專利名稱：：使用不需要鈣黏著蛋白受體的毒素遏制昆蟲對蘇云金芽孢桿菌cry毒素的抗性的制作方法使用不需要鈣黏著蛋白受體的毒素遏制昆蟲對蘇云金芽孢桿菌CRY毒素的抗性發(fā)明概述蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)的Cry毒素由于它們在控制不同栽培品種、林木中的蟲害和在人類中傳播疾病的昆蟲的能力而具有重要價值。昆蟲侵襲對Bt毒素抗性的產(chǎn)生是繼續(xù)成功使用此環(huán)境友好的殺蟲劑的主要障礙。昆蟲中對Cry毒素抗性的主要機制包括Cry毒素與位于昆蟲腸道的特異性受體的結(jié)合降低(Ferr6和VanRie，2002)。CrylA蛋白質(zhì)是殺死一些重要鱗翅目昆蟲的一組Bt毒素。在三種主要的棉花害蟲品系中[煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)(Gahan等人，2001)、紅鈴麥蛾(Pectinophoragossypiella)(Morin等人，2003)和棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)(Xu等人，2005)]，對CrylA毒素的抗性與鈣黏著蛋白的變化有關(guān)，鈣黏著蛋白擔當易感昆蟲的腸中Cry毒素的初級受體(primaryrec印tor)。鈣黏著蛋白基因的突變產(chǎn)生對Bt毒素的"1型"抗性，這種類型的抗性是不同昆蟲中出現(xiàn)頻率最高的抗性。這種類型的抗性呈現(xiàn)對至少一種CrylA毒素的高水平抗性，其本質(zhì)是隱性的，它降低至少一種CrylA毒素與抗性昆蟲的膜的結(jié)合并呈現(xiàn)非常小的對毒素CrylC的交叉抗性(Ferr6和VanRie，2002)。令人感興趣的是，小菜蛾(gusanodorsodediamante,DBM)，Plutellaxylostella，攻擊蔬菜諸如西蘭花(br6coli)和花椰菜的一種世界范圍的害蟲，呈現(xiàn)對CrylA毒素的"l型"抗性，但是在這種情況下它并不與鈣黏著蛋白基因中的突變直接相關(guān)。DBM是田間選擇的世界上唯一的Bt毒素抗性昆蟲(Tabashnik，2004)。與鈣黏著蛋白的結(jié)合促進了結(jié)構(gòu)域I的a_1螺旋的蛋白水解切割和負責這些蛋白質(zhì)的毒性的寡聚體前孔(pre-poro)的形成(G6mez等人，2002)。在本發(fā)明中，證明了從缺少編碼螺旋a-1的DNA的3_結(jié)構(gòu)域Cry基因構(gòu)建體(construcciones)產(chǎn)生的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，殺死對野生型(silvestres)3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素(未修飾的Cry毒素)具有抗性的昆蟲。昆蟲對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的抗性的遺傳基礎(chǔ)與編碼CrylA毒素初級受體的鈣黏著蛋白基因中的突變有關(guān)。在抗性昆蟲中，所述初級受體被截短或不存在，所以Cry毒素與腸細胞膜的結(jié)合被降低或不存在。因此，抗性昆蟲對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素不敏感。本發(fā)明中介紹的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素通過不需要毒素與鈣黏著蛋白受體的結(jié)合來遏制抗性。修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的毒性得到了對野生型CrylA毒素具有抗性的兩種昆蟲品系的證明，其還在通過沉默f丐黏著蛋白RNA誘導的對Cry毒素的具有降低的易感性的昆蟲中進行了測試。一個抗性昆蟲品系通過鈣黏著蛋白基因的遺傳修飾呈現(xiàn)1型抗性，而另一品系則呈現(xiàn)與鈣黏著蛋白基因中的突變無關(guān)的1型抗性。通過構(gòu)建缺少a-1螺旋的基因產(chǎn)生的修飾的CrylA蛋白質(zhì)誘導寡聚體前孔的體外(invitro)形成而不需要結(jié)合鈣黏著蛋白受體，也不需要含有Cry毒素結(jié)合位點的鈣黏著蛋白的片段或scFv格式的抗體(scFv73)(其模擬鈣黏著蛋白受體中存在的Cry毒素結(jié)合區(qū))(G6mez等人，2002)。另一方面，未修飾的CrylA蛋白質(zhì)需要scFv73抗體或鈣黏著蛋白的片段或鈣黏著蛋白的存在以體外產(chǎn)生寡聚體前孔。由于CrylA蛋白質(zhì)作用模式與其他3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素的相似性、以及各種昆蟲對Cry毒素具有共同的抗性機制，本文描述的發(fā)明可具有非常廣泛的應(yīng)用。除了CrylA蛋白質(zhì)之外，還有許多其他為具有3-結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的Cry毒素的Bt毒素，其中包括氨基酸序列具有低相似性的蛋白質(zhì)(deMaagd等人2001)。已報告不同的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素(CrylA、CrylB、CrylC、CrylD、CrylE、CrylF、Cry3A、Cry3B、Cry3C、Cry4A、Cry4B和Cry11)形成與對CrylAb毒素觀察到的那些相似的寡聚體結(jié)構(gòu)，并且所述結(jié)構(gòu)插入靶幼蟲腸細胞的膜形成離子孔。這表明3-結(jié)構(gòu)域Cry蛋白質(zhì)具有相似的作用機制(G6mez等人，2002;Rausell等人，2004a;Rausell等人，2004b;Herrero，S.等人，2004;Muft0Z-Garay等人，2006)。此夕卜，昆蟲中對CrylA毒素最常見的抗性機制包括初級鈣黏著蛋白受體的改變。這些改變避免了通常由Cry毒素與鈣黏著蛋白受體的相互作用介導的寡聚體前孔結(jié)構(gòu)的形成。因此，我們預測對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素具有抗性的不同昆蟲可能對相應(yīng)的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素敏感，其中編碼a-l螺旋的片段已被除去(revealed)。由本文描述的基因構(gòu)建體產(chǎn)生的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素可作為局部施用的殺蟲劑(例如，作為噴霧殺蟲劑)、作為轉(zhuǎn)基因微生物、或作為轉(zhuǎn)基因植物呈現(xiàn)于昆蟲群體。背景蘇云金芽孢桿菌(Bt)是屬于蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)組的細菌(Helgason等人2000)。與蠟狀芽孢桿菌組的其他成員不同，Bt產(chǎn)生主要由稱為Cry毒素、Bt毒素或S-內(nèi)毒素的殺蟲劑蛋白質(zhì)構(gòu)成的伴胞晶體。Bt毒素對一些特定的昆蟲有毒性，而對人類、脊椎動物和植物無毒。它們還是完全生物可降解的。因此，Bt毒素對控制害蟲是安全和有效的。這些毒素的應(yīng)用包括l)控制林木的落葉侵襲，2)控制蚊和黑蠅，它們是人類疾病的載體，3)使用含有Bt毒素的殺蟲劑制劑或表達它們的微生物控制農(nóng)業(yè)侵襲，和4)通過使用產(chǎn)生Bt毒素的轉(zhuǎn)基因植物控制農(nóng)業(yè)侵襲。根據(jù)Cry蛋白質(zhì)的同源性，它們可劃分為幾個組。含有最大數(shù)量的Cry毒素變體的組是3-結(jié)構(gòu)域Cry蛋白質(zhì)組。具有Cry毒素同源性的其他組包括與球形芽孢桿菌(Bacillussphaericus)產(chǎn)生的Bin和Mtx毒素相似的Cry毒素(Crickmore等人，1998;Crickmore等人，2002)。截至目前，已分離了大量Bt株系，找到了對鱗翅目、雙翅目或鞘翅目昆蟲有活性的毒素(Schn印f等人，1998)。Cry毒素殺死昆蟲，因為它們在幼蟲的腸表皮細胞的膜上形成溶孔。3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的結(jié)構(gòu)。3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素家族的成員是由通過簡單的接頭(conectores)連接的三個結(jié)構(gòu)域形成的球形蛋白質(zhì)。已報道了以CrylAa蛋白酶(鱗翅類特異的)、Cry3A、Cry3B(鞘翅類特異的)、Cry4Aa和Cry4Ba(雙翅類特異的)和Cry2Aa原毒素(protoxin)(雙翅類和鱗翅類特異的)作用的毒素的三維結(jié)構(gòu)(Grouchulski等人，1995;Li等人，1991;Galistki等人，2001;Morse等人，2001;Boomserm等人，2005;Boomserm等人，2006)。這些毒素中的一些毒素之間的序列同一性是低的。例如，Cry2Aa和Cry3Aa之間為20X同一性，而毒素Cry2Aa和CrylAa存在僅17%序列同一性。盡管這些毒素的低序列同一性，但是它們的三維結(jié)構(gòu)是相似的，表明它們共有相似的作用機制(圖1)。3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素家族的每種毒素具有稱為I、II和III的三個結(jié)構(gòu)性域。結(jié)構(gòu)域I是通過七個a-螺旋的分支形成的，其中中央螺旋(a5螺旋)被外部螺旋包圍。a5螺旋在3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素家族內(nèi)是高度保守的。此結(jié)構(gòu)域已參與靶昆蟲膜的離子孔的形成。結(jié)構(gòu)域II由形成P-結(jié)構(gòu)棱的沿疏水中心堆疊的三個反平行的P-折疊組成。結(jié)構(gòu)域II已被指定為決定特異性的結(jié)構(gòu)域，它是最富變化的結(jié)構(gòu)域(deMaagd等人，2001)。參與結(jié)構(gòu)域I和II之間的接觸的氨基酸殘基(存在于a-7螺旋和13-1折疊)在毒素Cry家族中是高度保守的。結(jié)構(gòu)域III由兩個反平行的P-折疊形成。此結(jié)構(gòu)域還參與特異性和與受體的相互作用(deMaagd等人，2001)。結(jié)構(gòu)域II和III之間的接觸部分(對應(yīng)于和P-12折疊)以及結(jié)構(gòu)域III的內(nèi)部區(qū)域(對應(yīng)于P-17和P-23折疊)在3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素家族中也是高度保守的。作用機制為了殺死昆蟲，3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素從由原毒素構(gòu)成的伴胞晶體被轉(zhuǎn)變成由插入膜的寡聚體結(jié)構(gòu)形成的離子通道，所述離子通道造成離子的輸出和細胞裂解。伴胞晶體被易感的幼蟲攝??；此晶體在幼蟲腸內(nèi)溶解。如圖l所示，溶解的原毒素被腸的蛋白酶切割，產(chǎn)生60-70kDa的蛋白片段(deMaagd等人，2001)。毒素的此初始活化包括N-末端(對Cryl毒素為25-30個氨基酸，對Cry3毒素為58個殘基，而對Cry2Aa為49個)的蛋白水解加工，并且在130kDa的長Cry原毒素(Cryl、Cry4、Cry5、Cry7-Cry14、Cryl6-21、Cry24-Cry32、Cry39-44、Cry47-48和Cry50)情形中，其C-末端的大約一半蛋白質(zhì)也被加工。在初始的蛋白水解切割后，毒素結(jié)合于腸上皮中存在的柱狀細胞的頂膜微絨毛(刷狀緣)中的特異性受體(Schn印f等人，1998;deMaagd等人，2001)。與初級受體的相互作用誘導所述毒素的第二次蛋白水解切割，其中a-l螺旋被除去。第二次切割后，毒素分子被完全活化，并可與其他相似分子締合以形成寡聚體結(jié)構(gòu)。毒素的寡聚體呈現(xiàn)對二級受體(氨肽酶或堿性磷酸酶)的高親和性。與二級受體的相互作用促進插入膜的微結(jié)構(gòu)域(Schn印f等人，1998;Aronson和Shai，2001;Bravo等人，2004;Pardo等人，2006)。毒素的插入導致在頂膜微絨毛形成溶孔，并最終導致細胞的死亡(Schn印f等人，1998;Aronson和Shai，2001)。已描述了鱗翅目昆蟲中能夠結(jié)合CrylA毒素的至少四種不同的蛋白質(zhì)初級受體表征為類似于鈣黏著蛋白的蛋白質(zhì)(CADR);二級受體是通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)橋錨定于膜的兩種蛋白質(zhì)，氨肽酶-N(APN)和堿性磷酸酶(FAL)。最后，還報道270kDa的糖軛合物(glicoconjugato)是可能的初級受體(Vadlamudi等人，1995;Knight等人，1994;Jurat-Fuentes等人，2004;Valaitis等人，2001)。在本發(fā)明中，我們將使用縮寫CADR來指擔當一種或多種Bt毒素的初級受體的鈣黏著蛋白類型的蛋白質(zhì)。