者或來自多個捐贈者。T-MSC和 /或T-MSC-DL可以是和預期接受者完全HLA匹配的，或部分或完全HLA不匹配的。
[0248] 在另一個具體的實施方式中，所述容器是袋、瓶或罐。在一個更具體的實施方式 中，所述袋是無菌塑料袋。在一個更具體的實施方式中，所述袋適合、允許或有助于T-MSC 和/或T-MSC-DL靜脈內給藥。該袋子可以包括多個腔或室，給藥之前或期間，所述腔或室 相互連接，以允許該細胞以及一種或多種其他溶液（例如藥物）相混合。在另一個具體的 實施方式中，這種組合物包含一種或多種化合物，促進組合的干細胞群冷凍促存。在另一個 具體的實施方式中，T-MSC和/或T-MSC-DL被包含在生理學可接受的水性溶液中。在一個 更具體的實施方式中，這種生理學可接受的水性溶液是〇. 9% NaCl溶液。在另一個具體的 實施方式中，hES-MSC和接受者的干細胞群是HLA匹配的。在另一個具體的實施方式中，所 述組合的干細胞群包含hES-MSC，這些hES-MSC至少部分和接受者的干細胞群HLA匹配。
[0249] 5. 10T-MSC分化為多種細胞系
[0250] T-MSC可以分化成多種細胞系，包括神經元譜系細胞或神經元、或脂肪細胞、或肌 細胞、或成纖維細胞、或成骨細胞、或軟骨細胞。除非特別說明，T-MSC可被接種于包被明膠、 膠原蛋白、纖連蛋白、基質膠、層粘連蛋白、玻連蛋白、或聚（賴氨酸）的細胞培養(yǎng)板。T-MSC 可以以濃度I X IO3細胞/cm2至I X 10 4細胞/cm 2接種至無血清培養(yǎng)基或含F(xiàn)BS或ABHS的 血清培養(yǎng)基。根據(jù)以上所述條件接種T-MSC可以按以下的其中一種方法分化。
[0251] 在一個實施方式中，T-MSC可分化的培養(yǎng)基中含有l(wèi)-50ng/m成纖維細胞生長因 子-2(FGF-2)(最佳為10ng/ml)加 l-50ng/ml表皮細胞生長因子（EGF)(最佳為10ng/ml) 加0. 5-5ng/ml血小板源生長因子（PDGF)(最佳為lng/ml)。每2 - 3天更換培養(yǎng)基，并且 2-4星期后收獲細胞，預期產量為每I X IO6T-MSC產生0. 5 X 106-2 X IO6神經細胞元譜系細 胞。
[0252] 在另一個實施方式中，T-MSC接種在包被多聚-L-鳥氨酸和層粘連蛋白的培養(yǎng)板， 可分化為神經元譜系細胞。T-MSC的分化分為3個階段。階段l:l-50ng/ml FGF-2(最佳 為10ng/ml)和l-50ng/ml EGF(最佳為10ng/ml)，使hMSCs朝神經細胞方向分化。階段2 : 10-200ng/ml 音猜因子（SHH)(最佳為 100ng/ml)，l-50ng/ml FGF-8(人）（最佳為 IOng/ 1111)和50-50(^144?(最佳為20(^1)，開始向中腦分化。階段3:5-5001^/1111膠質細胞 衍生的神經營養(yǎng)因子（⑶NF)(最佳為50ng/ml)和50-500 μM AAP(最佳為200 μM)，以誘 導分化和成熟多巴胺能神經元。每個階段需要一個星期，并且在每個階段之間，使用胰酶或 TrypLE/分散酶解離粘連細胞以傳代。每天補充生長因子以及每2天更換培養(yǎng)基。預期產 量為每I X IO6T-MSC產生0. 5 X IO6 - 4x IO6神經細胞元譜系細胞。
[0253] 在另一個實施方式中，T-MSC可在神經基質培養(yǎng)基中（Gibco)分化為神經元譜系 細胞，該培養(yǎng)基包含〇. 25ΧΒ-27補充物，加10-200ng/ml音猬因子（SHH)(最佳為IOOng/ ml)，加 l_50ng/ml FGF_8(小鼠）（最佳為 10ng/ml)，加 l_200ng/ml FGF_2(最佳為 50ng/ ml)。在第6天和第12天收集細胞，在這期間不更換培養(yǎng)基。預期產量為每I X IO6T-MSC產 生0.5XlO6-4x IO6神經細胞元譜系細胞。
[0254] 在另一個實施方式中，T-MSC可經兩個階段分化為神經元譜系細胞。階段I :T_MSC 在含2mM谷氨酰胺、l-20U/ml (最佳為12. 5U/ml)制霉菌素、N2補充物、2-50ng/ml (最佳 為20ng/ml)成纖維細胞生長因子-2(FGF-2)和l-50ng/mL EGF(最佳為10ng/ml)的無血 清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)48-72小時。階段2 :細胞在含B27補充物、0. l-10mM(最佳為ImM) 二丁酰環(huán)腺苷酸（dbcAMP)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX)、10-500 μM(最佳為200 μM) 抗壞血酸、l-100ng/ml BDNF(最佳為50ng/ml)、l-50ng/ml膠質細胞衍生的神經營養(yǎng)因 子（⑶NF，最佳為 10ng/ml)、0.2-10ng/ml 轉化生長因子-0 3(TGF-0 3,最佳為 2ng/ml)、 0.05-5 μ M全反式視黃酸（RA，最佳為0.1 μ Μ)。每個階段需要一個星期，并且在每個階段 之間，使用胰酶或TrypLE/分散酶解離粘連細胞以傳代。每2天更換培養(yǎng)基，預期產量為每 I X IO6T-MSC產生0. 5 X 106-4X IO6神經細胞元譜系細胞。
[0255] 在另一個實施方式中，T-MSC可被培養(yǎng)以誘導成骨分化。T-MSC將在含10% FCS、l-150uM(最佳為80μΜ)、2-磷酸抗壞血酸、0. 5-5μΜ(最佳為1 μΜ)地塞米松和 I-IOOmM(最佳為20mM) β -甘油磷酸鹽的低糖DMEM培養(yǎng)基中。每2-3天更換培養(yǎng)基，在2 星期后，預期產量為每IX IO6T-MSC產生0. 5 X 106-4x IO6神經細胞元譜系細胞。
[0256] 在另一個實施方式中，T-MSC可被培養(yǎng)以誘導分化為脂肪細胞。T-MSC將在含 20 % FCS，l-10yg/ml(最佳為5yg/ml)胰島素、0. 5-10μΜ(最佳為2μΜ)地塞米松、 0.1-1禮（最佳為0.51111)異丁基甲基黃嘌呤和1-1001^(最佳為601^)吲哚美辛的低糖 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每2-3天更換培養(yǎng)基，在4星期后，預期產量為每I X IO6T-MSC產生 0. 5 X 106-4 X IO6神經細胞元譜系細胞。
[0257] 在另一個實施方式中，T-MSC可被培養(yǎng)以誘導分化為軟骨細胞。T-MSC將 在含0. 5-10mM(最佳為ImM)丙酮酸鈉、0. 05-lmM(最佳為0. ImM) 2-磷酸抗壞血酸、 0.05-1以]?(最佳為0.1以]\〇地塞米松、0.2-2%(最佳為1%)幾5和1-5〇1^/1111(最佳為 10ng/mL) TGF- β 3的高糖DMEM培養(yǎng)基中以小球狀生長。每2-3天更換培養(yǎng)基，在20天后， 預期產量為每IX IO6T-MSC產生0. 5 X 106-4 X IO6神經細胞元譜系細胞。
[0258] 在另一個實施方式中，T-MSC可被培養(yǎng)以誘導分化為成肌細胞。T-MSC將在含10% FBS、l-20yM(最佳為10μΜ)5-氮胞苷和l-50ng/ml(最佳為10ng/ml)堿性FGF的低糖 DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24小時后，含10% FBS和l-50ng/ml (最佳為10ng/ml)堿性FGF的成肌 誘導培養(yǎng)基替換DMEM培養(yǎng)基。每2-3天更換培養(yǎng)基，在2星期后，預期產量為每I X IO6T-MSC 產生0. 5 X 106-4 X IO6神經細胞元譜系細胞。
[0259] 在另一人實施方式中，T-MSC可被培養(yǎng)以誘導分化為成纖維細胞。T-MSC將在含 10% FBS、50-200ng/ml(最佳為100ng/ml)重組人結締組織生長因子（CTGF)U-IOOyg/ ml (最佳為50 μ g/ml)抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基是用來培養(yǎng)hMSCs的。每 3-4天更換培養(yǎng)基，在4星期后，預期產量為每I X IO6T-MSC產生0. 5 X 106-4 X IO6神經細胞 元譜系細胞。
[0260] 利用任何分化方法從T-MSC衍生的所有細胞系和細胞類型包括但不限于，上述被 稱為T-MSC-DL全部方法。
[0261] 5. 11藥物制劑
[0262] 在一個實施方式中，這里提供一種藥物組合物，其中，包括治療有效量的T-MSC和 藥學上都接受的載體。
[0263] 所述藥物組合物可包括任何數(shù)量的T-MSC和/或T-MSC-DL。例如，1個單位劑量 的T-MSC可包括，在不同的實施方式中，約至少，或不超過I X 105、5 X 105、I X 106、5 X 106、 I X 107、5 X 107、I X 108、5 X 108、I X 109、5 X 109、I X 101CI、5 X 101。、I X IO11或更多的 T-MSC 和 / 或 T-MSC-DL。
[0264] 本文公開的藥物組合物包括細胞群，這些細胞群包含50%或更多的活細胞（即 是，細胞群中至少50%的細胞是有功能的或存活的）。優(yōu)選地，細胞群中至少60%的細胞是 活的。更優(yōu)選地，在藥物組合物里，細胞群中至少70%、80%、90%、95%或99%的細胞是活 的。
[0265] 本文公開的藥物組合物包括一種或多種化合物，比如有利于移植的化合物，例如， 抗T細胞受體抗體、免疫抑制劑等；也可以是穩(wěn)定劑，例如白蛋白、葡聚糖40、明膠、羥乙基 淀粉等。
[0266] 短語"藥學上可以接受的"是指分子實體和組合物具有生理容許性而且在施用于 人后通常不會產生過敏或者相類似的反應，如胃部不適，頭暈等。并且由聯(lián)邦或州政府管理 部門批準的，或在美國藥典或其它公認的用于動物，更特別地用于人的藥典中列出的。載 體"是指藥劑批準的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載體。此類藥物載體可以是無菌液體，例如水的 鹽水溶液和油，包括石油、動物油、植物油或合成油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。 當藥物組合物靜脈給藥時，鹽水溶液是優(yōu)選的載體。鹽水溶液和含水葡萄糖以及甘油溶液 也可用作液體載體，特別是注射用液體。合適的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、 明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘 油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，這些組合物還包含極小量的濕潤劑、乳化劑和/ 或pH緩沖劑。
[0267] 這些組合物可以采用以下形式：溶液、混懸劑、乳劑、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、持續(xù) 釋放制劑、扁囊劑、錠劑、錠劑、分散劑、栓劑、軟膏劑、巴布劑（泥敷劑）、糊劑、敷料、霜劑、 硬膏劑、貼劑、氣霧劑、凝膠劑。液體劑型適于胃腸外施用至患者，以及滅菌固體制劑（如晶 體或無定形固體）被重構成液體劑型以適于非腸道給藥患者。這樣的組合物應該包含治療 有效量的所述化合物（優(yōu)選純化的形式）以及適量的載體，以便向患者提供適當?shù)慕o藥形 式。
[0268] 適于口服給藥的藥物組合物可以是膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑、溶液劑、糖漿劑、懸 浮液（在非水或水性液體）或乳劑。片劑或硬明膠膠囊可以包括乳糖、淀粉或其衍生物、硬 脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、硬脂酸或其鹽。軟明膠膠囊可以包括植物油、蠟、脂肪、半 固體、或液體多元醇。溶液和糖漿可以包含水、多元醇和糖。設計用于口服給藥的活性藥劑 可用延遲該活性藥劑在胃腸道的崩解和/或吸收的物包衣或者與其混合。因此，可實現(xiàn)活 性劑持續(xù)釋放多個小時，并且如果需要，可將活性劑保護以防止在胃中降解。配制用于口服 給予的藥物組合物，而便于活性劑在特定的胃腸位置釋放?？膳渲瓶诜┯玫乃幬锝M合物 以幫助活性劑在特定胃腸道位置（由于特殊pH或酶條件）的釋放。
[0269] 適合透皮給藥的制劑可以為不連續(xù)的貼劑，以長時間與受治者表皮保持緊密接 觸。
[0270] 適合對鼻腔和肺用藥的藥物組合物可包含固態(tài)載體如可以快速通過鼻子給藥的 粉劑。用于鼻腔黏膜給藥的藥物組合物可以包括液體載體，例如鼻噴霧劑或滴鼻劑。另外， 可通過深吸一口氣或安裝吹管以實現(xiàn)直接吸入肺部。這些組合物可以包含活性成分的水或 油溶液。用于通過吸入給藥的組合物可以裝在專門配套的設備中，包括但不限于加壓氣溶 膠、噴霧器或吹入器，可以制造這樣的裝置，以便提供預定劑量的活性成分。
