專利名稱：：編碼青霉素酰化酶的dna序列，攜帶該序列的新型重組dna結(jié)構(gòu)及重組微生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種編碼青霉素?；傅腄NA序列，攜帶該序列的新型重組DNA結(jié)構(gòu)及重組微生物。
背景技術(shù)：
：青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11，青霉素酰胺水解酶)是由細(xì)菌、放線菌、真菌和酵母產(chǎn)生的。這些重要的工業(yè)酶根據(jù)其底物特異性可以分為三種青霉素G?；?PGA)，青霉素V酰化酶(PVA)和a-氨基酸水解酶(AEH，也稱氨芐青霉素?；?。PGA類酶具有廣泛的底物特異性，能催化青霉素和頭孢菌素的氨鍵水解。PGA的細(xì)菌產(chǎn)物屬于下述類別中的一種氣單胞菌，無(wú)色桿菌，產(chǎn)堿菌，節(jié)桿菌，芽孢桿菌，棒狀桿菌，大腸桿菌，歐文氏菌，黃桿菌，克呂沃爾菌，微球菌，諾卡氏菌，變形桿菌，普羅威登斯菌，假單胞菌，八疊球菌，黃單胞菌，木質(zhì)部小菌屬(ProcessBiochem.24:146—154，1989，ProcessBiochem.27:131—143,1992，Biotechnol.Adv.18:289-301，2000)除了由變異獲得的能表達(dá)PGA的高產(chǎn)菌株之外，還可以從大腸桿菌(CS244343和CS246957)，產(chǎn)堿菌屬或糞產(chǎn)堿菌屬(CurrentMicrobiology39:2444-2448,1999;EP638649，Appl.Environ.Microbiol.63:3412-3418:1997)，粘節(jié)桿菌Appl.Environ.Microbiol.54:2603-2607，1988a55:1351-1356，1989;Gene143:79-83,1994)，巨大芽孢桿菌(J.Bacteriol.93:302-306，1967，Appl.Microbiol.Biotechnol.25:372-378，1987;US3145395;ProcessBiochemistry29:263-270,1994)，嗜檸檬酸克呂沃爾氏菌(Agric.Biol.Chem.39:1225-1232，1975;Gene49:69-80，Biotechnol.Letters14:285-290，1992)，雷氏普羅威登斯菌(ActaBiochim.Polonica28:275-284，1981;J.Bacteriol.168:431-433,1986;DNAsequences3:195-200，1992)也可以產(chǎn)生具有重組質(zhì)粒的重組微生物，其中重組質(zhì)粒中含有可以編碼PGA的結(jié)構(gòu)基因。大多數(shù)產(chǎn)PGA的原核生物為革蘭氏陰性菌，而酶是在細(xì)胞的外周胞質(zhì)中。在巨大芽孢桿菌的培養(yǎng)中，酶是從細(xì)胞中分泌到培養(yǎng)基中。青霉素G?；冈诠I(yè)上主要用于水解頭孢菌素的苯乙酰衍生物，而青霉素G用于生產(chǎn)中間產(chǎn)物6-APA和7-ADCA?，F(xiàn)在，合成反應(yīng)中也會(huì)用到這些酶，在上述中間產(chǎn)物的?；杏脕?lái)生產(chǎn)半合成抗生素(e.g.，US5753458andUS5801Oil;WO98/04732;WO97/04086;EnzymeMicrob.Technol.25:336—343，1999;SynthesisofP-lactamantibiotics:Chemistry,BiocatalysisandProcessIntegration,Ed.:A.Bruggink,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht/Boston/London,2001)。酶是穩(wěn)定地固定或封閉形成一種酶催化劑從而使PGA可以在酶催化反應(yīng)中反復(fù)、長(zhǎng)期的使用。這樣，酶就能并在反應(yīng)條件下顯現(xiàn)較高的pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的半衰期。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種長(zhǎng)度為2646bp的核苷酸序列，該核苷酸序列與圖5所示的核苷酸序列至少有95%相同。本發(fā)明的另一個(gè)目的是進(jìn)一步提供本發(fā)明的核苷酸序列的片斷，至少由150個(gè)核苷酸組成的該序列片斷用于編碼青霉素?；?。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種含有本發(fā)明的核苷酸序列或核苷酸序列片斷的核酸結(jié)構(gòu)，它至少具有一個(gè)調(diào)控序列，用于調(diào)控基因表達(dá)和多肽的產(chǎn)生，所述的多肽具有青霉素?；富钚?。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組質(zhì)粒，它含有本發(fā)明的核苷酸序列或核苷酸序列片斷。