由于這些蛋白質(zhì)的系統(tǒng)命名尚未確立的事實，不同昆蟲中存在的不同CADR的名稱有所不同，例如，Bt-Ri代表煙草天蛾(Manducasexta)的f丐黏著蛋白(Vadlamudi等人，1995)，而BtR代表紅鈴麥蛾的f丐黏著蛋白(Morin等人，2003)。CADR是具有細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域并具有細胞外的胞外域的跨膜蛋白質(zhì)，所述胞外域含有表征鈣黏著蛋白的各種重復的模體，在Bt-I^的情形中為12個重復的模體(Vadlamudi等人，1995)。這些胞外域含有鈣結(jié)合位點、與整聯(lián)蛋白和鈣黏著蛋白結(jié)合序列相互作用的序列。已詳細描述了煙草天蛾中CrylA毒素的毒素與不同受體相互作用的連續(xù)過程。在此昆蟲中，毒素首先結(jié)合于初級Bt-I^受體。毒素寡聚體化之后，它與通過GPI錨定于膜的二級受體APN或FAL結(jié)合(Bravo等人，2004;Jurat-Fuentes等人，2006)。煙草天蛾中CrylAb與Bt-^的結(jié)合促進了毒素N_末端的又一次蛋白水解切割(除去a-l螺旋)。此切割促進了具有寡聚體結(jié)構(gòu)的前孔的形成，所述前孔增加毒素對二級受體的親和性，并且對毒素插入膜和對毒性是重要的(G6mez等人，2002;Rausell等人，2004a)。將CrylAb原毒素與煙草天蛾腸中存在的蛋白酶在單鏈抗體scFv73(其模擬Bt-^受體上存在的結(jié)合位點)存在下孵育，也產(chǎn)生了含有250kDa寡聚體的毒素制品，所述250kDa寡聚體缺少結(jié)構(gòu)域Ia_1螺旋(G6mez等人，2002，2003)。此250kDa寡聚體也形成于當將CrylAb原毒素與煙草天蛾腸的蛋白酶在含有Bt-^受體用于特異性結(jié)合毒素的序列(CADR7和11上的重復區(qū))的肽的存在下孵育時(G6mez等人，2002，2003)。CrylAb和CrylAc的寡聚體結(jié)構(gòu)使它們結(jié)合二級APN受體的親和性增加大約100至200倍，顯示0.75-lnM的表觀解離常數(shù)(G6mez等人，2003、Pardo等人，2006)。與60kDa的單體相反，250kDa的寡聚體能夠插入膜(Rausell等人，2004a)。用合成脂構(gòu)建的平面脂雙層中的孔形成分析證明了CrylAb寡聚體和單體孔形成的差異。首先，對于寡聚體，孔形成以比單體的低得多的濃度發(fā)生。第二，寡聚體誘導的離子通道更穩(wěn)定，并呈現(xiàn)更高的開放概率，而不像單體誘導的離子通道(Rausell等人，2004a)。對于CrylAa、CrylAb、CrylCa、CrylDa、CrylEa、CrylFa、CrylCa、Cry3A、Cry3B、Cry3C和Cry4B毒素，已證明了從Cry毒素的寡聚體形成(G6mez等人，2002;Rausell等人，2004a，Rause11等人，2004b;Herrero，S.等人，2004;Muftoz.-Garay等人，2006;Tigue等人，2001;Likitvivatanavong等人，2006)。CryllAa毒素還在它們的受體存在下寡聚化(P6rez，個人交流)。在所有這些情形中，含有寡聚體結(jié)構(gòu)的毒素樣品中的孔形成活性比僅含有毒素的單體結(jié)構(gòu)的那些高得多。此數(shù)據(jù)支持Cry毒素寡聚體的形成增加這些蛋白質(zhì)的毒性的假設(shè)。APN和FAL受體已被牽涉入CrylA毒素插入膜的過程。經(jīng)由使用磷脂酰肌醇特異性的磷脂酶C處理(此酶移除GPI錨定的蛋白質(zhì))的GPI切割移除APN和FAL，顯著地減少了插入膜微結(jié)構(gòu)域的CrylAb寡聚體水平，并顯著降低毒素孔形成活性(Bravo等人，2004)。此外，將APN摻入合成的平面雙層增加了CrylAa孔形成活性(Schwartz等人，1997)?；谏衔拿枋龅臄?shù)據(jù)，提出了CrylA毒素的作用機制模型，其包括CrylA毒素首先與Bt-^受體和然后與APN-FAL分子的連續(xù)相互作用。CrylA單體與鈣黏著蛋白受體的相互作用促進寡聚體前孔結(jié)構(gòu)的形成，其呈現(xiàn)與二級APN或FAL受體的結(jié)合親和性的增加。毒素前孔然后與APN或FAL結(jié)合。最后，毒素前孔插入膜微結(jié)構(gòu)域(或脂筏)，誘導孔形成和細胞裂解(Bravo等人，2004)。昆蟲對Cry毒素的抗性。對Cry毒素的主要抗性機制包括毒素與位于昆蟲的腸的受體結(jié)合的降低(Ferr6和VanRie，2002)。編碼CADR的基因的突變與至少三種極為重要的昆蟲害蟲中對CrylA毒素的抗性強烈相關(guān)煙芽夜蛾(Gahan等人，2001)、紅鈴麥蛾(棉紅鈴蟲)(Morin等人，2003)和棉鈴蟲(Xu等人，2005)。在小菜蛾(DBM)，Plutellaxylostella，攻擊蔬菜諸如西蘭花和花椰菜的一種世界范圍的害蟲的情形中，"l型"抗性與鈣黏著蛋白基因的突變不是直接相關(guān)。不過，可能是該抗性昆蟲系的突變可間接影響鈣黏著蛋白的表達(Baxter等人2005)。產(chǎn)生Cry毒素以殺死主要害蟲的轉(zhuǎn)基因作物的創(chuàng)建是減少化學殺蟲劑使用和增加環(huán)境兼容和友好的控制昆蟲的替代物的使用的決定性時刻。轉(zhuǎn)基因植物中不斷產(chǎn)生Cry毒素，這允許它們控制表面噴霧化學殺蟲劑無法殺死的昆蟲蛀蟲。已通過具有與植物的密碼子(codons)使用兼容的密碼子使用的Cry基因的遺傳工程、消除可能的RNA加工序列和切割原毒素C-末端區(qū)改進了Cry毒素的產(chǎn)生(Schuler等人，1998)。昆蟲抗性轉(zhuǎn)基因植物自1996年起已大規(guī)模使用。2005年Bt_玉米和Bt_棉花的種植已達2600萬公頃(James，2005)。Bt作物的這一非常廣泛的使用激勵了昆蟲害蟲群體中對Bt毒素抗性的強烈選擇壓力(Tabashnik，1994，Gould，1998)。如果昆蟲害蟲發(fā)展抗性，Bt毒素的有效性就結(jié)束了。響應(yīng)這一挑戰(zhàn)，已發(fā)展并實施了控制抗性的策略以延長Bt作物的效用。防止Bt作物抗性的基本策略是使用保護區(qū)(refugios)(Gould,1998)。保護區(qū)是在Bt作物附近種植的非轉(zhuǎn)基因作物區(qū)域。保護區(qū)策略的目標是回溯可與抗性昆蟲配偶的易感昆蟲的抗性保持群體。在所研究的大多數(shù)情形中，對Cry毒素的抗性是通過隱性突變賦予的(Ferr6禾口VanRie，002;Conner等人，2003;Tabashnik等人，2003)。鑒于是隱性抗性，可由Bt作物出現(xiàn)的抗性純合子昆蟲與保護區(qū)區(qū)域的易感純合子昆蟲之間的雜交將產(chǎn)生對Bt作物表達的Cry毒素易感的雜合子后代。雖然此策略看似對回溯抗性有用，但是尚未執(zhí)行仔細的大規(guī)模田間試驗(Tabashnik等人，2005)。在任何情形中，保護區(qū)策略都是假定抗性將被回溯而不是被防止。雖然尚未報道田間的Bt作物抗性，不過實驗室選擇已在許多昆蟲害蟲中產(chǎn)生了Bt抗性株系(Tabashnik，1994;Ferr6和VanRie，2002;Tabashnik等人，2003)。另外，田間已發(fā)展了小菜蛾P(guān)lutellaxylostella(L.)對噴霧Bt毒素的抗性，并且花椰菜lOOpers溫室群體發(fā)展了粉紋夜蛾Trichoplusiani(HUbner)對噴霧Bt毒素的抗性(Tabashnik，1994;Ferr6和VanRie，2002;Janmaat和Meyers,2003;Tabashnik等人，2003)。鑒于Bt毒素在世界的廣泛使用并鑒于其使用的快速增加，昆蟲害蟲對目前使用的Cry毒素的抗性是人類健康、食物生產(chǎn)和環(huán)境的日益嚴重的威脅。因此，殺死抗性昆蟲的修飾的Cry毒素是期望的并且是完全必要的。附圖詳述圖1,未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的作用機制。圖2,修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的作用機制。圖3._用于長(130kDa)和短(70kDa)Cry毒素的PCR反應(yīng)的引物(primeros)的設(shè)計。圖4._用于產(chǎn)生缺少蛋白質(zhì)的N-末端至最多達到a-1螺旋的末端的CrylAb和Cry1Ac的PCR策略。^^^^啟動子區(qū)(390bp)^^M含有a—I螺旋的氨基末端lillllll國a-2螺旋至|3-23的毒素區(qū)(1687bp)原毒素的C-末端片段(2069bp)圖5.-無a-1螺旋的突變的修飾CrylAb和CrylAc毒素的SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠電泳證明產(chǎn)生130kDa原毒素蛋白質(zhì)。圖6,將CrylAb原毒素與煙草天蛾腸的胃液在CADR蛋白質(zhì)片段(含有重復段7-12、11-12或12)存在下、或在scFv73抗體存在下、或無CADR片段或抗體下(對照)孵育^，獲得的未修飾的CrylAb毒素的寡聚體結(jié)構(gòu)(250kDa)的經(jīng)由蛋白質(zhì)印跡免疫檢測的檢圖7.-僅通過用胰蛋白酶處理修飾的3-結(jié)構(gòu)域(:"毒素、(:"^&10(1和(:"^010(1獲得的寡聚體結(jié)構(gòu)(250kDa)的經(jīng)由蛋白質(zhì)印跡免疫檢測的檢測。圖8,瓊脂糖凝膠電泳顯示用T7聚合酶體外轉(zhuǎn)錄后獲得的Bt-^基因片段和基因?qū)φ盏碾p鏈RNA(dsRNA)。圖9,幼蟲腸勻漿液(lOiig)經(jīng)由蛋白質(zhì)印跡免疫檢測的檢測，以抗Bt-I^抗體或以針對腸的頂膜微絨毛的總蛋白質(zhì)的抗體(抗-BBMV)檢測(reveal)。對照(泳道(line)1和2)是注射水并以無毒素的人工飼料培養(yǎng)的兩種分開的幼蟲。注射lygdsRNABt-I^并以含20ngCrylAb/cm2的人工飼料培養(yǎng)的7種分開的幼蟲(泳道(line)3至9)的腸樣品。圖10-煙草天蛾幼蟲注射1iigBt-RlClSRNA并在Petri箱中以含以下的人工飼料孵育三天:A)20ngCrylAb/cm2;B)5ngCrylAbMod/cm2;C)水(對照)。發(fā)明詳述術(shù)語"3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素"指殺蟲劑晶體蛋白質(zhì)家族(也稱為Cry毒素、Bt毒素或s-內(nèi)毒素)的亞組的一個(一些)成員，它們是由三個不同的結(jié)構(gòu)域a、n和ni)通過簡單的鍵連接構(gòu)成的球形蛋白質(zhì)。雖然這些毒素中的一些毒素之間的序列同一性低，但是它們的結(jié)構(gòu)拓撲是相似的，表明它們共有相似的作用機制(圖l)。在這些3-結(jié)構(gòu)域毒素中，本發(fā)明靶向非常公知的一組尤其是短Cry毒素(Cry3、Cry2和Cryll)和長cry毒素(Cryl、Cry4、Cry5、Cry7、Cry8、Cry9、CrylO、Cryll、Cryl2、Cryl3、Cryl4、Cryl6、Cryl7、Cryl8、Cryl9、Cry20、Cry21、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry47、Cry48和Cry50)，它們擁有共同的作用機制。為了殺死昆蟲，這些毒素必須在形成寡聚體結(jié)構(gòu)之前結(jié)合于初級受體，所述寡聚體結(jié)構(gòu)將其自身插入膜以生成孔。術(shù)語"未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素"代表未被修飾的野生型(silvestre)3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素。這些未修飾的毒素需要結(jié)合于初級受體，并且必須被酶促加工移除a-1螺旋，以完全活化和對易感幼蟲具有毒性(圖1)。術(shù)語"修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素"代表被修飾的以使它們?nèi)狈-1螺旋的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素。這些毒素不需要結(jié)合初級受體，它們也不需要其a-l螺旋被酶促加工才能變得有活性(圖2)。術(shù)語"CrylAbMod"和"CrylAcMod"代表兩種具體的缺少a_1螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，它們分別對應(yīng)于未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素CrylAb和CrylAc。術(shù)語"合格的抗性昆蟲"指對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素具有抗性的昆蟲，其抗性與影響初級受體基因(對于CrylA毒素，稱為鈣黏著蛋白)表達的突變有關(guān)，無論述突變是直接存在于初級受體基因或存在于影響所述初級受體表達的其他基因。由于當初級受體被修飾、截短或不表達時，未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素與腸細胞頂膜的結(jié)合被降低或消除，并且毒素不能被完全活化，不能形成寡聚體，寡聚體不能將自身插入膜，也就不能殺昆蟲。