[0271] 適于腸胃外給藥的藥物組合物包括水性和非水性無菌注射溶液或懸浮液，所述溶 液或混懸劑可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑以及使所述組合物變得與預定接受者的血液 大體上等滲的溶質。這類組合物中可以存在的其他成分包括，例如水、醇、多元醇、甘油和植 物油。適于腸胃外給藥的組合物可以存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和 小瓶，并且可以儲存在冷凍干燥（凍干）條件下。對于這種情況，在臨用前僅需迅速加入無 菌液體載體。臨時注射溶液和懸浮液可以由無菌粉末、顆粒和片劑制備?？捎糜谔峁┍景l(fā)明 腸胃外劑型的合適載體是本領域技術人員所熟知的。實例包括：USP注射用水；水性載體， 例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液和乳酸林格注射 液；水可混溶的媒介物諸如乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和非水性載體，如玉米油、棉籽油、 花生油、芝麻油、油酸乙醋、肉豆蔻酸異丙酯和苯甲酸芐酯。
[0272] 有效劑量的選擇將由本領域技術人員根據(jù)對本領域普通技術人員周知的幾個因 素的考慮來確定。這些因素包括抑制劑的特定形式及其藥物動力學參數(shù)如生物利用度、代 謝、半衰期等，這些因素將在常規(guī)的開發(fā)程序中被確立，通常運用這些程序才能獲得對藥物 化合物的按規(guī)定的批準。與劑量有關的另一些因素包括，將要治療的病癥或疾病，或者對正 常人將要獲得的益處，病人的體重，用藥的途徑，用藥是急性或是慢性，伴隨給藥，以及影響 所給藥劑效率的其它周知因素。因此精確的劑量應當根據(jù)醫(yī)師的判斷和每位患者的具體情 況來定。
[0273] 在某些實施方式中，給患者施用解熱和/或抗組胺劑（對乙酰氨基酚和鹽酸苯海 拉明），以減少與hES-MSC治療時所含的冷凍元件有關的任何可能的DMSO輸注毒性。
[0274] 5. 12T-MSC條件培養(yǎng)基和衍生物
[0275] 本文公開的T-MSC可用于生產免疫抑制的條件培養(yǎng)基，也就是該培養(yǎng)基包含一種 或多種由干細胞分泌或排泄的生物分子。所述干細胞對多個一種或多種類型的免疫細胞有 可檢測的免疫抑制能力。在各種實施方式中，所述條件培養(yǎng)基包括T-MSC已經生長了至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天數(shù)的培養(yǎng)基。在其它的實施方式中，所述條 件培養(yǎng)基包括T-MSC已經生長到匯合度至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或達 到100%的培養(yǎng)基。這種條件培養(yǎng)基可用于支持單個T-MSC群的培養(yǎng)，或其它類型的干細 胞的培養(yǎng)。在另一個實施方式中，所述條件培養(yǎng)基包括T-MSC已經分化成熟細胞的培養(yǎng)基。 在另一個實施方式中，本發(fā)明的條件培養(yǎng)基包括已經培養(yǎng)過T-MSC和非T-MSC的培養(yǎng)基。
[0276] 因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種包括培養(yǎng)基、細胞裂解物和/或其它 T-MSC衍生物的組合物，其中所述T-MSC(a)粘附在基質上；(b)表達CD73、CD105、CD90、 CD29、CD44、CD146、IL-10、TGFb2、HGF，但是不表達IL-6、TNFα、IL-12和/或RAGE。在另 一個具體的實施方式中，該組合物包括抗增殖試劑，如抗-MIP-I a或抗-MIP-I β抗體。
[0277] 本文提供一種使用本文所述T-MSC作為飼養(yǎng)細胞擴增骨髓造血干細胞、外周血造 血干細胞和臍帶造血干細胞的方法。在某些實施方式中，適合于本公開方法的T-MSC表達 Str〇-3、Str〇-l、DLl和/或Nestin。所述T-MSC也可被本文第5. 5節(jié)公開的方法修飾或改 造以表達高水平的Str〇-3、Str〇-l、DLl、Nestin和/或Frizzle。在某些實施方式中，所述 T-MSC是間充質干細胞。本文提供如本文所述T-MSC和骨髓造血干細胞的共培養(yǎng)物。本文 提供如本文所述T-MSC和臍帶造血干細胞的共培養(yǎng)物。
[0278] 5. 13包括T-MSC和/或T-MSC衍生細胞系的基質
[0279] 本發(fā)明還包括基質、水凝膠、支架和類似的包含T-MSC和/或T-MSC-DL。T-MSC和/ 或T-MSC-DL可接種在天然基質，如生物材料。在某些實施方式中，通過3維打印獲得所述支 架。T-MSC和/或T-MSC-DL可懸浮在適合如注射的水凝膠溶液。對于這樣的組合物的合適的 水凝膠包括自組裝肽，例如RAD16。在一個實施方式中，包含細胞的水凝膠溶液可允許變硬， 例如在模具中，以形成具有細胞分散在其中的用于移植的基質。T-MSC和/或T-MSC-DL可培 養(yǎng)在這樣的基質，使細胞在移植前進行有絲分裂擴增。所述水凝膠是，例如有機聚合物（天 然的或合成的），通過共價、離子或氫鍵交聯(lián)以創(chuàng)建三維開放的晶格結構，其俘獲的水分子， 以形成凝膠。水凝膠形成材料包括多糖，例如褐藻膠及其鹽、多肽、聚膦嗪和聚丙烯酸酯， 它們是通過離子鍵、或嵌段聚合物交聯(lián)，嵌段聚合物包括例如聚環(huán)氧乙烷一聚丙二醇嵌段 共聚物，它們是分別通過溫度或PH值交聯(lián)。在一些實施方式中，本發(fā)明的水凝膠或基質是 可生物降解的。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述制劑包含原位聚合的凝膠（見，例如，美 國專利申請公開 2002/0022676 ;Anseth 等，J. Control Release，78 (1-3) : 199-209 (2002); Wang 等·，Biomaterials，24(22):3969-80 (2003)〇
[0280] 在一些實施方式中，所述聚合物至少可部分溶解于具有帶電荷側基或其單價離子 鹽的水溶液例如水，或含水醇溶液中。具有酸性側基的聚合物的實例，聚合物可以與陽離子 反應的是聚（磷腈）、聚（丙烯酸）、聚（甲基丙烯酸）、丙烯酸和甲基丙烯酸、聚（乙酸乙烯 酯）的共聚物、以及磺化的聚合物，例如作為磺化聚苯乙烯。也可以使用具有由丙烯酸或甲 基丙烯酸與乙烯醚單體或聚合物反應形成的酸性側基的共聚物。酸性基團的實例是羧酸基 團、磺酸基團、鹵代（優(yōu)選氟代）醇基團、酚OH基團和酸性OH基團。
[0281] T-MSC、T-MSC_DL和/或共培養(yǎng)物可以接種至三維框架或支架，并移植入體內。這 種框架可以和任何一個或多個生長因子、細胞、藥物或其它組分一起移植，以刺激組織形成 或以其它方式增強或改善本發(fā)明的實施。
[0282] 可在本發(fā)明中使用的支架的實例包括非織造墊、多孔泡沫、或自組裝多肽。可以 用纖維形成無紡布襯墊，該纖維由乙醇和乳酸合成的可吸收的共聚物構成（如PGA/PLA) VICRYL，Ethicon，Inc.，Somerville，N.J.)。泡沫也可以用作支架，該泡沫由如通過聚 (ε -己內酯）/聚（乙醇酸）（PCL/PGA)共聚物構成。該共聚物通過例如冷凍干燥或凍干工 藝形成（見，例如，美國專利號6355699)。
[0283] T-MSC和/或T-MSC-DL也可以接種在或接觸生理上可接受的陶瓷材料，包括 但不限于，單_、二_、三_、α-三-、β-三和四磷酸鈣、羥基磷灰石、氟磷灰石、硫酸鈣、 鈣氟化物、氧化鈣、碳酸鈣、鎂鈣磷酸鹽、生物活性玻璃如BIOGLASS?以及它們的混合 物。目前市售的多孔生物相容的陶瓷材料包括SURGIBONE? (CanMedica Corp.，加拿 大），ENDOBON? (Merck Biomaterial France，法國）、CEROS? (Mathys，AG，貝特拉 赫，瑞士）和礦化膠原骨移植產品，例如HEALOS?(DePuy，Inc.，雷納姆，馬薩諸塞州）和 VITOSS?，RHAK0SS?和 CORTOSS? (Orthovita，Malvern，Pa·)。該框架可以是一個混合 物、共混物或天然和/或合成材料的復合物。
[0284] 在另一個實施方式中，T-MSC和/或T-MSC-DL可以接種在或接觸毛氈，該毛氈可 以由，如復絲構成。該復絲可由生物吸收的材料如PGA、PLA、PCL共聚物或共混物，或透明質 酸制成。
[0285] 在另一個實施方式中，T-MSC和/或T-MSC-DL可以接種在泡沫支架，該支持可以是 復合結構。此類泡沫支架可以模制成有用的形狀，例如，待修復、替換或補充的身體特定結 構的一部分。在一些實施方式中，所述框架在接種本發(fā)明的細胞之前，使用例如〇. IM乙酸 處理，然后在聚賴氨酸、PBS和/或膠原蛋白溫育，以增強細胞粘附?；|的外部表面可以 被修飾以改善細胞和組織的分化，例如離子體包被基質，或添加一種或多種蛋白質（例如 膠原、彈性纖維、網狀纖維）、糖蛋白、葡糖氨基葡聚糖（例如硫酸肝素、軟骨素-4-硫酸鹽、 軟骨素-6-硫酸鹽、硫酸皮膚素、硫酸角質素等）、細胞外基質和/或其它基質，如但不限于 明膠、藻酸鹽、瓊脂、瓊脂糖和植物膠等。
[0286] 在一些實施方式中，所述支架包括不使其形成血栓的材料，或支架被這種材料處 理。這些處理和材料也可以促進和維持內皮生長、迀移和細胞外基質沉積。這些材料和治 療的實施方式包括但不限于天然材料例如基底膜蛋白，如層粘連蛋白和IV型膠原，合成材 料，例如EPTFE和分段的聚氨醋脈娃酮，例如roRSPANTMf^The Polymer Technology Group， Inc.，伯克利分校，加州）。所述支架還可以包含抗血栓形成劑，例如肝素。在接種干細胞 前，該支架也可以被處理，以改變表面電荷（例如，包被等離子體）。
[0287] 5· 14 永生化的 T-MSC 和 / 或 T-MSC-DL
[0288] 哺乳動物的T-MSC和/或T-MSC-DL可通過轉染含有生長促進基因的任何合適的 載體以實現(xiàn)有條件的永生化。這些基因編碼的蛋白質在適當條件下促進轉染的細胞生長， 使得所述生長促進蛋白質的產量和/或活性聽上去像是外界因素。在一個優(yōu)選的實施方式 中，生長促進基因是癌基因，例如但不限于v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多瘤 病毒大T抗原、Ela的腺病毒或E7蛋白人乳頭狀瘤病毒。
[0289] 促生長蛋白調節(jié)的實例可以通過下以實現(xiàn)，將促生長基因置于外界可調控的啟 動子上，例如，啟動子的活性受控于，例如被轉染細胞溫度或與細胞接觸培養(yǎng)基的成分改 變。在一個實施方式中，可使用四環(huán)素（tet)控制的基因表達系統(tǒng)（參照Gossen等， Proc. Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551，1992;Hoshimaru 等，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 93:1518-1523,1996)。當不存在tet時，載體中tet控制的反式作用因子（tTA)強激活 phCMV*-l的轉錄，其中phCMV*-l是融合至tet操縱子序列的最小人巨細胞病毒啟動子。tTA 的是大腸桿菌的轉座子-10來源的tet抗性操縱子和單純皰瘆病毒的VP16的酸性結構域 的阻遏（四面體）的融合蛋白。低、無毒濃度的tet (例如，0.01?1.0 μ g/mL)幾乎完全消 除tTA的反式激活。
[0290] 在一個實施方式中，載體還包含編碼選擇標記（例如賦予藥物抗性的蛋白質）的 基因。該細菌新霉素抗性基因（nec/)就是這樣一種標記，該標記也可以用于本發(fā)明中?？?通過對于本領域的普通技術人員已知的方法選擇攜帶neo K的細胞，例如，在生長培養(yǎng)基中 添加 100-200 μ g/mL G418。
[0291] 可通過本領域中普通技術人員已知的各種方法中任何一種方法實現(xiàn)轉染，包括但 不限于反轉錄病毒感染。通常，對細胞培養(yǎng)物轉染可通過與條件培養(yǎng)基和包含N2補充物的 DMEM/F12形成的混合物溫育。其中，條件培養(yǎng)基來自針對所述載體的生產細胞系。例如，通 過在1倍體積條件培養(yǎng)基和2倍體積含有N2補充物的DMEM/F12的混合物中溫育約20小 時，如上所述制備的干細胞培養(yǎng)物可在體外被感染，例如5天。接著可按如上所述的方法選 擇攜帶可選擇標記的轉染細胞。
[0292] 轉染后，培養(yǎng)物傳代到允許增殖的表面，例如，允許至少30%的細胞在24小時周 期內倍增。優(yōu)選地，所述基質是聚鳥氨酸/層粘連蛋白基質，包括組織培養(yǎng)塑料涂有聚鳥氨 酸（10 μ g/mL)和/或層粘連蛋白（10 μ g/mL)、聚賴氨酸/層粘連蛋白基質、或用纖粘連蛋 白處理的表面。然后，每3-4天用生長培養(yǎng)基飼養(yǎng)培養(yǎng)物，生長培養(yǎng)基中可以或可以不補充 1個或多個增殖增強因子。當培養(yǎng)物的匯合度少于50%時，可在生長培養(yǎng)基中添加增殖增 強因子。
[0293] 可使用標準技術傳代所述條件永生化的T-MSC和/或T-MSC-DL細胞系，如當 80-95%匯合度時，使用胰蛋白酶消化細胞。在一些實施方式中，高達約20代有利于維持選 擇（例如，在含有新霉素抗性基因的細胞中添加 G418)。細胞還可以在液氮中冷凍以進行長 期儲存。