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種重組表達(dá)載體，它含有本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)譯啟動(dòng)信號(hào)和轉(zhuǎn)譯轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明的核酸結(jié)構(gòu)。在該宿主細(xì)胞中，本發(fā)明的重組表達(dá)載休攜帶了該核酸結(jié)構(gòu)或該核酸結(jié)構(gòu)被插入到該細(xì)胞基因組中。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供重組質(zhì)粒pKXIPl，pKLP3和沐LP6，它們是從無(wú)色桿菌屬菌種中分離出來(lái)的，并插入了本發(fā)明的核苷酸序列，其限制性內(nèi)切酶圖譜如圖1和圖2所示。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種大腸桿菌菌種BL21,它含有由質(zhì)粒pKXIPl，pKLP3和pKLP6攜帶的本發(fā)明的序列。本發(fā)明的基礎(chǔ)是長(zhǎng)度為2646bp的核苷酸序列，該核苷酸序列與圖5所示的核苷酸序列相同，然后長(zhǎng)度至少為150個(gè)堿基的含有該序列的片斷用于編碼青霉素酰化酶。所述的序列可以成為DNA結(jié)構(gòu)，重組質(zhì)粒和載體的一部分。所述的序列可以通過(guò)合適的載體被插入到一個(gè)細(xì)菌或酵母宿主的基因組中，這樣該細(xì)菌或酵母宿主就可以產(chǎn)生青霉素?；噶?。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是含有重組質(zhì)粒PKX1P1的大腸桿菌菌種BL21(pKXlPl)(CCM7394)，它是基于最新分離出的，具有青霉素酰化酶活性的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列制備的。所述的質(zhì)粒特征是將長(zhǎng)度為2646bp的DNA片斷(含有SD序列的區(qū)域)插入到質(zhì)粒載體pK19(R.D.Pridmore，Gene56:309-312，1987)中，其限制性內(nèi)切酶圖譜如圖1所示。制備該重組微生物包括將染色體DNA從無(wú)色桿菌屬菌種CCM4824(古生睪酮叢毛單胞菌子CCM4824;Plhackovaetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.62:507-516，2003)中分離出來(lái)，然后制備攜帶了一個(gè)5.lkb長(zhǎng)的染色體DNA片斷的重組微生物大腸桿菌T0P10(pKLP3)。用質(zhì)粒pKLP3的DNA，通過(guò)PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))獲得結(jié)構(gòu)基因/^a的核苷酸序列。根據(jù)已測(cè)定的基因NT序列，提出了可以測(cè)定基因完整核苷酸序列的DNA引物(表1)，引物包括具有通過(guò)了相同的PCR-測(cè)序技術(shù)的SD序列的調(diào)控區(qū)。在完整核苷酸序列的基礎(chǔ)上，提出了用于青霉素?；钢姓麄€(gè)結(jié)構(gòu)基因的PCR擴(kuò)增引物(PCR;W.Rychlik:MethodsinMolecularBiology15，3卜39，1993)。以無(wú)色桿菌屬菌種CCM4824的染色體DNA為模板。分離獲得的PCR產(chǎn)物并插入到多拷貝質(zhì)粒pK19(R.D.Pridmore，Gene:309-312,1987)中，獲得的重組質(zhì)粒用于宿主菌株大腸桿菌T0P10(Invitrogen，USA.)的轉(zhuǎn)化。H.Hanahan，J.Mol.Biol.166:557-580,1983中公開(kāi)了使用一組重組質(zhì)粒制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化宿主菌種。使用堿裂解法(HC.BirnboimaJ.Doly:MethodsinEnzymology100,243-254，1983)可以將重組質(zhì)粒從生長(zhǎng)后的菌落中分離出來(lái)，并確定插入片斷的大小和位置。在所選擇的宿主T0P10的重組克隆中，采用LB培養(yǎng)基分批培養(yǎng)來(lái)測(cè)試青霉素酰化酶的酶活。將從菌種中分離出來(lái)的，具有最高的PGA整個(gè)活性的重組質(zhì)粒被命名為pKXIPl。這種質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中可以基本表達(dá)p狩基因。宿主菌種BL21隨后被該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。在一個(gè)攪拌式生物反應(yīng)罐中培養(yǎng)已獲得的攜帶有質(zhì)粒PKXIP1，并產(chǎn)生青霉素?；傅闹亟M菌種大腸桿菌。