因此，這些昆蟲對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素具有抗性。這些抗性昆蟲是本發(fā)明修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的靶，其中所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素遏制昆蟲的抗性，已經(jīng)能夠形成寡聚體，將它們自身插入膜，并最終殺死這些抗性昆蟲。如上所述，存在可能目前是農(nóng)業(yè)、林業(yè)和公眾健康的重要難題的問題。這一問題是持續(xù)暴露于這些毒素的昆蟲害蟲中出現(xiàn)對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的抗性，因為這些毒素被噴霧或通過轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生。已出現(xiàn)了不同的策略來追溯這一問題，但是預期這些策略并不能在問題發(fā)生時阻止或解決它。本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計并實施了遏制昆蟲中對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的抗性的方法，所述方法通過合格的抗性昆蟲并用修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素進行，所述修飾的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素繞過了未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素(圖2)作用機制的兩個步驟1)毒素與初級受體之間的結(jié)合，和2)毒素N-末端的另外的蛋白水解切割，這使得切割a-l螺旋成為可能。對于未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素來說，需要這些步驟以促進具寡聚體結(jié)構(gòu)的前孔的形成，所述寡聚體前孔對于將毒素插入膜和對于毒性是重要的(G6mez等人，2002;Rausell等人，2004a)。本發(fā)明是基于對3-結(jié)構(gòu)域Cry家族的某些成員的作用機制(在圖1中闡明)的理解，并希望這一機制對3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素家族的其他成員也是共同的(Bravo等人，2004;G6mez等人，2002;Rausell等人，2004a，Rausell等人，2004b;Herrero，S.等人，2004;MufiOZ-Garay等人，2006)。本發(fā)明還基于對初級受體中的缺陷構(gòu)成昆蟲藉以對Cry毒素產(chǎn)生抗性的最普遍和重要的機制的理解(Gahan等人，2001，F(xiàn)err6和VanRie，2002;Morin等人，2003;Xu等人，2005)。在第一個方面(alcance)，本發(fā)明涉及獲得編碼缺少a-1螺旋的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體的方法。如上文已提及的，毒素此部分的體外酶促切割促進未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素中寡聚體前孔的形成(圖1)。與未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素相反，所指的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的毒性或與初級受體(對于CrylA毒素為CADR)的結(jié)合或a-1螺旋的酶促切割都不需要與初級受體的鍵的締合(圖2)。這些DNA構(gòu)建體對于產(chǎn)生繞過與初級受體的結(jié)合步驟和a-l螺旋的酶促切割的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素是重要的。所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素是有用的，無論它們是通過轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生或表達于其他系統(tǒng)如微生物，或以另一途徑諸如噴霧殺蟲劑施用。獲得編碼缺少a-1螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體的方法由下列步驟組成a)選擇希望修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素耙基因。b)鑒定啟動子區(qū)、編碼蛋白質(zhì)片段的區(qū)域和a-1螺旋的編碼區(qū)。c)擴增所述基因，并不包括編碼氨基末端和a-1螺旋的區(qū)域。缺少a-1螺旋的基因的擴增可使用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行，使用含有所選的未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素基因的適當?shù)腄NA模板。這可以兩個或多個擴增步驟進行，取決于基因的大小和希望使用的片段。擴增的第一個步驟(PCR1)僅擴增啟動子區(qū)，第二PCR(PCR2)和隨后的擴增步驟(PCR3)擴增從a_2螺旋開始至達P-23的編碼區(qū)并擴增(如果存在)對應(yīng)于蛋白質(zhì)的羧基末端的區(qū)域。對于PCR1，對擴增反應(yīng)首先設(shè)計了包含起始密碼子(ATG)和內(nèi)部限制性酶切位點Ncol的寡核苷酸。對于PCR2和下列擴增，寡核苷酸必須設(shè)計為獲得期望以包含從a-2螺旋至達P-23折疊的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的DNA片段數(shù)。所選3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的蛋白質(zhì)羧基末端(如果存在)也必須擴增，以包含蛋白質(zhì)的終止子區(qū)。優(yōu)選地，所述寡核苷酸必須在其5'端包含不存在于所選基因中的限制性酶切位點?？墒褂脙?nèi)部Ncol位點以使PCR1的產(chǎn)物與PCR2的產(chǎn)物連接(unir)。限制性酶切位點的選擇方式應(yīng)使PCR-1反應(yīng)的產(chǎn)物的3'端僅可連接于PCR-2反應(yīng)的產(chǎn)物的5'端，而PCR-2的產(chǎn)物的3'端僅可連接于PCR-3的產(chǎn)物的5'端，以此類推(圖3)。優(yōu)選地，必須使用包含于含有啟動子區(qū)的PCR1的產(chǎn)物的5'端并包含于含有終止子的PCR產(chǎn)物的3'端的特異性限制性酶切位點，以使這些DNA片段連接(ligar)于適當?shù)馁|(zhì)粒載體。對于CrylAb和CrylAc毒素，此方法的應(yīng)用在實施例1中說明。然而，這可應(yīng)用于任何其他未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素以獲得對應(yīng)的缺少a-1螺旋的修飾的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素。NeilCrickmore的網(wǎng)頁(Crickmore，N.、Zeigler，D.R.、Schn印f，E.、VanRie，J.、Lereclus，D.、Baum，J、Bravo，A.禾口Dean，D.H."Bacillusthuringiensistoxinanomenclature"(蘇云金芽抱桿菌毒素命名)，2005，http:〃www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/NeilCriekmore/Bt/)列出了大多數(shù)已知的Cry毒素和3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，包括它們的編碼DNA的NCBI登錄號?？蛇x擇這些3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的任一種來應(yīng)用本發(fā)明的方法，以獲得修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的相應(yīng)DNA構(gòu)建體。這些DNA構(gòu)建體的表達可容易地實現(xiàn)，如實施例2所示。優(yōu)選地，所述質(zhì)粒載體將是具有可在大腸桿菌(Escherichiacoli)和蘇云金芽孢桿菌細胞中復制的雙復制起點的載體。所述表達載體可含有選擇標記，其是載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞的存活或生長所必需的蛋白質(zhì)編碼基因。典型地，選擇標記基因編碼賦予對抗生素或其他物質(zhì)(例如，氨芐青霉素、新霉素或甲氨蝶呤)的抗性的蛋白質(zhì)。選擇標記基因還可以是補足營養(yǎng)缺陷或提供復合培養(yǎng)基中沒有的關(guān)鍵營養(yǎng)的基因。選擇適當?shù)倪x擇標記基因?qū)⑷Q于宿主細胞；在本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中，不同宿主的適當選擇標記是已知的。連接(ligaci6n)混合物可轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細胞，然后可純化轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化入蘇云金芽孢桿菌細胞以表達修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素和產(chǎn)生生物殺蟲劑?？蛇x地，修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素基因可表達于異源(heter6logos)的系統(tǒng)，如使用適當載體的其他微生物(包括細菌、病毒、藻類和酵母)或其他生物體包括轉(zhuǎn)基因昆蟲和植物細胞。對于轉(zhuǎn)基因植物，所述載體必須適合植物(諸如玉米、棉花和大豆或其他)中的轉(zhuǎn)化和表達，以使加工的植物產(chǎn)生修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素。以此方式轉(zhuǎn)化的植物可免受對未修飾的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素具有抗性的靶昆蟲的攻擊。以噴霧生物殺蟲劑施用的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的優(yōu)選用途包括而不限于保護蔬菜和林木。我們努力以此方式控制的優(yōu)選侵襲包括但不限于鱗翅目昆蟲的侵襲。為了證明此方法如何工作，通過如實施例1所示的本發(fā)明方法，從缺少a-1螺旋的CrylAb和CrylAc毒素獲得了蛋白質(zhì)片段。通過上述方法獲得的編碼缺少a-1螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在實施例2中，說明了含有上文提及的編碼缺少a-1螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的構(gòu)建體的載體，其包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，載體的選擇將具體取決于所用的宿主細胞。含有前述載體的遺傳加工的宿主細胞也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，一些優(yōu)選的宿主細胞包括細菌，特別是革蘭氏陽性細菌諸如芽孢桿菌屬(g紐eroBacillus)的那些，或革蘭氏陰性細菌諸如假單胞菌屬(Pseudomonas)和埃希氏菌屬(Escherichia)，和植物細胞諸如玉米、大豆、馬鈴薯、棉花和其他植物。產(chǎn)生本發(fā)明的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的重組方法應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。一般而言，這些方法包括培養(yǎng)遺傳加工的宿主細胞的步驟，所述遺傳加工的宿主細胞含有容納修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體的載體。在適當?shù)纳L條件下，遺傳加工的宿主細胞產(chǎn)生修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素。這些方法還包括任選地(opci6n)從細胞培養(yǎng)物中回收修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，無論是以孢子，或作為純化的蛋白質(zhì)，或包含于宿主生物體內(nèi)。