[0294] 可從如上所述的條件永生化的人T-MSC細胞系中分離克隆細胞系。通常，可使用 標準技術分離這種克隆細胞系，如通過有限稀釋法或使用克隆環(huán)和擴增。通?？砂慈缟纤?述飼養(yǎng)和傳代克隆細胞系。
[0295] 條件永生化的人T-MSC細胞系可以是，但不需要是純系的。通?？赏ㄟ^在促進分 化的培養(yǎng)條件下抑制生長促進蛋白的生產或活性而誘導條件永生化的人T-MSC細胞系分 化。例如，如果編碼生長促進蛋白的基因被外部調節(jié)的啟動子的控制，可以改變條件，例如 溫度或培養(yǎng)基的組合物，從而抑制生長促進基因的轉錄。對于上面討論的四環(huán)素控制的基 因表達系統(tǒng)，可以通過加入四環(huán)素抑制生長促進基因的轉錄而實現(xiàn)分化。通常I yg/mL四 環(huán)素處理4-5天足以引發(fā)分化。為了促進進一步分化，可在生長培養(yǎng)基中加入額外的藥劑。
[0296] 5. 15 試驗
[0297] T-MSC和/或T-MSC-DL可應用于試驗以確定培養(yǎng)條件、環(huán)境因素、分子（例如， 生物分子、小無機分子等）等對干細胞增殖、擴增和/或分化的影響，基于與T-MSC和/或 T-MSC-DL不暴露于這樣的條件相比較。
[0298] 在一個優(yōu)選的實施方式中，T-MSC和/或T-MSC-DL可用于分析一旦細胞接觸分 子，增殖、擴大或分化的變化。在一個實施方式中，例如，本發(fā)明提供了一種鑒定調節(jié)多個 T-MSC和/或T-MSC-DL增殖的化合物，其中，在允許增殖的條件下，T-MSC和/或T-MSC-DL 接觸該化合物，其中與T-MSC和/或T-MSC-DL未與該化合物接觸相比較，如果該化合物引 起對T-MSC和/或T-MSC-DL的增殖可檢測的變化，那么該化合物被鑒定為調節(jié)T-MSC和/ 或T-MSC-DL增殖的化合物。在一個具體的實施方式中，所述化合物被鑒定是增殖抑制劑。 在另一個【具體實施方式】中，所述化合物被鑒定是增殖增強劑。
[0299] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種鑒定調節(jié)多個T-MSC和/或T-MSC-DL 擴增的化合物，其中，在允許擴增的條件下，T-MSC和/或T-MSC-DL接觸該化合物，其中 與T-MSC和/或T-MSC-DL未與該化合物接觸相比較，如果該化合物引起對T-MSC和/或 T-MSC-DL擴增可檢測的變化，那么該化合物被鑒定為調節(jié)T-MSC和/或T-MSC-DL擴增的化 合物。在一個具體的實施方式中，所述化合物被鑒定是擴增抑制劑。在另一個具體實施方 式中，所述化合物被鑒定是擴增增強劑。
[0300] 在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種鑒定調節(jié)多個T-MSC和/或T-MSC-DL 分化的化合物，其中，在允許分化的條件下，T-MSC和/或T-MSC-DL接觸該化合物，其中 與T-MSC和/或T-MSC-DL未與該化合物接觸相比較，如果該化合物引起對T-MSC和/或 T-MSC-DL分化可檢測的變化，那么該化合物被鑒定為調節(jié)T-MSC和/或T-MSC-DL分化的化 合物。在一個具體的實施方式中，所述化合物被鑒定是分化抑制劑。在另一個具體實施方 式中，所述化合物被鑒定是分化增強劑。
[0301] 5. 16人胚胎干細胞衍生的間充質干細胞的治療應用
[0302] 來源于骨髓的間充質干細胞（BM-MSCs)已經被用于基于T細胞相關的自身免疫性 疾病的治療，包括多發(fā)性硬化癥（MS)，但由于來源有限、質量不穩(wěn)定和對使用來自成體組織 細胞生物安全的擔憂，使骨髓間充質干細胞作為輔助治療劑受到了限制。
[0303] 本文所述的從胚胎干細胞產生間充質干細胞的新方法，和使用這種方法產生的新 T-MSC，提供了針對T細胞相關的自身免疫性疾病，特別是多發(fā)性硬化癥的新療法，
[0304] 在某些實施方式中，向EAE發(fā)病的小鼠施用T-MSC，顯著地降低這些動物的疾病評 分。所述評分降低伴隨著降低脫髓鞘、T細胞的浸潤和中樞神經系統(tǒng)的小膠質細胞反應，以 及在體外抑制免疫細胞增殖和分化。
[0305] 在某些實施方式中，向疾病發(fā)作后的EAE小鼠施用T-MSC，也可觀察到疾病評分逐 漸下降。在某些實施方式中，T-MSC同時具有對該疾病預防性和治療性效果。
[0306] 在某些實施方式中，T-MSC的免疫抑制活性導致被輻射過的T-MSC對這些疾病預 防性效果，這些被輻射過的T-MSC不大可能替換受損的髓磷脂，但是有效地下降疾病評分。 在一個實施方式中，福射并未縮短T-MSC的壽命。
[0307] 在某些實施方式中，T-MSC的治療效果涉及免疫抑制、神經修復和再生。
[0308] 在某些實施方式中，T-MSC處理的EAE小鼠在它們的中樞神經系統(tǒng)存在更少炎癥 性T細胞以及更少T細胞滲透至脊髓。所述T-MSC可以減少由炎癥性T細胞引起的損傷和 癥狀，使得它們有用于所有與T細胞相關的自身免疫性疾病的治療和預防。T-MSC也減少脫 髓鞘。
[0309] T-MSC的特性全都和骨髓來源的間充質干細胞獲得的結果形成鮮明對比。BM-MSCs 僅抑制T細胞響應于體外低劑量抗-CD3抗體刺激的增殖，而且甚至增強Thl和Thl7細胞滲 透到中樞神經系統(tǒng)。已經發(fā)現(xiàn)自體反應的效應CD4+T細胞與一些自身免疫疾病的發(fā)病機理 有關，包括多發(fā)性硬化癥、克羅恩氏病和類風濕性關節(jié)炎。這些CD4+T細胞包括Thl和Th 17 細胞。人BM-MSCs對EAE小鼠的治療僅具有微弱或可以忽略的效果（Gordon等.2008a ; Zhang等.2005 ;Payne等.2012)。最近的報道顯示，使用人臍帶來源的間充質干細胞治療 EAE小鼠，疾病評分僅從3. 5下調至3. 0(Liu et al. 2012)。本文的結果和來自這些研宄的 結果突出了本發(fā)明T-MSC的新穎性和實用性。
[0310] 另外，BM-MSC和T-MSC具有非常相似的整體轉錄譜，但差異表達一些促炎和抗炎 因子。在這些因子中，BM-MSCs的IL-6的表達水平高于T-MSC。此外，在體外經IFNy刺激 后，BM-MSCs的IL-6的表達升高1倍，然而T-MSC的IL-6表達仍保持低水平。
[0311] IL-6是一種多效性細胞因子，涉及造血/免疫細胞和基質細胞之間的串擾，包括 炎癥的開始和終止。IL-6可促進Thl7細胞的分化和功能（Dong，2008)。多發(fā)性硬化癥病 人血液和腦組織的單核細胞的IL-6水平升高（Patanella等，2010)，IL-6水平在老年人 的血清中也升高（Sethe et al，2006)。缺少IL-6受體α的小鼠在T細胞致敏時是抵抗 EAE的（Leech等，2012)。CNS產生的位點特異性IL-6可重新定位和增強EAE的免疫反應 (Quintana等，2009)，然而，IL-6中和抗體可減少EAE小鼠的炎癥反應（Gijbels et，1995)。 因此，IL-6已成為治療多發(fā)性硬化癥有前途的治療靶標。
[0312] 在MSC治療MS和EAE時，外周T細胞活性的免疫調節(jié)、神經細胞再生和神經細胞 修復是被廣泛認可的治療作用（Al Jumah and八13111]^代6,2012;411161:丨3等，2012;]\1〇四11(1〇 等，2012)。然而，MS病人的長期功能神經恢復和持續(xù)緩解病情需要修復受損的血-腦屏障 和血脊髓屏障（Correale and Villa，2007 ;Minagar等，2012)。換句話說，MS是一種炎癥 性、神經變性和血管性疾病，而且有效的治療需要針對所有三個部分。
[0313] T-MSC的特性使它們特別適用于治療T細胞相關的自身免疫疾病，尤其是多發(fā)性 硬化。特別地，T-MSC可降低EAE小鼠的疾病評分，而且還減少脫髓鞘和降低Th 1和Th 17細 胞的增殖，并且IL-6低表達。后兩個特性使它們適合于治療其它的T細胞相關的自身免疫 性疾病。此外，T-MSC穿過血-腦屏障和血脊髓屏障的能力，使得它們在治療和預防多發(fā)性 硬化癥和其它與中樞神經系統(tǒng)相關的自身免疫性疾病具有更大的優(yōu)勢。
[0314] 在一個實施方式中，本發(fā)明提供了一種治療和預防與T細胞相關的自身免疫性疾 病的方法，其中，包括給有需要其的受試者施用藥的步驟，所述藥是包括MSC的治療有效量 的溶液、細胞培養(yǎng)物或藥物制劑。T細胞相關的自身免疫疾病包括但不限于多發(fā)性硬化癥、 炎性腸病、克羅恩病、移植物抗宿主病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕性關節(jié)炎。受試者是哺 乳動物，最優(yōu)選的是人。所述溶液、細胞培養(yǎng)物或藥物制劑可以包括被輻射或未經輻射的 T-MSC。所述溶液、細胞培養(yǎng)物或藥物制劑優(yōu)選通過注射給藥。
[0315] 多發(fā)性硬化癥已被劃分成四個亞型：復發(fā)性/持久性；繼發(fā)進行性；原發(fā)進行性； 和進行性復發(fā)。該復發(fā)性/持久性亞型的特征是不可預測復發(fā)繼之以長時間緩解。繼發(fā)進 行性MS個體往往以復發(fā)性/持久性MS開始，然后是沒有緩解期的進行性衰退。原發(fā)進行 性MS描述了少數(shù)出現(xiàn)癥狀后從未有緩解的個體。進行性復發(fā)是最常見的亞型，具有穩(wěn)定神 經衰退，并且遭受急性發(fā)作的特征。
[0316] 本文為有此需要的受試者提供一種治療或預防多發(fā)性硬化癥的方法，其中，該方 法包括向有需要其的受試者施用藥的步驟，所述藥是包括MSC的治療有效量的溶液、細胞 培養(yǎng)物或藥物制劑。所述多發(fā)性硬化癥可以是復發(fā)性/緩解性多發(fā)性硬化癥、進行性/復 發(fā)性多發(fā)性硬化癥、原發(fā)性多發(fā)性硬化癥、或繼發(fā)性多發(fā)性硬化癥。所述溶液、細胞培養(yǎng)物 或藥物制劑可以包括被輻射或未經輻射的T-MSC。所述溶液、細胞培養(yǎng)物或藥物制劑優(yōu)選通 過注射給藥。
[0317] 多發(fā)性硬化癥中出現(xiàn)的一系列癥狀包括四肢感覺障礙、視神經功能障礙、錐體束 功能障礙、膀胱功能障礙、腸功能障礙、性功能障礙、共濟失調和復視攻擊。
[0318] 本發(fā)明的另一個實施方式是一種治療多發(fā)性硬化癥的方法，其中，包括向有需要 其的受試者施用藥的步驟，所述藥是包括MSC的治療有效量的溶液、細胞培養(yǎng)物或藥物制 劑。其中可檢測的改善有至少一種癥狀、至少兩種癥狀、至少三種癥狀、至少四種癥狀、至少 五種癥狀或所有這些癥狀。
[0319] 擴展殘疾狀態(tài)量表（EDSS)是最常用的評價患有多發(fā)性硬化臨床狀態(tài)的評價標 準。它根據(jù)多個單獨的參數(shù)測量殘疾：強度、感覺、腦干功能（語言和吞咽）、協(xié)調、視覺、認 知和腸/膀胱失禁。它是一個公認的MS殘疾測量表。并且執(zhí)行起來不是特別困難或耗時。 該EDSS量化殘疾的八個功能系統(tǒng)（FS)并且允許神經專家分配這些中的每一個功能系統(tǒng)評 分（Kurtzke 1983)。
[0320] Kurtzke如下定義功能系統(tǒng)：
[0321] ?錐體狀
[0322] ?小腦
[0323] ?腦干
[0324] ?感覺
[0325] ?腸和膀胱
[0326] ?視覺
[0327] ?大腦
[0328] ?其它
[0329] EDSS評分I. 0至4. 5指完全不臥床的多發(fā)性硬化癥患者。EDSS通過損傷到行走 定義5. 0至9. 5。每個可能結果的臨床意義如下：
[0330] 0. 0 :神經檢查正常；
[0331] I. 0 :無殘疾，一個功能系統(tǒng)中最小異常體征；
[0332] 1. 5 :無殘疾，2/7功能系統(tǒng)中最小異常體征；
[0333] 2· 0 :1/7功能系統(tǒng)中有最低能力喪失；
[0334] 2. 5 :兩個功能系統(tǒng)中有最低能力喪失；
[0335] 3. 0 :-個功能系統(tǒng)中有中度能力喪失；或三個或四個功能系統(tǒng)中有輕度能力喪 失，盡管完全能走動；
[0336] 3. 5 :完全能走動，但是一個功能系統(tǒng)中有中度能力喪失和1或2個功能系統(tǒng)輕微 能力喪失，或2個功能系統(tǒng)中度能力喪失，或5個功能系統(tǒng)輕微能力喪失；
[0337] 4.0 :盡管有相對重度的能力喪失，在沒有幫助的情況下，完全能走動、自立，長達 約12h/天；沒有幫助或不休息的情況下，能夠行走約500m ;
[0338] 4. 5 :在沒有幫助的情況下，一天中約大部分的時間完全能走動，能工作一整天，另 外可能在充分活動方面受一些限制或需要基本的幫助；以相對重度的能力喪失為特點；沒 有幫助或不休息的情況下，能行走約300m ;
[0339] 5. 0 :不需要幫助能行走約200米。殘疾妨礙所有日?；顒?；
[0340] 5. 5 :能走動100米，殘疾妨礙所有日?；顒樱?br> [0341] 6. 0 :不管是否休息，需要間歇性或單側持續(xù)援助（手杖、拐杖或支架）行走100 米；
[0342] 6. 5 :需要持續(xù)的雙邊支持（手杖、拐杖或支架）以不休息地行走20米；
[0343] 7.0 :即使在有幫助時也不能行走超過5米，基本上限制在輪椅，自己操作標準輪 椅走動；一天在輪椅中待的時間長達約12h ;