最優(yōu)選的過(guò)程是在礦物培養(yǎng)基M9中培養(yǎng)菌種，其中培養(yǎng)基中加入了酪蛋白水解產(chǎn)物和甘油作為碳源及能量來(lái)源。補(bǔ)料分批培養(yǎng)的溫度為20-30'C，而pH值保持在5.5-7.5之間，培養(yǎng)基中的氧溶解濃度為10-40%。圖1是重組質(zhì)粒PKXIP1的限制性內(nèi)切酶圖譜。圖2是質(zhì)粒pKAG&i/401，pKLP3andpKLP6。圖3是攪拌式生物反應(yīng)罐中菌種BL21(pKXIPl)分批培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)光密度(0D600)變化和細(xì)胞(干燥)干重的變化。圖4是攪拌式生物反應(yīng)罐中菌種BL21(pKXlPl)分批培養(yǎng)時(shí)，總活性(TA)和特異性活性(SA)的變化。圖5是結(jié)構(gòu)基因P^9及其相鄰區(qū)域的核苷酸序列。例1Asp.的培養(yǎng)及染色體DNA的分離將從土壤中分離出來(lái)的無(wú)色桿菌屬CCM4824(Skrobetal.，EnzymeMicrobiol.Technol.32:738-744，2003;Plhackovaetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.62:507-516，2003)培養(yǎng)在50ml的LB培養(yǎng)基(其中，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl5g/l;pH7.2-7。5)中，37。C下震蕩(200rpm)12-16小時(shí)。用離心法將2ml培養(yǎng)基中的生物量從培養(yǎng)基中分離出來(lái)，再用鹽水洗滌，-2(TC下儲(chǔ)存。使用商用組GENOMIOTIP100/G(Qiagen，Switzerland)和適宜的緩沖液套裝GENOMICBUFFERSET(Qiagen)將染色體DNA從解凍后的生物量中分離出來(lái)。例2重組DNA技術(shù)所有限制性內(nèi)切酶(Fermentas，Lithuania)裂解DNA的方法，加入了TBE緩沖液的1.09&瓊脂糖凝膠(USB，U.S.A.)中對(duì)DNA分子的分析，T4DNA連接酶的連接都是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案(J.Sambrook，1989)進(jìn)行的。PCR反應(yīng)和DNA測(cè)序中使用的引物(表1)由MWG-BiotechAG(Germany)和Metabion(Germany)聯(lián)合組成。使用熱循環(huán)儀PTC-200(MJ-Research,Inc.,U.S.A.)進(jìn)行PCR反應(yīng)，所有反應(yīng)都在GC-RICH溶液(ROCHE,Switzerland)中，加入了AraSuperYieldDNA聚合酶進(jìn)行的。加入了TBE緩沖液的1.0%瓊脂糖凝膠中測(cè)定PCR技術(shù)中產(chǎn)物的大小，其中抗菌素入被限制性核酸內(nèi)切酶裂解的DNA作為分子重量標(biāo)準(zhǔn)。按照其使用說(shuō)明使用QIAEXIIGelExtractionKit(Qiagen,Germany)將需要進(jìn)一步克隆或測(cè)序的PCR特異性產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中分離出來(lái)。按照其使用說(shuō)明使用HighPurePCRProductPurificationKit(ROCHE,Switzerland)，純化單一的DNA片斷。根據(jù)J.Hanahan，Mol.Biol.166:557-580，1983制備感受態(tài)細(xì)胞并轉(zhuǎn)化宿主菌種，其中感受態(tài)細(xì)胞被攜帶了預(yù)定PCR片斷的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，然后在37t:下，添加了卡那霉素抗生素(Km，50"g/ml)的固體培養(yǎng)基Luria-Bertani(LB，其中，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl5g/1;pH7.2-7.5)中培養(yǎng)16h，然后加入到50ml添加了Km的液體LB培養(yǎng)基中置于震蕩搖床Gallenkamp上(200rpm)培養(yǎng)。接著根據(jù)使用說(shuō)明使用QiagenPlasraidMidiKit(Qiagen,Germany)禾口HighPurePlasmidIsolationKit(ROCHE,Switzerland)分離重組質(zhì)粒，以便后面的分析。所有的NTDNA序列的測(cè)定都是根據(jù)微生物ASCR研究自動(dòng)地于3100DNA序列(Perkin-Elmer,U.S.A.)之上的。用軟件Lasergene(DNASTARInc.，U.S.A.)分析獲得的序列。使用軟件BLAST(NationalCenterforBiotechnologyInformation,U.S.A.;S.F.Altschuletal:NucleicAcidsRes.25:3389-3402，1997)檢測(cè)NT序列的同源性。