對于修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素(CrylAbMod和CrylAcMod)，這些方法在實施例2中說明。在另一方面(alcance)，描述了所編碼的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素。修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素不需要結(jié)合于初級受體來形成前孔寡聚體結(jié)構(gòu)。因此，鑒于缺少a-l螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素對合格的抗性昆蟲具有毒性，它們還將繼續(xù)對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素敏感的昆蟲具有毒性。如上文提及的，在溶解于腸基質(zhì)(intestinomedio)后，作用模式中接下來的三個步驟是l)由腸基質(zhì)的蛋白酶進行的初始酶促切割，造成從C-末端區(qū)(如果其存在于毒素中)移除N-末端肽；2)結(jié)合于初級受體，和3)第二次酶促切割，造成a-1螺旋的移除。這三個步驟產(chǎn)生能夠形成稱為前孔的寡聚體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(圖1)。缺陷的初級受體(CADR)是昆蟲對Cry毒素產(chǎn)生抗性的最重要和普遍的機制(Gahan等人，2001，F(xiàn)err6和VanRie，2002;Morin等人，2003;Xu等人，2005)。初級受體的改變降低或消除未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的結(jié)合，明顯阻止a-1螺旋的酶促切割并抑制毒性必需的前孔寡聚體結(jié)構(gòu)的形成。修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素缺少a-l螺旋。這樣，為了殺死昆蟲，這些毒素不需要結(jié)合于初級受體，也不需要造成失去a-l螺旋的與此結(jié)合相關(guān)的切割。因為它們不需要結(jié)合于初級受體，所以阻止此結(jié)合的初級受體的缺陷不阻止其毒性。換言之，修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素遏制昆蟲的抗性是因為不需要與初級受體的相互作用。為了說明這些修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，獲得了編碼修飾的CrylAb和CrylAc毒素(缺少a-1螺旋)的DNA構(gòu)建體，如實施例1所示，并且表達了所述修飾的毒素，如實施例2所示。為了證明修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素能夠形成前孔寡聚體結(jié)構(gòu)，兩種修飾的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素的原毒素CrylAbMod和CrylAcMod僅用胰蛋白酶處理，由此產(chǎn)生250kDa寡聚體。相反，用胰蛋白酶對兩種對應(yīng)的未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素CrylAb和CrylAc的原毒素的相同處理僅產(chǎn)生60kDa單體結(jié)構(gòu)，如實施例3所示。通過在生物測定中向抗性和易感幼蟲喂食含有不同濃度的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的食物，確定了修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的毒性。比較了CrylAbMod和CrylAcMod與它們的未修飾的對等物CrylAb和CrylAc，針對棉紅鈴蟲(紅鈴麥蛾)的第一期易感(野生型(silvestre))幼蟲和對CrylAb和CrylAc具有抗性的棉紅鈴蟲的毒性。還比較了CrylAcMod與其對等物未修飾的CrylAc針對小菜蛾的CrylAc易感和抗性株系的一齡幼蟲的毒性。未修飾的CrylAb和CrylAc毒素對易感幼蟲具有高度毒性，但是對抗性幼蟲則不是這樣(表1和2)。相反，修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素CrylAbMod和CrylAcMod殺死易感幼蟲以及抗性幼蟲(表1和2)。這些結(jié)果顯示所用來舉例的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素(CrylAbMod和CrylAcMod)遏制合格的抗性昆蟲對未修飾的CrylA毒素的高水平抗性，所述抗性與影響初級受體(在CrylA的情形中為CADR)表達的突變有關(guān)，無論它們是所述初級受體基因的直接突變(如在棉紅鈴蟲的情形中)或是間接影響初級受體表達的基因中的突變(如在小菜蛾的情形中)。為了測試本發(fā)明的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素針對另一靶昆蟲煙草天蛾(尚未分離或培養(yǎng)其抗性昆蟲群體)的毒性，獲得了CADR受體被沉默的煙草天蛾幼蟲，并測試它們以確定它們對未修飾的CrylAb的抗性，如實施例5中所述。使用這些煙草天蛾幼蟲(CADR受體被沉默)，測試了修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素CrylAbMod的毒性，如實施例6所述。結(jié)果再一次證明修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素殺死對相應(yīng)的未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素具有抗性的昆蟲。在另一方面(alcance)，本發(fā)明涉及遏制合格的抗性昆蟲的抗性的方法，所述方法是基于通過允許所述昆蟲食用含有足量的本發(fā)明的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的食物而殺死它們。致死劑量取決于許多因素，包括所用的賦形劑混合物；施用的技術(shù)和條件；所述制劑是氣霧劑、薄膜還是小顆粒；薄膜的厚度或顆粒的大小和其他此類的因素。決定這些因素和適合確定修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的致死劑量的其他考慮因素在本
技術(shù)領(lǐng)域：
的專業(yè)人員的能力之內(nèi)。為了向合格的抗性昆蟲喂食修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，所述毒素必須在昆蟲群體的食物內(nèi)可獲得。這可通過應(yīng)用含有修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的制劑實現(xiàn)。這還可通過產(chǎn)生含有編碼修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物實現(xiàn)，所述DNA構(gòu)建體以可操作方式連接于適合植物表達的載體，以使所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素。制劑和轉(zhuǎn)基因生物可用于農(nóng)業(yè)作物、林木和控制疾病載體。例如，存在一些產(chǎn)生Bt毒素的遺傳改造的樹木，藻類也被遺傳改造為產(chǎn)生Bt毒素以控制蚊類。為了殺死合格的抗性昆蟲，可定期向昆蟲侵襲傳播的地方施用含有修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的制劑。例如，它可施用于植物(葉、莖、根或其他植物部位)以殺死侵襲作物或林木的合格的抗性昆蟲，和施用于水體以殺死為人類疾病載體的在幼蟲期生活于水中的合格的抗性昆蟲(例如，蚊和黑蠅)。這可通過循環(huán)交替施用含有未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的制劑(不含修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素)和施用含有修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素制劑實現(xiàn)。可施用未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，直至計算到要發(fā)生或觀察到合格的抗性昆蟲的出現(xiàn)，此后可施用含有修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的制劑以殺死抗性昆蟲。本發(fā)明的另一方面(alcance)涉及含有一種或多種修飾的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素以遏制合格的抗性昆蟲的抗性的新的制劑或組合物。在所述制劑中，所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素可以是包含于宿主生物體中或聯(lián)合孢子或在純蛋白質(zhì)的均一制品中或在孢子與培14養(yǎng)的轉(zhuǎn)化生物體的混合物中。所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素還可以包含于不產(chǎn)生孢子的微生物諸如大腸桿菌或產(chǎn)生孢子的微生物諸如巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌中、聯(lián)合用于表達它們的株系的孢子或作為與賦形劑混合物一起的分離的晶體(并且任選地純的Cry蛋白)。使用的賦形劑混合物的量將取決于制劑中期望的效價。在選擇作為制劑組分的賦形劑混合物時，應(yīng)考慮制劑追求的最終目的。例如，對于將施用于作物的制劑，必須使用農(nóng)業(yè)可接受的賦形劑混合物，而對于將施用于林木(以控制合格的抗性昆蟲的林木侵襲)和水體(控制為合格的抗性昆蟲的載體昆蟲)的制劑，則必須選擇生態(tài)可接受的賦形劑。賦形劑的混合物可包含載體(carrier)、表面活性劑、紫外線防護劑和其他組分，并可采取可濕性粉劑、液體濃縮物、粒劑或其他制劑的形式。這些制劑和應(yīng)用程序是本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的。如本文所用，術(shù)語"賦形劑"意指與活性化合物混合或配制以便于所述活性化合物在植物、種子、地面、水或要處理的其他物體上的應(yīng)用或它的儲存、運輸和/或管理的惰性固體或液體材料，其可以是無機的或有機的，并且可以是合成或天然來源。生物殺蟲劑的制劑中通常使用的任何材料，例如園藝、農(nóng)業(yè)和生態(tài)可接受的添加劑，是合適的?！┖线m的固體賦形劑是天然的和合成的粘土和硅酸鹽類，例如天然硅石，諸如硅藻土；硅酸鎂類，例如，滑石；硅酸鋁鎂類，例如，綠坡縷石和蛭石；硅酸鋁類，例如，高嶺石、蒙脫石和云母；碳酸鈣；硫酸鈣；合成的羥基硅酮(6xidoshidratadosdesiliconsint6ticos)和合成的硅酸鈣或硅酸鋁；元素諸如，例如，碳和硫；天然和合成的樹脂諸如，例如，香豆酮(coumarone)樹脂、聚氯乙烯以及苯乙烯聚合物和共聚物；瀝青；蠟諸如，例如，蜂蠟、石蠟和氯化礦物蠟；固體肥料，例如，過磷酸鹽類；和研磨的(molidos)天然纖維材料，諸如研磨的玉米芯。合適的液體賦形劑是水、醇類諸如異丙醇和乙二醇；酮類諸如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮和環(huán)己酮；醚類諸如溶纖劑；芳香烴類諸如苯、甲苯和二甲苯；石油餾分諸如煤油、輕礦物油；氯代烴類諸如四氯化碳、全氯乙烯和三氯甲烷。其他合適的化合物為液化的通常為蒸氣或氣體的化合物。不同液體的混合物通常是合適的?？商砑颖砻婊钚詣霰砻婊钚詣┛梢允侨榛RU、分散劑或增濕劑可以是非離子的或離子的?？墒褂贸輨┗驓⑾x劑的制劑中通常應(yīng)用的這些表面活性劑的任一種。合適的表面活性劑的一些實例是聚丙烯酸和磺酸的鈉鹽和鈣鹽；在環(huán)氧乙烷和/或環(huán)氧丙烷分子中含有至少12個碳原子的脂肪酸或脂肪胺或酰胺縮合產(chǎn)物；甘油酯和脂肪酸、山梨聚糖、蔗糖或戊硫醇；這些與環(huán)氧乙烷和/或環(huán)氧丙烷的縮合；脂肪酸或烷基酚例如對辛基苯酚(p-octylfenol)或?qū)π粱追?p-octilcreso1)，與環(huán)氧乙烷和/或環(huán)氧丙烷的縮合產(chǎn)物；這些縮合產(chǎn)物的硫酸酯或磺酸酯的堿金屬鹽或堿土金屬鹽，優(yōu)選地分子中含有至少10個碳原子的硫酸酯或磺酸酯的鈉鹽，例如，十二烷基硫酸鈉、仲烷基硫酸鈉、磺化蓖麻油的鈉鹽，和烷基芳基磺酸鈉諸如十二烷基苯基磺酸鈉；和環(huán)氧乙烷聚合物和環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷共聚物。美國專利第5，141，744號中提及了紫外線防護劑的一些實例，其中描述了含有用于殺蟲劑包括Bt毒素的紫外線防護劑(如辛基二甲基PABA)的穩(wěn)定的大粒凝膠(macrogeles)(至少六個月)，所述紫外線防護劑提供防止被陽光滅活的優(yōu)點。美國專利第4，094，969號公開了通過添加磺酸酯共聚物建立含有Bt毒素的殺蟲劑制劑的另一方式，Bt15毒素在暴露于陽光時快速降解。