[0344] 7. 5 :不能多走幾步，限制在床，轉移時可能需要幫助。可自已上輪椅，但可能需要 電動椅以完成所有日?；顒?；
[0345] 8. 0 :基本上限制在床、椅子或輪椅，但可以不臥床；
[0346] 8. 5:-天大部分時間基本上限制在床，能有效地使用手臂，保留了一些自理能 力；
[0347] 9. 0 :在床無助的病人，可以交流和飲食；
[0348] 9. 5 :不能有效交流或飲食/吞咽；
[0349] 10;因 MS而死亡。
[0350] 本文提供一種用于治療需要其受試者的多發(fā)性硬發(fā)癥的方法，該方法包括向有需 要其的受試者施用藥的步驟，所述藥是包括T-MSC的治療有效量的溶液、細胞培養(yǎng)物或藥 物制劑。其中，所述受試者擴展殘疾狀態(tài)量表（EDSS)的評分至少改善一分，而且優(yōu)選至少 改善2分。
[0351] 還有其它已經用于治療和預防多化性硬化癥的治療藥物，包括但不限于芬戈莫 德、促腎上腺皮質激素（ACTH)、甲基強的松龍、地塞米松、IFN β -la、IFN-lb、醋酸格拉替雷、 環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)孢菌素、米托蒽醌和柳氮磺吡啶。
[0352] 因此，本發(fā)明的方法還可進一步包括向受試者給予一種或多種其它治療藥劑， 所述藥劑包括但不限于芬戈莫德、促腎上腺皮質激素（ACTH)、甲基強的松龍、地塞米松、 IFNf3-la、IFN-lb、醋酸格拉替雷、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、克拉屈濱、環(huán)孢菌素、米 托蒽醌和柳氮磺吡啶。在另一個實施方式中，所述其它治療藥劑可在T-MSC施用后再施用， 或和T-MSC同時施用，或可共軛或連接至T-MSC。
[0353] 除了 T細胞，T-MSC也具有對B細胞、樹突細胞、嗜中性粒細胞、NK細胞、巨噬細 胞強大的免疫抑制功能和其它炎癥性和免疫相關功能。因此，與T細胞、B細胞、炎癥性和 /或先天免疫相關的自身免疫性疾病都可以用公開的T-MSC治療，所述自身免疫性疾病包 括但不限于，斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血 性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內耳病、自身免疫性淋巴增生綜合征（ALPS)、自身免 疫性血小板減少性紫癜（ATP)、白塞氏病、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜瀉-皮炎、慢性疲 勞綜合征性免疫缺陷綜合癥（CFIDS)、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經病、慢性阻塞性肺 疾?。–OPD)、瘢痕性類天皰瘡、冷凝集素病、CREST綜合征、克羅恩病、波德戈里察病、皮肌 炎、青少年型皮肌炎、盤狀紅斑狼瘡、特發(fā)性混合冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、格雷 夫斯病、吉蘭-巴雷綜合征、橋本氏甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜 (ITP)、免疫球蛋白A腎病、胰島素依賴性糖尿?。↖型）、11型糖尿病、幼年型關節(jié)炎、狼瘡、 美尼爾氏病、混合性結締組織病、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結節(jié) 性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體綜合征、風濕性多肌痛、多發(fā)性肌炎和皮肌炎、原發(fā)性丙種球 蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、牛皮癬、雷諾氏現(xiàn)象、瑞特氏綜合癥、風濕熱、類風濕關節(jié) 炎、結節(jié)病、硬皮病、干燥綜合征、僵人綜合癥、多發(fā)性大動脈炎、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、 潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜風、韋格納氏肉芽腫或任何急性或慢性炎癥有關的 燃燒、手術損傷和過敏。
[0354] T-MSC可分化成多種細胞系，包括但不限于脂肪細胞、成肌細胞、神經細胞譜系細 胞、成骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞、間質細胞。這些T-MSC衍生的細胞（T-MSC-DL)可用 于治療多種組織損傷，并且可用于組織工程、組織修復、組織再生、關節(jié)修復、腱愈合、結締 組織愈合、神經宗族組織和細胞修復、脂肪組織愈合、骨愈合、皮膚愈合、其它傷口愈合、肌 肉愈合、愈合軟骨、平滑肌愈合、心肌愈合、上皮組織愈合、韌帶愈合、基質修復等。
[0355] 具體地，T-MSC可以分化成神經細胞譜系細胞，用于治療許多神經疾病，包括但 不限于失寫癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側索硬化癥、失語、失用癥、蛛網膜炎、共濟失調 毛細血管擴張癥、注意力缺陷多動癥、聽覺處理障礙、自閉癥、酒精中毒、阿斯伯格綜合癥、 雙相情感障礙、貝爾氏麻痹、臂叢神經損傷、腦損傷、腦損傷、腦腫瘤、卡納萬病、卡普格拉 綜合癥、灼痛、中樞性疼痛綜合征、腦橋中央髓鞘溶解癥、中央核肌病、頭部失調癥、腦動脈 瘤、腦動脈硬化、腦萎縮、大腦性巨人癥、腦性麻痹、腦血管炎、頸椎椎管狹窄、腓骨肌萎縮 癥、阿齊畸形、舞蹈病、慢性疲勞綜合征、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經?。–IDP)、慢性疼 痛、科勒二氏綜合征、昏迷、復雜區(qū)域疼痛綜合征、壓縮性神經病變、先天性面癱、皮質基底 變性、顱動脈炎、頡縫早閉、克羅伊茨費爾特-雅各布病、累積創(chuàng)傷性疾病、庫欣綜合征、巨 細胞包涵體?。–IBD)、巨細胞病毒感染、丹迪-沃克綜合征、道森病、德Morsier綜合征、 Dejerine-Klumpke麻痹、Dejerine-索塔斯疾病、睡眠時相延遲綜合癥、老年癡呆癥、皮肌 炎、發(fā)育運動障礙、糖尿病神經病變、彌漫性硬化、唐氏綜合癥、德摩西埃綜合征、自律神經 失調、計算障礙、書寫困難、閱讀障礙、肌張力障礙、空蝶鞍綜合征、腦炎、腦膨出、腦三叉神 經血管瘤病、大便失禁、癲癇、歐勃氏麻痹、紅斑性肢痛癥、特發(fā)性震顫、法布里病、法爾氏綜 合征、暈厥、家族性痙攣性癱瘓、高熱驚厥、費雪癥候群、弗里德共濟失調、纖維肌痛、福維爾 氏綜合征、胎兒酒精效應、高歇病、格氏綜合征、巨細胞動脈炎、巨細胞包涵體病、球形細胞 腦白質營養(yǎng)不良、灰質異位、格林-巴利綜合征、HTLV-I相關性脊髓病、哈勒沃登-斯帕茨 疾病、頭部外傷、頭痛、面肌痙攣、遺傳性痙攣性截癱、多神經炎型遺傳性運動失調、耳部帶 狀皰疫、帶狀皰瘆、平山綜合征、前腦無裂畸形、亨廷頓氏病、積水性無腦、腦積水、皮質醇增 多癥、缺氧、免疫介導性腦脊髓炎、包涵體肌炎、色素失禁癥、小兒植烷酸貯積病、小兒雷弗 素姆病、嬰兒痙攣癥、炎癥性肌病、顱內囊腫、顱內壓增高、朱伯特綜合征、卡拉克綜合征、卡 恩斯-塞爾綜合征、甘乃迪病、金斯布林納綜合征、克利佩爾-費爾綜合征、克拉伯病、庫格 爾貝格-韋蘭德病、拉福拉病、蘭伯特-伊頓肌無力綜合征、伴發(fā)癲癇的獲得性失語、延髓外 側（沃倫貝格）綜合癥、學習障礙、利氏病、倫-加斯托二氏綜合征、自毀容貌綜合征、腦白 質營養(yǎng)不良、路易體癡呆、無腦回畸形、閉鎖綜合征、盧伽雷氏癥（見肌萎縮側索硬化癥）、 腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥、萊姆病-神經系統(tǒng)后遺癥、馬查多-約瑟夫?。?型脊髓小 腦性共濟失調）、巨腦、視物顯大癥、巨腦、梅-羅綜合征、美尼爾氏病、腦膜炎、門克斯病、異 腦白質營養(yǎng)不良、小頭畸形、視物顯小癥、偏頭痛、米勒費雪癥候群、小中風（短暫性腦缺血 發(fā)作）、恐音癥、線粒體腦肌病、莫比斯綜合癥、單肢肌萎縮、運動神經元病、運動技能障礙、 煙霧病、粘多糖貯積病、多發(fā)性腦梗塞性癡呆、多灶性運動神經病、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮 癥、肌肉萎縮癥、肌痛性腦脊髓炎）、重癥肌無力、髓鞘破壞彌漫性硬化癥、嬰兒肌陣攣性腦 病、肌陣攣、肌病、肌小管性肌病、先天性肌強直、嗜眠發(fā)作、神經纖維瘤病、惡性精神抑制藥 綜合征、AIDS的神經表現(xiàn)、狼瘡的神經后遺癥、神經性肌強直、神經元蠟樣質脂褐質沉積癥、 神經元移位異常、尼曼-皮克病、非24小時睡眠-覺醒綜合征、非言語型學習障礙、奧沙利 文-麥克勞德綜合征、枕神經痛、隱性脊柱神經管閉合不全序列征、大田原綜合征、橄欖體 腦橋小腦萎縮、眼球斜視疫攣綜合征、視神經炎、直立性低血壓、過度使用綜合、持續(xù)后像、 感覺異常、帕金森氏癥、先天性肌強直病、副腫瘤性疾病、陣發(fā)性發(fā)作、帕-羅二氏綜合征、 佩利措伊斯-梅茨巴赫病、周期性麻痹、周圍神經病、廣泛性發(fā)育障礙、旋光性噴嚏反射、植 烷酸貯積癥、皮克氏病、捏神經、垂體瘤、PMG、多發(fā)性神經病、小兒麻痹癥、多小腦回、多發(fā)性 肌炎、脊髓灰質炎后綜合癥、帶狀皰瘆后遺神經痛（PHN)、體位性低血壓、普拉德-威利綜合 征、原發(fā)性側索硬化、朊病毒疾病、進行性面部偏側萎縮、進行性多灶性腦白質病、進行性核 上性麻痹、假性腦瘤、四肢癱瘓、狂犬病、拉姆齊?亨特綜合征I型、拉姆齊-亨特綜合征II 型、拉姆齊-亨特綜合征III型（見拉姆齊-亨特綜合征）、拉斯姆腦炎、反射神經血管營養(yǎng) 不良、雷弗素姆病、重復性壓力損傷、不寧腿綜合征、逆轉錄病毒相關性脊髓病、雷特氏綜合 癥、瑞氏綜合征、節(jié)律性運動障礙、雷爾氏綜合癥、圣維特斯舞蹈病、桑德霍夫病、希爾德病、 腦裂畸形、感覺統(tǒng)合失調、隔-視神經發(fā)育不良、搖晃嬰兒綜合癥、帶狀皰瘆、夏-德綜合征、 干燥綜合征、睡眠呼吸暫停、睡眠病、飽食（Snatiation)、索托斯綜合征、痙攣、脊柱裂、脊髓 損傷、脊髓腫瘤、脊髓性肌萎縮、脊髓小腦性共濟失調、腦裂、斯蒂爾-理查德森-歐斯祖斯 基病、僵人綜合征、中風、斯特奇-韋伯綜合征、亞急性硬化性全腦炎、皮層下動脈硬化性腦 病、表面鐵質沉著癥、西德納姆舞蹈癥、暈厥、共感覺、脊髓空洞癥、踝管綜合征、遲發(fā)性運動 障礙、遲發(fā)性精神障礙、Tarlov囊腫、泰薩二氏病、顳動脈炎、破傷風、脊髓栓系綜合征、肌強 直性白內障、胸廓出口綜合征、三叉神經痛、托德氏癱瘓、妥瑞癥、中毒性腦病、短暫性腦缺 血發(fā)作、傳染性海綿狀腦病、橫斷性脊髓炎、腦外傷、震顫、三叉神經痛、熱帶痙攣性截癱、錐 蟲病、結節(jié)性硬化、Ubisiosis、單相抑郁、希林二氏?。╒HL)、威流斯科腦脊髓炎（VE)、瓦倫 堡氏綜合征、沃尼克-霍夫曼癥、韋斯特綜合征、揮鞭樣損傷、威廉斯綜合征、威爾遜氏病。
[0356] 5. 17使用T-MSC作為遞送系統(tǒng)
[0357] 因為本發(fā)明的T-MSC已經展示穿過血-腦屏障和血-脊髓屏障獨特的能力，本發(fā) 明的另一個實施方式是一種使用T-MSC穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以遞送藥劑的 方法，該方法的藥劑和T-MSC連接或綴合以形成復合物，并將T-MSC -藥劑復合物施用給受 試者，其中T-MSC穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以遞送藥劑至中樞神經系統(tǒng)。T-MSC 可以是單細胞、細胞培養(yǎng)物、溶液或藥物制劑的形式。藥劑將包括但不限于化學品、藥物、蛋 白質、DNA、RNA、抗體和小分子。
[0358] 本發(fā)明的另一個實施方式是一種穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以遞送藥劑 的遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括藥劑和T-MSC綴合或連接。
[0359] 所述透過血-腦屏障和血-脊髓屏障的能力將可用于治療和預防疾病，包括但不 限于多發(fā)性硬化、癌癥、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、腦膜炎、腦炎、狂犬病、 癲癇、癡呆、萊姆病、中風、肌萎縮性側索硬化、腦和脊髓損傷。因此，有需要其的受試者將患 有或有風險患上涉及血-腦屏障和血-脊髓屏障的疾病。因此，本發(fā)明的另一個實施方式 是一種治療疾病或損傷的方法，所述方法的藥劑綴合或連接至T-MSC以形成復合物，并且 給有需要其的受試者施用T-MSC-藥劑復合物，其中，T-MSC穿過血-腦屏障和/或血-脊 髓屏障并將藥劑遞送至中樞神經系統(tǒng)，所述藥劑用于治療或預防受試者的疾病或損傷。由 于T-MSC具有強大的迀移能力和滲透能力，它也可用作載體以運送抗腫瘤藥物和蛋白以治 療腫瘤/癌癥。所述T-MSC可以是單細胞、細胞培養(yǎng)物、溶液或藥物制劑的形式。藥物包括 但不限于化學品、藥物、蛋白、DNA、RNA、微-RNA、非編碼RNA、抗體、小分子和/納米分子。
[0360] 用于治療和預防疾病的有用藥劑包括但不限于抗生素、抗病毒劑、抗真菌劑、類固 醇、化學治療劑、抗炎劑、細胞因子和/或合成肽。