表lDNA引物及它們?cè)趐ga基因中的位置<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>例3pga基因核苷酸序列的測(cè)定及表達(dá)系統(tǒng)的制備無(wú)色桿菌屬菌種CCM4824的染色體DNA被酶5"a"3Al部分裂解。這些DNA片斷被與載體pK19的^/m-線性化質(zhì)粒DNA連接(RD.Pridmore:Gene56,309-312，1987)。所得到的結(jié)構(gòu)隨后被用于轉(zhuǎn)化宿主菌種大腸桿菌TOPIO。從顯現(xiàn)為青霉素酰化酶顯型(PGA+)的大腸桿菌重組菌種中分離出來(lái)的質(zhì)粒pKAG&"401(圖2)被P"I所限制。5.lkb的最大PWI片斷，隨后被克隆入P"I-線性化載體pK19，形成具有相反的P"I-插入方向的pKLP3和pKLP6(圖2)2種結(jié)構(gòu)。重組菌種大腸桿菌T0P10(pKLP3)和大腸桿菌TOP10(pKLP6)均具有顯型PGA+。被分離的引物PKLP3和pKLP6作為模板用于獲得/^s基因的完整核苷酸序列，其中引物包括常用的M13/pUC序列弓I物及隨后衍生的p辟嚴(yán)格特異性引物(引物列表-見(jiàn)表1)。該結(jié)構(gòu)基因P《s的核苷酸序列具有2592個(gè)核苷酸(包括三聯(lián)體終止子TAA)，并與相關(guān)微生物木糖氧化物色桿菌木糖氧化亞種(GenBankAF490005)的核苷酸63-2592有92%的相同性。因此基于所獲得的具有調(diào)控區(qū)的/^s基因核苷酸序列，以無(wú)色桿菌屬菌種CCM4824的染色體DNA為模板，用引物對(duì)/^a結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)中使用的引物UPACYLJ力al和REVACYL尸Wl均在相鄰區(qū)域到;^a結(jié)構(gòu)基因間插入了限制性位點(diǎn)ibal，resp.Atl(表l)，該反應(yīng)包括以下步驟1)94。C下5分鐘；2)94。C下變性45秒，30個(gè)循環(huán)，60。C下結(jié)合引物45秒，72"C下聚合3分鐘；3)72匸下10分鐘，完成聚合。這樣就制成了2663bp長(zhǎng)的特異性PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物攜帶了具有上述SD序列調(diào)控區(qū)的整個(gè)結(jié)構(gòu)基因；ga。這個(gè)pga特異性PCR產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶ibal(耙序列在UPACYLJfoal引物上)裂解，隨后連接到載體pK19上，再被北al和6ksl兩種多聚接頭酶裂解。所獲得的重組結(jié)構(gòu)即為pKXIPl質(zhì)粒(圖1)。對(duì)該質(zhì)粒的DNA序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在PCR產(chǎn)物的插入中，沒(méi)有發(fā)生插入缺失突變，但是與原來(lái)預(yù)計(jì)的核苷酸序列相比，發(fā)現(xiàn)在結(jié)構(gòu)基因/^a的第99個(gè)核苷酸上的C-T有突變。然而，這種突變是隱性的，因?yàn)樗⒉桓淖內(nèi)?lián)體編碼的氨基酸類型。使用所分離出來(lái)的重組質(zhì)粒沐LP6和pKXIPl及原核表達(dá)系統(tǒng)BL21(pKXlPl)轉(zhuǎn)化原養(yǎng)型宿主菌種大腸桿菌BL21(Invitrogen公司，美國(guó))，從而制備PGA。例4/^a在大腸桿菌中的表達(dá)制備用于培養(yǎng)大腸桿菌BL21(pKXIPl)菌種的接種體將-7(TC下，甘油保藏的菌種(按照J(rèn).Sambrook，1989的向生長(zhǎng)后的培養(yǎng)物中混入甘油)接種至50ml，加入了卡那霉素(Km，50"g/ml)的LB培養(yǎng)基中。該接種體在28-C下，搖床Gallenkamp震蕩(200rpm)培養(yǎng)16小時(shí)。生物反應(yīng)罐中的發(fā)酵在攪拌式生物反應(yīng)罐BiostatMD(B.BraunBiotechIntl.,Melsungen,Germany)中，使用添加了甘油(5-25g/l)和酪蛋白的水解產(chǎn)物(5-25g/l)作為碳源和能量來(lái)源的培養(yǎng)基M9(表2)，嚴(yán)格控制條件培養(yǎng)菌種BL21(pKXIPl):工作體積8.21，空氣流入速度8-91/分鐘，初始攪拌速率200-300rpm，溫度控制在20-28°C。培養(yǎng)基的pH控制在7.5-5.5之間，將攪拌速率控制在200-840rpm之間，使氧溶解濃度(p02)自動(dòng)地保持在5-30%的培養(yǎng)基最大氧飽和度。分批補(bǔ)料培養(yǎng)20-25小時(shí)(圖3和4)。最后測(cè)定下述參數(shù)青霉素酶的生物量濃度(細(xì)胞干重，cdw)，總活性(TA)和特異性活性(SA)。