本發(fā)明的組合物可制備為可濕性粉齊U、粒齊U、溶液、乳化原液、濃懸劑(concentradosensuspensi6n)和氣霧劑。所述可濕性粉劑通常復合為含有按重量計25至75%的活性化合物，并通常在固體載體之外含有按重量計3%至10%的分散劑、12%至15%的表面活性劑、必要時直至按重量計0至10%的穩(wěn)定劑和其他添加劑諸如滲透劑或黏合劑。所述粉劑通常配制為組成類似于可濕性粉劑但不含分散劑或表面活性劑的濃縮粉劑，并在田間以另外的固體載體稀釋以獲得含有按重量計0.5%至10%的活性化合物的組合物。所述粒劑通常制備為10至100BS目(1,676-0.152mm)大小，并可通過凝聚或注入(impregnaci6n)技術(shù)制備。一般而言，所述粒劑含有按重量計0.5%至25%的活性化合物、按重量計0至1X的添加劑諸如穩(wěn)定齊U、減緩釋放的改性劑和膠黏劑(agglutinatingagent)。除了溶劑和必要時助溶劑之外，乳化原液通常含有按體積重量計10%至50%的活性化合物、按體積重量計2%至20%的乳化劑和按體積重量計0至20%的適當添加劑諸如穩(wěn)定劑、滲透劑和緩蝕劑。濃懸劑被復合為獲得穩(wěn)定的、不易沉降的和液體的產(chǎn)物，并通常含有按重量計0至75%的活性化合物、按重量計0.5%至5%的分散劑、1%至5%的表面活性劑、按重量計0.1%至10%的懸浮劑諸如消泡劑、緩蝕劑、穩(wěn)定劑(尤其是用于蛋白質(zhì)的)、滲透劑和黏合劑和作為載體的水或活性化合物在其中基本不溶的有機液體；某些有機固體或無機鹽可溶解于所述載體中以幫助防止沉淀或作為水的防凍劑。可水分散的粒劑制劑是以基本不含粉末并耐磨損和處理的硬的、干燥顆粒形式，這樣可使粉末的形成最小化。與水接觸后，所述粒劑迅速瓦解以形成活性材料的顆粒懸浮液。這種類型的制劑含有按重量計90%或更多的活性材料、按重量計3%至7%的研磨的表面活性劑(充當分散保濕劑、懸浮劑和膠黏劑)和按重量計1%至3%的載體(充當懸浮劑)。水分散劑和乳劑，例如通過將根據(jù)本發(fā)明的可濕性粉劑或濃縮物用水稀釋獲得的制劑，也屬于本發(fā)明的范圍。所述乳劑可以是油包水類型或水包油類型，或其可具有像蛋黃醬一樣濃稠(espesa)的黏稠度。根據(jù)上文顯然的，本發(fā)明提供含有低至按重量計0.0001%和高至按重量計95%的本發(fā)明的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素作為活性劑的制劑。由于商業(yè)制品優(yōu)選地配制為濃縮物，因此最終的使用者一般使用顯著更低濃度的稀釋制劑。本發(fā)明的組合物還含有其他活性成分，例如，擁有殺蟲劑(pesticidal)性質(zhì)尤其是殺昆蟲劑(insecticida)(特別是Cry和Crt毒素之外的)、殺螨劑或殺真菌劑性質(zhì)的，適合預定目的的其他化合物。含有修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的制劑根據(jù)已知方法制備，例如通過將活性成分與載體混合物均勻混合和/或研磨。本發(fā)明的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素還可通過表達這些修飾的毒素的轉(zhuǎn)基因植物施用于靶昆蟲侵襲。有幾種商業(yè)可得的轉(zhuǎn)基因Bt作物，包括玉米和棉花。構(gòu)建這些和其他轉(zhuǎn)基因植物以表達CryBt毒素基因的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。簡要而言，有幾種方法來轉(zhuǎn)化植物細胞和組織"基因槍"方法(也稱為顯微注射或生物射彈轟擊(參見授予Cornell的美國專利第4，945，050號和授予DowElanco，現(xiàn)在的DowAgroSciences，LLC的美國專利第5，141，131號);電穿孔方法(參見授予BoyceThompsonInstitute的W087/06614和授予PlantGeneticSystems的W092/09696和W093/21335)，該方法在轉(zhuǎn)化單子葉物種諸如玉米和水稻時尤其有用；和農(nóng)桿菌(Agrobacteriun)介導的方法(Vaeck等人，1987)，該方法已成功在雙子葉植物(具有較大葉片的植物諸如大豆和番茄)中實踐多年，并且最近已有效用于一些單子葉植物(草和其他相關(guān)植物)(參見授予UniversityofToledo的美國專利第5，177，010號；授予TexasA&M的美國專利第5，104，310號；授予Schilperoot的歐洲專利申請0131624B1、120516、159418B1和176，112;授予Schilperoot的美國專利第5，149，645、5，469，976、5，464，763、4，940，838和4，693，976號；授予MaxPlanckInstitute的歐洲專利申請第116718、290799、320500號;授予CibaGeigy，現(xiàn)在的Novartis的歐洲專利申請0267159和0292435和美國專利第5，231，019號)?！愣?，由于農(nóng)桿菌方法的高頻率外源DNA單位點插入使得監(jiān)測更加容易，認為其優(yōu)于基因槍方法。如果使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，插入植物基因組的DNA必須克隆于特殊的質(zhì)粒中，無論是以中間載體或雙元載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地使用此轉(zhuǎn)化方法，用含有本發(fā)明的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，以產(chǎn)生殺死田間的合格的抗性昆蟲或避免其出現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因植物。下面的實施例說明了本發(fā)明是如何構(gòu)思和實踐的，并顯示了其應(yīng)用方法。這些實施例絕不是用來限制本發(fā)明。下面的實施例中提供的描述涉及使用用于構(gòu)建載體和其他DNA分子的公布方案的可用策略的優(yōu)選分子生物學方法。所有必需的分子克隆和重組DNA技術(shù)可通過標準方法執(zhí)行(Sambrook等人，1995)。實施例實施例1.使用本發(fā)明的方法獲得編碼缺少a-1螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體實例。為了說明本發(fā)明的方法，選擇了兩種3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素CrylAb和CrylAc。鑒定了這兩者中的啟動子區(qū)、完整蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和a-1螺旋，如下所示<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>pb，堿基對為了除去a-1螺旋的編碼區(qū)，擴增了稱為(:"^&10(1和(:"^010(1的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的基因構(gòu)建體，如下所示在這些情形中，執(zhí)行圖4中顯示的3個PCR步驟。使用含有pHT315CrylAb質(zhì)粒的蘇云金芽孢桿菌株系Bt407的總DNA和BtHD73株系的總DNA(其分別含有CrylAb和CrylAc基因;根據(jù)GeneBank中的報告，登錄號分別為X98793和ML1068)作為模板。對于PCRl，正向寡核苷酸在5'端包含限制性酶切位點Hindi11(其將用于插入合適的載體)，后跟啟動子區(qū)的前18pb，而反向寡核苷酸在5'端含有ATG密碼子和NeoI限制性酶切位點(以與PCR2片段連接)。PCR2的寡核苷酸設(shè)計為在正向寡核苷酸的5'端包含Neol限制性酶切位點，后跟a-2螺旋的前20pb。反向寡核苷酸包含a-23螺旋的最后20pb，后跟BamHI限制性酶切位點(以與PCR3片段連接)。PCR3的正向寡核苷酸設(shè)計為在5'端包含BamHI限制性酶切位點，后跟蛋白質(zhì)C-末端的前19pb。反向寡核苷酸在5'端包含終止子區(qū)的最后21pb和Smal限制性酶切位點(用于克隆于合適的載體中)。純化三種PCR片段并將其分別連接于pBCKS載體，所述載體已預先用對應(yīng)于每種PCR產(chǎn)物的限制性酶消化。最后，純化每種pBCKS質(zhì)粒并用對應(yīng)的限制性酶切割以釋放PCR片段(PCRlHindIII-NcoI;PCR2NcoI-BamHI和PCR3BamHI-Smal)。純化這些PCR片段并將其連接于雙復制起點載體pHT-315(Lereclus等人，1989)，所述載體預先用限制性酶HindIII和Smal消化。所得質(zhì)粒含有crylAb和crylAc基因的修飾形式，其缺少a-1螺旋的編碼區(qū)。這些基因被稱為CrylAbMod和CrylAcMod。實施例2.獲得含有編碼修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體的載體和宿主細胞以及它們在產(chǎn)生修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的重組方法中的用途。獲得包含基因構(gòu)建體CrylAbMod和CrylAcMod的載體，所述基因構(gòu)建體克隆于雙復制起點載體pHT-315中(Lereclus等人，1989)。通過用上述載體轉(zhuǎn)化去晶體化(acristalifera)的株系Bt407Cry-(血清型Hl，Lereclus等人，1989)獲得含有所述構(gòu)建體的遺傳改造的宿主細胞。為了產(chǎn)生此實施例的修飾的和未修飾的(野生型(silvestre))3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，轉(zhuǎn)化和野生型(silvestre)株系在振蕩孵育器中于29。C和200rpm下在補充10yg/ml的紅霉素的營養(yǎng)產(chǎn)孢培養(yǎng)基(Lereclus等人，1995)中培養(yǎng)3天。通過蔗糖梯度回收并純化修飾的和未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素晶體(Thomas和Ellar，1983)，并將其溶解于10mMpH10.5的碳酸鹽緩沖液。蛋白質(zhì)樣品在10%SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠中分離(Laemmli，1970)。遺傳改造的細胞以及未改變的細胞產(chǎn)生表觀分子量為大約130kDa的蛋白質(zhì)(圖5)。實施例3.用作實例的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素寡聚體的形成(CrylAbMod和CrylAcMod)。通過含有毒素結(jié)合區(qū)的Bt-I^蛋白質(zhì)片段存在下或在模擬對CADR受體的這些毒素結(jié)合區(qū)的scFv73抗體存在下，用蛋白酶活化CrylA原毒素來促進寡聚體的體外形成(G6mez等人，2003)。當與含有CADR的7-12、11-12或12重復段的CADR片段孵育時，CrylAb原毒素產(chǎn)生250kDa寡聚體(圖6)。當在不存在CADR受體下用胰蛋白酶處理CrylAbMod和CrylAcMod原毒素時，它們產(chǎn)生250kDa寡聚體，但在這些條件下，野生型(silvestre)原毒素CrylAb和CrylAc不形成寡聚體，而僅產(chǎn)生60kDa單體(圖7)。這些結(jié)果表明當修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素在不存在初級受體下被蛋白水解活化時，它們產(chǎn)生250kDa寡聚體前孔。實施例4.蛋白質(zhì)CrylAb、CrylAc、CrylAbMod和CrylAcMod在紅鈴麥蛾(棉紅鈴蟲)和Plutellaxylostella(小菜蛾)的易感和抗性株系中的毒性。在幾種鱗翅目昆蟲中，對Bt毒素抗性的最常見類型(稱為"模式l")與CADR基因的突變有關(guān)(Gahan等人，2001;Morin等人，2003;Xu等人，2005)。不過，在小菜蛾的情形中，此昆蟲呈現(xiàn)的1型抗性與f丐黏著蛋白基因的突變無關(guān)(Baxter等人2005)。通過在10塊棉花田中選擇暴露于CrylAc毒素的幸存者獲得棉紅鈴蟲的AZP-R抗性株系(Tabashnik等人，2000)。重復的選擇使AZP-R株系對CrylAc的抗性相對于棉紅鈴蟲的易感APHIS-S株系增加高達3，100倍(Tabashnik等人，2002a)。在棉紅鈴蟲AZP-R株系中，對CrylAc的抗性是隱性遺傳的，并與CADR(BtR)基因的3個突變等位基因(rl、r2和r3)有關(guān)(Morin等人，2003)。具有任何組合的2個突變r等位基因的個體對毒素CrylAc和產(chǎn)生此毒素的轉(zhuǎn)基因棉花植物具有抗性(Morin等人，2003)。AZP-R株系還呈現(xiàn)對毒素CrylAb的交叉抗性和CrylAb毒素與幼蟲腸細胞頂端微絨毛結(jié)合的降低(Tabashnik等人，2002b，Gonz(5lez-Cabrera等人，2003)。小菜蛾是對在田間以噴霧形式施用的CrylAc毒素發(fā)展抗性的唯一昆蟲害蟲(Tabashnik2004)。