[0361] 與T-MSC綴合的蛋白質和多肽也將是有用的T-MSC，所述蛋白質和多肽包括促紅 細胞生成素（EPO)、抗β淀粉樣蛋白肽、組織纖溶酶原激活劑（TPA)、粒細胞集落刺激因子 (G-CSF)、干擾素（IFN)、生長因子/激素、抗血管內皮生長因子肽、抗腫瘤壞死因子肽、神經 生長因子、肝細胞生長因子、IL-2、CX3CL1、GCV、CPT-11、胞嘧啶脫氨酶、HSV-TK、羧酸酯酶、 溶瘤病毒、TSP-1、TRAIL、FASL、IL-10以及TGFb。結合于特異的受體并封閉這些受體的蛋 白質和多肽，也將是有用的并且是本發(fā)明計劃連接T-MSCs的。
[0362] 編碼治療蛋白和多肽的DNA和RNA也可與T-MSC綴合形成綴合物，以穿過血-腦 屏障和/或血-脊髓屏障遞送。
[0363] 術語"抗體"包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化或嵌合抗體、單鏈Fv抗體片段、 Fab片段和F (ab'）2片段。多克隆抗體針對抗原內包含的特定抗原表位的異源群抗體，而單 克隆抗體指針對抗原所含特定表位的同質群抗體。單克隆抗體是本發(fā)明中特別有用的。
[0364] 有效地阻止疾病信號通路中分子或受體分子活化、表達和/或作用的任何藥劑可 用于連接或綴合T-MSC，所述疾病指涉及穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障的任何疾病。 這種藥劑包括但不限于化學品、植物化學品、藥物、生物制劑、有機小分子、抗體、核酸、肽類 和蛋白質。
[0365] 也可以使用"誘餌"分子抑制信號通路，該"誘餌"分子模擬靶分子在通路中結合 和激活的區(qū)域。活化的分子會結合代替靶標的誘餌，并且不可能發(fā)生活化。
[0366] 還可以使用"顯性干擾"分子或活化分子（活化分子是縮短了的，缺少激活域）保 留的結合域抑制。這些分子在信號通路中結合受體，但是不能生產的，并且阻止受體結合至 所述活化分子。這種誘餌分子和顯性干擾分子可通過本領域內已知的方法進行制造，并且 通過連接或綴合至T-MSC以穿過血-腦屏障或血-脊髓屏障遞送。
[0367] 穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以遞送藥劑的方法也用于診斷劑，包括但不 限于化學品、抗體、多肽、蛋白、DNA、RNA。這種為了應用于診斷的藥劑必須有被可視化和/ 或定量的方法。這種方法包括但不限于熒光、生物標記、染料、放射性同位素標記和/或納 米顆粒。
[0368] 這樣的遞送方法和遞送系統(tǒng)將有利于診斷神經障礙、多發(fā)性硬化、癌癥、帕金森氏 病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓氏病、腦膜炎、腦炎、狂犬病、癲癇、癡呆、萊姆病、中風、肌萎縮 性脊髓側索硬化癥、以及腦和脊髓損傷。因此，本發(fā)明的另一個實施方式是一種診斷疾病或 損傷的方法，該方法通過將藥劑連接或綴合至T-MSC以形成復合物；并且把T-MSC-藥劑復 合物施用于疑患病的受試者，其中，所述T-MSC穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障并將所 述藥劑遞送至中樞神經系統(tǒng)。所述T-MSC可以是單細胞、細胞培養(yǎng)物、溶液或藥物制劑的形 式。藥劑包括但不限于化學品、藥物、蛋白、DNA、RNA、抗體和小分子。
[0369] 不論什么類型和是否用于治療、預防、診斷的試劑，可通過本領域已知的任何方法 綴合或連接到T-MSC，包括但不限于合成細胞外基質、藻酸-聚-L-賴氨酸膠囊和/或容器。
[0370] 在某些實施方式中，工業(yè)制造的大規(guī)模生產水平被包括在本發(fā)明，這樣的方法是 本領域熟知的。在某些實施方式中，大規(guī)模生產包括使用Hyper-STACK2D培養(yǎng)系統(tǒng)和/或 微載體3D生物反應器。 6.實施例
[0371] 實施例I. T-MSC的衍生
[0372] 材料和方法
[0373] 以下試劑和材料從以下所述廠商獲得：
[0374] 定制的mTeSRl培養(yǎng)基：干細胞技術有限公司
[0375] BMP4 : Stemgent 或其他供應商
[0376] SB431542 :Cayman Chemical 或其他供應商
[0377] A83-01 : Stemgent 或其他供應商
[0378] ALK5抑制劑！Stemgent或其他供應商
[0379] DMEM/F12 :GIBCO美國生命技術公司
[0380] alpha-MEM :GIBCO美國生命技術公司
[0381] 胎牛血清：GIBCO美國生命技術公司或其他供應商
[0382] hESC細胞系CT2來自康涅狄格大學干細胞中心，在已被輻射的小鼠胚胎成纖維細 胞（MEF)作飼養(yǎng)細胞的條件下培養(yǎng)2代，然后所述hESC接種在包被基質膠的培養(yǎng)皿并培養(yǎng) 在mTeSRl培養(yǎng)基中（Ludwig等，2006)(干細胞技術公司，溫哥華，加拿大）。人胚胎干細胞 ESI-017、ESI-05、ESI-053、ESI-049和ESI-35從生物時代公司購買（加利福尼亞州）。
[0383] T-MSC 的衍牛
[0384] 如圖1所示，將在基質膠包被培養(yǎng)皿上匯合度達約80 %的hESCs被lmg/ml分散酶 消化5-10分鐘。然后該細胞經mTESRl培養(yǎng)基清洗1次并以小塊或單細胞接種在包被基質 膠的培養(yǎng)皿并在mTESRl培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時。接著培養(yǎng)基被換成滋養(yǎng)細胞形成培養(yǎng)基， 該培養(yǎng)基包含BMP4 (2-100ng/ml)，或可選A83-01 (0. 1-1 μ M)。在培養(yǎng)48-72小時后，所述 細胞從hESC樣形態(tài)變成滋養(yǎng)細胞形態(tài)，滋養(yǎng)細胞形態(tài)的特征為扁平、細胞尺寸增大、核/胞 質溶膠比例小和彌漫性細胞邊界。所述細胞被Tryp-LE消化并用MSC生長培養(yǎng)基清洗，MSC 生長培養(yǎng)是包含20% FBS和非必需氨基酸的α-MEM。然后該細胞以5000細胞/cm2的密 度接種在包被基質膠的培養(yǎng)皿。24小時后更換培養(yǎng)基，接著每3-4天更換培養(yǎng)基。再過6 天，該細胞分化成紡錘樣細胞，類似典型的MSCs的形態(tài)。第2天滋養(yǎng)細胞的形態(tài)如圖2A所 示。第5天前-T-MSC的形態(tài)如圖2B所示。T-MSC的形態(tài)如圖2C所示。
[0385] HB-MSC 的衍牛
[0386] hESC細胞系CT2分化成EB細胞，然后按以前所述方法富集HB (Lu et等，2008)。 在包被基質膠培養(yǎng)皿上匯合度達50-80 %的hEC細胞用分散酶（lmg/ml，5至10分鐘） 消化，然后使用如下培養(yǎng)基清洗：EB形成基礎培養(yǎng)基或HPGM (Lon z a，Wa I k s V i 11 e，馬里 蘭）或STEMLINE I/II造血干細胞擴增培養(yǎng)基（Sigma，St.Louis，密蘇里）、或StemSpan H3000 (Stem Cell Technologies，溫哥華，加拿大）或含 10% FBS 的頂DM 或含 10% FBS 的 DMEMM/F12。然后細胞培養(yǎng)在EB形成培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補充了 50ng/ml VEGF(P印rotech) 和50ng/ml of BMP4 (Stemgent)。以約2-3百萬細胞/ml的密度在超低培養(yǎng)皿中培養(yǎng)48小 時。48小時后，一半的培養(yǎng)基被更換成添加了 25-50ng/ml bFGF的新鮮EB形成培養(yǎng)基。
[0387] 4天后，收集在培養(yǎng)基中形成的EB細胞并且在37°C使用C rypLE消化2-3分鐘，把 EB細胞分散成單細胞。細胞被清洗并以1-5百萬細胞/ml的密度重懸在EB形成基礎培養(yǎng) 基。所述單細胞懸液以1:10的比例和成血管細胞生長培養(yǎng)基（Stem Cell Technologies， 溫哥華，加拿大）混合。
[0388] 母細胞生長培養(yǎng)基的配制如下：在總量為IOOrnl的無血清的甲基纖維素 CFU培 養(yǎng)基中添加如下，VEGF、ΤΡ0、FLT3-配體至濃度50ng/ml、bFGF至濃度20-50ng/ml、lml EX-CYTE生長增強培養(yǎng)基補充物和Iml Pen/Strap，混合均勻。
[0389] 混合物經渦旋后穿過16G針接種在超低培養(yǎng)皿并在37°C、C02環(huán)境中培養(yǎng)5-9天。
[0390] 單細胞在MSC培養(yǎng)基中重懸，該培養(yǎng)基包括：1)含10-20 % FBS的 a -MEM (Invitrogen)，或 2)含 10-20 % KOSR 的 α -MEM，3)含 10-20 % FBS 的高糖 DMEM，或 4)含10-20% KOSR的高糖DMEM。細胞以100-5000細胞/cm2的密度培養(yǎng)在包被基質膠、明 膠、玻連蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白或膠原I的培養(yǎng)皿。在24小時后更換該培養(yǎng)基并且每 2-4天更新。在6-12天后，所述細胞逐漸分化成紡綞狀細胞，形態(tài)類似典型的MSC。
[0391] 通過使用SB431542衍生MSC
[0392] 這種方法先前已發(fā)表（Chen等，2012)。
[0393] 結果
[0394] 已經發(fā)現(xiàn)，所述產生T-MSC的方法具有高效率、高產量和高純度的特點。如圖1底 部所示，在第10天，T-MSC已經產生>90%純度的MSC并且細胞數(shù)提高了 10倍，而其它方法 要么不產生任何MSC，要么產生的MSCs純度非常低。在第20天，T-MSC已經產生>99 %純 度的MSC并且細胞數(shù)量擴增了 300倍，而其它方法最多僅擴增20倍。在第30天，10萬個 hESC 69 {10143/003371-W00/01055509. 1}產生 500 億個 T-MSC，也就是說，原初的 hESC 擴 增了 500000倍，然而其它方法最多僅擴增3000倍。
[0395] 實施例2. T-MSC的表征
[0396] 進一步采用流式細胞術免疫熒光染色分析從實施例1中獲得的T-MSC。
[0397] 材料和方法
[0398] 使用流式細胞術分析T-MSC的特征。使用含2 %的BSA的PBS清洗和封閉細 胞，并根據(jù)廠商說明書使用抗體對各種細胞表面標記染色，所述標記有Tr〇p-2(Trp-2， eBioscience)、CD31、CD34、CD29、CD73、CD90、CD105、CD44、CD45、CD146、CD166、HLA-ABC HLA-DR、HLA-G(BD Bioscience 或 eBioscience)。在 nFACS LSR II 流式細胞儀中使用 FACSDiva軟件（BD Bioscience)收集數(shù)據(jù)。使用FlowJo軟件（Treestar)分析收集的數(shù) 據(jù)。
[0399] MS
[0400] 第2天獲得的貼壁滋養(yǎng)細胞、第5天的貼壁前-T-MSC和第9天貼壁T-MSC進行 ⑶73和Tro-2染色。所述滋養(yǎng)細胞僅表達高水平的Tro-2 (大于95% )，但表達少于1 %的 CD73 (圖3A);在第5天，所述前-T-MSC有多于50 %的細胞同時表達Trop-2和CD73,40 %的 細胞僅表達CD73 (圖3B);在hESC分化第9天獲得的T-MSC有少于1 %的細胞表達Trop-2 并且99 %的細胞僅表達⑶73 (圖3C)。
[0401] 進一步采用流式細胞術染色分析T-MSC的多個細胞表面標記，結果顯示T-MSC中 〈3%細胞表達Trop-2,〈1 %細胞表達⑶31和⑶34, >99 %細胞表達⑶73, >95 %細胞表達 0)90，>90%細胞表達0)105，>99%細胞表達0)44，>80%細胞表達0)29(圖44-!1)。
[0402] 實施例3. T-MSC在體外比BM-MSC對T細胞功能有更強的抑制能力
[0403] 比較hEs-MSCs和BM-MSCs在體外抑制抗原刺激的T細胞增殖的能力。
[0404] 材料和方法
[0405] BM-MSCs 的培養(yǎng)
[0406] BM-MSCs來源于骨髓單核細胞（BMMNCs)或從AllCells公司（阿拉米達）和 Lonza (巴塞爾，瑞士）獲得BMMNCs。為了衍生，解凍BMMNCs并接種在組織培養(yǎng)用的塑料皿， 培養(yǎng)基為含MEM+20 % FBS。在前4-5天內開始出現(xiàn)粘附細胞，并且每隔2-3天喂養(yǎng)細胞，直 到約10-12天，這時收集細胞并以3000-5000細胞/cm 2重新鋪。