測(cè)定的參數(shù)如下生物量濃度培養(yǎng)基的28gcdw/1總活性培養(yǎng)基的18000U/1特異性活性670U/gcdw酶活性的測(cè)定從實(shí)例的培養(yǎng)產(chǎn)物中取l-2ml體積的培養(yǎng)物來(lái)測(cè)定PGA酶活性。離心過(guò)濾分離生物量，然后用1-2ml蒸餾水洗滌，再進(jìn)行離心過(guò)濾，-2(TC下儲(chǔ)存。解凍后的生物量懸浮在0.005M磷酸鹽緩沖液中(pH8.0)。37-C下，以青霉素G作為酶作用物，用滴定法測(cè)定PGA的活性。表2培養(yǎng)基M9的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>工業(yè)應(yīng)用含有本發(fā)明的核苷酸序列的微生物重組菌種可以用于制備各種應(yīng)用在化學(xué)及制藥工業(yè)領(lǐng)域的青霉素?；?。權(quán)利要求1.一種長(zhǎng)度為2646bp的核苷酸序列，其特征在于該核苷酸序列與圖5所示的核苷酸序列至少有95％相同。2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列的片斷，其特征在于至少由150個(gè)核苷酸組成的該序列片斷用于編碼青霉素酰化酶。3.—種含有如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列或如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列片斷的核酸結(jié)構(gòu)，其特征在于它至少具有一個(gè)調(diào)控序列，用于調(diào)控基因表達(dá)和多肽的產(chǎn)生，所述的多肽具有青霉素?；富钚?。4.一種重組質(zhì)粒，其特征在于它含有如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列或如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列片斷。5.—種重組表達(dá)載體，其特征在于它含有如權(quán)利要求3所述的結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子、'轉(zhuǎn)譯啟動(dòng)信號(hào)和轉(zhuǎn)譯轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。6.—種宿主細(xì)胞，其特征在于它含有如權(quán)利要求3所述的核酸結(jié)構(gòu)。7.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于如權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體攜帶了該宿主細(xì)胞中的核酸結(jié)構(gòu)。8.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于細(xì)胞基因組中含有所述的核酸結(jié)構(gòu)。9.重組質(zhì)粒pKXIPl，pKLP3和pKLP6，其特征在于它們是從無(wú)色桿菌屬菌種中分離出來(lái)的，并插入了如權(quán)利要求l所述的核苷酸序列，其限制性內(nèi)切酶圖譜如圖l和圖2所示。10.—種大腸桿菌菌種BL21，其特征在于含有由如權(quán)利要求9所述的質(zhì)粒pKXIPl，pKLP3和pKLP6攜帶的如權(quán)利要求1所述的序列。全文摘要本發(fā)明包括一種長(zhǎng)度為2646bp的核苷酸序列，其中從無(wú)色桿菌屬CCM4824(古生睪酮叢毛單胞菌子CCM4824)中得到的該核苷酸序列具有編碼青霉素?；傅暮塑账嵝蛄械奶卣鳎罱K該序列片斷至少由150個(gè)核苷酸組成。該序列可用于形成一種DNA結(jié)構(gòu)，最后得到的結(jié)構(gòu)至少有一個(gè)調(diào)控序列來(lái)調(diào)控基因表達(dá)和具有青霉素?；富钚缘亩嚯牡漠a(chǎn)生。該序列可以成為一個(gè)含有上述結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)譯啟動(dòng)信號(hào)和轉(zhuǎn)譯轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的重組表達(dá)載體的一部分。此外，本發(fā)明還涉及一種重組宿主細(xì)胞，含有被載體攜帶或細(xì)胞基因組中的核酸，以及一種大腸桿菌菌種BL21，它含有質(zhì)粒pKXIP1，pKLP3和pKLP6攜帶的，可以編碼青霉素?；傅暮塑账嵝蛄小Ｎ臋n編號(hào)C12N15/55GK101563459SQ200780032936公開(kāi)日2009年10月21日申請(qǐng)日期2007年5月15日優(yōu)先權(quán)日2007年1月31日發(fā)明者D·阿奴巴瑪,J·馬薩雷克,K·普拉科瓦,L·哈羅諾華,P·肯斯利克,S·貝卡,V·斯特帕尼克,W·R·維亞薩蕊亞妮申請(qǐng)人:酵素生物技術(shù)有限公司;微生物研究所