在此實驗中，我們執(zhí)行了確認所用的未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的生物測定，例如CrylAc和CrylAc對所分析的昆蟲棉紅鈴蟲和小菜蛾的易感幼蟲具有高度毒性，但對抗性幼蟲則沒有(表1和2)。在100iig毒素/ml食物濃度下，對于未修飾的CrylAb和CrylAc，抗性棉紅鈴蟲的存活率是高的(分別為94%和100%)。相反，所用的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素例如(CrylAbMod和CrylAcMod)殺死易感幼蟲以及抗性幼蟲。在30yg毒素/ml食物濃度下，對于修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素CrylAbMod和CrylAcMod二者，抗性棉紅鈴蟲的存活率均為0%(表2)。這些結(jié)果顯示，本發(fā)明的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素遏制使用合格的抗性昆蟲實例(即，具有與初級受體突變相關(guān)的抗性的棉紅鈴蟲的幼蟲)對相應(yīng)的未修飾的3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素的抗性。表2顯示，像棉紅鈴蟲一樣，CrylAcMod蛋白質(zhì)殺死抗性rPxAc小菜蛾，不同的是CrylAc蛋白質(zhì)對DBM的rPxAc株系沒有毒性。此株系對CrylAc毒素的抗性范圍增高30，000倍，因為CrylAc毒素的LC5。劑量是易感DBM株系0.3ng/孔和抗性株系>10，000ng/孔。在CrylAcMod毒素的情形中，抗性范圍被降低5倍，因為CrylAcMod的LC5。劑量是DBM易感株系20ng/孔和DBM抗性rPxAc株系lOOng/孔。表1.CrylAbMod和CrylAcMod毒素殺死對CrylAb和CrylAc毒素具有抗性的棉紅鈴蟲。觀察到在lOOiig毒素/ml食物濃度下，對于CrylAb和CrylAc毒素，棉紅鈴蟲的存活率是高的(分別為94%和100%)。然而，在30iig毒素/ml食物濃度下，對于CrylAbMod和Cry1AcMod毒素，抗性棉紅鈴蟲的存活率均為0%。因此，修飾的毒素Cry1AbMod和CrylAcMod遏制棉紅鈴蟲對未修飾的毒素CrylAb和CrylAc的抗性。在10yg毒素/ml食物濃度下，修飾的毒素以及未修飾的毒素殺死超過87%的棉紅鈴蟲易感幼蟲。毒素皿存活率(％)2(iig毒素易感抗性/ml食物)(APHIS-S)(AZP-R)未修飾的毒素CrylAb1090100100100N廬80CrylAc109410098__修飾的毒素CrylAbMod11746101.86.53000CrylAcMod1888810127.530ND0*存活率值根據(jù)未處理食物上對照昆蟲的死亡率進行了調(diào)整。調(diào)整后的存活率計算為處理的食物上的存活率除以未處理的食物上的存活率。樣本大小=40至80只幼蟲/株系/處理。**柳=未確定表2.CrylAcMod蛋白質(zhì)殺死對CrylAc毒素具有抗性的小菜蛾。我們觀察到，在20微克(Pg)毒素/ml食物下，當用毒素CrylAc處理時，抗性存活的小菜蛾的幸存者的數(shù)量是非常高的(90.6%)。然而，在20iig毒素/ml食物濃度下，當用CrylAcMod毒素處理時，小菜蛾抗性株系的存活率為0%。因此，修飾的毒素CrylAcMod遏制小菜蛾對未修飾的毒素CrylAc的抗性。在20yg毒素/ml食物下，修飾的和未修飾的CrylAc毒素殺死100%的小菜蛾易感昆蟲。毒素皿存活率(％F(iig毒素易感抗性/ml食物)(PxGen88)(rPxAc)未修飾的Cry毒素CrylAc0.2_Q_2_0_IM25_0_90.6修飾的Cry毒素CrylAcMod0.2__90.62_0_25_0_^*存活率值根據(jù)未處理食物上對照昆蟲的死亡率進行了調(diào)整。調(diào)整后的存活率計算為處理的食物上的存活率除以未處理的食物上的存活率。樣本大小=32只幼蟲/株系/處理。實施例5沉默煙草天蛾幼蟲的CADR受體降低對CrylAb毒素的易感性。為了確定棉紅鈴蟲的結(jié)果是否擴展至其他鱗翅目昆蟲，使用RNA干擾(RNAi)阻斷CADR受體(Bt-R》的產(chǎn)生，創(chuàng)建了具有降低的對CrylAb毒素的易感性的煙草天蛾幼蟲。關(guān)于RNAi，特定基因的雙鏈RNA(dsRNA)干擾所述基因的翻譯，從而抑制此基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生(Sijen等人，2001)。為了從煙草天蛾的編碼基因Bt-^產(chǎn)生dsRNA，通過rtPCR從產(chǎn)自RNAm樣品的cDNA擴增了所述基因的442pb片段(殘基8至155)，所述RNAm樣品是使用下列寡核苷酸作為rtPCR反應(yīng)中的引物(first)從5°齡幼蟲獲得的GCTCTAGAGCTGC20CTTCCTGCTGGTGTTTA和GGAATTCCTCCACGCGCACATTGAACAT。用限制性酶Xbal和EcoRI消化此442pb片段，并克隆于預先用相同的限制性酶消化的pLITMUS28i(HiScribe)中，此載體具有側(cè)翼于多克隆位點的兩個T7啟動子。這允許克隆片段的擴增，和插入物的兩條DNA鏈的體外轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生dsRNA。圖8顯示通過使用T7聚合酶擴增的Bt-^基因片段的體外轉(zhuǎn)錄獲得的dsRNA。為了證明是否可沉默Bt-I^蛋白質(zhì)，向于血淋巴中的一齡煙草天蛾幼蟲注射于lOOnl水中的1ygBt-I^的dsRNA或僅lOOnl水(對照)。在不含毒素的人工食物上12小時后，35只注射Bt-I^的dsRNA的幼蟲的存活率為74%，而35只對照幼蟲的存活率為75%。在未處理的食物上存活12小時的幼蟲中，將注射dsRNA幼蟲組或?qū)φ沼紫x組的各24只幼蟲轉(zhuǎn)移至用20ng原毒素CrylAb/cm2處理的食物。在用所述毒素處理的食物上3天后，對照幼蟲全部死亡，而注射Bt-^的dsRNA的幼蟲全部存活(表3)。通過使用特異性抗-Bt-R抗體的蛋白質(zhì)印跡免疫檢測測定，證明注射dsRNA顯著地降低或完全消除幼蟲腸基質(zhì)中的Bt-I^蛋白質(zhì)(圖9)。生物測定和Bt-^免疫檢測的結(jié)果表明，RNAi降低煙草天蛾幼蟲中Bt-I^蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和對毒素CrylAb的易感性。表3.注射Bt-RidsRNA的煙草天蛾幼蟲對CrylAb毒素不易感。向煙草天蛾幼蟲注射lOOnl水或于lOOnl水中的1ygBt-RlClsRNA并暴露于含有20ngCrylAb毒素/cm2的人工食物。處理暴露于加ngCrylAb/cm2存活率(％)的幼蟲數(shù)H2Q_24_QdsRNABt-R丄24_實施例6.CrylAb和CrylAbMod毒素對Bt-^受體被沉默的煙草天蛾幼蟲的毒性。為了確定CrylAbMod對于對野生型(silvestre)CrylAb毒素具有降低的易感性(通過用Bt-I^RNAi沉默造成)的幼蟲是否具有毒性，向一齡煙草天蛾幼蟲注射如實施例5所述的1ygBt-RlClsRNA。向注射后的幼蟲喂養(yǎng)補充20ng野生型(silvestre)CrylAb原毒素/cm2或5ngCrylAbMod原毒素/cm2的食物。通過Bt-I^的RNAi沉默的幼蟲對野生型(silvestre)CrylAb毒素不易感，但是它們對修飾的CrylAbMod毒素易感(圖10)。這些結(jié)果顯示所用的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素之一，例如CrylAbMod,遏制煙草天蛾幼蟲中由通過RNAi阻斷Bt-^表達造成的易感性降低的效應(yīng)。參考文獻全部參考文獻通過參考被引入。AronsonA.I.andShaiY.(2001)WhyBacillusthuringiensisinsecticidaltoxinsaresoeffective:皿iquefeaturesoftheirmodeofaction.FEMSMicrobiol.Lett.195，1-8.Baxter,S.W.，Zhao，J._Z.，Gahan，L.J.，Shelton，A.M.，Tabashnik，B.E.，Heckel，D.G.2005.Novelgeneticbasisoffield—evolvedresistancetoBttoxinsinPlutellaxylostella.InsectMol.Biol.14，327-334Boonserm，P.，Davis，P.，Ellar，D.J.，Li，J.2005.CrystalStructureoftheMosquito—larvicidalToxinCry4BaandItsBiologicalImplications.J.Mol.Biol.348，363—382Boonserm，P.，Mo，M.，Angsuthanasombat，Ch.，Lescar，J.2006.StructureofthefunctionalformofthemosquitolarvicidalCry4AatoxinfromBacillusthuringiensisata2.8-angstromresolution.J.Bacteriol.188，3391—3401.Bravo，A.，G6mez，I.，Conde，J.，Muftoz'-Garay，C.，Sdnchez，J.，Zhuang，M.，Gill，S.S.，Sober6n，M.(2004)Oligomerizationtriggersdifferentialbindingofapore_formingtoxintoadifferentreceptorleadingtoefficientinteractionwithmembranemicrodomains.Biochem.Biophys.Acta.1667，38—46.CrickmoreN.ZeiglerD.RFeitelsonJ.SchnepfE.VanRieJ.LereclusD.BaumJ.andDeanD.H.(1998).RevisionofthenomenclaturefortheBacillusthuringiensispesticidalcrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62，807—813.CrickmoreN.ZeiglerD.R.SchnepfE.VanRieJ.LereclusD.BaumJBravoA.andDeanD.H.〃Bacillusthuringiensistoxinnomenclature"(2002)http://www,biols.susx.ac.uk/Home/NeilCrickmore/Bt/index,htmlConnerA.J.GlareT.R.andNapJ._P.(2003)ThereleaseofgeneticallyModifiedcropsintotheenvironment.PartII.Overviewofecologicalriskassessment.ThePlantJournal.33，19_46.deMaagdR.A.BravoA.andCrickmoreN.(2001)HowBacillusthuringiensishasevolvedspecifictoxinstocolonizetheinsectworld.TrendsinGenet.17，193-199.Ferr6J.andVanRieJ.(2002)BiochemistryandgeneticsofinsectresistancetoBacillusthuringiensis.Ann.Rev.Entomol.47，501—533.GahanJ.GouldF.andHeckelD.G.(2001)IdentificationofageneassociatedwithBtresistanceinHeliothisvirescens.Science.293，857—860.GalitskyN.CodyV.WojtczakA.DebashisG.LuftJ.R.PangbornW.andEnglishL(2001)Structureofinsecticidalbacterial5-endotoxinCry3BblofBacillusthuringiensis.Acta.Cryst.D57，1101—1109.G6mezI.OlteanD.I.SanchezJ.GillS.S.BravoA.andSober6nM.(2001)MappingtheepitopeinCadherin-likereceptorsinvolvedinBacillusthuringiensisCrylAtoxininteractionusingphagedisplay.J.Biol.Chem.276，28906-28912.G6mezI.Sc5nchezJ.MirandaR.BravoA.andSober6nM.(2002).Cadherin-likereceptorbindingfacilitatesproteolyticcleavageofhelixa_1indomainIandoligomerpre_poreformationofBacillusthuringiensisCrylAbtoxin.FEBSLett.513，242-246.G6mezIDeanD.H.BravoA.andSober6nM.