[0407] 使用從小鼠外周淋巴結分離的淋巴細胞進行T細胞增殖的體外試驗。這些淋巴細 胞在37°C溫度下被5 μΜ羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（CFSE)標記10鐘，通過觀測CFSE在子 代細胞的稀釋追蹤細胞增殖。10000T-MSC或BM-MSC和100000淋巴細胞混合在96孔板的 一個孔，并且連接在培養(yǎng)板的抗-⑶3抗體（0. 3,1 μ g/ml)和可溶的抗-⑶28抗體（1 μ g/ ml，eBioscience，加利福尼亞州）刺激該細胞增殖。在刺激后第3天收集該細胞，接著進行 染色抗-⑶4和抗-⑶8抗體（BD Bioscience，加利福尼亞州）的FACS。CFSE稀釋分別作 CD4+和CD8+T細胞的門控。
[0408] 結果
[0409] 通過小鼠淋巴細胞的體外試驗，發(fā)現(xiàn)在抗-⑶3抗體（0. 3和1 μ g/ml)刺激時， T-MSC抑制小鼠⑶4+和⑶8 +T細胞的增殖，然而BM-MSC僅在低劑量（例如0. 3 μ g/ml) 抗-CD3抗體刺激時才具有抑制作用（圖5)
[0410] 實施例4. T-MSCs降低EAE小鼠的疾病評分
[0411] 因為已經證明BM-MSCs能夠減緩多發(fā)性硬化癥小鼠模型一實驗性自身免疫性腦 脊髓炎（EAE)的疾病發(fā)展，將實施例1中獲得的T-MSC注射入EAE小鼠以確定它們是否具 有相同的效果。
[0412] 材料和方法
[0413] 使用SB431542衍生MSC ;來源于這種方法的MSC將被稱為hES-MSC(SB)。這種方 法已經發(fā)表（Chen et等，2012) 〇
[0414] 該EAE小鼠模型的誘導如以前所述（Stromnes和Goverman，2006)。C57BL/6 小鼠皮下由注射髓鞘少突膠質細胞糖蛋白肽35-55 (M0G35%)、弗氏佐劑和百日咳毒素 組成的混合物，以上藥劑包含在EAE誘導試劑盒中（Hooke Laboratories公司，MA， (Cat. #EK-0114))。誘導的操作流程根據(jù)廠商的說明書并且在Ge等（2012)中描述。
[0415] BM-MSC、T-MSC或hES-MSC (SB) /小鼠或PBS (賦形劑對照）通過皮下注射（i. P.)， 其中，在免疫后第6天注射以誘導預發(fā)病模型，在免疫后第18天注射以誘導發(fā)病后模型。每 天監(jiān)測小鼠的疾病評分，直至31天。
[0416] 疾病評分系統(tǒng)如下：
[0417] 0:沒有疾病的跡象
[0418] 1 :完全尾巴癱瘓
[0419] 2 :部分后肢癱瘓
[0420] 3 :完全后肢癱瘓
[0421] 4:前肢體癱瘓；
[0422] 5 :垂死
[0423] (Stromnes 和 Goverman，2006)
[0424] MM.
[0425] 如圖6所示，在注射后6天或預發(fā)病，所述T-MSC顯著地減少每日的疾病評分，展 現(xiàn)出T-MSC的預防效果。注射BM-MSC的小鼠并沒有減少疾病評分，hES-MSC (SB)部分有效 地減少疾病評分，但效果不如T-MSC好。
[0426] 實施例5. T-MSC的多譜系分化
[0427] 材料和方法
[0428] T-MSC的成骨形成、軟骨形成和脂肪形成
[0429] STEMPR0成骨和軟骨分化試劑盒（Invitrogen公司，格蘭德島，NY)用于成骨和軟 骨形成，并且Hyclone公司AdvanceSTEM脂肪分化試劑盒（Thermo Scientific，洛根，猶他 州）用于脂肪分化，根據(jù)制造商的說明進行操作。
[0430]
[0431] 如圖7所示，T-MSC具有良好的潛能分化成中胚層組織的所有3個細胞系：成骨細 胞、軟骨細胞和脂肪細胞。因此，T-MSC可作為細胞源以應用于組織再生、組織工程和組織 修復。
[0432] 實施例 6. T-MSC 不同于 hES-HB-MSC 和 BM-MSC
[0433] 通過微陣列分析比較T-MSC、hES-HB-MSC和BM-MSCs的基因表達模式
[0434] 材料和方法
[0435] 為了進行微陣列分析，根據(jù)制造商說明書操作，用Trizol (Invitrogen，CA)提取 第2-4代hES-MSC或第3代BM-MSC的RNA。使用人HT-12v4表達微珠芯片陣列（Illumina， 圣地亞哥，加利福尼亞）分析所述細胞的基因表達譜。使用Genome Studio V2011.1分析 數(shù)據(jù)。2株來源不同的BM-MSC細胞系被使用，2株來源于H9和MA09的hES-MSC系被使用。
[0436] 結果
[0437] 如圖8所示，3種不同MSCs的一些重要細胞因子、轉錄因子、細胞表面標記的整體 表達譜大不相同。T-MSC可以在免疫抑制和組織再生中起不同的作用。
[0438] 參考文獻
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[0526] 盡管參考優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了描述，但本領域普通技術人員應該理解，可 進行各種變化，并且可用等同物對其要素進行替代，而不超出本發(fā)明的范圍。此外，在不偏 離本發(fā)明的實質范圍和精神的條件下，根據(jù)本發(fā)明的教導，可以作出許多修改以適應特定 用途、應用、制造條件、使用條件、組合物、介質、尺寸和/或材料。因此，本發(fā)明不局限于所 述的特定實施例和如本文所述最佳實施方式。這種修改將落入所附權利要求的范圍內。
[0527] 這里引用的所有參考文獻的全部內容為所有目的并入這里作為參考，如同每個出 版物或專利或專利申請的全部內容被專門地單獨指出為所有目的并入作為參考一樣。
【權利要求】
1. 一種從人胚胎干細胞（hESCs)或誘導多能干細胞（iPSCs)生產滋養(yǎng)層來源的間充質 干細胞（T-MSCs)的方法，所述方法包括： (a) 在包含骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hESCs或iPSCs合適的第一時間段， 足以使hESCs或iPSCs分化成滋養(yǎng)細胞，或連同TGFb抑制劑以提高分化效率； (b) 把滋養(yǎng)細胞分散成單細胞； (c) 將所述滋養(yǎng)細胞重新鋪在包被明膠、玻連蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、基質膠或膠 原的板上；以及 (d) 在間充質干細胞（MSC)生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述滋養(yǎng)細胞合適的第二時間段，其中 所述間充質干細胞生長培養(yǎng)基含LIF、bFGF或TOGF以提高擴增效率。
2. -種從hESCs或iPSCs生產T-MSCs的方法，所述方法包括： (a) 在包含BMP4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hESCs或iPSCs 2-5天以使hESCs或iPSCs分化成滋 養(yǎng)細胞； (b) 分離所述滋養(yǎng)細胞； (c) 從所述分離的滋養(yǎng)層分散滋養(yǎng)細胞； (d) 把所述滋養(yǎng)細胞重新鋪在包被基質膠的培養(yǎng)板上；以及 (e) 在包含血清的MSC生長培養(yǎng)基、KOSR或其它無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述滋養(yǎng)細胞 4-10天，所述培養(yǎng)基的量足夠誘導所述單細胞分化成間充質干細胞；其中至少90%所述間 充質干細胞表達⑶73。
3. 權利要求1所述的方法，其中，所述第一時間段是約1 72天至約4天。
4. 權利要求3所述的方法，其中，所述第一時間段是約2天至約5天。
5. 權利要求1所述的方法，其中，所述第二時間段是約4天至約10天。
6. 權利要求5所述的方法，其中，所述第二時間段是約6天至約8天。
7. 權利要求2所述的方法，其中，所述培養(yǎng)基進一步包含TGF0抑制劑以提高分化效 率。
8. 權利要求7所述的方法，其中，所述TGF 0抑制劑是SB431542、A83-01或ALK5抑制 劑。
9. 權利要求1和2所述的方法，其中，在權利要求1第一步之前，hESCs培養(yǎng)包括以下 步驟： (i) 在基質膠包被的培養(yǎng)板上培養(yǎng)至約80 %匯合度； (ii) 在合適的條件下分散細胞； (iii) 分離；和 (iv) 清洗。
10. 權利要求1所述的方法，其中，所述BMP4是BMP4、BMP2、BMP7、生長和分化因子 5(⑶P5)或其組合。 11?權利要求10所述的方法，其中，所述BMP4的濃度是約lng/ml至約100ng/ml，所述 BMP2的濃度是約100ng/ml至500ng/ml，所述BMP7的濃度是約100ng/ml至約500ng/ml，以 及所述⑶P5的濃度是約10ng/ml至50ng/ml。
12.權利要求1所述的方法，其中，所述BMP是在由hESCs分化成MSCs方面在功能上 和生物學上等同于BMP4的因子或肽，BMP4的衍生物、BMP4制劑、BMP4氨基末端肽段、BMP4 羧基末端肽段或其組合。
13. 權利要求2所述的方法，其中，所述BMP4的濃度是約2ng/ml至約100ng/ml。
14. 權利要求2所述的方法，其中，所述BMP4的濃度是約lng/ml至約10ng/ml。
15. 權利要求8所述的方法，其中，所述A83-01的濃度是約0. 1 y M至約5 y M。
16. 權利要求8所述的方法，其中，所述SB431542的濃度是約1 yM至約20 yM。
17. 權利要求1至16所述的方法，其中，所述產生的T-MSC是CD73 +、CD105+、CD90+，并 且純度至少約90%。
18. 滋養(yǎng)層來源的MSCs (T-MSC)，其通過權利要求1或權利要求2所述的方法生產。
19. 權利要求1或權利要求2所述的方法，其中，hESCs被替換為非人類哺乳動物來源 的胚胎干細胞（ESCs)，并且生產非人類哺乳動物MSCs。
20. 權利要求1或權利要求2所述的方法，其中，hESCs被替換為誘導多能干細胞 (iPSCs)，并且生產iPSC衍生的T-MSCs。
21. 脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞、神經細胞譜系細胞、成肌細胞、基質細胞和成纖維 細胞，其由權利要求18所述的T-MSC產生。
22. 滋養(yǎng)層衍生的MSCs (T-MSCs)細胞群，其由權利要求1所述的方法產生。 23?權利要求22所述的細胞群，其中，所述T-MSCs是CD73 +、CD105+、CD90+。
24. -種治療受試者自身免疫性疾病或病癥的方法，所述方法包括通過合適的給藥途 徑給予合適劑量的權利要求1至17所述的方法生產的T-MSC。
25. -種受試者免疫調節(jié)的方法，所述方法包括通過合適的給藥途徑給予合適劑量的 權利要求1至17和19至20所述的方法生產的T-MSC。
26. -種在組織或器官移植過程中為受試者預防或抑制免疫排斥的方法，所述方法包 括通過合適的給藥途徑給予合適劑量的權利要求1至17和19至20所述的方法生產的 T-MSC。
27. 權利要求22所述的細胞群，其中，所述細胞至少約90%是CD73 +。
28. 權利要求22所述的細胞群，其中，所述細胞至少約95%是CD73 +。
29. 權利要求27和28所述的細胞群，其中，所述細胞是⑶73(>98% )，⑶90 (>95% )， CD105 (>90 % )，CD44 (>95 % )，CD29 (>80 % )。
30. 權利要求27至29所述的細胞群，其中，所述細胞是內皮標記⑶31陰性和造血標記 ⑶34陰性。
31. -種選擇臨床級別滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)以治療自身免疫性疾病 的方法，其中，選擇的T-MSCs具有以下特征：（i)包含>95%的細胞表達組-1標記；（ii)包 含>80 %的細胞表達組-2標記；（iii)包含〈5 %的細胞表達組-3標記；（iv)表達IL-10和 丁6卩0;(￥)包含〈2%的表達11^6、幾-12和了即€[的細胞；（"）包含〈〇.〇〇1%的共表達所 有組-4標記的細胞，其中組-1標記是：⑶73、⑶90、⑶105、⑶146、⑶166和⑶44,組-2標 記是：CD13、CD29、CD54 和 CD49E，組-3 標記是：CD45、CD34、CD31 和 SSEA4,組-4 標記是： 0CT4、NANOG、TRA-1-60 和 SSEA4。
32. 權利要求31所述的方法，其中，所述細胞不表達IL-6、IL-12和TNF a。
33. 權利要求31所述的方法，其中，所述細胞不表達TGF-M、TGF-0 2和IL10。
34. 權利要求31所述的方法，其中，所述細胞不表達MMP2和RAGE。
35. 權利要求31所述的方法，其中，與骨髓間充質干細胞（BM-MSC)的IFNyRl和 IFN y R2表達相比較，所述T-MSC細胞的IFN y R1和IFN y R2表達低。
36. -種生產修飾的T-MSC細胞群的方法，包括修飾間充質干細胞（MSC)以生產修飾的 T-MSCs，所述修飾的T-MSCs具有以下特征：（i)表達IL-10和TGF0 ;并且（ii)包含〈2% 的表達IL-6、IL-12和TNF a的細胞。
37. 權利要求36所述的方法，進一步包括修飾所述MSC以減少IL-6、IL-6受體、IL-12、 TNF a或其組合的表達。
38. 權利要求36所述的方法，進一步包括修飾所述MSC以減少MMP2、RAGE或其組合的 表達。
39. 權利要求36所述的方法，進一步包括通過shRNA和miRNA修飾所述MSC提高 TGF-0 l、TGF-0 2 和 / 或 IL10 的表達。