(2003)MolecularbasisforBacillusthuringiensisCrylAbtoxinspecificity:TwostructuraldeterminantsintheManducasextaBt—I^receptorinteractwithloopsa_8and2indomainIIofCylAbtoxin.Biochemistry.42,10482-10489.Gonz(5lez-Cabrera，J.，B.Escriche，B.E.TabashnikandJ.Ferr6.2003.BindingofBacillusthuringiensistoxinsinresistantandsusceptiblestrainsofpinkbollworm(Pectinophoragossypiella).InsectBiochem.Mol.Biol.33:929-935.GrochulskiP.MassonL.BorisovaS.Pusztai—CareyM.Schwartz22J丄BrousseauR.andCyglerM.(1995)BacillusthuringiensisCrylA(a)insecticidaltoxin-CrystalstructureandchannelformationJ.Mol.Biol.254，447_464.Gould，F(xiàn).(1998)Sustainabilityoftransgenicinsecticidalcultivars:integratingpestgeneticsandecology.Ann.Rev.Entomol.43，701—726.HelgasonE.Okstad0.A.CaugantD.A.JohansenH.A.FouetA.MockM.HegnaIandKolstoA.B.(2000).Bacillusanthracis，Bacilluscereus，andBacillusthuringiensis—onespeciesonthebasisofgeneticevidence.Appl.Environ.Microbiol.66,2627-2630.Herrero，S.，Gonzalez—Cabrera,J.，F(xiàn)erre，J.，Bakker，P.L，deMaagd.R.A.(2004)MutationsintheBacillusthuringiensisCrylCatoxindemonstratetheroleofdomainsllandIIIinspecificitytowardsSpodopteraexigualarvae.Biochem.J.384,507-513.James，C.2005.Globalstatusofbiotech/GMCropsin2005.2005.ISAAABriefsNo.34.Ithaca，NY，InternationalServicefortheAcquisitionofAgri-biotechApplications.Janmaat，A.F.，andJ.H.Myers.(2003)RapidevolutionandthecostofresistancetoBacillusthuringiensisingreenhousepopulationsofcabbageloppers，Trichoplusiani.Proc.Roy.Soc.Lond.B.270，2263-2270.Jurat-Fuentes，J.L.，Adang，M.J.(2004)CharacterizationofaCrylAc—receptoralkalinephosphataseinsusceptibleandresistantHeliothidvirescenslarvae.Eur.J.Biochem.271，3127-3135.Jurat-Fuentes，J丄，Adang，M.J.(2006)CrytoxinmodeofactioninsusceptibleandresistantHeliothisvirescenslarvae.J.Invertebr.Pathol.92，166-172KnightP.CrickmoreN.andEllarD.J.(1994)ThereceptorforBacillusthuringiensisCryIA(c)delta-endotoxininthebrushbordermembraneofthelepidopteranManducasextaisaminopeptidaseN.Mol.Microbiol.11，429—436.Laemmli，U.K.(1970)CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4，Nature227，680_685.LereclusD.Arantes0.ChaufauxJ.andLecadetM._M.(1989)Transformationandexpressionofacloned5-endotoxingeneinBacillusthuringiensis.FEMSMicrobiol.Lett.60,211-218LereclusD.，AgaisseH.，GominetM.，ChafauxJ.1995.OverproductionofencapsulatedinsecticidalcrystalproteinsinaBacillusthuringiensisspoOAmutantBiotechnology13,67—71.LiJ.CarrollJ.andEllarD.J.(1991)Crystalstructureofinsecticidal5-endotoxinfromBacillusthuringiensisat2.5Aresolution.Nature353,815-821.MorinS.BiggsR.W.ShriverL.Ellers-KirkC.HigginsonD.HolleyD.Gahan，HeckelD.G.CarriereY.DennehyT.J.BrownJ.K.andTabashnikB.E.(2003)ThreecadherinallelesassociatedwithresistancetoBacillusthuringiensisinpinkbollworm.Proc.Nat.Acad.Sci.100，5004-5009.MorseR.J.YamamotoT.andStroud.R.M.(2001)StructureofCry2Aasuggestsammexpectedreceptorbindingepitope.Structure9，409—417.Mufioz-Garay，C.，Sc5nchez，J.，Darszon，A.，deMaagd，R.，Bakker，P.，Sober6n，M.，andBravo，A.(2006)PermeabilitychangesofManducasextaMidgutBrushBorderMembranesInducedbyOligomericStructuresofDifferentCryToxins.J.Membr.Biol.InthepressPardo-L6pez，L.，G6mez，I.，Rausell，C.，Sc5nchez，J.，Sober6n，M.andBravo，A.2006StructuralchangesoftheCrylAcoligomericpre—porefromBacillusthuringiensisinducedbyN_acetylgalactosaminefacilitatestoxinmembraneinsertion.Biochemistry45:10329—10336Rausell，C.，Mufloz.-Garay，C.，Miranda-CassoLuengo，R.，G6mez，I.，Rudifto-Pifiera,E.，Sober6n，M.，Bravo，A.(2004a).TryptophanspectroscopystudiesandblacklipidbilayeranalysisindicatethattheoligomericstructureofCrylAbtoxinfromBacillusthuringiensisisthemembrane—insertionintermediate.Biochem.43，166-174.RausellC.，Garcia_Rob1es，I.，Sc5nchezJ.，Mufioz'-GarayC.，Martinez-Ramirez,A.C.，Real,M.D.，BravoA.(2004b)RoleoftoxinactivationonbindingandporeformationactivityoftheBacillusthuringiensisCry3toxinsinmembranesofL印tinotarsadecemlineata[Say].Biochem.BiophysActa1660,99-105SchnepfE.CrickmoreN.VanRieJ丄ereclusD.BaumJ.R.FeitelsonJ.ZeiglerD.andDean，D.H.Q998)Baci1lusthuringiensisanditspesticidalcrystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev.62，705-806.SchulerT.H.PoppyG.M.KerryB.R.andDenholmI.(1998)Insect-resistanttransgenicplants.TrendsBiotechnol.16，168_175.SchwartzJ.LLuY.J.SohnleinP.BrousseauR.LapradeR.MassonLandAdangM.J.(1997)IonchannelsformedinplanarlipidbilayersbyBacillusthuringiensistoxinsinthepresenceofManducasextamidgutreceptors.FEBSLett.412,270-276.SijenT.FleenorJ.SimmerF.ThijssenK.LParrishS.TimmonsLPlasterkR.H.andFireA.(2001)0ntheroleofRNAamplificationindsRNA-triggeredgenesilencing.Cell.107,465—476.TabashnikB.E.FinsonN.JohnsonM.W.HeckelD.G.(1994)Cross-ResistancetoBaci1lusthuringiensisToxinCryIFintheDiamondbackMoth(Piute1laxylostella).ApplEnvironMicrobiol.60(12):4627—4629TabashnikB.E.PatinA丄DennehyT.J丄iuY.B.CairiereY.SimsM.A.andAntillaL(2000)FrequencyofresistancetoBacillusthuringiensisinfieldpopulationsofpinkbollworm.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，12980—12984Tabashnik,B.E.，Y.B.Liu，T.J.Dennehy，M.A.Sims，M.S.Sisterson，R.W.BiggsandY.Carriere.2002a.InheritanceofresistancetoBttoxinCrylAcinafield-derivedstrainofpinkbollworm(L印idoptera:Gelechiidae).J.Econ.Entomol.95:1018-1026.Tabashnik，B.E.，T.J.De騰hy，M.A.Sims，K.Larkin，G.P.Head,W.J.MoarandY.Carriere.2002b.ControlofresistantpinkbollwormbytransgeniccottonwithBacillusthuringiensistoxinCry2Ab.Appl.Environ.Microbiol.68:3790—3794.Tabashnik，B.E.，Carriere,Y.，De皿ehy，T.J.，Morin，S.，Sisterson，M.S.，Roush，R.T.，Shelton，A.M.，andZhao，J_Z(2003)InsectresistancetotransgenicBtCrops:LessonsfromtheLaboratoryandfield.J.Econom.Entomol.96，1031—1038.Tabashnik,B.E.，De皿ehy，T.J.，andCarriere,Y.(2005)Delayedresistancetotransgeniccottoninpinkbollworm.Proc.Nat.Acad.Sci.102，15389—15393.Thomas,W.E.，andEllar，D.J.(1983)Bacillusthuringiensisvarisraelensiscrystal5-endotoxin:effectininsectandmammaliancellsinvitro，J.CellSci.60，181-197Vadlamudi，R.K.，Weber，E.，Ji，I.，Ji，T.H.andBulla,L.A.Jr.(1995)CloningandexpressionofareceptorforaninsecticidaltoxinofBacillusthuringiensis.J.Biol.Chem.270，5490-5494.Vaeck，M.，Reynaerts，A.，H3fte，H.，Jansens，S.，DeBeuckekeer，M.，Dean，C.