40. 權利要求36所述的方法，進一步包括修飾所述的MSC減少IFNyRl、IFNyR2、 IFNy或其組合的表達水平。
41. 權利要求1或權利要求2所述的方法，進一步包括輻射所述T-MSC的步驟。
42. 權利要求1或權利要求2所述的方法，其中，所述方法產生1 X 106至5 X 10 1(lT-MSCs 或生產1 X 105人胚胎干細胞或誘導多能干細胞。
43. 權利要求31所述的方法，其中，所述選擇的T-MSCs的特征進一步包括表達⑶73的 特征和低水平表達或不表達IL-6。
44. 權利要求31所述的方法，其中，所述選擇的T-MSCs特征進一步包括以下：在⑶90、 ⑶105、⑶13、⑶29、⑶54、⑶146、⑶166和⑶44中表達至少一種細胞標記；低水平表達或不 表達選自⑶34、⑶31和⑶45的至少一種細胞標記；低水平表達或不表達選自MMP、RAGE、 IFNy Rl、IFNy R2、IL-12、TNFa 和 VCAM1 的至少一種標記。
45. 權利要求43所述的方法，其中，所述選擇的T-MSCs被進一步輻射。
46. 權利要求44所述的方法，其中，所述選擇的T-MSCs被進一步輻射。
47. -種包含權利要求43所述選擇的T-MSCs的細胞培養(yǎng)物。
48. -種包含權利要求44所述選擇的T-MSCs的細胞培養(yǎng)物。
49. 一種包含權利要求45所述選擇的T-MSCs的細胞培養(yǎng)物。
50. -種包含權利要求46所述選擇的T-MSCs的細胞培養(yǎng)物。
51. -種藥物制劑，包含權利要求43所述選擇的T-MSCs和藥學上可接受的載體。
52. -種藥物制劑，包含權利要求44所述選擇的T-MSCs和藥學上可接受的載體。
53. -種藥物制劑，包含權利要求45所述選擇的T-MSCs和藥學上可接受的載體。
54. -種藥物制劑，包含權利要求46所述選擇的T-MSCs和藥學上可接受的載體。
55. -種治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利43所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種所述疾病的癥 狀或扭轉所述疾病。
56. -種預防T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利43所述選擇的T-MSCs以預防所述疾病發(fā)展或最小化所述疾 病的程度或減緩它們的發(fā)展。
57. -種治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利44所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種所述疾病的癥 狀或扭轉所述疾病。
58. -種預防T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利44所述選擇的T-MSCs以預防所述疾病發(fā)展或最小化所述疾 病的程度或減緩它們的發(fā)展。
59. -種治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利45所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種所述疾病的癥 狀或扭轉所述疾病。
60. -種預防T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利45所述選擇的T-MSCs以預防所述疾病發(fā)展或最小化所述疾 病的程度或減緩它們的發(fā)展。
61. -種治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利46所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種所述疾病的癥 狀或扭轉所述疾病。
62. -種預防T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利46所述選擇的T-MSCs以預防所述疾病發(fā)展或最小化所述疾 病的程度或減緩它們的發(fā)展。
63. -種治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利51所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種所述疾病的癥 狀或扭轉所述疾病。
64. -種預防T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利51所述選擇的T-MSCs以預防所述疾病發(fā)展或最小化所述疾 病的程度或減緩它們的發(fā)展。
65. -種治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利52所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種所述疾病的癥 狀或扭轉所述疾病。
66. -種預防T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利52所述選擇的T-MSCs以預防所述疾病發(fā)展或最小化所述疾 病的程度或減緩它們的發(fā)展。
67. -種治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利53所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種所述疾病的癥 狀或扭轉所述疾病。
68. -種預防T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利53所述選擇的T-MSCs以預防所述疾病發(fā)展或最小化所述疾 病的程度或減緩它們的發(fā)展。
69. -種治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利54所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種所述疾病的癥 狀或扭轉所述疾病。
70. -種預防T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方法包括給有 需要其的受試者施用足量權利54所述選擇的T-MSCs以預防所述疾病發(fā)展或最小化所述疾 病的程度或減緩它們的發(fā)展。
71. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 43所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀或扭轉多發(fā)性硬化癥。
72. -種預防多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 43所述選擇的T-MSCs以預防多發(fā)性硬化癥發(fā)展或最小化治療多發(fā)性硬化癥的程度或減緩 它的發(fā)展。
73. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 44所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀或扭轉多發(fā)性硬化癥。
74. -種預防多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 44所述選擇的T-MSCs以預防多發(fā)性硬化癥發(fā)展或最小化治療多發(fā)性硬化癥的程度或減緩 它的發(fā)展。
75. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 45所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀或扭轉多發(fā)性硬化癥。
76. -種預防多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 45所述選擇的T-MSCs以預防多發(fā)性硬化癥發(fā)展或最小化治療多發(fā)性硬化癥的程度或減緩 它的發(fā)展。
77. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 46所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀或扭轉多發(fā)性硬化癥。
78. -種預防多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 46所述選擇的T-MSCs以預防多發(fā)性硬化癥發(fā)展或最小化治療多發(fā)性硬化癥的程度或減緩 它的發(fā)展。
79. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 51所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀或扭轉多發(fā)性硬化癥。
80. -種預防多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 51所述選擇的T-MSCs以預防多發(fā)性硬化癥發(fā)展或最小化治療多發(fā)性硬化癥的程度或減緩 它的發(fā)展。
81. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 52所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀或扭轉多發(fā)性硬化癥。
82. -種預防多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 52所述選擇的T-MSCs以預防多發(fā)性硬化癥發(fā)展或最小化治療多發(fā)性硬化癥的程度或減緩 它的發(fā)展。
83. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 53所述擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀或扭轉多發(fā)性硬化癥。
84. -種預防多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 53所述選擇的T-MSCs以預防多發(fā)性硬化癥發(fā)展或最小化治療多發(fā)性硬化癥的程度或減緩 它的發(fā)展。
85. -種治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 54所述選擇的T-MSCs以改善或減輕至少一種多發(fā)性硬化癥的癥狀或扭轉多發(fā)性硬化癥。
86. -種預防多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用足量權利 54所述的選擇的T-MSCs來預防多發(fā)性硬化癥發(fā)展或最小化治療多發(fā)性硬化癥的程度或減 緩它的發(fā)展。
87. -種穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障遞送藥劑的方法，所述方法包括以下步 驟：連接藥劑至T-MSC以形成T-MSC-藥劑復合物；并且將所述T-MSC-藥劑復合物施用于有 需要其的受試者，其中所述T-MSC能夠穿過血-腦屏障和/或血-脊髓屏障以及所述藥劑 用于有需要其的受試者以治療、預防、阻止或診斷疾病或損傷。
88. 試劑盒，包括權利要求43所述選擇的T-MSCs和載體。
89. 權利要求88所述的試劑盒，包括融化劑、免疫抑制增強劑和抗組胺。
90. 權利要求41所述的方法，其中，所述T-MSCs用y射線輻射。
91. 權利要求41所述的方法，其中，所述T-MSCs用銫-137 Y輻射或用x射線光子輻射 進行輻射。
92. -種治療癌癥或腫瘤的方法，所述方法包括給有需要其的受試者施用有效量權利 要求51所述的藥物組合物。
93. 權利要求92所述的方法，進一步包括施用第二治療劑。
94. 權利要求92所述的方法，其中，所述受試者以前用治療劑治療過。
95. 權利要求92所述的方法，其中，所述選擇的T-MSC被下以方式修飾：遺傳修飾、表 觀遺傳調控、小分子處理、營養(yǎng)物處理、天然化合物或抗體處理。
96. 修飾的滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)，其通過權利要求36的方法生產。
97. -種細胞培養(yǎng)物，包括權利要求96所述修飾的T-MSCs。
98. -種藥物制劑，包括權利要求96所述修飾的T-MSCs的和藥學上可接受的載體。
99. 一種用于預防或治療T細胞、B細胞、炎癥和/或先天免疫相關疾病的方法，所述方 法包括向有需要其的受試者施用有效量的由權利要求36所述方法生產的修飾的T-MSCs。
100. -種用于預防或治療多發(fā)性硬化癥的方法，所述方法包括向有需要其的受試者施 用有效量的由權利要求36所述方法生產的修飾的T-MSCs。
101. -種試劑盒，包括權利要求96所述修飾的T-MSCs和載體。
102. 權利要求101所述的試劑盒，進一步包括融化劑、免疫抑制增強劑和抗組胺。
103. 權利要求96所述修飾的T-MSCs，其中，所述修飾的T-MSCs進一步用y射線輻射。
104. 權利要求103所述修飾的T-MSCs，其中，所述輻射是銫-137 Y射線輻射或x射線 光子福射。
105. 權利要求36所述的方法，其中，所述的T-MSCs被以下方式修飾：shRNA、miRNA、敲 除、敲入、嗎啉代、引誘RNA、DNA甲基化調控、組蛋白甲基化調控、翻譯抑制和/或抗體阻斷， 或它們的組合。
106. 由權利要求36所述方法生產的所述修飾的T-MSCs，其中，所述修飾的T-MSCs的 特征進一步包括表達CD73和低水平表達或不表達IL-6的特征。
107. 由權利要求36所述方法生產的所述修飾的T-MSCs，其中，所述修飾的T-MSCs的 特征進一步包括以下特征：在⑶90、⑶105、⑶13、⑶29、⑶54、⑶146、⑶166和⑶44中至少 表達一種細胞標記；低水平表達或不表達選自⑶34、⑶31和⑶45的至少一種細胞標記；低 水平表達或不表達MMP、RAGE、IFNyRl、IFNyR2、IL-12、TNFa和VCAM1中的至少一種標 記。
108. 由權利要求31所述方法生產的條件培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基、細胞裂解物或其衍生品 的濃縮液。
109. 由權利要求36所述方法生產的條件培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基、細胞裂解物或其衍生品 的濃縮液。
110. 權利要求36所述的方法，其中，所述的MSC是BM-MSC、T-MSC、hES-MSC或成體組 織來源的MSC。
111. 一種共培養(yǎng)權利要求43所述的T-MSCs與骨髓造血干細胞和/臍帶造血干細胞的 方法。
112. 權利要求111所述的方法，其中，所述的T-MSCs表達Stro-3。
113. 權利要求111所述的方法，其中，所述的T-MSCs表達Stro-1。
114. 權利要求111所述的方法，其中，所述的T-MSCs表達Nestin。
115. 權利要求111所述的方法，其中，所述的T-MSCs是間充質基質細胞。
116. -種權利要求43所述的T-MSCs和骨髓造血干細胞的共培養(yǎng)物。
117. -種權利要求43所述的T-MSCs和臍帶造血干細胞的共培養(yǎng)物。
118. -種權利要求43所述的hES-MSC和外周血造血干細胞的共培養(yǎng)物。
119. 權利要求31所述的方法，其中，所述選擇的T-MSCs的特征由以下確定：流式細胞 術、多重微陣列、RT_PCT、RNA印跡或蛋白質印跡。
120. 權利要求36所述的方法，其中，所述的T-MSCs的特征由以下確定：流式細胞術、 多重微陣列、RT_PCT、RNA印跡或蛋白質印跡。
121. -種應用滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)進行組織再生的方法，所述方 法包括給有需要其的受試者施用有效量的權利要求43-46和權利要求51-54所述選擇的 T-MSCs以促進組織再生，包括但不限于關節(jié)再生、腱再生、結締組織再生、神經譜系細胞再 生、脂肪組織再生、骨再生、皮膚再生、肌肉再生、軟骨再生、平滑肌再生、心肌再生、上皮組 織再生和/或韌帶再生。
122. -種應用滋養(yǎng)層衍生的間充質干細胞（T-MSCs)進行組織修復的方法，所述方 法包括給有需要其的受試者施用有效量的權利要求43-46和權利要求51-54所述選擇的 T-MSCs以促進愈合，包括但不限于關節(jié)愈合、腱愈合、結締組織愈合、神經譜系細胞愈合、 脂肪組織愈合、骨愈合、皮膚愈合、其它傷口愈合、肌肉愈合、軟骨愈合、心肌愈合、平滑肌愈 合，上皮組織愈合，和/或韌帶愈合。
123. -種利用滋養(yǎng)層衍生的間充質干細胞（T-MSCs)進行急性組織損傷治療的方法， 所述方法包括給有需要其的受試者施用有效量的權利要求43-46和權利要求51-54所述選 擇的T-MSCs以治療多種急性損傷，包括但不限于脊髓損傷、急性心臟梗塞、急性輻射綜合 征、急性燒傷、急性骨折、急性軟組織損傷和/或急性器官損傷。
124. -種生產滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的細胞系的方法，所述細胞 系在下文稱為T-MSC-DL，所述方法包括： (a) 將所述的T-MSCs鋪到明膠、玻連蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、基質膠或膠原包被 的板上，濃度為1父103細胞/〇112至1\104(^118/〇11 2;和 (b) 在無血清培養(yǎng)基或含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)T-MSCs以生產T-MSC-DL，所述含血清的 培養(yǎng)基包含牛血清FBS或人AB血清ABHS。
125. -種生產滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的細胞系的方法，所述細胞 系在下文稱為T-MSC-DL，所述方法包括：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述的T-MSC -段合適的時間以 生產T-MSC-DL，所述培養(yǎng)基包括l-50ng/ml，優(yōu)選10ng/ml，成纖維細胞生長因子2 (FGF-2); l_50ng/ml，優(yōu)選10ng/m，表皮生長因子；和0? 5_5ng/ml，優(yōu)選lng/ml，血小板源生長因子 (PDGF)〇
126. -種生產滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的多巴胺能神經元表型細胞 系的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述T-MSCs -段合適的時間以使T-MSCs朝神經命運分化，所述 的培養(yǎng)基包括l_50ng/ml，優(yōu)選10ng/ml，成纖維細胞生長因子2(FGF-2) ;l-50ng/ml，優(yōu)選 10ng/m，表皮生長因子； (b) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟（a)的T-MSCs以引發(fā)中腦特化，所述培養(yǎng)基包含10-200ng/ ml，優(yōu)選 100ng/ml，音猬因子（SHH) ;l-50ng/ml，優(yōu)選 10ng/ml，F(xiàn)GF-8(人）；和 50-500 yM， 優(yōu)選 200 y M，APP ; (c) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟（b)的T-MSCs以誘導T-MSCs向多巴胺能神經元表型細胞系 分化和成熟，所述培養(yǎng)基包含5-500ng/ml，優(yōu)選50ng/ml，膠質衍生神經營養(yǎng)因子（⑶NF)和 50-500 y M，優(yōu)選 200 y M，APP。
127. -種生產由滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的成骨表型細胞系的 方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述T-MSCs -段合適的時間以誘導T-MSCs向成骨 細胞分化，所用培養(yǎng)基包含低葡萄糖DMEM，添加10% FCS ;l-150yM，優(yōu)選80yM，抗壞血 酸-2-磷酸鹽；0. 5-5 y M，優(yōu)選1 y M，地塞米松；和l-100mM，優(yōu)選20mM，0 -甘油磷酸鹽。
128. -種生產由滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的脂肪形成表型細胞系 的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述T-MSCs -段合適的時間以誘導T-MSCs向脂 肪形成細胞分化，所用培養(yǎng)基包含低葡萄糖DMEM，添加20% FCS ;l-10yg/ml，優(yōu)選5yg/ ml，胰島素；0. 5-10yM，優(yōu)選2yM，地塞米松；0. 1-lmM，優(yōu)選0. 5mM，異丁基甲基黃嘌呤；和 1-100 y M，優(yōu)選60 y M，吲哚美辛。
129. -種生產由滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的軟骨形成表型細胞系 的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中以小球形式培養(yǎng)所述T-MSCs -段合適的時間以誘導 T-MSCs向軟骨形成細胞分化，所述培養(yǎng)基包含高葡萄糖糖DMEM，添加0. 5-10mM，優(yōu)選ImM， 丙酮酸鈉；〇. 5-lmM，優(yōu)選0. ImM，抗壞血酸-2-磷酸鹽；0. 05-1 y M，優(yōu)選0. 1 y M，地塞米松； 0? 2-2%，優(yōu)選 1%，ITS ;和 l-50ng/ml，優(yōu)選 10ng/ml，TGF-0 3。
130. -種生產由滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的肌原性表型細胞系的方 法，所述方法包括以下步驟： (a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述T-MSCs -段合適的時間，所述的培養(yǎng)基包括低葡萄糖DMEM， 添加 10% FBS ;l-20yM，優(yōu)選 10yM，5-氮雜胞苷；和 l-50ng/ml，優(yōu)選 10ng/ml，堿性 FGF， 24小時； (d) 用包括DMEM加10% FBS ;l-50ng/ml，優(yōu)選10ng/ml，堿性FGF的培養(yǎng)基更換步驟 (a)的培養(yǎng)基，以誘導T-MSCs肌原性分化。
131. -種生產由滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的成纖維細胞表型細胞系 的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述T-MSCs -段合適的時間以誘導T-MSCs成纖維 細胞分化，所述培養(yǎng)基包括DMEM加10% FBS ;50-200ng/ml，優(yōu)選100ng/ml，結締組織生長 因子（CTGF);和1-100 y g/ml，優(yōu)選50 y g/ml，抗壞血酸。
132. -種生產由滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的細胞系的方法，所述細 胞系在下文稱為T-MSC-DL，所述方法包括以下步驟： (a) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述T-MSCs -段合適的時間，所述培養(yǎng)基包含神經基礎培養(yǎng)基， 添加了 0.25x B-27補充物；10-200ng/ml，優(yōu)選 100ng/ml，音猬因子（SHH) ;l-50ng/ml，優(yōu)選 10ng/ml，F(xiàn)GF-8(小鼠），和 l-200ng/ml，優(yōu)選 50ng/ml，F(xiàn)GF-2 ;和 (b) 在步驟（a)培養(yǎng)6至12天后收獲所述T-MSC-DL。
133. -種生產由滋養(yǎng)層來源的間充質干細胞（T-MSCs)分化的細胞系的方法，所述細 胞系在下文稱為T-MSC-DL，所述方法包括以下步驟： (a) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述T-MSCs 48-72小時，所述培養(yǎng)基包括無血清培養(yǎng)基加2mM谷 氨酰胺；l-20U/ml，優(yōu)選12. 5U/ml，制霉菌素；N2補充物；2-50ng/ml，優(yōu)選20ng/ml，成纖維 細胞生長因子 2(FGF-2) ;l-50ng/mL，優(yōu)選 10ng/ml，EGF ;和 (b) 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟（a)所述T-MSCs以生產T-MSC-DL，所述培養(yǎng)基包含神經基礎 培養(yǎng)基，添加 B27補充物；0. 優(yōu)選ImM，雙丁酰環(huán)化AMP (dbcAMP) ;3_異丁基-1-甲 基黃嘌呤（IBMX) ;10-500 yM，優(yōu)選 200 yM，抗壞血酸；l-100ng/ml，優(yōu)選 50ng/ml，BDNF ; l-50ng/ml，優(yōu)選10ng/ml，膠質衍生神經營養(yǎng)因子（⑶NF) ;0? 2-10ng/ml，優(yōu)選2ng/ml，轉化 生長因子0 3(TGF-0 3)和0? 05-5Mm，優(yōu)選〇? 1 yM，全反式維甲酸（RA)。
【文檔編號】C12N5/074GK104487568SQ201380036985
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權日:2012年7月11日
【發(fā)明者】王小方, 徐仁和 申請人:愛姆斯坦生物技術公司