，Zabeau，M.，VanMontagu,M.andLeemansJ.1987Transgenicpintsprotectedfrominsectattack.Nature328，33_37.ValaitisA.P.JenkinsJ丄丄eeM.K.DeanD.H.andGarnerK.J.(2001)IsolationandpartialcharacterizationofGypsymothBTR—270ananionicbrushbordermembraneglycoconjugatethatbindsBacillusthuringiensisCrylAtoxinswithhighaffinity.Arch.Ins.Biochem.Physiol.46，186-200.Xu，X.，Yu，L，andWu，Y.(2005)DisruptionofacadheringeneassociatedwithresistancetoCrylAc5-endotoxinofBacillusthuringiensisinHelicoverpaarmigera.Appl.Environ.Microbiol.71，948—954.2權(quán)利要求一種用于獲得編碼缺少α-1螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體的方法，其中所述編碼的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素能夠殺死合格的抗性昆蟲、遏制它們的抗性，所述方法由下列步驟組成a)選擇3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的編碼基因作為靶標；b)鑒定啟動子區(qū)，分別的未修飾毒素的從α-2螺旋至β-23折疊的蛋白質(zhì)片段的修飾區(qū)域、α-1螺旋的編碼區(qū)和原毒素的C-末端編碼區(qū)，如果其存在于所選擇的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素中的話；c)擴增不包括α-1螺旋編碼區(qū)的基因構(gòu)建體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述擴增步驟是通過由下列步驟組成的連續(xù)擴增執(zhí)行的a)僅擴增啟動子區(qū)的第一擴增步驟；b)擴增從a-2螺旋開始至P-23折疊的編碼區(qū)和如果存在原毒素的羧基末端區(qū)則擴增原毒素的羧基末端區(qū)的一個或多個擴增步驟；c)連接步驟a)和b)中獲得的PCR產(chǎn)物。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素選自由來自以下亞家族的所有3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組Cryl、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry7、Cry8、Cry9、CrylO、Cryll、Cryl2、Cryl3、Cryl4、Cryl6、Cryl7、Cryl8、Cryl9、Cry20、Cry21、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry39、Cry40、Cry41、C4ry2、Cry43、Cry44、Cry7、Cry48和Cry50。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素選自由來自亞家族Cryl的所有3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素選自由來自亞家族CrylA的所有3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素選自由來自亞家族CrylAb和CrylAc的所有3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。7.—種分離的DNA片段，其包含修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的編碼區(qū)，其特征在于所編碼的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素缺少a-1螺旋并因此能夠殺死合格的抗性昆蟲、遏制它們對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的抗性。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的DNA片段，其特征在于所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素選自由以下亞家族的所有3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組Cryl、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry7、Cry8、Cry9、CrylO、Cryll、Cryl2、Cryl3、Cryl4、Cryl6、Cryl7、Cryl8、Cryl9、Cry20、Cry21、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry47、Cry48和Cry50，它們被修飾以使它們?nèi)鄙賏_1螺旋。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分離的DNA片段，其特征在于所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素選自由被修飾以使它們?nèi)鄙賏-1螺旋的來自亞家族Cryl的所有3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分離的DNA片段，其特征在于所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素選自由被修飾以使它們?nèi)鄙賏-1螺旋的來自亞家族CrylA的所有3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分離的DNA片段，其特征在于所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素選自由被修飾以使它們?nèi)鄙賏-1螺旋的來自亞家族CrylAb和CrylAc的所有3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。12.—種分子載體，其特征在于它包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的DNA片段。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分子載體，其特征在于所述載體是具有可在蘇云金芽孢桿菌和大腸桿菌細胞中復制的雙復制起點的載體。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的分子載體，其特征在于所述載體適于在植物細胞中轉(zhuǎn)化和表達。15.—種遺傳修飾的細胞，其選自由細菌細胞或植物細胞組成的組，其特征在于所述宿主細胞包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的DNA片段。16.—種修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，其缺少a_1螺旋，其特征在于它能夠殺死合格的抗性昆蟲、遏制它們對未修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的抗性。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，其特征在于它選自由來自以下亞家族的所有3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組Cryl、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry7、Cry8、Cry9、Cryl0、Cryll、Cryl2、Cryl3、Cryl4、Cryl6、Cryl7、Cryl8、Cryl9、Cry20、Cry21、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry47、Cry48和Cry50，它們被修飾以使它們?nèi)鄙賏_1螺旋。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，其特征在于它選自由被修飾以使它們?nèi)鄙賏-1螺旋的亞家族Cryl的所有3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，其特征在于它選自由被修飾以使它們?nèi)鄙賏-1螺旋的來自亞家族CrylA的所有3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，其特征在于它選自由被修飾以使它們?nèi)鄙賏-1螺旋的來自亞家族CrylAb和CrylAc的所有3_結(jié)構(gòu)域Cry毒素組成的組。21.—種獲得缺少a-l螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的方法，其特征在于它包括以下步驟a)培養(yǎng)包含編碼缺少a-1螺旋的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的DNA構(gòu)建體的遺傳修飾的宿主細胞，所述培養(yǎng)在適于允許表達所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的條件下進行，和任選地b)分離所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素，和任選地c)純化所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素。22.—種殺死合格的抗性昆蟲以遏制它們的抗性的組合物，其特征在于它含有足以控制靶侵襲的量的一種或多種修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素以及農(nóng)業(yè)和生態(tài)可接受的賦形劑的混合物。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素以按重量計介于0.0001%和95%的量存在。24.—種轉(zhuǎn)基因植物，其包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA片段。25.—種遏制合格的抗性昆蟲的抗性的方法，其特征在于它包括使所述合格的抗性昆蟲食用致死劑量的修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的步驟。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素作為組合物的一部分被食用。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素存在于轉(zhuǎn)基因植物中。全文摘要本發(fā)明涉及用于獲得編碼具有3個缺少α-1螺旋的結(jié)構(gòu)域的Cry毒素(也稱為Cry毒素、Bt毒素或δ-內(nèi)毒素)的DNA構(gòu)建體的方法。所述DNA構(gòu)建體被修飾以編碼可殺死對相應(yīng)的未修飾的Cry毒素具有抗性的昆蟲的蛋白質(zhì)。本發(fā)明涉及修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的基因的DNA構(gòu)建體和修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry蛋白質(zhì)，以及方法、含有所述構(gòu)建體的分子載體和宿主細胞，以及產(chǎn)生修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的重組方法。此外，本發(fā)明涉及含有修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的制劑。昆蟲對未修飾的Cry毒素的抗性是由于毒素與昆蟲腸中的受體的結(jié)合降低。更具體地，本發(fā)明涉及修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的表達、表達所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的方法、具有表達所述修飾的3-結(jié)構(gòu)域Cry毒素的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化微生物和轉(zhuǎn)基因植物以及遏制害蟲對未修飾的Cry毒素的抗性的方法。文檔編號C12N15/74GK101730712SQ20078005327公開日2010年6月9日申請日期2007年6月8日優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日發(fā)明者E·B·塔巴什尼克,L·帕多-羅佩斯,M·A·布拉沃-德拉帕拉,M·索維倫-查韋斯申請人:墨西哥國立大學;亞利桑那大學評議會